Xác định hàm lượng protease cố định và khảo sát thông số động học

Xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Anson cải tiến.- Phương pháp dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzyme protease có trong dịch nghiên cứu.. Tính toán kết quả hà

Bài 2 : PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VÀ

HOẠT TÍNH CỦA ENZYME

2. Đơn vị hoạt tính enzyme

A. Đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt U) do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế(International Union of Biochemistry – IUB) định nghĩa:

i. Một đơn vị chuẩn của enzyme ( 1 U) là lượng enzyme xúc tácchuyển hóa được 1 µmol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn

1 U = 1 µmol sản phẩm = 1 µmol cơ chất (10-6 mol)/phút

B. Katal : 1 Katal là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 mol cơ chấtsau 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn

1kat = 1 mol cơ chất / giây = 60 mol / phút = 60 x 106 µmol/ phút = 6 x

107 U

1 U = 1/60 x 10-6 Kat = 16.67 nKat (nanokatal)

2.1 Hoạt tính riêng ( specific activity) của enzyme :

Hoạt tính riêng của ă chế phẩm enzyme đặc trưng cho độ tinh sạch của chếphẩm enzyme Hoạt tính riêng được biểu thị bằng số đơn vị enzyme/mgprotein (U/mg pro)

Hình 2.1 : Enzyme trong sau khi Ly Tâm

Hình 2.2 Các ống nghiệm đã chuẩn bị theo bảng trên

Hình 2.1 : Số liệu thu nhận từ máy đo OD và đường chuẩn Albumin

3.2 Xác định hàm lượng trong mẫu :

Xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Anson cải tiến.

- Phương pháp dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzyme protease có trong dịch nghiên cứu

màu với thuốc thử Follin – ciocalteu

- Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine để tính lượng sản phẩm do enzyme xúc tác tạo nên

Dung dịch trochlacetic acid 1mM (1µmol/ml)

Thuốc thử Follin – ciocalteu (gọi tắc là FC)

Dung dịch enzyme: thu được từ bài 1

0,6

0,8

1

8

0,6

0,4

0,2

0,6

0,81Lắc đều để yên ở 37oC/30 phút Đo độ hấp thu dung dịch ở 750nm lấy mẫu

đối chứng (ĐC) làm mẫu trắNg (Blank)

HÌNH: ống mẫu đo OD dựng đường chuẩn Tyrosine Kết quả đo OD 750:

1µmol/

ml

0D750nm

Kết tủa cơ chât còn dư: lắc đều, ủ ở 37oC/ 30 phút Lọc lấy dịch loại bỏ kết

AĐC = 0

3. Tính toán kết quả

hàm lượng protein được giải phóng do enzyme protease thủy phân được tínhdựa vào đường chuẩn tyrosine từ (ATN - AĐC) suy ra X µmol/ml tyrosine sinhra

HTo (U/g) = = = 38,61 (U/g)

Xác định hoạt tính enzyme amylase

Phương pháp này dựa vào sự thủy phân cơ chất tinh bột bởi enzyme amylase (không phân biệt alpha và glucoamylase) nguồn gốc nấm mốc ở pH 5.0 và 400c thành glucose Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS), màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở bước sóng 540nm ( phương pháp Miller, 1959

Hóa chất

- Đệm Na-acetate 0.05M

- Cơ chất: tinh bột tan

- Dung dịch cơ chất (1% W/V tinh bột): hòa tan 10g tinh bột (theo chất khô tuyệt đối) với 50 ml nước cất trong bình định mức 100ml, lắc đều Đặt vào bếp cách thủy đang sôi, lắc liên tục cho đến khi tinh bột tan hoàn toàn Sau đó làm nguội và

bổ sung đệm Na-acetate 0.1M pH=5.0 đến vạch mức, lắc đều Dung dịch được chuẩn bị trong ngày sử dụng

Dung dịch acid dinitrobenzoic (DNS): cân 20g dinitrobenzoic (DNS), cho vào beaker 2000ml, thêm khoảng 800ml nước cất, đặt beaker vào chậu nước 800c và khuấy đều, hòa tan 32g NaOH với 300ml nước cất, thêm dung dịch NaOH này từ từ vào dung dịch, khuấy ở nhiệt 800c Tiếp tục thêm 600g potassium sodium tartrate tetrahydrate vào dung dịch DNS và tiếp tục khuấy

