Báo cáo chuyên đề ứng dụng laser trong điều trị ung thư

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TPHCM KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN VẬT LÝ KỸ THUẬT Y SINH Báo cáo chuyên đề Tp Hồ Chí Minh, Tháng năm 2010 MỤC LỤC Mục lục Phần 1: LỜI NÓI ĐẦU Phần ĐẠI CƢƠNG VỀ UNG THƢ 2.1 Bản chất ung thƣ 2.2 Cơ chế bệnh sinh ung thƣ 2.3 Các tác nhân gây ung thƣ 2.4 Triệu chứng ung thƣ 2.5 Phân loại ung thƣ 2.6 Dịch tễ học ung thƣ Phần 3: CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ UNG THƢ HIỆN NAY .9 3.1 Y học cổ truyền .9 3.2 Y học đại .9 3.3 Các phƣơng pháp hỗ trợ điều trị ung thƣ 11 Phần 4: CƠ BẢN VỀ ỨNG DỤNG LASER TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ 12 4.1 Laser đặc tính ƣu việt điều trị 12 4.2 Các phƣơng pháp sử dụng laser công suất cao điều trị ung thƣ 13 4.3 Các loại laser sử dụng điều trị ung thƣ 13 4.4 Ƣu khuyết điểm việc sử dụng laser 13 Phần 5: LIỆU PHÁP QUANG ĐỘNG HỌC (Photodynamic Therapy - PDT) .14 5.1 Giới thiệu PDT .14 5.2 Cơ chế PDT việc tiêu diệt tế bào ung thƣ 14 5.3 Các chất nhạy quang dùng PDT 15 5.4 Tiến trình thực PDT 18 5.5 Ƣu điểm khuyết điểm PDT .18 Phần 6: ỨNG DỤNG LIỆU PHÁP QUANG ĐỘNG HỌC (PDT) ĐỂ TĂNG CƢỜNG HỆ MIỄN DỊCH TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ 19 6.1 Khái quát hệ miễn dịch 19 6.2 Ứng dụng liệu pháp quang động học (PDT) kích thích hệ miễn dịch nhằm điều trị ung thƣ 23 6.3 Thí nghiệm khảo sát tác dụng khác liệu pháp laser kích thích hệ miễn dịch điều trị khối u ung thƣ di đƣợc nghiên cứu chuột 29 Phần 7: KẾT LUẬN .38 Tài liệu tham khảo 39 Phần LỜI NÓI ĐẦU Từ trƣớc đến nay, ung thƣ bệnh vô nguy hiểm phổ biến nƣớc ta toàn giới, gây tử vong cho nhiều bệnh nhân Trong suốt chiều dài lịch sử y học, nhà y học không ngừng nghiên cứu để tìm nhiều phƣơng pháp điều trị ung thƣ nhƣ phẫu thuật, xạ trị, hóa trị … Những phƣơng pháp có hiệu điều trị cao đƣợc ứng dụng cho lọai ung thƣ khác Nhƣng bên cạnh đó, chúng gây ảnh hƣởng xấu đến khỏe ngƣời bệnh Chẳng hạn, phƣơng pháp hóa trị gây tác dụng phụ đến quan khác thể, xạ điện từ phƣơng pháp xạ trị có tác dụng ion hóa mạnh làm chết tế bào lành Trong bối cảnh đó, việc đề xuất phƣơng pháp điều trị ung thƣ gây tác dụng phụ đến bệnh nhân trở thành nhu cầu cấp thiết ngành ung thƣ học Trong tiến trình đáp ứng nhu cầu đó, phƣơng pháp ứng dụng laser điều trị ung thƣ đƣợc nghiên cứu ứng dụng số nƣớc có y học phát triển giới bƣớc đầu có thành tựu to lớn Việc ứng dụng laser điều trị ung thƣ đƣợc tiến hành qua hai liệu pháp Đó liệu pháp quang động học việc tiêu diệt tế bào ung thư liệu pháp ứng dụng laser tăng cường hệ miễn dịch thể điều trị ung thư Trong báo cáo này, cung cấp nhìn tồng quan hai phƣơng pháp ứng dụng laser điều trị ung thƣ nhƣ nói Theo đó, lần lƣợt trình bày vấn đề sau:  Đại cƣơng ung thƣ Phần cung cấp vấn đề bệnh ung thƣ, bao gồm chất, chế bệnh sinh, tác nhân gây bệnh, phân loại ung thƣ  Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ Phần trình bày liệu pháp phẫu thuật, xạ trị, hóa trị, bao gồm ƣu điểm khuyết điểm chúng  Cơ ứng dụng laser điều trị ung thƣ Phần trình bày tác dụng điều điều trị laser thông qua hiệu ứng sinh học xảy laser tƣơng tác với mô sống, ƣu khuyết điểm liệu pháp laser  Liệu pháp quang động học (Photodynamic Therapy - PDT) Phần tập trung trình bày tác dụng điều trị thứ PDT, tác dụng tiêu diệt trực tiếp tế bào ung thƣ hiệu ứng quang động học  Ứng dụng liệu pháp quang động học để tăng cƣờng hệ miễn dịch điều trị ung thƣ Phần trình bày tác dụng thứ hai PDT, tác dụng tăng cƣờng chức hệ miễn dịch PDT điều trị ung thƣ Phần ĐẠI CƢƠNG VỀ UNG THƢ 2.1 Bản chất ung thƣ Trong thời đại ngày khoa học có tiến vƣợt bậc đặc biệt lĩnh vực sinh học phân tử, nhiên để định nghĩa bệnh ung thƣ không dễ dàng Tuy nhiên định nghĩa ung thƣ nhƣ trình bệnh lý số tế bào thoát khỏi kiểm soát, biệt hóa sinh lý tế bào tiếp tục nhân lên Những tế bào có khả xâm lấn phá hủy tổ chức chung quanh Đồng thời chúng di trú đến phát triển nhiều quan khác hình thành nên di căn, cuối ung thƣ gây tử vong nguyên nhân sau: - Các biến chứng cấp tính nhƣ: xuất huyết ạt, chèn ép não, ngạt thở - Tiến triển nặng dần tiến đến rối loạn chức quan khối di nhƣ thiểu hô hấp, suy chức gan thận - Sự thoái triển dần dần, kéo dài dẫn đến suy kiệt cuối bệnh