Giardia lamblia trên bò nuôi tại Khánh Hòa
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Viện Công nghệ sinh học & Môi trường - - TRẦN THỊ VĨNH TRANG KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM, PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH ĐƠN BÀO GIARDIA LAMBLIA TRÊN BÒ NUÔI TẠI NINH HÒA – KHÁNH HÒA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP (Ngành Công Nghệ Sinh Học) Nha Trang – năm 2016 I BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Viện Công nghệ sinh học & Môi trường - - TRẦN THỊ VĨNH TRANG KHẢO SÁT TỶ LỆ NHIỄM, PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH ĐƠN BÀO GIARDIA LAMBLIA TRÊN BÒ NUÔI TẠI NINH HÒA – KHÁNH HÒA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP (Ngành Công nghệ sinh học) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Nguyễn Thị Sâm ThS Nguyễn Thị Thanh Hải Nha Trang – năm 2016 II LỜI CẢM ƠN Trước hết em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học Môi Trường tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đồ án tốt nghiệp Em xin gửi đến biết ơn sâu sắc dành cho cô TS Nguyễn Thị Sâm – Cán phòng Nghiên cứu ký sinh trùng trực thuộc Phân viện Thú y miền Trung, thầy PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa – Viện Trưởng Viện Công nghệ Sinh học Môi trường – Trường Đại học Nha Trang cô ThS Nguyễn Thị Thanh Hải – Giảng viên Trường Đại học Nha Trang tận tình bảo hướng dẫn em thực đồ án cách tốt Xin cảm ơn cô ThS Khúc Thị An – Trưởng môn Công nghệ Sinh học thầy TS Nguyễn Văn Duy – Phó Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh Môi trường – Trường Đại học Nha Trang với ban cán giảng viên phản biện cho em kiến thức sâu sắc lời khuyên vô quý báu để đồ án nghiên cứu hoàn thành tốt Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, giúp đỡ của: thầy cô giáo Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, cán - Bộ môn Ký sinh trùng tập thể cán công nhân viên – Phân viện Thú y miền Trung giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện làm việc tốt cho em suốt thời gian em thực đồ án Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến Cha Mẹ, người thân bạn đồng hành tập thể lớp 54CNSH – Trường Đại học Nha Trang gắn bó động viên khích lệ em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp Nha Trang, ngày 11 tháng năm 2016 Sinh viên thực Trần Thị Vĩnh Trang III MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC HÌNH ẢNH V DANH MỤC BẢNG VI CHÚ THÍCH THUẬT NGỮ VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT VII LỜI NÓI ĐẦU 1.1 Đặc điểm chung đơn bào ký sinh trùng Giardia lamblia: 1.1.1.Hình thái cấu tạo: 1.1.2.Vòng đời đơn bào ký sinh trùng Giardia lamblia: 1.1.3.Thành phần loài đơn bào Giardia lamblia gây bệnh cho người động vật: 1.2 Dịch tễ học triệu chứng bệnh lây nhiễm: 1.2.1.Vật chủ cảm nhiễm: 1.2.2.Tình hình nhiễm bệnh người: 1.2.3.Tình hình nhiễm Giardia lamblia động vật: 1.2.4.Mùa nhiễm bệnh: 1.2.5.Đường lây bệnh nguyên nhân lây nhiễm: 1.2.6.Triệu chứng nhiễm bệnh: 1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh lây nhiễm Giardia lamblia: 1.3.1.Chẩn đoán lâm sàng: 1.3.2.Chẩn đoán cận lâm sàng: 1.4 Các biện pháp phòng điều trị bệnh lây nhiễm Giardia lamblia: 19 1.4.1.Điều trị: 19 1.4.2.Phòng bệnh: 20 1.5 Những nghiên cứu đơn bào ký sinh trùng giới Việt Nam: 20 1.5.1.Nghiên cứu ký sinh trùng đơn bào Giardia lamblia giới: 20 1.5.2.Nghiên cứu đơn bào ký sinh trùng Giardia lamblia Việt Nam: 22 1.5.3.Các ứng dụng phương pháp ELISA việc xác định phân biệt ký sinh trùng Việt Nam: 22 1.5.4.Các ứng dụng PCR việc xác định phân biệt ký sinh trùng Việt Nam: 23 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng, thời gian địa điểm nghiên cứu đề tài: 24 2.1.1.