Phân tích đa hình các gen GH, GHR, DGAT1 và mối liên quan của chúng với sản lượng sữa của bò

PHÂN TÍCH ĐA HÌNH CÁC GEN GH, GHR, DGAT1 VÀ MỐI LIÊN QUAN CỦA CHÚNG VỚI SẢN LƯỢNG SỮA CỦA BÒ Trần Xuân Hoàn, Phạm Thị phương Mai, Nguyễn Thị Quỳnh Châu, Trần Xuân Toàn, Giang Thị Thanh Nhàn, Trịnh Thi Thảo Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Động vật Tóm tắt Phân tích đa hình gen GH, GHR DGAT1 quần thể: Bò lai Ba Vì, bò HF Mộc Châu Tuyên Quang, bò đực giống Moncada cho thấy ba quần thể bò sữa kiểu gen AA LL gen GH chiếm tỷ lệ cao Bò HF Mộc Châu mang kiểu gen AA từ sau chu kỳ cho sản lượng sữa cao so với bò mang kiểu gen AB BB (P0,05) Phân tích gen GHR AluI cho thấy tỷ lệ tần số alen + - tương đương quần thể bò bò đực giống Đặt vấn đề Trong chăn nuôi, chọn lọc giống có ý nghĩa định, góp phần nâng cao suất, giảm giá thành sản xuất tạo nên tính hiệu đảm bảo cho việc phát triển bền vững nghành Những thành tựu nghiên cứu sinh học đại áp dụng vào chọn lọc giống vật nuôi, giúp tiếp cận phương thức chọn lọc mới, xác hiệu phương pháp chọn lọc trợ giúp thị phân tử Các gen liên quan với tốc độ tăng trưởng, sinh sản sản lượng sữa nghiên cứu chọn lọc cách xác hiệu Trong đáng ý là: gen hormon sinh trưởng (GH), gen mã hóa thụ thể hormon sinh trưởng (GHR) gen DGAT1 mã hoá enzym diacylglycerol O-acyltranferase Các công trình nghiên cứu đa hình gen GH bò, cho thấy đa hình gen có ảnh hưởng đến nhiều tính trạng sản xuất, có suất sữa Andrzej Dybus (2002) nghiên cứu đa hình gen GH bò lang trắng đen Ba lan, cho thấy đa hình gen có ảnh hưởng đến tính trạng sản xuất sữa bò Zhou (2005) nghiên cứu đa hình gen GH bò Holstein Bắc Kinh nhận thấy đa hình gen có liên quan với tính trạng sản xuất sữa Lucky (1993) Yao(1996) phát hai điểm đa hình exon gen GH có ảnh hưởng tới tính trạng sản xuất sữa Aggrey (1999) phân tích đa hình gen GHR bò đực giống HF Canada cho thấy đa hình gen có ảnh hưởng tới giá trị giống mỡ sữa Đa hình K232A gen DGAT1 mã hóa enzym diacylglycerol O-acyltranferase xúc tác tổng hợp triglycerid thành phần mỡ sữa, nhà khoa học nghiên cứu nhiều giống bò Holstein, Fleckvieh, Ayrshire, Jersey, Angeln Đức, bò lang trắng đen Ba Lan, Normande, Montbéliarde Pháp Kết cho thấy đa hình K232A gen DGAT1 có ảnh hưởng đến tính trạng sản xuất sữa Tuy nhiên phân bố alen gen DGAT1 giống bò khác ([6, 8,13,14,15,16,17,18,19]) Do đó, tiến hành đề tài xác định mối liên quan đa hình gen GH, GHR DGAT1 với sản lượng sữa bò Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành tổng số 400 cá thể bò bao gồm: - 14 bò đực giống nuôi trung tâm tinh đông lạnh Moncada - 62 bò bê lai nuôi Trung tâm Nghiên cứu bò đồng cỏ Ba Vì - 203 bò bê Holstein Friesian nuôi C.ty giống bò sữa Mộc Châu - 121 bò bê Holstein Freisian nuôi Trại bò sữa Tiền Phong, Tuyên Quang 2.