nhân tử vong Live cancer Lung cancer Brain cancer Hình 1: Một số loại ung thư 2.2 Cơ chế bệnh sinh ung thƣ Nguyên nhân gây ung thƣ sai hỏng ADN, tạo nên đột biến gen thiết yếu điều khiển trình phân bào nhƣ chế quan trọng khác Một nhiều đột biến đƣợc tích lũy lại gây tăng sinh không kiểm soát tạo thành khối u Khối u khối mô bất thƣờng, ác tính, tức ung thƣ lành tính, tức không ung thƣ Chỉ khối u ác tính xâm lấn mô khác di 2.3 Các tác nhân gây ung thƣ Gồm nhóm yếu tố môi trƣờng nguyên nhân bên 2.3.1 Các yếu tố môi trường + Tác nhân vật lý: chủ yếu xạ ion hóa tia cực tím + Tác nhân hóa học: Thuốc lá, Chế độ ăn uống chất gây ô nhiễm thực phẩm, Các ung thƣ liên quan đến nghề nghiệp, Hóa trị liệu + Tác nhân sinh học: Virus sinh ung thƣ, Ký sinh trùng vi trùng Hình 2: Cơ chế bệnh sinh ung thư 2.3.2 Các nguyên nhân bên - Yếu tố di truyền - Suy giảm miễn dịch AIDS - Nội tiết tố 2.4 Triệu chứng ung thƣ Ban đầu, hầu hết bệnh nhân ung thƣ triệu chứng lâm sàng rõ ràng Khi xuất triệu chứng rõ rệt thƣờng bệnh tiến triển trầm trọng.vThông thƣờng, ung thƣ có thời gian ủ bệnh (tức thời gian từ tế bào bị đột biến thành tế bào ung thƣ đến triệu chứng bệnh đƣợc bộc lộ) dài, khoảng 10 năm tùy thể loại ung thƣ Do cách phòng điều trị ung thƣ hiệu đƣợc khuyến cáo nên khám sức khỏe định kì tháng lần Do ung thƣ tập hợp nhiều dạng bệnh ung thƣ khác nên triệu chứng ung thƣ đa dạng khác tùy thể bệnh ung thƣ Đại khái, triệu chứng ung thƣ đƣợc phân làm ba nhóm chính: 1) Triệu chứng chỗ: khối u bất thƣờng hay phù nề, chảy máu (hemorrhage), đau loét (ulcer) Chèn ép vào mô xung quanh gây triệu chứng nhƣ vàng da 2) Triệu chứng di (lan tràn): hạch bạch huyết lớn lên, ho, ho máu, gan to, đau xƣơng, gãy xƣơng xƣơng bị tổn thƣơng triệu chứng thần kinh Đau gặp ung thƣ giai đoạn tiến triển, nhƣng thông thƣờng triệu chứng 3) Triệu chứng toàn thân: sụt cân, chán ăn suy mòn, tiết nhiều mồ hôi (đổ mồ hôi trộm), thiếu máu hội chứng cận u đặc hiệu, tình trạng đặc biệt đƣợc gây ung thƣ hoạt động, chẳng hạn nhƣ huyết khối (thrombosis) hay thay đổi nội tiết tố 2.5 Phân loại ung thƣ Ung thƣ đƣợc phân loại dựa theo tính chất giải phẫu bệnh theo quan bị tổn thƣơng Các tế bào ung thƣ khối u (bao gồm tế bào di căn) xuất phát từ tế bào phân chia mà thành Do bệnh ung thƣ đƣợc phân loại theo loại tế bào khởi phát theo vị trí tế bào Tuy nhiên, nhiều trƣờng hợp, ngƣời ta không xác định đƣợc khối u nguyên phát Có loại sau: 1) Ung thƣ biểu mô (carcinoma) có nguồn gốc từ tế bào biểu mô (ví dụ nhƣ ống tiêu hóa hay tuyến tiêu hoá) 2) Bệnh lý huyết học ác tính (hematological malignancy), nhƣ bệnh bạch cầu (leukemia) u lympho bào (lymphoma), xuất phát từ máu tủy xƣơng 3) Ung thƣ mô liên kết (sarcoma) nhóm ung thƣ xuất phát từ mô liên kết, xƣơng hay 4) U hắc tố rối loạn tế bào sắc tố 5) U quái bắt nguồn từ tế bào mầm Bảng 1: Các bệnh ung thư thường gặp giới THỨ TỰ NAM Gan Phổi Dạ dày Đại trực tràng Tiền liệt tuyến Hốc miệng Vòm hầu Thực quảng Lymphom Bệnh bạch cầu 10 NỮ Cổ tử cung Vú Đại trực tràn Phổi Dạ dày Gan Buồn trứng Tuyến giáp Thân tử cung Bệnh bạch cầu Trong Y học lâm sàng, nhà Y học phân loại ung thƣ theo cấu trúc mô tả, tức dựa vào đặc điểm đại thể vi thể khối u Bảng 2: Phân loại ung thư theo cấu trúc Tổ chức phát sinh Ác tính ĐƠN GIẢN * Các biểu mô: - Biểu mô phủ: + Tế bào gai + Tế bào chuyển tiếp + Tế bào trụ - Biểu mô tuyến - Biểu mô không biệt hoá * Các tổ chức liên kết: + Tổ chức xơ trƣởng thành + Tổ chức xơ phôi + Tổ chức mỡ + Ung thƣ biểu mô tế bào gai dạng thƣợng bì + Ung thƣ biểu mô tế bào chuyển tiếp + Ung thƣ biểu mô ung thƣ biểu mô tuyến nhú + Ung thƣ biểu mô tế bào đáy u tuyến nƣớc bọt + Ung thƣ biểu mô tuyến + Ung thƣ biểu mô tuyến gai + Ung thƣ biểu mô nang tuyến + Ung thƣ biểu mô phôi + Sarcôm xơ + U nhầy (sarcôm nhầy) + Sarcôm mỡ + Sụn + Xƣơng * Các tổ chức cơ: + Tổ chức trơn + Tổ chức vân + Nguồn gốc không xác định * Nội mô, trung biểu mô, quan tạo máu: + Mạch máu + Bạch mạch + Cuộn mạch da + Tế bào ngoại mạch + Trung biểu mô + Màng hoạt dịch * Các tổ chức cấu tạo máu: + Tổ chức lymphô + Tuyến + Tủy xƣơng * Tổ chức thần kinh: + Tổ chức thần kinh nguyên thủy biệt hoá + Màng não + Mào thần kinh đầu cuối dây thần kinh chuyên biệt + Võng mạc + Tế bào ƣa bạc + Sợi thần kinh tổ chức liên kết riêng * Nguyên