Đối tượng nghiên cứu: 24 2.1.2.Thời gian thu mẫu: 24 2.1.3.Địa điểm thu mẫu: 24 2.2 Phương pháp thu mẫu: 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu: 26 2.3.1.Phương pháp phù nổi: 27 2.3.2.Phương pháp ELISA phát kháng nguyên kit GIARDIA II test 28 2.3.3.Phương pháp Nested PCR định danh đơn bảo Giardia lamblia ký sinh mẫu phân bò thu được: 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia bò thị xã Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa phương pháp phù nổi: 39 3.2 Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia bò thị xã Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa phương pháp ELISA: 40 3.2.1.Kết xét nghiệm ELISA tỷ lệ nhiễm Giardia mức độ tẩy giun theo định kỳ: 42 3.2.2.Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm thông qua diện cầu trùng (Coccidia): 43 IV 3.2.3.Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm Giardia thông qua diện giun tròn (Strongyles): 44 3.2.4.Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm Giardia theo độ lớn chuồng/trại chăn nuôi: 45 3.2.5.Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm Giardia theo tần suất cho ăn cỏ tự nhiên: 45 3.2.6.Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm Giardia theo loại sàn chăn nuôi: 46 3.2.7.Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm Giardia theo tần suất làm chuồng/trại chăn nuôi: 47 3.2.8.Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo tính chất địa lý vùng chăn nuôi: 48 3.3 Kết thực phản ứng PCR chạy điện di gel Agarose nhằm giám định chủng đơn bào Giardia lamblia: 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 4.1 Kết luận: 51 4.2 Kiến nghị: 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 55 V DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1 Giardia lamblia Hình Hình thái thể kén đơn bào Giardia lamblia Hình Hình thái thể hoạt động (trophosite) đơn bào Giardia lamblia Hình Vòng đời đơn bào Giardia lamblia Hình Nguyên tắc kỹ thuật ELISA 10 Hình Nguyên tắc kỹ thuật PCR 15 Hình Các bước kỹ thuật ELISA gián tiếp chẩn đoán bệnh ký sinh trùng 23 Hình Sơ đồ hóa quy trình nghiên cứu 26 Hình 2 Phương pháp phù 28 Hình Quy trình tiến hành thử nghiệm ELISA phát 28 Hình Sơ đồ quy trình tiến hành Nested PCR 34 Hình Sơ đồ quy trình tách chiết DNA tổng số 34 Hình Chu trình nhiệt phản ứng Nested PCR 37 Hình Hình thái thể kén đơn bào Giardia lamblia nhuộm lugol-iodine 39 Hình Tỷ lệ mẫu dương tính Giardia lamblia theo phương pháp phù 39 Hình 3 Kết phản ứng ELISA phát kháng nguyên Giardia lamblia 40 Hình Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo dấu hiệu bệnh lâm sàng tiêu chảy 41 Hình Tỷ lệ mẫu dương tính Giardia theo mục tiêu nghiên cứu định kỳ tẩy giun bò 42 Hình Tỷ lệ mẫu dương tính Giardia lamblia thông qua diện cầu trùng 43 Hình Tỷ lệ mẫu dương tính Giardia thông qua diện giun tròn 44 Hình Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo độ lớn chuồng/trại nuôi 45 Hình Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo tần suất cho ăn cỏ tự nhiên 46 Hình 10 Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo loại sàn chăn nuôi 46 Hình 11 Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo tần suất làm chuồng trại chăn nuôi 47 Hình 12 Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo tính chất địa lý vùng chăn nuôi 48 Hình 13 Kết điện di sản phẩm