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Lấy mẫu máu Lấy khoản 0,5 ml máu bò, chống đông dung dịch EDTA 0,5 M theo tỷ lệ thể tích 1: 20 2.2.2 Tinh ADN Sử dụng 200 μl máu chống đông để tách chiết ADN, kít hãng Bio Neer 2.2.3 Phản ứng PCR - Sử dụng cặp mồi ký hiệu GH1 để nhân vùng intron gen GH có trình tự sau: 5’-CCCACGGGCAAGAATGAGGC-3’ Xuôi 5’-TGAGGAACTGCAGGGGCCCA-3’ Ngược Chu trình nhiệt: Sau biến tính 94oC phút, thực phản ứng 35 chu kỳ nhiệt sau: 94oC phút, 60oC 50s 72oC phút Sau kết thúc 72oC 10 phút - Sử dụng cặp mồi ký hiệu GH2 để nhân vùng exon gen GH có trình tự sau: 5’- GCTGCTCCTGAGGGCCCTTCG -3’ Xuôi 5’- GCGGCGGCACTTCATGACCCT-3’ Ngược Chu trình nhiệt: Sau biến tính 94oC phút, thực phản ứng 35 chu kỳ nhiệt sau: 94oC phút, 61oC phút 72oC phút Sau kết thúc 72oC phút - Sử dụng cặp mồi ký hiệu GHR để nhân gen GHR có trình tự sau: 5’- TGCGTGCACAGCAGCTCAACC -3’ Xuôi 5’- AGCAACCCCACTGCTGGGCAT-3’ Ngược Chu trình nhiệt: Sau biến tính 94oC 10 phút, thực phản ứng 35 chu kỳ nhiệt sau: 92oC phút, 66oC 80 s 72oC phút Sau kết thúc 72oC phút - Sử dụng cặp mồi ký hiệu DG để nhân gen DGAT1 có trình tự sau: 5’- GCACCATCCTCTTCCTCAAG -3’ Xuôi 5’- GGAAGCGCTTTCGGATG -3’ Ngược Chu trình nhiệt: Sau biến tính 94oC 10 phút để ADN, thực phản ứng 35 chu kỳ nhiệt sau: 94oC phút, 60oC phút 72oC phút Sau kết thúc 72oC phút 2.2.4 Sản phẩm PCR cắt enzym giới hạn Sản phẩm PCR từ cặp mồi GH1 cắt enzym MspI Sản phẩm PCR từ cặp mồi GH2 cắt enzym AluI Sản phẩm PCR từ cặp mồi GHR cắt enzym AluI Sản phẩm PCR từ cặp mồi DG cắt enzym CfrI 2.2.5 Điện di gel agarose Sau cắt sản phẩm PCR enzym giới hạn, kích thước đoạn ADN xác định phương pháp điện di gel agarose (2% agarose cho sản phẩm từ cặp mồi GH1; GHR; DG 2,5% agarose cho cặp mồi GH2) với điện 65V 60 phút hệ đệm TBE 1X, nhuộm ethidium bromide Các băng điện di đối chứng với thang ADN chuẩn Kiểu gen cá thể xác định dựa có mặt hay vắng mặt đoạn ADN 2.2.6 Phân tích xử lý số liệu Xử lý số liệu thống kê theo phương pháp phân tích phương sai ( ONE –WAY ANOVA) phần mềm MINITAB 14 Kết thảo luận 3.1 Phân tích đa hình gen GH MspI Sản phẩm PCR nhân lên từ cặp mồi GH1 thu băng đặc hiệu có kích thước 329 bp phù hợp với kết Zhou (2005) Cắt sản phẩm PCR từ cặp mồi GH1 thu kiểu gen tương ứng sau: Kiểu gen AA thu đoạn có kích thước 224 bp 105 bp, AB thu đoạn có kích thước 329 bp, 224 bp 105 bp BB thu đoạn 329 bp Kết cắt sản phẩm PCR từ cặp mồi GH1 thể hình M Hình Sản phẩm PCR từ cặp mồi GH1 cắt MspI M: Marker 100 bp; 1: kiểu gen BB; 2,3: kiểu gen AB; 4,5,6: kiểu gen AA; 7: sản phẩm PCR Sử dụng MspI cắt sản phẩm PCR từ cặp mồi GH1 400 cá thể bò, thấy mức độ đa hình có khác giống bò Kết trình bày bảng Bảng.1 Tỷ lệ kiểu gen tần số alen gen GH- MspI Đối tượng bò Bò sữa lai Ba Vì Bò HF Mộc Châu Bò HF Tuyên Quang Bò đực giống n (cá thể) 62 203 121 14 Kiểu gen AA (%) 41,94 76,35 61,16 Kiểu gen AB (%) 48,38 21,68 34,71 100 Kiểu gen BB (%) 9,68 1,97 4,13 Tần số alen A 0,66 0,87 0,79 0,50 Tần số alen B 0,34 0,13 