bào nuôi * Các vết tích phôi: + Dây sống + Men + Tổ chức sót thừa cạnh tuyến yên + U nang mang + Ống niệu rốn * Các hamactôm: + Sắc tố bào + Mạch máu + Sarcôm sụn + Sarcôm tạo xƣơng (sarcôm xƣơng) + Sarcôm trơn + Sarcôm vân + Sarcôm mô mềm hốc + Sarcôm huyết quản + U huyết quản nội mô ác + Sarcôm bạch mạch + U tế bào ngoại mạch ác + U trung biểu mô ác + U màng hoạt dịch ác + U lymphô ác + Bệnh Hodgkin + U tuyến ác + Bệnh bạch cầu + Đa u tủy + Sarcôm Ewing + Sarcôm lƣới + Cá u thần kinh đệm ác + U màng não ác + U nguyên bào thần kinh + U hạch nguyên bào thần kinh + U sắc bào ác + U cận hạch ác + U nguyên bào võng mạc + Cacxinoit ác + sacrom xơ thần kinh + u bao thần kinh ác Ung thƣ biểu mô màng đệm + U dây sống + U men ( u nguyên bào men răng) + U sọ hầu + Ung thƣ biểu mô mang + Ung thƣ biểu mô ống niệu rốn + U hắc tố ác + Sarcôm mạch máu * U lồi xƣơng lồi xƣơng: + Bệnh u xơ thần kinh + Bệnh xơ củ + Sarcôm sụn + Sarcôm xơ thần kinh + U thần kinh đệm ác PHỨC HỢP * Các tổ chức trƣởng thành: Tổ chức biểu mô trung mô * Các tổ chức phôi: + Các tế bào đa trung mô Sarcôm nang hình ác + U trung mô ác + U hỗn hợp trung bì + Ung thƣ biểu mô Sarcôm + U nguyên bào thận + U nguyên bào gan + U quái ác + Thận + Gan + Các tế bào toàn 2.6 Dịch tễ học ung thƣ 2.6.1 Về số lượng người bị bệnh Ngƣời ta ƣớc lƣợng tổng số ca ung thƣ mắc giới nhƣ sau: - Năm 1980: 6.4 triệu - Năm 1985: 7.6 triệu - Năm 2000: 10.3 triệu Đối với Đàn ông 33% 32% 5% 10% 7% Ung thƣ Tiền liệt tuyến Ung thƣ Phổi 13% Ung thƣ Trực Đại Tràng Ung thƣ Bàng Quang U Hắc Tố Da Ung thƣ khác Hình 3: Tỷ lệ loại ung thư mắc phải nam giới Đối với Phụ Nữ trƣởng thành Ung thƣ Vú Ung thƣ Phổi 35% 32% Ung thƣ Đại Trực Tràng Hình 4: Tỷ lệ loại ung thư mắc phải nữ giới Tỉ lệ mắc thƣờng đƣợc dùng để cung cấp liệu xuất ung thƣ quần thể dân cƣ theo nhóm tuổi, giới tính chủng tộc…Ngƣời ta tính tỉ lệ mắc cho toàn dân cƣ phận quần thể dân cƣ với đặc trƣng phân bố khác 2.6.2 Tỉ lệ tử vong Đƣợc tính số ca tử vong 100.000 dân năm Tỉ lệ đƣợc phản ánh cho toàn dân cƣ hay cho giới tính, nhóm tuổi… Tỉ lệ tử vong ung thƣ Ung thƣ Phổi 31% 40% Ung thƣ Tiền Liệt Tuyến Ung thƣ Đại Trực Tràng 4% 5% 10% 10% Ung thƣ Tuỵ Ung thƣ Bạch Cầu Hình 5: Tỷ lệ tử vong ung thư nam giới lệ Tổng tỉ Ung thƣ Trên giới nay, tỉ lệ tử vong ung thƣ nam Khácở nữ, nam giới có tỉ lệ mắc ung thƣ cao khó chữa khỏi cao (phổi, dày, thực quản, tiền liệt tuyến) ung thƣ thƣờng gặp nữ lại thƣờng có tiên lƣợng tốt (vú, tử cung) thuận lợi cho việc điều trị Ở nhiều nƣớc, đa số ca tử vong bệnh ung thƣ phụ thuộc đáng kể vào cấu trúc tuổi dân số (sự gia tăng tỉ lệ già, mà phần lớn ung thƣ gặp lứa tuổi này), mức độ phụ thuộc vào tiến chẩn đoán, nhờ mà bệnh ung thƣ đƣợc chẩn đoán trƣớc lúc chết Tỉ lệ tử vong Ung thƣ phụ nữ Ung thƣ Phổi 27% Ung thƣ Vú 36% Ung thƣ Trực Tràng Ung thƣ Buồng Trứng 15% 6% 6% 10% Ung thƣ Tuỵ Tổng tỉ lệ ung thƣ khác Hình 6: Tỷ lệ tử vong ung thư nữ giới Phần CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ UNG THƢ HIỆN NAY 3.1 Y học cổ truyền Y học cổ truyền phƣơng Đông đƣa phƣơng pháp điều trị cách đƣa vào thể dƣợc chất thiên nhiên nhằm hạn chế phát triển tế bào ung thƣ, cung cấp dinh dƣỡng cho thể để tăng cƣờng khả đề kháng hệ miễn dịch chống ung thƣ, loại trừ chất độc đƣợc tạo trình chống chọi tế bào ung thƣ Tác dụng chủ yếu phƣơng pháp làm tiêu nhỏ dần khối u kéo dài sống tốt Một số biện pháp hỗ trợ điều trị nhƣ tập Yoga, thiền, luyện võ công…cũng có tác dụng đáng kể 3.2 Y học đại Trong điều trị ung thƣ, bên cạnh phƣơng pháp cổ điển phẫu thuật, tia xạ hóa trị, xuất kỹ thuật nhƣ liệu pháp sinh hoc, liệu pháp nhiệt … 3.2.1 Phẫu thuật (surgery) Phƣơng pháp giải phẫu chủ yếu mổ cắt bỏ khối u nguyên phát hƣớng di trực tiếp Hiệu điều trị tuỳ thuộc vào số yếu tố sau: - U bƣớu thu gọn chỗ chƣa di - Tế bào ung thƣ tăng sinh chậm - Vị trí u bƣớu - Khả chuyên môn phẫu thuật gia - Công hiệu dịch phụ hỗ trợ nhƣ thuốc mê, kiểm soát ngừa nhiễm trùng, tiếp máu, dụng cụ giải phẫu chăm sóc sau mổ Ƣu điểm: có tác dụng tiêu diệt hoàn toàn khối u ung thƣ khu trú Nhƣợc điểm: - Thời gian hồi phục lâu - Dễ bị nhiễm trùng vết mổ cho thấy bệnh lý ung thƣ chủ yếu làm tăng tế bào viêm nhiễm nên đƣờng hoạt hóa miễn dịch PDT theo đƣờng dùng tế bào viêm nhiễm để kích thích hệ miễn dịch