Nested PCR phát định danh 49 VI DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Danh mục thành phần loài đơn bào ký sinh trùng Giardia lamblia Bảng Các kiểu gene đơn bào Giardia lamblia Bảng Triệu chứng nhiễm bệnh ký sinh trùng Giardia lamblia gây Bảng Phân loại PCR 17 Bảng Phiếu điều tra mẫu phân thu nhận Thị xã Ninh Hòa 25 Bảng 2 Bảng đọc kết ELISA 32 Bảng Trình tự nucleotide cặp mồi dùng cho Nested PCR 36 Bảng Thành phần hóa chất sử dụng cho Nested PCR 36 Bảng Tỷ lệ nhiễm đơn bào Giardia lamblia 184 mẫu phân xét nghiệm theo phương pháp phù 55 Bảng Tỷ lệ nhiễm đơn bào Giardia lamblia theo phương pháp ELISA 55 Bảng 3 Tỷ lệ nhiễm đơn bào Giardia lamblia theo trạng thái đối tượng thu mẫu 55 Bảng 4.Kết xét nghiệm ELISA tỷ lệ nhiễm Giardia mức độ tẩy giun theo định kỳ 55 Bảng Tỷ lệ dương tính Giardia thông qua diện cầu trùng 56 Bảng Tỷ lệ nhiễm Giardia thông qua diện giun tròn 56 Bảng Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo độ lớn chuồng/trại chăn nuôi 56 Bảng Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo tần suất cho ăn cỏ tự nhiên 56 Bảng Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo loại sàn chăn nuôi 56 Bảng 10 Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia dựa theo tần suất làm chuồng/trại 57 Bảng 11 Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia dựa tính chất địa lý vùng chăn nuôi 57 VII CHÚ THÍCH THUẬT NGỮ VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT - Trophozoites: thể hoạt động đơn bào Giardia lamblia - Cysts: thể kén đơn bào Giardia lamblia - Tm: melting temperature (nhiệt độ bắt cặp) - DNA: Deoxyribose Nucleic Acid - RNA: Ribose Nucleic Acid - Kb: Kilo Basepair - Bp: Base pair - dNTP: Deoxynucleoside triphosphate/ Deoxynucleoside 5'-triphosphate/ Deoxyribonucleoside triphosphate - dUTP: Deoxyuridine triphosphates/ Deoxyuridine 5'-triphosphate - Enzyme UNG: - ELISA: Enzym Linked Immunosorbent Assay - PCR: polymerase chain reaction - nm: nanomet - µm: micromet - µg: micro gram - UV: Ultra violet - Pos: positive (dương tính) - Neg: negative (âm tính) - KN: kháng nguyên - KT: kháng thể LỜI NÓI ĐẦU Ninh Hòa huyện thuộc vùng duyên hải tỉnh Khánh Hòa, ngành chăn nuôi bò thịt phát triển, tổng số đàn bò lên đến xấp xỉ 2000 Đây nơi cung cấp thịt bò cho người tiêu dùng tỉnh Khánh Hòa Tuy nhiên, địa hình vùng duyên hải xen kẽ đồi núi, nắng nhiều mưa, với phương thức chăn nuôi chủ yếu chăn thả nên dịch bệnh xảy thường xuyên Trong đó, bệnh tiêu chảy đơn bào Giardia lamblia gây nguyên nhân làm mục đích chăn nuôi không đạt hiệu cao gây thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi Hơn đơn bào Giardia lamblia gây bệnh cho người Tổ chức y tế giới xếp Giardia lamblia vào nhóm ký sinh trùng nhiệt đới bị quên lãng, nước phát triển Ở nước ta, nghiên cứu đơn bào Giardia lamblia chưa trọng Do đó, dịch bệnh mà Giardia lamblia gây chưa quan tâm nhiều, gây suy giảm sức khỏe sinh trưởng vật nuôi đặc biệt bò thịt, gây nên tổn thất kinh tế cho người chăn nuôi Đồng thời gây thiệt hại tinh thần sức khỏe cho người mắc phải bệnh lây nhiễm ký sinh trùng Từ thực tế trình bày, thực đề tài “Khảo sát tỷ lệ nhiễm, phân lập định danh đơn bào Giardia lamblia bò nuôi Ninh Hòa – Khánh Hòa” nhằm khảo sát tỷ lệ nhiễm đơn bào Giardia lamblia bò chăn nuôi đưa nghiên cứu cho việc định danh đơn bào để kịp thời phát điều trị, phòng bệnh cách Mục tiêu nghiên cứu: (1) Khảo sát tỷ lệ nhiễm đơn bào Giardia lamblia bò nuôi Ninh Hòa – Khánh Hòa phương pháp ELISA (2) Phân lập định danh đơn bào Giardia lamblia bò