0,210 0,50 Qua bảng cho thấy quần thể bò HF Mộc Châu Tuyên Quang, kiểu gen AA chiếm tỷ lệ cao thấp kiểu gen BB Nhưng quần thể bò lai kiểu gen AB có tỷ lệ cao thấp kiểu gen BB Trong quần thể bò đực giống có kiểu gen AB Qua kết cho thấy bò đực giống mang kiểu gen AB 100%, nên đàn bò lai kiểu gen AB chiếm tỷ lệ cao So với đàn bò HF Bắc Kinh, đàn bò HF Mộc Châu Tuyên Quang tỷ lệ kiểu gen tương đối giống nhau, cao kiểu AA thấp kiểu BB Zhou (2005) phân tích đa hình gen GH MspI đàn bò Holstein Bắc Kinh cho thấy kiểu gen AA, AB BB có tỷ lệ tương ứng 77%; 21% 2% Tác giả cho biết bò HF mang kiểu gen AA có sản lượng sữa cao so với bò mang kiểu gen AB BB ba chu kỳ I; II III Có thể trình chăn nuôi, người chăn nuôi chọn lọc bò có suất sữa cao, nên ảnh hưởng đến tần số kiểu gen quần thể 3.2 Phân tích đa hình gen GH AluI Sản phẩm PCR nhân lên từ cặp mồi GH2 thu băng đặc hiệu có kích thước 223 bp phù hợp với kết Mattos (2004) Cắt sản phẩm PCR từ cặp mồi GH2 thu kiểu gen tương ứng sau: Kiểu gen LL thu đoạn có kích thước 171 bp 52 bp, LV thu đoạn có kích thước 223 bp, 171 bp 52 bp VV thu đoạn 223 bp Kết cắt sản phẩm PCR từ cặp mồi GH2 thể hình M Hình Sản phẩm PCR từ cặp mồi GH2 cắt AluI M: Marker 100 bp; 1,3,4,5,6: kiểu gen LL; 2: kiểu gen LV; 7: kiểu gen VV Sử dụng AluI cắt sản phẩm PCR từ cặp mồi GH2 400 cá thể bò, cho thấy tỷ lệ kiểu gen GH có khác giống bò Kết trình bày bảng Bảng.2 Tỷ lệ kiểu gen tần số alen gen GH- AluI Đối tượng bò Bò sữa lai Ba Vì Bò HF Mộc Châu Bò HF Tuyên Quang Bò đực giống n (cá thể) 62 203 121 14 Kiểu gen LL (%) 95,2 77,34 72,73 Kiểu gen LV (%) 3,2 19,70 25,62 100 Kiểu gen VV (%) 1,6 2,96 1,65 Tần số alen L 0,97 0,87 0,86 0,50 Tần số alen V 0,03 0,13 0,14 0,50 Qua bảng cho thấy đàn bò sữa lai bò HF, bò mang kiểu gen LL có tỷ lệ cao thấp kiểu VV Trong bò đực giống có kiểu gen LV Andrzej Dybus (2002) cho biết bò lang trắng đen Ba Lan có kiểu gen LL chiếm tỷ lệ cao 65,3% thấp kiểu gen VV 2,3% Tác giả cho biết bò mang kiểu gen LL có suất sữa cao so với kiểu gen LV VV Theo Lucky (1993) bò HF mang kiểu gen LL có suất sữa cao bò mang kiểu gen LV Qua kết phân tích đa hình gen GH đàn bò sữa lai bò HF cho thấy bò đực giống có kiểu gen dị hợp tử, bò sữa có kiểu gen đồng hợp tử LL cao hai giống, điều cho thấy khả kiểu gen có ảnh hưởng đến kiểu hình bò sữa, nên chọn lọc theo kiểu hình để có bò cho suất sữa cao ảnh hưởng đến tần số kiểu gen đàn, dẫn đến kiểu gen cho suất sữa cao chiếm tỷ lệ cao 3.3 Phân tích đa hình gen GHR enzym AluI Sản phẩm PCR nhân lên từ cặp mồi GHR thu băng đặc hiệu có kích thước 836 bp phù hợp với kết Aggrey (1999) Cắt sản phẩm PCR từ cặp mồi GHR thu kiểu gen tương ứng sau: Kiểu gen +/+ có đoạn với kích thước tương ứng 602 bp, 145 bp, 75 bp 14 bp, kiểu gen +/- có đoạn tương ứng 747 bp, 602 bp, 145 bp, 75 bp 14 bp; kiểu gen -/- có đoạn 747 bp, 75 bp 14 bp Tuy nhiên đoạn 14 bp không phát điện di agarose