tỏ hiệu cao việc đối phó với khối u ung thƣ đƣờng làm cho tế bào chết theo chƣơng trình nhƣ liệu pháp hóa trị xạ trị làm Trong trƣờng hợp thành phần viêm nhiễm, nhƣ tễ bào chết theo chƣơng trình lan tràn ngoại bào màng plasma thành tế bào bị vỡ chúng kích thích mạnh mẽ đáp ứng viêm thể Sản phẩm sản sinh trình an toàn bị cô lập màng tế bào Quá trình viêm cấp tính làm tăng đáp ứng miễn dịch cách thu hút tế bào bạch cầu tập trung vào khối u, kết dẫn tới làm tăng số lƣợng tế bào trình diện kháng nguyên hệ thống đáp ứng miễn dịch Một yếu tố quan trọng trình sử dụng liệu pháp quang động học (PDT) khả làm viêm nhiễm khối u cách tạo protein shock nhiệt ngoại bào (HSP) Các protein shock nhiệt tăng sau trình tác động, diễn chủ yếu bên tế bào, bảo vệ protein cách tập hợp yếu tố ức chế protein Các protein shock nhiệt tác dụng ức chế tế bào khối u gây chết theo chƣơng trình nội bào, mà thúc đẩy hình thành phức hợp kháng nguyên khối u Các kháng nguyên tác dụng bề mặt kháng thể lạ đƣợc nhận biết trƣớc khỏi tế bào hoại tử chết hoạt động kết hợp với tế bào trình diện kháng nguyên (APCs), để tăng cƣờng trình thực bào đồng thời kích thích đáp ứng miễn dịch tiêu diệt khối u Đồ thị 2: Liệu pháp quang động học PDT hoạt hóa tế bào kháng thể đặc hiệu T Khi ánh sáng kích thích đƣợc truyền cho chất nhạy quang (PSs) lƣợng gây trình chết theo chƣơng trình chết viêm nhiễm tế bào Những tế bào sau bị thực bào tế bào gai, dẫn đến đáp ứng cấp tính dƣới tác dụng liệu pháp quang động học Các tế bào gai trƣởng thành sau đƣợc kích thích cytokine, chất đƣợc phát vị trí viêm, vị trí hạch bạch huyết nơi mà tế bào trình diện kháng nguyên trình kháng nguyên cho tế bào lympho T Các tế bào lympho T sau đƣợc hoạt hóa đƣợc gọi tế bào T hoạt hóa, chúng bị thu hút chemokine, đến khối u tiêu diệt tế bào khối u Các protein shock nhiệt (HSP) ngoại bào có tác dụng gắn receptor có lực cao lên bề mặt tế bào trình diện kháng nguyên, từ dẫn đến hoạt hóa kích thích tăng trƣởng tế bào đuôi gai (DCs), trình kích thích trình diện chéo kháng nguyên peptide protein shock nhiệt tế bào trình diện kháng nguyên (APCs) với tế bào T CD8+ Nồng độ protein shock nhiệt mRNA đƣợc tăng liệu pháp quang động học thông qua loại nhạy quang (mono-l-aspartyl chlorin, tin etiopurpurin 25 photofrin) nhƣng có mono-l-aspartyl chlorin, tin etiopurpurin làm tăng mức độ protein khối u chuột hai trƣờng hợp in vivo in vitro Trong nghiên cứu gần đây, Forter cộng sử dụng phƣơng pháp chụp ảnh huỳnh quang thấy chất nhạy quang tetrahydroxyphenylchlorin làm tăng protein shock nhiệt mẫu mô dƣới liệu pháp quang động học Những tế bào đƣợc chuyển cách ổn định với plasmid có chứa gen đƣợc mã hóa protein huỳnh quang xanh (GFP) dƣới điều khiển protein shock nhiệt (HSP) Verwanger nghiên cứu sử dụng mảng nhỏ cDNA để phát mức độ nén cao gen khác sau sử dụng PDT HSP70 cho thấy tăng nén cao (tạo 12 gấp) Thêm vào đó, báo cáo gần cho thấy 15 - 25% lƣợng protein shock nhiệt tổng bị đƣa lên trình diện gần nhƣ bề mặt tế bào sau dùng liệu pháp quang động học PDT với chất nhạy quang photofrin, tỷ lệ lớn đƣợc phát vòng PDT mức liều gây độc Cùng với HSP70 protein nhóm nhƣ HSP47, HSP60 protein cảm ứng khác nhƣ glucose regulate protein (GRP gồm nhóm GRP78, GRP94) tăng cƣờng co nén Sự phát protein nhạy nhiệt HSPkháng nguyên bao xung quanh khối u để làm cho chúng dễ dàng bị nhận lấy tế bào trình diện kháng nguyên (APC) PDT dẫn đến chết tế bào hoại tử giải thích tác dụng kích thích đáp ứng miễn dịch liệu pháp quang động học 6.2.3 PDT đáp ứng miễn dịch chống lại khối u Vấn đề nuôi cấy khối u chuột từ lúc sinh hay trƣởng thành có lƣợng phức hợp tƣơng hợp mô (viết tắt MHC-chứa chủ yếu kháng nguyên gluco protein đặc hiệu màng tế bào) hệ miễn dịch đƣợc nghiên cứu khả chống lại hệ miễn dịch khối u sau điều trị liệu pháp quang động học PDT Canti đồng giải thích tác dụng PDT với chất nhạy quang aluminium disulphonate phthalocyanine đáp ứng chống ung thƣ chuột mang sacrom xơ hóa Tất chuột chữa trị sống sót, nhƣng cản trở tái phát sacrom có chuột sống sót đƣợc điều trị PDT, chuột sốt sót có tiêm chất ức chế miễn dịch hay đƣợc điều trị phẫu thuật chết sau tái phát khối u Korbelik báo cáo Photofrin kết hợp PDT điều trị 100% sarcroms vú chuột không bị mắc bệnh tiểu đƣờng, béo phì thiếu hụt miễn