Nghiên cứu quá trình tách phân đoạn sản phẩm polysaccharide từ nấm linh chi đỏ thứ cấp ở việt nam

SVTH: NGƠ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án trước hết xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Thu Huyền trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình phương pháp khoa học tạo điều kiện tốt để chúng tơi hồn thành đồ án Tôi xin chân thành cảm ơn “Bộ môn Q trình - Thiết bị Cơng nghệ Hóa học Thực phẩm” , Viện nghiên cứu phát triển hợp chất thiên nhiên INAPRO, Đại học Bách Khoa Hà Nội tạo điều kiện cho sử dụng phịng thí nghiệm trang thiết bị Mặc dù cố gắng chắn đồ án tránh khỏi thiếu sót Chúng tơi mong nhận đóng góp, phê bình của thầy Chúng tơi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Ngơ Văn Thước Vũ Trí Kỷ GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page SVTH: NGÔ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Nấm Linh chi mọc tự nhiên…………………………………………………….8 Hình 1.2 Nấm Linh chi đỏ ni trồng…………………………………………………….8 Hình 1.3 Phân loại Nấm Linh chi theo màu sắc……………………………………… 10 Hình 1.4 Sản lượng Nấm Linh chi nuôi trồng Nhật Bản …………………………… 18 Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo polysaccharide……………………………………… 20 Hình 2.1 Các thiết bị, dụng cụ thí nghiệm………………………………………………27 Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu…………………………………………………………… 27 Hình 3.1 Các dung dịch chuẩn………………………………………………………… 34 Hình 3.2 Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại……………………………………… 34 Hình 3.3 Đồ thị đường chuẩn……………………………………………………………35 Hình 3.4 Hiện tượng xảy trộn dịch chiết với dung mơi…………………… 37 Hình 3.5 Biểu đồ thể hiệu suất kết tinh polysaccharide dung môi……… 38 Hình 3.6 Ảnh hưởng tỉ lệ dung mơi/dịch chiết đến trình kết tinh polysaccharide ……………………………………………………………………………………………42 Hình 3.7 Tinh thể chưa rửa…………………………………………………………… 44 GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page SVTH: NGƠ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ Hình 3.8 Tinh thể sau rửa axeton…………………………………………… 44 Hình 3.9 Sơ đồ quy trình phân đoạn sản phẩm polysaccharide ……………………… 46 GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page SVTH: NGƠ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học tổng quát Linh chi………………………………… 12 Bảng 1.2 Các hoạt chất sinh học nấm Linh chi………………………………… 13 Bảng 1.3 Tác dụng hoạt chất polysaccharide ……………………………… 22 Bảng 3.1 Hiện tượng kết tinh dung môi…………………………………… 36 Bảng 3.2 Lượng polysaccharide dung dịch, phần kết tinh dung môi phân lớp……………………………………………………………………………………… 37 Bảng 3.3 So sánh khả tạo kết tinh polysaccharide etanol 96% V hỗn hợp etanol 96% V - metanol………………………………………………………………….39 Bảng 3.4 Hiện tượng kết tinh polysaccharide nhiệt độ khác ………… 40 Bảng 3.5 Lượng polysaccharide kết tinh nhiệt độ khác nhau……………………40 Bảng 3.6 Ảnh hưởng tỷ lệ dung mơi/dịch chiết đến q trình kết tinh polysaccharide 41 Bảng 3.7 Số lần kết tinh polysaccharide hàm lượng, hiệu suất thu hồi polysaccharide……………………………………………………………………………40 Bảng 3.8 Kết khảo sát dung môi rửa tinh thể…………………………………… 42 GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page SVTH: NGÔ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Ý nghĩa PS Polysaccharide ATVSTP Vệ sinh an toàn thực phẩm BYT Bộ Y tế QCVN Quy chuẩn Việt Nam TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, dược thảo ngày đóng vai trị quan trọng phòng bệnh, chữa bệnh nâng cao sức khỏe Từ lâu, nấm Linh chi loại thảo dược quý hiếm, xem “thần dược” Theo Đơng y, Linh chi có tác dụng kiện não, bảo an, cường tâm, cường phế, giải độc, trường sinh, Theo Tây y, từ Linh chi người ta bào chế thuốc chữa nhiều bệnh, đáng quan tâm bệnh tiểu đường, viên gan, ung thư, AIDS [16] Thành phần tạo nên hoạt tính kỳ diệu Linh chi nhóm chất polysaccharide số hoạt chất khác Nhóm PS Linh chi polymer thiên nhiên, có cấu trúc đa dạng phức tạp Hàm lượng, cấu trúc thành phần hóa học polysaccharide khác loại Linh chi khác nhau, chí lồi ni trồng điều GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page SVTH: NGƠ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ kiện khác có hàm lượng cấu trúc hóa học khác Vì vậy, việc nghiên cứu tách chiết nhóm polysaccharide nấm Linh chi vấn đề không đơn giản Hiện nay, người dân Việt Nam sử dụng nấm Linh chi nhiều, từ nhiều nguồn khác nhau: nuôi trồng, thu hái thiên nhiên hay nhập Hiện nay, giá thành nấm thị trường dao động từ 300.000- 30.000.000 đ/kg tùy theo loại nấm: nuôi trồng, thiên nhiên, thời gian thu hoạch ngắn ngày hay dài ngày [17] Nhiều địa phương nước có phong trào ni trồng nấm Linh chi lấy giống từ Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc Do vậy, để đáp ứng nhu cầu dược phẩm, thực phẩm chức nước việc tách chiết, tinh chế riêng nhóm polysaccharide từ nấm Linh chi cần thiết Xuất phát từ điều kiện thuận lợi nhu cần nêu thực đề tài: “Nghiên cứu trình tách phân đoạn sản phẩm polysaccharide từ nấm Linh chi đỏ thứ cấp Việt Nam” CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu nấm Linh chi 1.1.1 Nguồn gốc, phân bố, phân loại đặc điểm nấm Linh chi 1.1.1.1 Nguồn gốc, phân bố Tên gọi: Nấm Linh Chi, Nấm Trường Thọ, Nấm thần tiên, Cỏ trường sinh, Hạnh nhĩ … Tên khoa học: Ganoderma lucidum Nấm Linh Chi thuộc: [3] - Giới (regnum): Nấm (Fungi) GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page SVTH: NGƠ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ - Ngành (phylum): Nấm đảm (Basidiomycota) - Lớp (class): Agaricomycetes - Bộ (ordo): Polyporales - Họ (familia): Nấm gỗ (Ganodermataceae) - Chi (genus): Ganoderma Loài (pecies): Ganoderma Lucidum Nấm Linh chi đỏ (Red Ganoderma) loại nấm thảo dược mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe Từ 2000 năm trước nấm Linh chi đỏ sử dụng Nhật Bản Trung Quốc, coi loại nấm sử dụng thuốc chữa bệnh Từ xa xưa, nấm dành riêng cho hoàng đế thành viên hoàng gia sử dụng [15] Trong tự nhiên, linh chi mọc rừng rậm, ánh sang có độ ẩm Tuy nhiên khơng phải thân mọc nấm Linh chi, mà hàng vạn có vài mọc Những thân mục thường mọc nấm Linh chi mận, câu dẻ (pasania) guercus serrata [1] Chính loại nấm Linh chi tự nhiên quý có giá trị cao GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page SVTH: NGƠ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ Hình 1.1 Nấm Linh chi mọc tự nhiên Hình 1.2 Nấm Linh chi đỏ ni trồng 1.1.1.2 Phân loại Các lồi Linh chi có đến 80 lồi, Linh chi đỏ gọi Linh chi chuẩn để phân biệt với lồi khác chi Khi nói đến Linh chi đề cập đến Linh chi đỏ Ganoderma lucidum, loại tốt loài thuộc họ Linh chi [6] Có nhiều cách phân loại, cách phân loại dễ thấy lâu đời phân loại