nuôi Ninh Hòa – Khánh Hòa kỹ thuật Nested PCR CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm chung đơn bào ký sinh trùng Giardia lamblia: 1.1.1 Hình thái cấu tạo: Đơn bào ký sinh trùng Giardia lamblia thể trùng roi ký sinh đường ruột phân loài định danh Lambl vào năm 1859 Kofoid & Christiansen vào năm 1915 https://vi.wikipedia.org/wiki/Giar dia_lamblia Lĩnh giới (domain): Eukaryota Ngành (phylum): Metamonada Bộ (ordo): Diplomonadida Họ (familia): Hexamitidae Chi (genus): Giardia Loài (species): Giardia lamblia Danh pháp đồng nghĩa: Giardia intestinalis; Giardia duodenalis Hình 1 Giardia lamblia Thể hoạt động (trophozoites) đơn bào Giardia lamblia quan sát diện theo chiều rộng, mặt bụng chúng có hình lê bổ đôi theo chiều dọc; nhìn nghiêng chúng có hình giống thìa với phía lưng gồ, bụng lõm Mặt lõm dùng để bám vào niêm mạc ruột gọi đĩa bám Đuôi cong lên phía lưng Thể hoạt động đơn bào có kích thước chiều dài tử đến 21 µm, chiều ngang từ đến 15 µm, bề dày từ đến µm Ở 1/3 mặt trước có hai nhân đối xứng hai bên trục sống Mỗi nhân có trung thể lớn tròn Vỏ nhân thể rõ ràng, vỏ nhân trung thể khoảng trống nên nhân giống hai mắt Thể hoạt động chúng có đôi roi, đôi phía trước, đôi giữa, đôi bụng đôi đuôi Có trục sống dọc thân Thể cạnh gốc hình dấu phẩy cắt ngang trục sống [8, tr.38-39] Thể kén (cysts) đơn bào Giardia lamblia có hình oval, vỏ dày có hai lớp; kén có nhân Kích thước thể kén có chiều dài từ 10 đến 14 µm, chiều rộng từ đến µm Về mặt sinh học, đơn bào sống ký sinh bề mặt niêm mạc ruột non tá tràng, thấy đường dẫn mật túi mật Chúng hoạt động 43 Từ kết Bảng 3.4 (phụ lục) Hình 3.5 cho thấy tỷ lệ dương tính Giardia lamblia mức độ tẩy giun không thường xuyên 26,79% gấp 2,45 lần so với tỷ lệ dương tính mức độ tẩy giun thực thường xuyên 10,94% Từ rút kết luận rằng: định kỳ tẩy giun yếu tố có ảnh hưởng quan trọng đến khả nhiễm bệnh ký sinh trùng đơn bào Giardia lamblia gây bò nuôi Ninh Hòa – Khánh Hòa 3.2.2 Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm thông qua diện cầu trùng (Coccidia): Kết xét nghiệm ELISA khảo sát tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo mức độ tẩy giun định kỳ thể qua biểu đồ Hình 3.6 Hình Tỷ lệ mẫu dương tính Giardia lamblia thông qua diện cầu trùng Theo kết xét nghiệm từ Bảng 3.5 (phụ lục) Hình 3.6 với kết âm tính cầu trùng cho kết dương tính Giardia 16,35% gấp 1,36 lần so với kết dương tính cầu trùng lại dương tính với Giardia 12% Tổng tỷ lệ nhiễm cầu trùng 184 mẫu phân thu 13,59% thấp 1,15 lần so với tổng tỷ lệ nhiễm Giardia Kết cho thấy tỷ lệ nhiễm cầu trùng nhiễm Giardia lamblia bò nuôi Ninh Hòa – Khánh Hòa xấp xỉ Do đó, diện cầu trùng khẳng định xuất lây nhiễm bệnh đơn bào Giardia lamblia bò 44 3.2.3 Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm Giardia thông qua diện giun tròn (Strongyles): Kết thí nghiệm ELISA khảo sát tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia thực thông qua mục tiêu nghiên cứu diện giun tròn (Strongyles) bò nuôi Ninh Hòa – Khánh Hòa trình bày Bảng 3.6 (phụ lục) Hình 3.7: Hình Tỷ lệ mẫu dương tính Giardia thông qua diện giun tròn Từ kết Bảng 3.6 (phụ lục) Hình 3.7 trình bày tỷ lệ dương tính giun tròn (Strongyles) 16,30% xấp xỉ (1,03 lần) với tổng tỷ lệ dương tính Giardia 184 mẫu phân thu (15,76%) Tỷ lệ dương tính với giun tròn cho kết dương tính Giardia 20% xấp xỉ 1,34 lần với tỷ lệ âm tính với giun tròn cho kết dương tính Giardia 14,94% Có thể kết luận rằng: Sự diện giun tròn có khả gây lây nhiễm Giardia lamblia bò nuôi Ninh Hòa – Khánh