dịch Ngƣời ta tiến hành tiêm lympho bào T từ lách chuột khỏe mạnh sau điều trị lên chuột thiếu hụt miễn dịch trƣớc dùng phƣơng pháp PDT lần sau vị trí mà trƣớc dùng PDT sau ngày mà chƣa có kết khả quan Hỗn hợp tế bào T CD4+, T CD8+ với vài tế bào B, tế NK (tế bào tiêu diệt tự nhiên) đơn bào từ chuột sống sót sau bị tiêm khối u sau tuần điều trị PDT trƣớc đó, cho thấy có tác dụng trị bệnh lên tế bào khối u phát triển chuột bị tiểu đƣờng béo phì Một báo cáo gần cho thấy PDT kết hợp với chất nhạy quang BDP để điều trị khối u cho kết khối u bên biến nhƣng lại không cho sống sót lâu dài tái phát Ngƣợc lại, khối u khảo sát sứa với tác dụng GFP (green fluorence protein) lại cho kết sống sót 100% có đề kháng lâu dài tái phát sau điều trị PDT PDT làm thay đổi nhận dạng miễn dịch GFP, khiến giống nhƣ kháng thể khối u Sự loại bỏ kháng thể kháng nguyên thêm vào đƣợc xác định dòng tế bào chuột Các chất làm tăng tiếp xúc nhạy quang (CHS) đƣợc tăng tác dụng kháng nguyên kèm theo đó, chẳng hạn nhƣ dinitrofluorobenzen (DNFB) tới da đƣợc trung hòa tác động phức hợp tƣơng hợp mô (MHC) nhóm lên keratinocyte (KC) Một tác động lại xảy sau với DNFB gây đáp ứng viêm tế bào T gây độc Chất DHT (delayed type hypersensitivity)tác dụng cách tiêm vào kháng nguyên tế bào chẳng hạn nhƣ protein bên ngoài, đƣợc trung hòa phức hợp tƣơng hợp mô (MHC) nhóm đƣợc tác động tế bào (DC) đƣợc nhận dạng tế bào lympho T hỗ trợ (CD4+) CHS đƣợc sử dụng PDT sử dụng ánh sáng xanh không xuyên da (ngƣợc lại với ánh sáng đỏ xuyên da) 26 Khi sử dụng ánh sáng đỏ chất nhạy quang CHS phụ thuộc vào tiết interleukin 10 (IL10) Trong DTH không bị làm PDT, chiếu cực tím (UVB) không DTH, CHS Các khác giải thích kết trái ngƣợc PDT kích thích hệ miễn dịch khu vực nhƣng lại làm suy giảm miễn dịch khu vực khác, UVB có tác dụng làm suy giảm hệ miễn dịch Đồ thị 3: Cơ chế trình PDT tác dụng lên hệ miễn dịch 6.2.4 Sự sản sinh cytokine đáp ứng viêm sau chiếu PDT PDT tạo đáp ứng viêm cấp tính mô thƣờng khối u Các cytokine chemokine sản sinh từ trình viêm đƣợc phát thấy huyết chuột sau đƣợc nhận liều PDT trực tiếp lên khối u dƣới da khu vực da bình thƣờng Những tƣợng kèm với xuất IL-6 (interleukin-6) protein kích thích đại thực bào đáp ứng viêm (macrophage inflammatory protein 1MIP1) protein kích thích đại thực bào đáp ứng viêm (macrophage inflammatory protein 2-MIP2) Sự tăng số lƣợng IL1IL IL-8 IL-10 đƣợc phát bệnh nhân sau đƣợc phẫu thuật -6, kết hợp PDT lên u biểu mô Nguồn giới thể trình viêm đa dạng loại tế bào tồn nơi khối u Thí dụ, tế bào ác tính, tế bào u màng leukocyte xâm nhập nội mô cho thấy chúng sản sinh nhóm chất trung gian trình viêm nhƣ prostaglandin Sự phát thromboxane từ tế bào màng sau chiếu PDT tạo nên ngƣng tắt mạch nuôi khối u Các đáp ứng viêm cấp tính quan trọng kích thích đáp ứng miễn dịch, chia trao đổi dạng tín hiệu nguy hiểm từ kích thích hệ miễn dịch vị trí vi mạch mô khỏe mạnh kế cận Môi trƣờn khối u lúc trở thành trạng thái môi trƣờng viêm mãn tính, trạng thái đối lập với viêm cấp tính Các yếu tố phiên mã vấn đề sản sinh cytokine Viêm cấp tính xuất sau dùng PDT tác động hai yếu tố phiên mã yếu tố hạt nhân B (nuclear factor κB - NFκB) protein hoạt hóa 27 (AP1) Cả yếu tố yếu tố tham gia hoạt hóa phiên mã gen đóng vai trò mã hóa điều tiết phản ứng miễn dịch protein tiền thời kỳ viêm, mà gây nên oxi hóa tế bào Photofrin (chất hoạt quang PDT) gây nên chuyển vị NFκB tế bào leukaemia L1210 dƣới điều kiện PDT cho 20% tế bào sống sót Tuy nhiên, Kick phát tế bào Hela đƣợc điều trị PDT với photofrin làm chất hoạt quang làm tăng tác dụng IL6 gây nên hoạt hóa AP1 NFκB Các tế bào carcinoma ruột kết đƣợc điều trị pyropheophorbide, loại este metyl, kết hợp với ánh sáng đỏ Đồ thị 4: Tác dụng liệu pháp quang động học – Sự gây đáp ứng viêm Sự vỡ niêm mạc tế bào dẫn đến loạt hiệu ứng dây chuyền dẫn đến đáp ứng viêm chỗ, mô nơi viêm bị sƣng lên, tập trung tiểu cầu Những điều dẫn đến phóng thích thromboxane (TBX) cytokine nhƣ interleukin 1(IL1 interleukin (IL6), interleukin (IL8), sản sinh yếu tố đáp ứng viêm ), tế bào TNFvà tạ xâm nhập khối u từ kích hoạt hệ miễn dịch tiêu diệt tế bào o khối u Các tế bào chết theo chƣơng trình hay chết viêm nhiễm tạo protein shock nhiệt (HSPs) cung cấp kháng thể cho tế bào đuôi gai (DCs) hạch