PHÂN TÍCH GEN GÂY BỆNH GREENING DO VI KHUẨN CANDIDATUS LIBERIBACTER GÂY RA TRÊN HỌ CÓ MÚI Bệnh vàng lá greening hay còn gọi là bệnh hoàng long, bệnh vàng lá trầu...do vi khuẩn Liberobacter asiaticum gây ra. Bệnh lây lan qua cành chiết và mắt ghép lấy từ cây bị bệnh để nhân giống. Trên đồng ruộng, rầy chổng cánh (Diaphorina citri) là môi giới truyền bệnh từ cây bị bệnh sang cây khoẻ. Bệnh vàng lá gân xanh trên cây có múi (greening) do vi khuẩn Liberobacter asiatus gây nên có rầy chổng cánh làm trung gian truyền bệnh được ghi nhận đầu tiên vào năm 1900 ở Trung Quốc (gọi là bệnh Huang longbin hay còn gọi là Hoàng Long, bệnh chụp vàng) và lây lan gây thiệt hại nặng cho những người trồng cam trên toàn thế giới. Tại Việt Nam, bệnh được Viện Nghiên cứu cây ăn quả miền Nam quan tâm đặc biệt và đã xây dựng nên quy trình SX giống cây có múi sạch bệnh. Tuy nhiên hiệu quả của những giải pháp trên không cao vì cây giống chỉ sạch bệnh trong nhà lưới nhưng sẽ bị nhiễm khi trồng đại trà ngoài đồng. Việc trồng xen cây có múi với cây ổi cũng được ghi nhận là hạn chế được sự xâm nhập của rầy chổng cánh, trung gian truyền bệnh Greening. Tại vùng cam Florida, thủ phủ cây có múi của Hoa Kỳ, bệnh Greening được phát hiện nào năm 1998, năm mà sản lượng ngành công nghiệp nước cam ép của Floria đạt đỉnh cao nhất trong lịch sử với 1,56 tỷ galon. Từ đó đến nay, sản lượng cứ liên tục bị giảm sút và hiện tại chỉ còn 0, 862 tỷ galon. Sự giảm sản lượng này được lý giải bằng nhiều nguyên nhân, trong đó có nguyên nhân quan trọng là do bệnh Greening tấn công. Diện tích vườn cam ở phía Nam Florida bị giảm tới 25%. Do SX bị giảm sút nên thị trường nước cam ép của Hoa Kỳ đang dần về tay Brazin với con số 200 triệu galonnăm. Tuy chưa có một báo cáo chính thức thiệt hại của bệnh, nhưng ở Philippines người ta đánh giá mức độ nhiễm lên đến 7 triệu CCM. Thái Lan có khoảng 95% cây bị nhiễm bệnh ở các tỉnh phía Bắc và Đông, nhiều nước khác cũng cho thấy kết quả thiệt hại của Greening ( Đài loan 1951, Châu phi 1947…)
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHỊ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
BÀI BÁO CÁO MÔN SINH TIN HỌC
PHÂN TÍCH GEN GÂY BỆNH GREENING DO VI KHUẨN
CANDIDATUS LIBERIBACTER GÂY RA TRÊN HỌ CÓ MÚI
GVHD: PHẠM DUY LÃM
SINH VIÊN:
MSSV:
NĂM HỌC: 2014 - 2015
Trang 2LỜI CÁM ƠN
Lời đầu tiên chúng em xin cám ơn ban giám hiệu trường đại học nông lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện để sinh viên chúng em có một môi trường học tập thoải mái về cơ sở vật chất cũng như cơ sơ hạ tầng
Em cảm ơn bộ môn công nghệ sinh học đã giúp chúng em mở mang kiến thức, giúp chúng em hiểu sâu hơn đến lĩnh vực khoa học và công nghệ Đặc biệt là chúng
em được bổ sung thêm nhiều kiến thức trong lĩnh vực công nghệ sinh học, là một trong những lĩnh vực đang nhiều nhà nghiên cứu khoa học quan tâm
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy Phạm Duy Lãm đã dạy chúng em một cách tận tình, giúp chúng em hiểu rõ ứng dụng tin học trong nghiên cứu sinh học Trong đó, giúp em sử dụng được những phần mền thiết kế mồi cũng như xây dựng cây di truyền… Thầy đã tận tình chỉ dạy và hướng dẫn chúng em trong các giờ lý thuyết cũng như thực hành trong suốt học phần sinh tin học
Qua bài học lý thuyết ở trên giảng đường và trong các buổi thực hành đã cho
em thêm nhiều kiến thức, đó là những kho tàng tri thức sẽ giúp ích cho em rất nhiều trong cuộc sống, quá trình học tập cũng như trong tương lai
Em xin chân thành cảm ơn!