Kết cắt sản phẩm PCR từ cặp mồi GHR thể hình M Hình Sản phẩm PCR từ cặp mồi GHR cắt AluI M: Marker 100 bp; 1, 2, 4: kiểu gen +/-; 3, ,5,6,7: kiểu gen +/+ Sử dụng AluI cắt sản phẩm PCR từ cặp mồi GHR 400 cá thể bò, thấy tần số alen + alen - có khác giống bò Kết trình bày bảng Bảng Tỷ lệ kiểu gen tần số alen gen GHR- AluI Đối tượng bò Bò sữa lai Ba Vì Bò HF Mộc Châu Bò HF Tuyên Quang Bò đực giống Bò HF Bò lai n ( cá thể) 62 203 121 14 7 Kiểu gen +/+ (%) 30,65 21,18 30,58 14,29 28,57 Kiểu gen +/- (%) 32,25 54,68 55,37 71,42 85,71 57,14 Kiểu gen -/- (%) 37,10 24,14 14,05 14,29 14,29 14,29 Tần số alen + 0,47 0,49 0,58 50,0 0,43 0,57 Tần số alen 0,53 0,51 0,42 50,0 0,57 0,43 Aggrey (1999) phân tích đa hình gen GHR AluI 301 bò đực Canada cho thấy tần số alen (+) 0,53 Trong tần số alen (+) hai nhóm bò đực giống từ năm 19501970 nhóm bò đực giống năm 1980 tương ứng 0,37 0,58 Tần số alen (+) hai nhóm bò có sai khác đáng kể Bò đực HF mang kiểu gen GHR +/+ có giá trị giống hàm lượng mỡ sữa cao bò mang kiểu gen GHR +/- hay GHR-/- 3.4 Phân tích đa hình gen DGAT1 CfrI Đoạn gen DGAT1 nhân lên từ cặp mồi Winter CS (2002) thiết kế có chiều dài mong đợi 411 bp Như cắt sản phẩm PCR gen DGAT1 nhân lên từ cặp mồi DG CfrI thu tối đa kiểu gen AA, KA KK Kiểu gen KA dạng dị hợp tử, cắt enzym CfrI thu đoạn có kích thước tương ứng 411 bp, 208 bp 203 bp Kiểu gen AA dạng đồng hợp tử, có điểm cắt đa hình CfrI, nên cắt enzym CfrI thu đoạn có kích thước tương ứng 208 bp 203 bp Kiểu gen KK dạng đồng hợp tử, điểm cắt đa hình CfrI, nên cắt enzym thu đoạn có kích thước 411 bp chiều dài sản phẩm PCR Nhưng thực nghiệm hai đoạn 203 bp 208 bp tách điện di agarose, nên thực tế kiểu gen KA thu băng băng 411 bp băng nằm khoảng 203-208 bp Kiểu gen AA phân lập điện di agarose thu băng có kích thước khoảng 203-208 bp Kết thể qua hình M 400 bp 411 bp 203-208 bp Hình Sản phẩm PCR từ cặp mồi DG cắt CfrI M: Marker 100 bp; 1-2-3-6: Kiểu gen AA; 4-5: Kiểu gen KA; 7: Kiểu gen KK Dựa vào kết phân lập điện di sản phẩm PCR cắt enzym CfrI 400 cá thể bò, xác định tỷ lệ kiểu gen gen DGAT1 cho đối tượng bò Kết trình bày bảng Bảng.4 Tỷ lệ kiểu gen tần số alen gen DGAT1- CfrI Đối tượng bò Bò sữa lai Ba Vì Bò HF Mộc Châu Bò HF Tuyên Quang Bò đực giống n ( cá thể) 62 203 121 14 Kiểu gen AA( %) 48,39 41,87 18,18 50,0 Kiểu gen KA ( %) 50,0 50,74 66,94 50,0 Kiểu gen KK ( %) 1,61 7,39 14,88 Tần số alen A 0,73 0,67 0,52 0,75 Tần số alen K 0,27 0,33 0,48 0,25 Kết thu tương tự với kết nghiên cứu Gautier (2007) quần thể bò Holstein Pháp, tần số alen A cao tần số alen K (tương ứng 0,63 0,37) Nghiên cứu Näslund (2008) quần thể bò Hoslstein Thụy Điển cho kết tương tự, tần số alen A 0,86, tần số alen K 0,14 Spelman (2002), Thaller (2003), Bennewitz (2004), Kaupe (2007), Banos (2008), Oikonomou (2009) phân tích tần số hai alen A K quần thể bò Hostein khác cho kết ngược lại Tần số alen K chiếm