bạch huyết 6.2.5 Sự kết hợp liệu pháp quang động học với chất tăng cường kích thích miễn dịch Tiêm vào bên khối u đa dạng phối tử cảm thụ quan T (TLR): bacilus bacillus Calmette–Guerin (BCG), vỏ khuẩn mycobacterial (MCWE), OK432, zymosan, schizophyllan (SPG) hay Corynebacterium parvum (CP) có tác dụng hoạt hóa tế bào (DCs) làm tăng cƣờng trình diện kháng nguyên đáp ứng viêm cục Việc tiêm vào loại cytokine khác chẳng hạn nhƣ yếu tố hoạt hóa đại thực bào granulocyte-macrophage (GMCSF) yếu tố hoại tử khối u tumour-α (TNFα), kết làm tăng thâm nhiễm đại thực bào, hoạt hóa bạch cầu trung tính, trực tiếp phá hủy mạch máu khối u 6.2.6 PDT sản sinh vac-xin ngừa ung thư tăng cường hệ miễn dịch Những nghiên cứu vấn đề phát triển kích thích hệ thống miễn dịch điều trị ung thƣ tạo nên vaccine đáp ứng ung thƣ liệu pháp quang động học sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy ống nghiệm in vitro Nhà nghiên cứu Gollnick so sánh tác dụng vaccine ngừa ung thƣ sản sinh từ liệu pháp quang động học tế bào ung thƣ so với trình chữa trị khối u phƣơng pháp chiếu tia cực tím 28 Đồ thị 5: Sự kết hợp PDT với phương pháp kích thích hệ miễn dịch Kết cho thấy, PDT sản sinh vaccine đặc hiệu với khối u, làm tăng đáp ứng tế bào gây độc T , không giống nhƣ phƣơng pháp khác không cần phải dùng thêm chất hỗ trợ khác để hoạt động PDT có tác dụng làm tăng khả ly giải tế bào ung thƣ cách làm tăng tế bào dạng gai trƣởng thành interleukin 12 Korbelik Sun sản suất vaccine để điều trị tế bào SCVII BPD, sau liệu pháp quang động học PDT cuối tia X liều cao, kết cho thấy xung quanh khối u đƣợc nuôi cấy vào chuột SCVII xuất hiệu ứng chống bệnh đặc hiệu phát triển chậm, suy thoái chết khối u Quan trọng hơn, tế bào vaccin sản sinh cách nhanh chóng khu vực tiêm, sau tiêm thuốc gồm tế bào đuôi gai trộn với protein shock nhiệt tập hợp lên bề mặt tế bào khối u đƣợc opsonin hóa hóa bổ thể C3 Một mảng ứng dụng liệu pháp PDT kết hợp phƣơng pháp can thiệp để tăng trang bị tế bào để có đáp ứng tốt cho hệ miễn dịch chống khối u Các tế bào T điều tiết có chức quan trọng việc điều khiển phát động hệ thống miễn dịch có đáp ứng chống lại nhiều khối u mục tiêu, tế bào khối u bị tiêu diệt hết liều thấp cyclophosphamide (CY), CY với liều cao lại có nguy gây ức chế hệ miễn dịch CY kết hợp với BDT- dạng PDT liều thấp, với thời gian chiếu ngắn, nhằm vào mục tiêu vi mạch máu nuôi khối u có tác dụng đặc hiệu lên tế bào lƣới sacrom có thời gian sống dài có tác dụng ngăn chặc tái phát khối u khu vực đƣợc điều trị, khu vực 100% khối u nguyên phát khối u di chết 6.3 Thí nghiệm khảo sát tác dụng khác liệu pháp laser kích thích hệ miễn dịch điều trị khối u ung thƣ di đƣợc nghiên cứu chuột Tóm lược Liệu pháp laser miễn dịch chiếu lên khối u nhằm kích thích trực tiếp lên hệ thống miễn dịch đối tƣợng Phƣơng pháp bao gồm việc giám sát khối u bên phép nhuộm màu thông qua hấp thụ laser hỗ trợ hệ miễn dịch việc chiếu laser không xâm lấn Các nghiên cứu trƣớc sử dụng glycated chitosan (GC) làm chất hoạt hóa miễn dịch indocyanine green (ICG) thuốc nhuộm phép hấp thụ laser 29 cho kết tích cực điều trị khối ung thƣ di chuột Kết xét nghiệm in vivo cho kết hứa hẹn:  Loại trừ triệt để khối u sơ cấp  Khống chế đƣợc di  Làm tăng đáp ứng hệ miễn dịch  Cản trở tái phát khối u Trong nghiên cứu này, khối u di sản sinh từ vùng ngực tuyến tiền lệt chuột đƣợc điều trị phƣơng pháp khác dựa yếu tố liệu pháp laser miễn dịch Những chuột sống sót số liệu khối u nguyên phát di sau đƣợc điều trị yếu tố riêng lẻ nhƣ kết hợp đƣợc phân tích tổng hợp Trong vấn đề điều trị khối u vùng ngực, tất nhóm thí nghiệm kết hợp chất hoạt hóa miễn dịch thất bại Việc dùng GC cách đơn lẻ kết hợp đƣợc ý cho tỷ lệ chuột bị nhiễm khối u sống sót cao Trong trƣờng hợp kết hợp yếu tố cho kết sống cao Ba nồng độ khác GC lần lƣợt 0.5%; 1% 2% đƣợc dùng để nghiên cứu khối u di Kết cho thấy nồng độ 1% cho hiệu tốt Trong vấn đề điều trị khối u di tuyến tiền liệt, phƣơng pháp laser-ICG laser-ICGGC làm giảm phát triển khối u nguyên phát di vào phổi Sự sống sót chuột mang khối u tuyến tiền liệt đƣợc thừa nhận thông qua liệu pháp laser kích thích hệ miễn dịch Những kết mở chức quan trọng chất hoạt hóa miễn dịch liệu pháp laser miễn dịch Giới thiệu Vấn đề quan trọng việc dùng laser điều