theo màu sắc Sách Bản thảo cương mục Lý Thời Trần, đại danh y Trung Quốc vào tính vị, cơng năng, tác dụng mà phân loại Linh chi thành loại [1] Thanh chi (Long chi): Màu xanh, tính bình, khơng độc; chủ trị sáng mắt, bổ can khí, an thần, tăng trí nhớ Hồng chi (Xích chi, Đơn chi): Màu đỏ, vị đắng, tính bình, khơng độc; chủ trị xung trung kết (tức ngực) ích tâm khí, bổ trung, tăng trí nhớ Hoàng chi (Kim chi): Màu vàng, vị cam (ngọt), tính bình, khơng độc; chủ trị ích trùng khí, an thần GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page SVTH: NGƠ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ Bạch chi (Ngọc chi): Màu trắng, vị cay, tính bình, khơng độc; chủ trị ích phế khí, làm thơng miệng, mũi, an thần Hắc chi (Huyền chi): Màu đen, vị mặn, tính bình, khơng độc; chủ trị ù tai, lợi khớp, bảo vệ cơng hệ thần kinh, ích tinh khí, làm dai gân cốt Tử chi (Mộc chi): Màu tím, vị ngọt, ơn, khơng độc; chủ trị lợi tiểu, ích thận khí Ngồi Linh chi cịn phân loại theo màu sắc (hình 1.3) Hình 1.3 Phân loại Nấm Linh chi theo màu sắc 1.1.1.3 Đặc điểm thực vật nấm Linh chi đỏ a Đặc điểm sinh học Về hình thái ngồi chúng có nhiều sai khác Quả thể có cuống dài ngắn, thường đính bên, đơi trở thành đính tâm q trình liền tán mà thành Cấu tạo gồm phần: cuống nấm mũ nấm GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page SVTH: NGÔ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ - Cuống nấm: Thường hình trụ mảnh (đường kính cỡ 0,3 - 0,8 cm) mập khỏe (đường kính - 3,5 cm), phân nhánh, đơi có uốn khúc cong biến dạng q trình ni trồng Lớp vỏ cuống láng bóng màu đỏ - nâu hay đỏ - nâu đen - Mũ nấm: Dạng thận, gần trịn, đơi xịe hình quạt nhiều dị dạng đồng tâm Màu sắc từ vàng chanh, vàng nghệ, vàng nâu, vàng cam, đỏ nâu, nâu tím, nhẵn bóng Khi già, mũ nấm sẫm màu, láng lớp phấn màu đỏ nâu lên bề mặt ngày nhiều dày Kích thước tai nấm biến động lớn, từ – 12 cm, dày từ 0,8 – 3,3 cm Phần đính cuống lồi lên lõm xuống lõm hình rốn - Thịt nấm: Dày từ 0,4 – 2,2 cm, có màu vàng kem, nâu nhạt, trắng kem, phân chia kiểu lớp lớp Ở lớp trên, tia sợi hướng lên Lát cắt giải phẫu hiển vi, thấy đầu sợi phình hình chùy, màng dày, đan khít vào nhau, tạo thành lớp vỏ láng dày khoảng 0,2 – 0,5mm Nhờ lớp láng bóng khơng tan nước mà nấm chịu mưa, nắng Ở lớp dưới, hệ sợi tia xuống đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào tử - Tầng sinh sản: Là lớp ống dày từ 0,2 – 1,8 cm màu kem, nâu nhạt gồm ống nhỏ thẳng, miệng tròn, màu trắng, vàng chanh nhạt, khoảng 3-35 ống/mm - Bào tử: Thường mơ tả dạng trứng, có cấu trúc vỏ kép, màu vàng mật ong sáng kích thước bào tử nhỏ dao động nhiều từ – 11,5 x - 7,7 µm Các hợp chất có bào tử như: Polyssacharide, triterpen, acid béo, acid amin, vitamin nguyên tố vi lượng với hàm lượng cao thân cuống Linh chi từ đến 20 lần Tuy vậy, số lượng bào tử Linh chi ít, thu hoạch nấm Linh chi thu 1kg bào tử GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page 10 SVTH: NGÔ VĂN THƯỚC – VŨ Ũ TRÍ KỶ K Máy siêu âm Máy cấtt quay chân khơng Máy đo quang phổ UV-vis Hình 2.1 Các thiết thi bị thí nghiệm 2.2 Phương pháp nghiên cứu u Quy trình nghiên cứu đượcc tiến ti hành theo sơ đồ hình 2.2 GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN HUY Page 33 SVTH: NGÔ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ + Đơn