Hòa 45 3.2.4 Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm Giardia theo độ lớn chuồng/trại chăn nuôi: Kết xét nghiệm ELISA khảo sát tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo độ lớn chuồng/trại chăn nuôi thể Bảng 3.7 (phụ lục) Hình 3.8: Hình Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo độ lớn chuồng/trại nuôi Từ kết trình bày Bảng 3.7 (phụ lục) Hình 3.8 thấy tỷ lệ nhiễm Giardia độ lớn 500 cao chiếm 29,69% (19 mẫu dương tính tổng số 64 mẫu thu nhận) Trong độ lớn 50 chiếm 6,5% (7 mẫu dương tính tổng số 108 mẫu thu nhận) thấp tỷ lệ nhiễm độ lớn 500 4,57 lần Đối với độ lớn 50 – 500 tỷ lệ nhiễm chiếm 25% gần xấp xỉ với độ lớn 500 1,19 lần, nhiên lại cao gấp 3,85 lần so với tỷ lệ nhiễm độ lớn 50 Từ bảng số liệu kết luận rằng: độ lớn chuồng/trại cao tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia lớn 3.2.5 Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm Giardia theo tần suất cho ăn cỏ tự nhiên: Kết khảo sát tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia phương pháp ELISA theo tần suất cho ăn cỏ tự nhiên trình bày Bảng 3.8 (phụ lục) Hình 3.9: 46 Hình Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo tần suất cho ăn cỏ tự nhiên Từ kết thể Bảng 3.8 Hình 3.9 cho thấy với tần suất cho ăn cỏ tự nhiên thường xuyên tỷ lệ nhiễm chiếm 27,54% cao 3,17 lần so với tần suất cho ăn cỏ tự nhiên không thường xuyên (8,7%) Từ kết luận, việc cho ăn cỏ tự nhiên yếu tố nguy gây nên bệnh lây nhiễm Giardia lamblia bò nuôi Ninh Hòa – Khánh Hòa 3.2.6 Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm Giardia theo loại sàn chăn nuôi: Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo loại sàn chăn nuôi thể Bảng 3.9 (phụ lục) Hình 3.10: Hình 10 Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo loại sàn chăn nuôi Từ kết Hình 3.10 Bảng 3.9 (phụ lục) cho thấy tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo loại sàn có khác biệt lớn: Loại sàn bê tông chiếm tỷ lệ nhiễm 47 13,84% (tương đương 22 mẫu dương tính tổng số 159 mẫu thu nhận), loại sàn có cát chiếm tỷ lệ cao 28% (7 mẫu dương tính tổng số 25 mẫu thu nhận) gấp 2,02 lần so với loại sàn bê tông Đối với loại sàn có cát trộn lẫn rơm mẫu thu nhận Từ đó, ta nhận định loại sàn chăn nuôi nguy gây nên lây nhiễm Giardia lamblia bò nuôi Ninh Hòa – Khánh Hòa Loại sàn cát có khả gây lây nhiễm Giardia lamblia so với loại sàn bê tông 3.2.7 Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm Giardia theo tần suất làm chuồng/trại chăn nuôi: Kết khảo sát tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo tần suất làm chuồng trại chăn nuôi thể Hình 3.11 Bảng 3.10 (phụ lục) Hình 11 Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo tần suất làm chuồng trại chăn nuôi Từ kết khảo sát tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo tần suất làm chuồng trại chăn nuôi Bảng 3.10 (phụ lục) Hình 3.11 cho thấy tỷ lệ dương tính Giardia với tần suất hàng ngày (8,4%) thấp 4,04 lần so với tần suất làm (33,96%) Có thể nhận định rằng: Với mức độ làm thường xuyên tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia bò giảm đáng kể Tần suất làm chuồng trại chăn nuôi yếu tố dẫn đến lây nhiễm Giardia lamblia 48 3.2.8 Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo tính chất địa lý vùng chăn nuôi: Kết xét nghiệm tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo tính chất địa lý vùng chăn nuôi khác trình bày Hình 3.12 Bảng 3.11 (phụ lục) Hình 12 Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo tính chất địa lý vùng chăn nuôi Từ kết thể