trị tác động cách đặc hiệu lên khối u gây kích thích hệ miễn dịch chủ thể Đáp ứng kéo theo đáp ứng miễn dịch toàn thể, từ phát công khối u nguyên phát khống chế khối u di mà phát đƣợc khu vực xa Hơn đáp ứng miễn dịch dẫn tới ngăn chặn cách lâu dài loại ung thƣ có nguồn gốc Trong yếu tố hỗ trợ miễn dịch đƣợc sử dụng thƣờng xuyên Trong liệu pháp miễn dịch chống ung thƣ truyền thống, chất hỗ trợ miễn dịch đƣợc dùng riêng vài trƣờng hợp đƣợc dùng kết hợp với liệu pháp hóa học Mặc dù chất hoạt hóa miễn dịch nhƣ CalmetteGue´rin, Corynebacterium parvum Freund có chức kích thích miễn dịch nhƣng chúng lại thiếu tác động lên khối u, mà chúng có hiệu hạn chế Những chất hỗ trợ miễn dịch đƣợc dùng điều trị ung thƣ nhƣ PDT.3 đƣợc ý nhiều PDT.3 có vai trò khởi động phản ứng kích thích, làm giải phóng cytokine kéo theo hàng loạt hoạt động khác hệ miễn dịch Khi liên kết với PDT, chất hỗ trợ miễn dịch góp phần làm tăng hoạt tính PDT chức miễn dịch Liệu pháp laser kích thích miễn dịch đƣợc sử dụng kết hợp với laser quang động học để điều trị khối u di Mục đích liệu pháp laser kích thích miễn dịch làm tăng đáp ứng miễn dịch lên khối u cần điều trị Không giống nhƣ liệu pháp quang hóa tác động lên cấu trúc khối u, liệu pháp kích thích miễn dịch laser sử dụng phản ứng quang nhiệt có chọn lọc nhằm công khối u Phƣơng pháp sử dụng laser bƣớc sóng 805 nm kết hợp ICG để thu đƣợc tƣơng tác quang nhiệt mong muốn Một chất hỗ trợ miễn dịch khác GC đƣợc dùng để nhuộm màu hấp thụ laser nhằm tăng phản ứng miễn dịch Phƣơng pháp đƣợc nghiên cứu việc diều trị khối u di ngực chuột kết đầy hứa hẹn Không khối u nguyên phát đƣợc trị thành công, mà khối u di vị trí xa bị tiêu diệt đồng thời ngăn cản tái phát khối u với liều điều trị cao ngăn ngừa khối u loại phát triển nhờ vào tính ghi nhớ hệ miễn dịch Theo giả thuyết laser kích thích hệ miễn dịch sử dụng đồng thời hai hiệu ứng hiệu ứng quang-nhiệt hiệu ứng quang-miễn dịch để tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch Cả hai đáp ứng giữ vai trò quan trọng liệu pháp laser miễn dịch Tuy nhiên, chế liệu pháp đến chƣa đƣợc 30 hiểu cách cặn kẽ Mục đích nghiên cứu khảo sát chức yếu tố riêng biệt đƣợc sủ dụng laser miễn dịch là: - Bƣớc sóng ánh sáng - Chất nhuộm màu hấp thụ laser - Chất hoạt hóa miễn dịch Do chất hoạt hóa miễn dịch đƣợc thêm vào điều trị ung thƣ quang-nhiệt, nên khảo sát vai trò chúng cách dùng GC với nồng độ khác điều trị khối u di chuột Hiểu đƣợc vai trò yếu khác liệu pháp laser miễn dịch giúp có đƣợc cách thức điều trị hiệu Các mẫu phương pháp tiến hành thí nghiệm Các thành phần liệu pháp laser miễn dịch: - Laser hồng ngoại gần - Chất nhuộm màu hấp thụ laser - Chất hoạt hóa miễn dịch Loại laser sử dụng laser bán dẫn DIOMED 25, phát bƣớc sóng 805 nm, công suất cực đại ngõ 25W Chất nhuộm màu để hấp thụ laser ICG, dung dịch có hấp thụ laser cực đại quang bƣớc sóng 800 nm Chất hoạt hóa miễn dịch thí nghiệm GC, thu đƣợc cách nuôi cấy chitosan dung dịch với galactose đƣợc ổn định cách giảm borohydrua (BoH) hỗn hợp bazo Schiff Amadori Mẫu khối u: sử dụng mẫu khối u vú nuôi cấy di căn, DMBA-4, chuột mang tên Wistar Furth phòng thí nghiệm, 5–6 tuần tuổi khối lƣợng 100-125 g Các mô sống sót trình nuôi cấy đƣợc thu lại từ chuột mang khối u sau cho vào dung dịch RPMI_10%FCS đƣợc nghiền để thành dung dịch đồng chứa tế bào đơn Các tế bào khối u sau đƣợc cấy vào vùng mỡ nằm dƣới bẹn với hàm lƣợng 105 tế bào khối u sống sót lên chuột Các tế bào khối u nguyên phát thƣờng phát huy tác dụng sau 7-10 ngày cấy ghép Các khối u di dọc theo hạch bạch huyết di vùng xa phát đƣợc sau tuần cấy ghép Nếu không đƣợc điều trị chuột có thời gian sống sót trung bình 35 ngày Mức độ hoạt động miễn dịch mô hình DMBA-4 thấp dựa kết phân tích thực nghiệm Một thí nghiệm khác đƣợc tiến hành nuôi cấy mẫu di tuyến tiền liệt, Met-Lu, chuột đực Copenhagen Những mẫu mô sống sót từ chuột mang khối u đƣợc thu cấy lên bẹn chuột khỏe mạnh Những khối u tuyến tiền liệt sé di đến vùng phổi Thời gian sống trung bình chuột không đƣợc điều trị thí nghiệm 55 ngày Liệu pháp điều trị kích thích hệ miễn dịch có nhiều kết hợp yếu tố liệu pháp laser miễn dịch để điều trị khối u Chi tiết phép kết hợp để điều trị khối u di tuyến tiền liệt chuột đực đƣợc cho bảng Tác dụng liệu pháp đƣợc xem