Trang 3Mục lục
LỜI CÁM ƠN 2
1 Tổng quan 4
1.1 Giới thiệu 4
1.2 Tim kiếm trình tự gen bằng công cụ FASTA trên NCBI 6
1.3 Dựng cây phân loài cho Candidatus Liberubacter (CKC) trên Taxonomy 7 2 Ứng dụng các phần mềm trong sinh tin học 9
2.1 Tìm các cặp tương đồng bằng ma trận trên Bioedit 9
2.2 Thiết kế mồi cho vùng bảo tồn bằng Bioedit 11
2.3 Chạy multiplex phát hiện các chủng Candidatus Liberibacter 14
2.4 Phần mềm Mege 4.1 17
TÀI LIỆU TTHAM KHẢO 22
Mục lục bảng: Hình 1.1.1: Đặc trưng của bệnh grenning ở lá chanh, bưởi 8
Hình 1.1.2: Rầy Bactericera cockerelli mang vi khuẩn gây bệnh khoai tây 8
Hình 1.2.1: Các lệnh cần chọn để tiềm kiếm trình tự theo tên 9
Hình 1.2.2 chọn trình tự và FASTA 9
Hình 1.2.3: Một đoạntrình tự gen của Liberibacter africanus được tìm thấy (nên lưu trình tự gene vào notepad) 9
Hình 1.3.1: bước 1 nhập các ID của từng loài vào và click vào tìm kiếm 10
Hình 1.3.2: bước 2 cào display setting chọn common tree → apply 10
Hình 1.3.3: so sánh sự phân loài qua cây phân loại 11
Hình 2.1.1: Các trình tự gen của các chủng CKC được load lên bioedit 12
Hình 2.1.2: Tìm vùng bảo tồn của gen CKC 12
Hình 2.1.3: Kết quả xuất hiện vùng tương đồng và kết quả chạy ClustalW (ẩn) 12
Hình 2.1.4: Ma trận ở dạng file của bioedid 13
Hình 2.1.5: Kết quả ma trận qua excel 13
Hình 2.2.1: thiết kế mồi cho vùng bảo tồn số 6 15
Hình 2.2.2: Kết quả thiết kế mồi cho vùng bảo tồn số 6 15
Hình 2.2.3: kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của mồi 15
Hình 2.3.1: cố định mồi ngược cho chủng Candidatus Liberibacter africanus, Liberibacter crescens, Candidatus Liberibacter europaeus 17
Trang 4Hình 2.3.3: vị trí mồi xuôi Candidatus Liberibacter europaeus từ 60 – 80bp 17
Hình 2.3.4: vị trí mồi xuôi của Liberibacter crescens từ 520 đến 450 bp 18
Hình 2.3.5: 18
Hình 2.3.6: Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi xuôi Candidatus Liberibacter africanus 19
Hình 2.3.7: kết quả kiểm độ đặc hiệu của mồi xuôi Candidatus Liberibacter europaeus 19
Hình 2.3.8:Kết quả kiểm tra mồi xuôi của Liberibacter crescens 19
Hình 2.3.7: kết quả kiểm tra mồi mồi xuôi Candidatus Liberibacter asiaticus 20
Hình 2.4.1.1: giao diện chính của phần mềm MEGA4.1 20
Hình 2.4.1.2: Chèn trình tự DNA vào MEGA 4 21
hình 2.4.1.3: Đặt tên tiêu ddeeef thông tin và không phân tích protein 21
Hình 2.4.1.4: Bảng trình tự DNA của Candidatus Liberibacter trên Mega 4 21
Hình 2.4.1.5: Click vào compute để tạo cây di truyền 22
Hình 2.4.1.5: Cây di truyền của các loài thuộc Candidatus Liberibacter dạng phân tích hình cây 22
Hình 2.4.2.1 khoảng cách di truyền của các Candidatus Liberibacter 23
Trang 51 Tổng quan
1.1 Giới thiệu
Bệnh vàng lá greening hay còn gọi là bệnh hoàng long, bệnh vàng lá trầu do vi khuẩn Liberobacter asiaticum gây ra Bệnh lây lan qua cành chiết và mắt ghép lấy từ cây bị bệnh để nhân giống Trên đồng ruộng, rầy chổng cánh (Diaphorina citri) là môi giới truyền bệnh từ cây bị bệnh sang cây khoẻ