2-hydroxy-3,5-ở nhiệt độ 800c Làm lạnh dung dịch DNS đến nhiệt độ phòng Chuyển dung dịch vào bình định mức 2000ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều Bảo quản dung dịch DNS trong chai màu nâu có nắp

- Dung dịch enzyme: thu được từ bài 1, có thể là enzyme trích ly, dung dịch

enzyme kết tủa sau khi hòa tan vào dung dịch đệm hay dung dịch thu được sau sắc

ký lọc gel

Mẫu được đun sôi:

Tiến hành

Bảng dựng đường chuẩn glucose để xác định hoạt tính enzyme amylase

Bảng các bước xác định hoạt tính enzyme amylase

Kết quả đo OD bước sóng 540nm:

Atn-Adc

HT(U/g)=HT*V/mHàm lượng enzyme amylase

P1(mg/ml) =X*F

=0,355*100

=35,5

BÀI 5: CỐ ĐỊNH ENZYME

Hóa chất

- Dung dịch natri alginate3%

- Dung dịch CaCl2 0,2M

- Hóa chất xác định protein theo Bradford

- Hóa chất xác định hoạt tính enzyme theo bài 2

Tiến hành

Cân 0,5g enzyme hòa tan trong dung dịch natri alginate3% Dùng ống xilanh

có đầu kim tiêm, hút dung dịch enzyme hòa tan này nhỏ từ độ cao 20 cm vào trong50ml dung dịch 0,2M CaCl2 để tạo gel Quá trình tạo gel xảy ra trong 2 giờ, ởnhiệt độ phòng Sau cố định, dung giấy lọc, lọc enzyme đã được cố định Kết quảthu được hạt gel enzyme đã được nhốt trong khuôn gel Dịch lọc thu được đem đixác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt tính

Xác định hoạt tính enzyme amylase

Ổn định nhiệt độ enzyme 40ºC/5 phútTinh bột 1% ủ ở 40ºC/5

1) Hiệu suất hoạt tính của enzyme cố định

Hiệu suất cố định enzyme được tính theo công thức sau:

Trong đó:

H Enz%: Hiệu suất cố định enzyme (%)

E0: Hoạt tính enzyme trong thể tích dùng để cố định

Ef: Hoạt tính enzyme trong thể tích sau khi cố định

V0: Thể tích dung để cố định

Vf: Thể tích enzyme còn lại sau khi cố định

2) Hiệu suất protein của enzyme cố định

Hiệu suất cố định protein được tính theo công thức sau:

Trong đó:

H Enz: Hiệu suất cố định enzyme

P0: Nồng độ ban đầu của protein

V0: Thể tích ban đầu của dung dịch enzyme

Pf: Nồng độ protein trong tổng phần nước lọc

1 Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme

Nhiệt độ khảo sát 30 0C, 40 0C, 50 0C, 60 0C, 70 0C trong khi giữ pH như trong điềukiện tiêu chuẩn

Sơ đồ xác định ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính enzyme

Hóa chất Ống thí nghiệm Ống đối chứng

ổn định nhiệt độ enzyme 40 0C/5 phútTinh bột 1% ủ ở 40 0C/5

Kết luận: ở nhiệt 40 0C, 50 0C thích hợp

Hệ số pha loãng ống 40 0C, 50 0C 8 lần

Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme

pH4 pH3

Enzyme

pH7 pH7

pH = 5 là thích hợp nhất

Dựa vào phương trình đường chuẩn y = 0,627X – 0,002 => R2 =0,9952

• Ở pH = 3 thế vào pt đường chuẩn: 0,083 = 0,627X3 – 0,002 => X3 = 0,135Vận tốc ban đầu của phản ứng enzyme: V03 = X/20 phút

Phản ứng enzyme t0pt, 20 phútTCA 5%

(ml)

2,5

0,507

1,280

0,295

0,361

0,432

0,989

1.328

Tính toán:

Nồng độ tyrosine được giải phóng do enzyme protease thủy phân được tính

dựa vào đường chuẩn tyrosine (từ (ATN – AĐC) suy ra X µmol/ml tyrosine sinh ra)

Vận tốc ban đầu của phản ứng enzyme

v0 (µM/phút) = X/20 phút