Hình 3.12 Bảng 3.11 (phụ lục) cho thấy tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia vùng địa lý khác khác Ở vùng duyên hải tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia (22,22%) cao so với vùng núi (15,06%) 1,5 lần Có thể nhận thấy tính chất vùng địa lý yếu tố nguy gây lây nhiễm Giardia lamblia bò 3.3 Kết thực phản ứng PCR chạy điện di gel Agarose nhằm giám định chủng đơn bào Giardia lamblia: Sử dụng – 5µl dịch chiết DNA tổng số tách chiết từ mẫu nhiễm dương tính Giardia với cường độ cao phát phương pháp ELISA bảo quản nhiệt độ -20oC để thực phản ứng Nested PCR nhằm định danh đơn bào Giardia lamblia mẫu xét nghiệm PCR công cụ giúp phát nhanh xác mầm bệnh vi sinh vật, ký sinh trùng thủy sản, thú y kể người Với phương pháp PCR cần khoảng ngày nhanh chóng phát đơn bào ký sinh trùng Giardia lamblia, mà kết lại xác, DNA Giardia lamblia bắt cặp với cặp mồi đặc hiệu vạch vị trí 511bp Cũng tương tự đề tài Nguyễn Trúc Phương 49 (2008) dùng phương pháp PCR để xác định kết định danh E ictaluri, cho kết nhanh xác Đề tài ứng dụng phương pháp Nested PCR để phát ký sinh trùng đơn bào Giardia lamblia nhằm kiểm tra tính xác kết định danh phương pháp sinh hóa truyền thống góp phần vào việc chuẩn hóa phương pháp nghiên cứu bệnh Giardia lamblia gây người động vật 511bp 500bp Hình 13 Kết điện di sản phẩm Nested PCR phát định danh đơn bào ký sinh trùng Giardia lamblia Kết phản ứng Nested PCR mẫu tách chiết DNA tổng số từ mẫu phân xét nghiệm phương pháp ELISA trình bày Bảng 3.2 (phụ lục) Hình 3.3 Từ kết Bảng 3.2 (phụ lục) Hình 3.3 cho thấy 22 mẫu DNA thực phản ứng PCR chạy điện di gel Agarose có 20 mẫu dương tính vạch vị trí 511bp Còn lại đối chứng âm mẫu không vạch Đúng theo kết nghiên cứu Caccìo (2002) Hopskins (1997) cho kết phát Giardia lamblia vị trí 511bp Chú thích: - Giếng M: thang đo DNA (Marker) - Giếng N: đối chứng âm - Giếng – 22: Mẫu DNA tách chiết từ chủng Giardia Kết quả: 50 - Có diện ký sinh trùng đơn bào Giardia lamblia 20 mẫu xét nghiệm (ký hiệu mẫu 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 10,11, 14, 15,16,18, 30, 36, 38, 44, 52,53,62) tổng số 22 mẫu thực Nested PCR chạy điện di, tỷ lệ dương tính 90,91% - Giếng đối chứng âm không lên vạch chứng tỏ phản ứng không bị nhiễm tạp - Vạch 511bp mờ vị trí mẫu thứ 17 19 (ký hiệu mẫu 36 44) hàm lượng DNA chiết tách không đủ Như vậy, kết giám định phản ứng Nested PCR cho thấy, chủng đơn bào Giardia phân lập dựa phương pháp ELISA phù có 90,91% Giardia lamblia (syn G duodenalis, G intestinalis) Từ cho thấy kết hai phương pháp kiểm tra sinh hóa ELISA phù có mức độ xác 90,91% 51 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận: Bệnh lây nhiễm Giardia lamblia khảo sát bò huyện Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa cho thấy tỷ lệ nhiễm khảo sát phương pháp ELISA 15,76%, phương pháp phù tỷ lệ nhiễm khảo sát 12,50% Từ cho thấy, phương pháp ELISA có độ nhạy cao so với phương pháp phù Bằng phương pháp xét nghiệm ELISA xác định yếu tố nguy có khả gây bệnh lây nhiễm Giardia lamblia sau: - Định kỳ tẩy giun mức độ thường xuyên cho kết dương tính Giardia lamblia 10,94%, mức độ không thường xuyên 26,79% - Sự diện giun tròn (Strongyles) cho kết dương tính Giardia diện giun tròn 14,94%, có diện giun tròn tỷ lệ dương tính Giardia cho kết 20% - Độ lớn chuồng nuôi cho kết tỷ lệ dương tính độ lớn 500 29,69%, độ lớn 50 – 500 25% độ lớn 50 cho kết tỷ lệ dương tính thấp chiếm 6,5% - Tần suất cho bò ăn cỏ tự nhiên không ăn thường xuyên cho kết dương tính Giardia 8,7% ăn