xét Một phƣơng pháp kết hợp laser-ICG đƣợc sử dụng, liệu pháp kết hợp laser-ICG-GC đƣợc sử dụng Các thông số vấn đề điều trị đƣợc đƣa bảng Để xét tác động chất hoạt hóa miễn dịch, dung dịch GC với nồng độ khác 0.5%, 1% 2% đƣợc sử dụng vào điều trị, mức nồng độ đƣợc thử nghiệm 16 chuột 31 Bảng 4: Sự thay đổi thông số yếu tố khác liệu pháp laser kích thích miễn dịch điều trị khối u ngực di chuột a Dữ liệu thu nhận từ hai liệu riêng biệt b Dung dịch ICG, GC, hay ICG-GC (200 l) tiêm trực tiếp vào trung tâm khối u nguyên phát Bảng 5: Các thông số dùng điều trị sử dụng yếu tố khác liệu pháp laser kích thích miễn dịch khối u di tuyến tiền liệt chuột đực Kết thu đƣợc liệu pháp laser miễn dịch: khối u chuột đƣợc tiến hành trình điều trị kích thƣớc khối u đạt 0.2-0.5 cm3 Trong nhóm đƣợc điều trị không sử dụng phép chiếu laser, 200 l dung dịch (ICG,GC ICG-GC kết hợp) đƣợc tiêm vào trung tâm khối u nguyên phát Liều lƣợng thành phần chất hoạt hóa miễn dịch nhƣ chất nhuộm đƣợc cho bảng Đối với nhóm có điều trị laser , dung dịch ICG, GC ICG-GC có thành phần nhƣ cho vào mẫu đƣợc chiếu laser sau Trƣớc đƣợc điều trị laser chuột đƣợc gây mê cạo lông nơi vùng mô đƣợc chiếu sáng Năng lƣợng chùm tia đƣợc đƣa trực tiếp vào vùng điều trị sợi quang Trong phép điều trị, sử dụng laser công suất 2W thời gian chiếu 10 phút, sợi quang đƣợc nối vào laser chiếu phủ lên cách vùng da mm Những kết thu đƣợc sau điều trị: sau điều trị, chuột đƣợc nuôi lồng riêng biệt, mang khối u ngực tuyến tiền liệt đƣợc theo dõi ngày khối u đƣợc đánh giá phƣơng pháp chụp 3D tuần Thời gian sống sót trung bình nhóm điều trị khác đƣợc so sánh với Theo khảo sát, chuột nhóm (kiểm soát, điều trị laser-ICG, điều trị laser ICG-GC) điều kết thúc điều trị sau 49 ngày kể từ ngày nuôi cấy khối u Các khối u nguyên phát đƣợc thu thập, trọng lƣợng thể tích khối u đƣợc đo Những khối u di phổi chuột đƣợc đo đạt kích thƣớc thể tích Thống kê liệu: phân tích thống kê đƣợc thực phần mềm StatView ANOVA đƣợc dùng để khảo sát khác thông số đo đƣợc liên tục thể tích khối u di Kết đƣờng cong sinh tồn cho thấy đặc trƣng khác phƣơng pháp 32 Kết thu Tác dụng yếu tố khác laser kích thích miễn dịch điều trị khối u di ngực Các mẫu khối u chuột mang tên Wistar Furth đƣợc lấy để khảo sát Những chuột đƣợc chia làm nhóm, nhóm kiểm tra nhóm đƣợc điều trị thay đổi khác yếu tố, nhƣ đề cập bảng Mƣời hai chuột lập thành nhóm, ngoại trừ nhóm kiểm tra nhóm có dùng laser ICG-GC, dƣợc chia thành hai nhóm nhỏ thí nghiệm Ba nhóm đƣợc điều trị yếu tố cách riêng lẻ dùng chất ICG hay GC hiếu sáng 805 nm Tỷ lệ sống sót ba nhóm đƣợc đƣa đồ thị Đồ thị 6: Tỷ lệ sống sót chuột mang khối u Đường mờ thể cho 35 chuột không điều trị phương pháp Đường gạch dài thể cho chuột điều trị cách tiêm vào bên khối u 200l dung dịch ICG 0.25% Đường gạch ngắn thể cho chuột điều trị cách tiêm vào bên khối u 200 l dung dịch GC 1% Đường đậm thể cho chuột điều trị laser công suất 2W thời gian chiếu 10 phút Đồ thị 7: Tỷ lệ sống sót chuột điều trị cách kết hợp yếu tố liệu pháp laser kích thích miễn dịch Đường cong mờ thể cho 35 chuột không điều trị phương pháp Đường gạch dài chấm mảnh thể cho 12 chuột tiêm vào khối u 200l dung dịch chứa 0.25% ICG 1%GC Đường gạch dài thể cho 12 chuột tiêm vào khối u 200 l dung dịch chứa 0.25% ICG kết hợp với chiếu laser 2W 10 phút Đường chấm thể cho 12 chuột điều tiêm vào khối u 200 l dung dịch GC  1% chiếu laser 2W 10 phút 33 Ta thấy đƣờng sống dài ứng với chuột đƣợc điều trị GC Tỷ lệ sống sót nhóm dùng ICG hay dùng laser điều trị xấp xỉ với nhóm kiểm chứng Phân tích thống kê cho thấy khác biệt lớn thời gian sống trung bình nhóm Tỷ lệ chuột sống sót nhóm đƣợc điều trị kết hợp hai yếu tố nhƣ laser-ICG, laser_Gc, hay ICG-GC đƣợc cho đồ thị Kết điều trị cho thấy liệu pháp kết hợp laser-GC ICG-GC cho quãng thời gian sống dài Tuy nhiên lại khác biệt đáng kể thời gian thời gian sống trung bình nhóm thể đồ thị Kết chuẩn đƣợc sử dụng cho liệu pháp laser kích thích miễn dịch thể đồ thị Trong hai thí nghiệm riêng biệt 31 chuột, có quãng thời gian sống dài sau đƣợc điều trị liệu pháp này, kết cho thấy tỷ lệ sống sót 30% Hơn nữa, thời gian sống trung bình chuột đƣợc điều trị liệu pháp kết hợp laser-ICG-GC có khác biệt đáng kể so với chuột không đƣợc điều trị liệu pháp (P