ưu so với alen A Tần số alen K quần thể bò Holstein Friesian New Zealand 0,6 [17]; quần thể bò Holstein Đức 0,548 [18], 0,53 [3] 0,549 [7], bò Holstein Scotland 0,53 [2] bò Holstein Hy Lạp 0,62 [12] Theo kết nghiên cứu Spelman (2002) alen mã hoá lysine làm tăng sản lượng mỡ sữa, lại làm giảm sản lượng protein sữa suất sữa Ở bò Holstein Friesian New Zealand alen mã hoá lysine làm tăng kg mỡ sữa làm giảm 2-3 kg protein sữa 120-130 lít sữa chu kỳ tiết sữa Kết nghiên cứu Thaller (2003), Sander (2006), Kaupe (2007), Näslund (2008) mối liên quan alen A K đến tính trạng sản xuất sữa khẳng định alen K có ảnh hưởng dương đến tính trạng hàm lượng (hàm lượng protein sữa, hàm lượng mỡ sữa), sản lượng mỡ sữa ảnh hưởng âm đến tính trạng sản lượng (sản lượng protein sữa, sản lượng sữa, sản lượng lactose) so với alen A Như chiếm ưu alen A so với alen K quần thể bò sữa nghiên cứu, lần cho thấy nguồn gốc bò hướng chọn lọc nhằm mục đích tăng suất sữa nguyên nhân dẫn đến sai khác Với hướng chọn lọc dựa vào tiêu sản lượng sữa mà không quan tâm tới chất lượng sữa dẫn đến khả tần số alen A ngày chiếm ưu quần thể Qua kết cho thấy tỷ lệ kiểu gen tần số alen có khả cho sản lượng sữa cao quần thể bò cao, cho thấy hướng chọn lọc theo ngoại hình ảnh hưởng đén tần số alen có lợi 3.5 Mối liên quan đa hình gen với sản lượng sữa bò Sau xác định số kiểu gen, so sánh sản lượng sữa bò HF nuôi Mộc Châu mang kiểu gen khác Sản lượng sữa bò mang kiểu gen GH-MspI khác thể qua bảng Bảng Sản lượng sữa bò mang kiểu gen GH- MspI khác Chu kỳ I II III Kiểu gen AA AB,BB AA AB,BB AA AB,BB n 44 10 112 49 Sản lượng sữa, Kg ( M± SD) 4858,8 ± 436,2 4877,7 ± 272,7 5251,1 ± 731,5 5000,0 ± 252,4 6006 ± 1404 5448 ± 695 P 0,901 0,436 0,009 Qua bảng cho thấy bò mang kiểu gen AA có xu cho sản lượng sữa cao bò mang kiểu gen AB BB từ sau chu kỳ II Sau chu kỳ III sản lượng sữa bò mang kiểu gen AA cao đáng kể so với bò mang kiểu gen AB BB (P0,05) Qua kết cho thấy sai khác sản lượng sữa bò mang kiểu gen khác không nhiều sai số chuẩn lớn, điều kiện nuôi dưỡng, chăm sóc bò chủ hộ chưa đồng đều, dẫn đến tiềm di truyền bò mang alen có lợi chưa phát huy tối đa Do để đánh giá ảnh hưởng kiểu gen đến sản lượng sữa cần phải có thí nghiệm đồng nuôi dưỡng Kết luận đề nghị 4.1 Kết luận Tỷ lệ kiểu gen AA tần số alen A gen GH phân tích MspI chiếm tỷ lệ cao quần thể bò sữa Bò HF Mộc Châu mang kiểu gen GH dạng AA có xu cho sản lượng sữa cao bò mang kiểu gen AB BB Từ sau chu kỳ III bò mang kiểu gen AA cho sản lượng sữa cao skể so với bò mang kiểu gen AB BB ( P< 0,01) Tỷ lệ kiểu gen LL tần số alen L gen GH phân tích AluI chiếm tỷ lệ cao quần thể bò sữa Bò HF Mộc Châu mang kiểu gen GH -AluI khác sai khác sản lượng sữa (P>0,05) Tỷ lệ kiểu gen KA tần số alen A gen DGAT1 phân tích CfrI chiếm tỷ lệ cao quần thể bò sữa Bò HF Mộc Châu mang kiểu gen AA có xu cho sản lượng sữa thấp bò mang kiểu gen KA KK tất