Bệnh vàng lá gân xanh trên cây có múi (greening) do vi khuẩn Liberobacter asiatus gây nên có rầy chổng cánh làm trung gian truyền bệnh được ghi nhận đầu tiên vào năm 1900 ở Trung Quốc (gọi là bệnh Huang longbin hay còn gọi là Hoàng Long, bệnh chụp vàng) và lây lan gây thiệt hại nặng cho những người trồng cam trên toàn thế giới
Tại Việt Nam, bệnh được Viện Nghiên cứu cây ăn quả miền Nam quan tâm đặc biệt và đã xây dựng nên quy trình SX giống cây có múi sạch bệnh Tuy nhiên hiệu quảcủa những giải pháp trên không cao vì cây giống chỉ sạch bệnh trong nhà lưới nhưng
sẽ bị nhiễm khi trồng đại trà ngoài đồng Việc trồng xen cây có múi với cây ổi cũng được ghi nhận là hạn chế được sự xâm nhập của rầy chổng cánh, trung gian truyền bệnh Greening
Tại vùng cam Florida, thủ phủ cây có múi của Hoa Kỳ, bệnh Greening được pháthiện nào năm 1998, năm mà sản lượng ngành công nghiệp nước cam ép của Floria đạtđỉnh cao nhất trong lịch sử với 1,56 tỷ galon Từ đó đến nay, sản lượng cứ liên tục bị giảm sút và hiện tại chỉ còn 0, 862 tỷ galon Sự giảm sản lượng này được lý giải bằng nhiều nguyên nhân, trong đó có nguyên nhân quan trọng là do bệnh Greening tấn công Diện tích vườn cam ở phía Nam Florida bị giảm tới 25% Do SX bị giảm sút nên thị trường nước cam ép của Hoa Kỳ đang dần về tay Brazin với con số 200 triệu galon/năm
Tuy chưa có một báo cáo chính thức thiệt hại của bệnh, nhưng ở Philippines người ta đánh giá mức độ nhiễm lên đến 7 triệu CCM Thái Lan có khoảng 95% cây
bị nhiễm bệnh ở các tỉnh phía Bắc và Đông, nhiều nước khác cũng cho thấy kết quả thiệt hại của Greening ( Đài loan 1951, Châu phi 1947…)
Đặc điểm phát sinh và gây hại của bệnh
Bệnh gây hại trên tất cả các giống cây có múi Tuy nhiên bệnh thường gây hại nặng trên các giống quýt, cam Sành, cam Vân Du, cam sông Con và cam Xã Đoài Trên bưởi và quất bệnh nhẹ hơn
Nhân giống bằng vật liệu như: cành chiết, mắt ghép lấy từ cây bị bệnh tạo điềukiện thuận lợi cho bệnh lây lan nhanh và xuất hiện sớm trên vườn cây Tại các vùngcam có nhiều cây bị bệnh và nhiều rầy chổng cánh thì bệnh lây lan càng nhanh và bịbệnh càng nhiều
Trang 6Bón phân đạm nhiều và bón rải rác để trên cây lúc nào cũng phát lộc tạo điềukiện thu hút rầy chổng cánh đến chích hút và lây bệnh Vườn cam quýt để um tùm hay
ít đốn tỉa bệnh thường nhiều hơn và nặng hơn
Triệu chứng của bệnh
Bệnh gây hại trên tất cả các giống: cam, quýt, chanh, bưởi, v.v Mới đầu bệnhhại trên từng cành sau đó lan dần ra cả cây Lá bị bệnh có mầu vàng loang lổ Lá nhỏlại và thường bị lệch tâm.Quả bị bệnh nhỏ, chậm phát triển và cũng bị lệch tâm Khi