cỏ thường xuyên 27,5% - Tần suất làm chuồng/trại chăn nuôi cho kết dương tính Giardia lamblia với tần suất làm hàng ngày 8,4% tần suất không làm lại lên đến 33,96% - Tỷ lệ dương tính với Giardia lamblia theo tính chất địa lý vùng chăn nuôi khác nhau: với vùng duyên hải tỷ lệ dương tính cho kết 22,22% với vùng núi tỷ lệ dương cho kết 15,06% - Với mục tiêu nghiên cứu loại sàn chăn nuôi có ảnh hưởng quan trọng đến tỷ lệ lây nhiễm Giardia lamblia: với loại sàn bê tông cho kết dương tính 13,84%, loại sàn cát kết dương tính cao với tỷ lệ 28% Kết dương tính Giardia xác định phản ứng ELISA phương pháp phù cho kết quả: biểu bệnh lây nhiễm Giardia lamblia triệu chứng bò bị tiêu chảy 52 Các chủng Giardia giám định định danh thành công với tỷ lệ 90,91% phương pháp Nested PCR 4.2 Kiến nghị: Bệnh lây nhiễm đơn bào ký sinh trùng Giardia lamblia xảy nhiều huyện tỉnh thành nước, nhiên, nghiên cứu bệnh ký sinh trùng hạn chế Do đó, cần thực nhiều đợt khảo sát tỷ lệ nhiễm giám định chủng ký sinh trùng nhiều tỉnh thành nhiều đối tượng nhiễm bệnh khác để đưa phương pháp điều trị phòng bệnh cách, kịp thời cho gia súc người 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Phạm Giang Anh (2012), Khảo sát thành phần tỷ lệ loại ký sinh trùng sốt rét huyện Bù Đăng, tỉnh Bình Phước ký thuật nhuộm Giem – sa Nested PCR, Luận văn thạc sĩ Sinh học Chuyên ngành Vi sinh vật học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh Lê Thị Ngọc Dung (2012), Định danh loài Gnathostoma sp phương pháp PCR nghiên cứu giai đoạn phát triển ấu trùng Gnathostoma sp ký chủ trung gian, Đồ án tốt nghiệp Ngành Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học Môi trường, Đại học Nha Trang Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003), Giáo trình Sinh học phân tử, Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương, (2006), Giáo trình Miễn dịch học ứng dụng, Nhà xuất Nông nghiệp Phạm Sĩ Lăng; Phan Địch Lân, Bệnh ký sinh trùng gia súc biện pháp phòng trị, Nhà xuất Nông Nghiệp Phan Lục (2005), Giáo trình Bệnh ký sinh trùng thú y, Nhà xuất Hà Nội Trần Quang Minh; Nguyễn Văn Tĩnh (2005), Điều tra tình trạng nhiễm giun sán ký sinh heo tỉnh An Giang, Luận văn tốt nghiệp Ngành Phát triển nông thôn, Khoa Nông nghiệp – Tài nguyên thiên nhiên, Đại học An Giang Phạm Văn Thân; Hoàng Tân Dân; Phạm Hoàng Thế; Trương Thị Kim Phượng, Phan Thị Hương Liên (2007), Ký sinh trùng, Nhà xuất Giáo Dục TÀI LIỆU THAM KHẢO NƯỚC NGOÀI Brain J.Ford (2005), The Discovery of Giardia, Gonville and Caius College, University of Cambridge, UK, Microscope, 53(4) 10 College of Veterinary Medicine Iowa State University Ames, Iowa 50011; (2012); Giardiasis, Giardia Enteritis, Lambliasis, Beaver Fever 11 Enedina Jiménez – Cardoso, Leticia Eligio – García, Adrian Cortés – Campos and Apolinar Cano – Estrada (2012), Genotyping of Giardia intestinalis Isolates from Dogs by Analysis of gdh, tpi, and bg Genes, Laborratorio de Investigacíon en Parasitologiá, Hospital Infantil de México Federico Gómez, México, D.F Mexico, Intech open science/ open minds 12 Leticia Eligio – Garcia, Cortés – Campos Adrian, Cano – Estrada Apolinar, Jiménez – Cardoso Êndina (2013), Assemblages of Giardia đuoenalis Isolates from Dogs by 54 Amplification and Restriction of tpi and β-Giardin Genes and Sequencing of SSU rDNA Gene, Laboratorio de Investigacíon en Parasitologiá, Children Hospital of México, México D.F, México – Open Journal of Veternary Medicine, 3, 222 – 227 13 Marco Lalle, Edoardo Pozio, Gioia Copelli, Fabrizio