chu kỳ Tuy nhiên sai khác sản lượng sữa ý nghĩa ( P>0,05) Tỷ lệ tần số alen + - gen GHR phân tích AluI tương đương quần thể bò bò đực giống Sự sai khác sản lượng sữa bò mang kiểu gen khác không nhiều sai số chuẩn lớn, điều kiện nuôi dưỡng, chăm sóc bò chủ hộ chưa đồng đều, dẫn đến tiềm di truyền bò mang alen có lợi chưa biểu 4.2 Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng kiểu gen đến sản lượng sữa qua thí nghiệm đồng nuôi dưỡng Tài liệu tham khảo Aggrey S.E., Yao J., Sabour M.P., Lin C.Y., Zadworny D., Hayes J.F., and Kuhnlein U ( 1999) “ Markers within the regulatory region of the growth hormone receptor gene and their association with milk-related traits in Holsteins” The American Genetic Association 90: PP.148-151 Banos S., Woolliams J.A., Woodward B.W., Forbes A.B., and Coffey M.P (2008) “Impact of Single Nucleotide Polymorphisms in Leptin, Leptin Receptor, Growth Hormone Receptor, and Diacylglycerol Acyltrasferase (DGAT1) Gene Loci on Milk Production, Feed, and Body Energy Traits of UK Dairy Cow” J Dairy Sci 91: 3190- 3200 Bennewitz J., Reinsch N., Paul S., Looft C., Kaupe B., Weimann C., Erhardt G., Thaller G., Kühn C., Schwerin M., Thomsen H., Reinhardt F., Reents R., and Kalm E (2004) “The DGAT1 K232A Mutation Is Not Solely Responsible for the Milk Production Quantitative Trait Locus on the Bovine Chromosome 14” J Dairy Sci 87:431–442 Andrzej Dybus (2002).” Association betweenLeu/Val polymorphismof growth hormone gene and milk production traits in Black-and –White cattle.” Arch.Tierz, Dummerstorf 45: PP.421-428 Gautier M., Capitan A., Fritz S., Eggen A., Boichard D., and Druet T (2007) “Characterization of the DGAT1 K232A and Variable Number of Tandem Repeat Polymorphisms in French Dairy Cattle” J Dairy Sci 90: 2980–2988 Kaupe B., Winter A., Fries R and Erhardt G (2004) “DGAT1 polymorphism in Bos indicus and Bos Taurus cattle breeds” Journal of Dairy Research Vol 71: 182–187 Kaupe B., Brandt H., Prinzenberg E.M and Erhardt G.(2007) “Joint analysis of the influence of CYP11B1 and DGAT1 genetic variation on milk production, somatic cell score, conformation, reproduction, and productive lifespan in German Holstein cattle” J Anim Sci 85:11-21 Kühn C., Thaller G., Winter A., Bininda-Emonds O.R.P., Kaupe B., Erhardt G., Bennewitz J., Schwerin M and Fries R (2004) “Evidence for Multiple Alleles at the DGAT1 Locus Better Explains a Quantitative Trait Locus With Major Effect on Milk Fat Content in Cattle” Genetics 167: 1873–1881 Lucky M.C., Hauser S.D., Eppard P.J., Krivi G.G., Clark J.H., Bauman D.E., Collier R.J (1993)” Variant of somatropin in cattle: Gene frequencies in major dairy breed and associatied milk production.” Domestic Animal Endocrinology,10: PP.325-333 10 Mattos K.K., Silvia Nassif Del Lamma, Mario Luiz Martinez and Ary Ferreira Freitas (2004).” Association of bGH and Pit-1 gene variants