bổ quả bị bệnh thường thấy hạt bị lép Quả từ cây bị bệnh khi chín thường loang lổmầu xanh, vàng xen kẽ Trong khi quả từ trên các cây không bị bệnh có mầu vàngtươi Cây bị bệnh nặng thường thấy hiện tượng ra hoa trái vụ Các cành lá vàng và khôdần cả cành, rồi khô đi Chính vì thế nhiều nơi gọi bệnh này là hiện tượng cây khô lávàng
Vi khuẩn Liberibacter được xác định là tác nhân gây nên bệnh vàng lá Greening
cho cn ác cây cam quýt Loài vi khuẩn này thường sống trong mạch dẫn của cây Các vườn cam quyt đều có nguy cơ nhiễm bệnh cao, nhưng không dễ dàng trong việc chuẩn đoán bệnh qua các triệu chứng thông thường Khi một cây biểu hiện bệnh thì cóthể bệnh đã lây lan sang cây khác Ở Việt Nam, bệnh vàng lá Greening đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất cũng như chất lượng quả đãn đến thiệt hại về kinh
tế đã có nhiều nghiên cứu nhằm đưa ra phương pháp phát hiện nhanh và sớm bệnh Greening Hiện nay, phương pháp dùng PCR để chuẩn đoán bệnh bệnh cho cây được
áp dụng nhiều một số tác giả đã áp dụng phương pháp PCR để phát hiện vi khuẩn
Liberibacter
Candidatus Liberibacter là một vi khuẩn gram âm trong họ Rhizobiaceae Thuật ngữ Candidatus được sử dụng để chỉ ra rằng nó đã không chứng minh khả năng duy
trì vi khuẩn này Phát hiện của các liberibacters được dựa trên sự khuếch đại PCR của
họ gen 16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu.Các thành viên của chi là tác nhân gây bệnh chủ yếu lây truyền qua rầy Các chi ban đầu được viết Liberobacter
Candidatus liberibacter có các biến thể sau:
Liberibacter africanus - Có nguồn gốc ở châu Phi và một tác nhân của
Huanglongbing , còn được gọi là bệnh greening và vectored bởi các cam quýt rầy
Phierytreae Trioza
Liberibacter americanus - Một loài mới từ Brazil mô tả vào năm 2005 và kết
hợp với Huanglongbing , còn được gọi là bệnh greening
Liberibacter asiaticus - Có nguồn gốc ở châu Á và một tác nhân của
Huanglongbing, còn được gọi là bệnh greening và vectored bởi các cam quýt rầy
Diaphorina citri Á.
Trang 7Hình 1.1.1: Đặc trưng của bệnh grenning ở lá chanh, bưởi
Liberibacter europaeus - Một loài mới được mô tả vào năm 2010, được tìm thấy trong quả lê cây mà nó dường như không gây triệu chứng và vectored do rầy Cacopsylla
Liberibacter psyllaurous - Một loài mới được mô tả vào năm 2008 từ họ cà cây
chủ khoai tây và cà chua Liberibacter psyllaurous đóng một vai trò kép như một
tác nhân gây bệnh và vi khuẩn như vi khuẩn cộng sinh di truyền Vật cộng sinh này sửa đổi bảo vệ cà chua có lợi cho bản thân và vector rầy của nó
Liberibacter solanacearum - Một tác nhân gây bệnh sọc vằn nâu ở khoai tây và
cà chua
Liberibacter crescens - phân lập từ quả đu đủ trồng ở Puerto Ric
Hình 1.1.2: Rầy Bactericera cockerelli mang vi khuẩn gây bệnh khoai tây
1.2.Tim kiếm trình tự gen bằng công cụ FASTA trên NCBI
Bước 1: trên NCBI chọn 1 trong 3 lệnh: nuclectide, gebe, protein Nhập tên loàicần tìm và tiềm kiếm
Trang 8Hình 1.2.1: Các lệnh cần chọn để tiềm kiếm trình tự theo tên.