Bruschi, Daniele Crotti, Simone M Caccìo (2004); Genetic heterogeneity at the β-Giardin locus among human and animal isolates of Giardia duodenalis and identification of potentially zoonotic subgenotypes, International Journal for Parasitology, 35, 207 – 213 14 Nantulya, V.M., Lindquist, K.J., Dlall, O and Olaho – Mukani (1989), Two simple antigen – detection enzyme immunoassays for the diagnosis of Trypanosoma evansi infections in the dromedary camel (Camelus dromedarius), Tropical Medicine and Parasitology 40 (755) 415 – 418 15 Tech Lab, 2001 Kraft Crive Blacksburg, VA 24060-6358 USA (2013), A Monoclonal ELISA for Detecting Giardia lamblia Antigen in Fecal Specimens, Catalog No 30405 (96 Test), Made in USA 16 Yaoyu Feng and Lihua Xiao (2011), Zoonotic Potentail and Molecular Epidemiology of Giardia Spacies and Giardiasis, Clinical Microbiology Reviews, 24, 110 – 140 TÀI LIỆU NGUỒN LINK THAM KHẢO TRÊN INTERNET 17 http://web.stanford.edu/group/parasites/ParaSites2006/Giardiasis/lifecycle.htm 18 http://www.cdc.gov/dpdx/giardiasis/ 55 PHỤ LỤC Bảng Tỷ lệ nhiễm đơn bào Giardia lamblia 184 mẫu phân xét nghiệm theo phương pháp phù Biến số Trạng Không thái đối tiêu chảy tượng Dương Âm Tổng Tỷ lệ dương tính tính số tính (%) 18 144 162 11,11% 17 22 22,73% 23 161 184 12,50% Tiêu chảy thu mẫu Tổng cộng Bảng Tỷ lệ nhiễm đơn bào Giardia lamblia theo phương pháp ELISA Dương tính (Pos) Âm tính (Neg) 29 155 Tổng số (Total) Tỷ lệ dương tính (%) 184 15,76% Bảng 3 Tỷ lệ nhiễm đơn bào Giardia lamblia theo trạng thái đối tượng thu mẫu Biến số Trạng thái Không tiêu đối tượng chảy thu mẫu Tiêu chảy Tỷ lệ Dương tính Âm tính Tổng số (Pos) (Neg) (Total) 20 143 162 12,35% 13 22 40,91% dương tính (% Pos) Bảng 4.Kết xét nghiệm ELISA tỷ lệ nhiễm Giardia mức độ tẩy giun theo định kỳ Biến số Định Không thường kỳ tẩy xuyên giun Thường xuyên Dương Âm tính tính (Pos) (Neg) 15 41 46 26,79% 14 114 128 10,94% Tổng số Tỷ lệ dương tính 56 Bảng Tỷ lệ dương tính Giardia thông qua diện cầu trùng Dương tính Âm tính Tổng số Tỷ lệ dương (Pos) (Neg) (Total) tính (% Pos) Âm tính với cầu trùng 26 133 159 16,35% Dương tính với cầu trùng 22 25 12% Biến số Bảng Tỷ lệ nhiễm Giardia thông qua diện giun tròn Tỷ lệ Biến số Dương tính Âm tính Tổng số Âm tính với Strongyles 23 131 154 14,94% Dương tính với Strongyles 24 30 20% dương tính Bảng Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo độ lớn chuồng/trại chăn nuôi Biến số Dương tính Âm tính Tổng số Tỷ lệ dương (Pos) (Neg) (Total) tính (%Pos) 19 45 64 29,69% 12 25% 101 108 6,5% Trên 500 Độ lớn chuồng/trại 50 – 500 chăn nuôi Dưới 50 Bảng Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo tần suất cho ăn cỏ tự nhiên Dương Biến số Tổng số 10 105 115 8,7% 19 50 69 27,54% tính Tần suất Không thường cho ăn cỏ xuyên tự nhiên Thường xuyên Tỷ lệ Âm tính dương tính Bảng Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia theo loại sàn chăn nuôi Biến số Dương tính Âm tính Tổng số Tỷ lệ dương tính Loại sàn Bê tông 22 137 159 12,84% chăn nuôi Chỉ có cát 18 25 28% 57 Cát trộn lẫn rơm 0 0 Bảng 10 Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia dựa theo tần suất làm chuồng/trại Biến số Dương tính Âm tính Tổng số Tỷ lệ dương tính 18 35 53 33,96% 11 120 131 8,4% Dọn phân hàng Tần ngày suất không bao làm làm sạch Dọn phân làm hàng ngày Bảng 11 Tỷ lệ nhiễm Giardia lamblia dựa tính chất địa lý vùng chăn nuôi Biến số Tính chất Vùng duyên địa lý vùng hải chăn nuôi Vùng núi Dương tính Âm tính Tổng số Tỷ lệ dương tính 14 18 22,22% 25 141 166 15,06%