with milk production traits in dairy Gyrbulls.”Presq.agropec.bras Brasilia version 39, 2:pp.147-150 11 Näslund J., Fikse W.F., Pielberg G.R., and Lundén A (2008) “Frequency and Effect of the Bovine AcylCoA:Diacylglycerol Acyltransferase (DGAT1) K232A Polymorphism in Swedish Dairy Cattle” J Dairy Sci 91:2127–2134 12 Oikonomou G., Angelopoulou K., Arsenos G., Zygoyiannis D and Banos G (2009) “The effects of polymorphisms in the DGAT1, leptin and growth hormone receptor gene loci on body energy, blood metabolic and reproductive traits of Holstein cows Animal Genetics 40: 10-17 13 Pareek C.S., Czarnik U., Zabolewicz T., Pareek R.S., Walawski K (2005) “DGAT1 K232A quantitative trait nucleotide polymorphism in Polish Black-and-White cattle” J Appl Genet 46(1): pp 85-87 14 Sanders K., Bennewitz J., Reinsch N., Thaller G., Prinzenberg E.M., Kühn C., and Kalm E (2006) “Characterization of the DGAT1 Mutations and the CSN1S1 Promoter in the German Angeln Dairy Cattle Population” J Dairy Sci 89: 3164–3174 15 Schennink A., Stoop W.M., Visker M.H.P.W., Heck J.M.L., Bovenhuis H., Vander Poel J.J,Van Valenberg H.J.F and Van Arendonk J.A.M.(2007) “DGAT1 underlies large genetic variation in milk-fat composition of dairy cows” International Society for Animal Genetics, Animal Genetics, 38, 467–473 16 Schennink A., Heck J.L.M., Bovenhuis H., Visker M.H.P.W., Van Valenberg H.J.F, and Van Arendonk J.A.M (2008) “Milk Fatty Acid Unsaturation: Genetic Parameters and Effects of Stearoyl-CoA Desaturase (SCD1) and Acyl CoA: Diacylglycerol Acyltransferase (DGAT1)” J Dairy Sci 91:2135– 2143 17 Spelman R.J., Ford C.A., McElhinney P., Gregory G.C., and Snell R.G (2002) “Characterization of the DGAT1 Gene in the New Zealand Dairy Population” American Dairy Science Association, J Dairy Sci Vol.85: 3514 – 3517 18 Thaller G., Krämer W., Winter A., Kaupe B., Erhardt G., and Fries R (2003) “Effects of DGAT1 variants on milk production traits in German cattle breeds” J Anim Sci Vol 81: 1911–1918 19 Winter A., Krämer W., Werner F.A.O., Kollers S., Kata S., Durstewitz G., Buitkamp J., Womack J.E., Thaller G., and Fries R (2002) “Asscioation of a lysine-232-alanine polymorphism in a bovine gene encoding acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase (DGAT1) with variation at a quantitative trait locus for milk fat content” PANS _ July 9, 2002 _ vol 99 _ no 14_ 9300 – 9305 20 Yao J., Aggrey S.E., Zadworny D., Heyes J.E and Kuhnllein U (1996).” Sequence variation in the bovine growth hormone gene characterized by single strand conformation polymorphism (SSSP) analysis and their association with milk production traits in Holstein.” Genetics 144:pp.1809-1816 21 Zhou G.L., Jin H.G., Chen L., Guo S.L., Zhu Q and Wu Y.H (2005).” Association of genetic polymorphism in GH gene with milk production traits in Beijing Holstein cows.” J Biosci,30(5): pp.595598