Hình 1.2.2 chọn trình tự và FASTA
Bước 2: chọn trình tự và vào công cụ FASTA để tìm kiếm trình tự gen
Hình 1.2.3: Một đoạntrình tự gen của Liberibacter africanus được tìm thấy (nên lưu
trình tự gene vào notepad)
Sau khi tìm được trình tự nucleotide trong genbank thì nên lưu trình tự gene vàonotepad đuôi file là “.txt” để thuận tiện cho ứng dụng các phần mềm sinh tin khác
Tương tự cho các chủng khác, ta tìm được các trình tự nucleotide
1.3 Dựng cây phân loài cho Candidatus Liberubacter (CKC) trên Taxonomy
Trang 9Xanthomonas oryzae ATCC 35933 (ID: 1313303)thuộc Xanthomonas Oryzea
Hình 1.3.1: bước 1 nhập các ID của từng loài vào và click vào tìm kiếm
Hình 1.3.2: bước 2 cào display setting chọn common tree → apply
Trang 10Hình 1.3.3: so sánh sự phân loài qua cây phân loại
2 Ứng dụng các phần mềm trong sinh tin học
2.1 Tìm các cặp tương đồng bằng ma trận trên Bioedit
Mục đích: Lập bảng ma trận để tìm cặp tương đồng cao, từ đó tìm vùng bảo tồn của các cặp có độ tương đồng cao, loại trừ những cặp có độ tương đồng thấp Từ vùng bảo tồn chung sẽ tiến hành thiết kế mồi trong vùng bảo tồn chung đó
Cách làm
Bước 1: sử dụng đoạn gen được lấy trình tự dưới dạng FASTA (ở phần 1.2)đượclưu trong Notepad
Bước 2: Load các trình tự tìm được lên phần mềm Bioedit
File -> New Alignment→ File →Import →Sequence alignment file →chọncác file Notepad “.txt” đã tìm ở bước 1
Trang 11Hình 2.1.1: Các trình tự gen của các chủng CKC được load lên bioedit.
Bước 3: Chọn tất cả các trình tự dùng lệnh Accessory Application → ClustalW Multiple alignment → Run ClustalW → OK
Hình 2.1.2: Tìm vùng bảo tồn của gen CKC
Hình 2.1.3: Kết quả xuất hiện vùng tương đồng và kết quả chạy ClustalW (ẩn)
Bước 4: Dùng lệnh Alignment → Sequence I dentity Matrix → chọn nơi save file ma trận Mục đích: để tạo ma trận
Bước 5: Coppy ma trận qua excel để dễ dàng cho việc phân tích
Hình 2.1.4: Ma trận ở dạng file của bioedid
Trang 12Hình 2.1.5: Kết quả ma trận qua excel
(màu đỏ: chỉ số tương đồng cao nhất giữa Candidatus Liberibacter psyllaurous
và Liberibacter crescens, màu xanh chỉ số tương đồng cao thứ 2, màu vàng
cam có chỉ số tương đồng thấp nhất)
Từ hình trên cho ta thấy mức độ tương đồng của các chủng không cao Điểm
hình giữa giữa Candidatus Liberibacter psyllaurous và Liberibacter crescens có mức
độ khá cao Giữa chủng Candidatus Liberibacter africanus với Candidatus
Liberibacter europaeus và Candidatus Liberibacter africanus với Liberibacter
crescens thì tương đối cao.
2.2 Thiết kế mồi cho vùng bảo tồn bằng Bioedit
Độ tương đồng giữa các chủng của Candidatus Liberibacter tương đối thấp nên
chỉ thiết kế mồi cho các chủng Candidatus Liberibacter africanus, Liberibacter crescens, Candidatus Liberibacter europaeus và giữa Liberibacter crescens với Candidatus Liberibacter psyllaurous
Thiết kế mồi chung cho các chủng Candidatus Liberibacter africanus,
Liberibacter crescens, Candidatus Liberibacter europaeus
Bước 1: Load trình tự nucleotide của các chúng lên bioedit và cho chạy ClustalW (giống bước 2, bước 3 ở mục 2.1)
Bước 2: Bước 2: Dùng lệnh Alignment → Find Conserved Regions
→Start
Kết quả tìm được các cùng bảo tồn các chủng Candidatus Liberibacter
africanus, Liberibacter crescens, Candidatus Liberibacter europaeus sau:
21 conserved regions found
Region 1: Position 80 to 104
Consensus:
80 AACGCATGGAAACGTGTGCTAATAC 104
-Region 2: Position 133 to 150 Consensus: 133 ATTGGAGAGAGATGAGCC 150
-………
……….
Trang 13
-Region 6: Position 221 to 335
Consensus:
221
GATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGAC AATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCC 335
-Region 21: Position 1080 to 1140
Consensus:
1080 GCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGCTGGGCTACACACG 1140
Trang 14Hình 2.2.2: Kết quả thiết kế mồi cho vùng bảo tồn số 6
Kết quả thu được:
Mồi xuôi: CCACACTGGGACTGAGACAC
Mồi ngược: TTCTTCACTCACGCGGCAT
Bước 5: kiểm tra mồi bằng nucleotide vưa thiết kế
Hình 2.2.3: kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của mồi
Kết quả cho không tương thích với chủng đang cần thiết kê Nguyên nhân do độ dài vùng bảo tồn quá ngắn, nên không tạo ra đoạn mồi
Thiết kế mồi cho Liberibacter crescens và Candidatus Liberibacter
psyllaurous
Tương tự như phần trên ta có:
27 conserved regions found (27 vùng bảo tồn)
-Region 4: Position 221 to 335
Consensus:
Trang 15221
GATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGAC AATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCC 335
2.3 Chạy multiplex phát hiện các chủng Candidatus Liberibacter
Mục đích: Chạy multiplex nhằm thiết kế mồi đặc hiệu cho từng chủng / loài virus, vi khuẩn Từ đó, có thể phát hiện ra từng loài vi khuẩn Candidatus
Liberibacter từ cặp mồi thiết kế dựa trên trình tự sai khác gene giữa các chủng
Candidatus Liberibacter với nhau
Nguyên lý: Thiết kế mồi để phát hiện từng phân chủng, đầu tiên ta cần tìm vùng chung cho các chủng cần tìm, cố định mồi xuôi (20 - 22 nucleotide), mồi ngược dựa vào sự khác nhau giữa các chủng virus mà ta dịch chuyển sao cho phù hợp (20 - 22 nucleotide) Mỗi một cặp mồi sẽ giúp phát hiện cho từng phân chủng virus khác nhau Có thể làm một trong hai cách sau:
Cách 1: Giữ cố định mồi xuôi, thay đổi mồi ngược
Cách 2: Thay đổi mồi xuôi, cố định mồi ngược
Do vùng bảo tồn của các loài Candidatus Liberibacter rất ít nên chia theo
từng nhóm: Candidatus Liberibacter africanus, Liberibacter crescens,
Candidatus Liberibacter europaeus
Chạy multilex cho Candidatus Liberibacter africanus, Liberibacter
crescens, Candidatus Liberibacter europaeus
Bước 1: Load các trình tự các loài của Candidatus Liberibacter
Bước 2: Dùng lệnh Accessory Application -> ClustalW Multiple alignment
Bước 3: Chọn ô “View conservation by plotting identities to a standard as a dot” để xuất hiện các vùng gene tương đồng, từ đó có thể cố định mồi ngược (hình 2.15) vị trí 760 - 780 bp (21 nucleotide) để thiết kế mồi ngược cho 3
chủng (Candidatus Liberibacter africanus, Liberibacter crescens, Candidatus Liberibacter europaeus).