dung mơi: etanol 96%V, Metanol, Aceton, Dietyl ete, Cloroform, Etyl axetat + Hỗn hợp dung môi: etanol 96%V-metanol theo tỷ lệ 3/1 (v/v) pH: Dùng HCl NaOH điều chỉnh pH từ 2÷12 (Dung mơi etanol 96%V, tỷ lệ dung môi/dịch chiết = 4/1 50C) Dịch chiết Cô đặc Nhiệt độ: Khảo sát 50C; 100C; 150C; 200C (Dung môi etanol 96%V) Dung dịch A - Nghiên cứu trình tách PS Tỷ lệ dung môi/dịch chiết (v/v): 1/1; 2/1; 3/1; 4/1 (Dung môi etanol 96%V 50C) Xác định lượng PS kết tinh Xác định hàm lượng PS Xác định tiêu nấm mốc Thời gian: 30, 60, 90, 120 phút (Dung môi etanol 96%V, tỷ lệ dung môi/dịch chiết 3/1 50C) Số lần kết tinh lại: lần (Dung môi cồn 96%V, tỷ lệ dung môi/dịch chiết = 3/1 50C) Dung môi rửa tinh thể: + Axeton + n-hexan Xác định lượng hàm lượng PS tinh thể Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page 34 SVTH: NGÔ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ 2.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu Thực nghiệm tiến hành sở kết nghiên cứu nhóm "Nghiên cứu q trình trích ly thu hồi PS từ nấm Linh chi đỏ thứ phẩm trồng Việt Nam" Nguyễn Văn Sơn tiến hành Cân xác 40 g nấm Linh chi đỏ xay kích thước nhỏ 2mm đưa vào trích ly siêu sâm tần số 35 kHz nước nhiệt độ 900C với tỷ lệ khối lượng rắn/lỏng 1/25 thời gian 30 phút Sau tiến hành lọc chân khơng thu lấy phần dịch chiết Dịch chiết đem cất chân không 700C để tăng nồng độ PS thu dung dịch A phân tích nồng độ PS có dung dịch A 2.2.2 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến q trình kết tinh nhóm PS Dựa vào đặc tính độ tan nhóm PS (khơng tan dung môi phân cực phân cực trung bình alcohol, acetone… tan dung mơi phân cực nước, NaOH loãng, formamide dimethylsulfoxide) Phương pháp tách phân đoạn sản phẩm cao chiết nấm Linh chi đỏ lựa chọn phương pháp kết tinh PS từ dung dịch hịa tan Trong q trình kết tinh nhóm PS, loại dung mơi, nồng độ PS, pH dung dịch, nhiệt độ, thời gian kết tinh, số lần kết tinh… ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất kết tinh thơng số nghiên cứu khảo sát Sau kết tinh, mẫu tiến hành lọc, sấy chân không 600C đến khối lượng khơng đổi đem phân tích UV-Vis xác định hàm lượng Nồng độ PS dung dịch A 17,38 mg/ml - Thí nghiệm khảo sát dung mơi: GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page 35 SVTH: NGÔ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ + Đơn dung mơi : Lấy ống nghiệm ống nghiệm lấy ml dung dịch A vào ống nghiệm thêm vào ống nghiệm ml loại dung môi khác theo tỷ lệ dung môi/dung dịch = 4/1 (V/V) Các loại dung môi nghiên cứu là: Etanol 960, metanol, aceton, n-hexan, etylaxetat, chloroform, dietylete Hỗn hợp lắc đều, làm lạnh 50C Sau đó, mẫu lấy quan sát mức độ kết tinh lọc thu tinh thể sấy khô xác định khối lượng đem phân tích xác định hàm lượng PS + Kết tinh PS hỗn hợp dung môi : Lấy ống nghiệm ống nghiệm lấy 5ml dung dịch A ống nghiệm thêm vào 20 ml etanol 96 %V tỷ lệ dung môi/dung dịch = 4/1 (V/V) ống nghiệm lại thêm vào ống nghiệm 15ml etanol 96 %V 5ml metanol (tỉ lệ dung dịch/etanol/metanol 1/3/1 (ml/ml/ml)) Lắc ống nghiệm, làm lạnh lưu 50C thời gian Sau mẫu lọc, sấy đem phân tích hàm lượng PS - Thí nghiệm thay đổi pH dung dịch (dùng HCl NaOH để đưa dung dịch môi trường axit bazơ): Thực thí nghiệm khác nhau: Mỗi thí nghiệm lấy 2ml dung dịch A thêm ml etanol 96% V tỷ lệ dung mơi/dung dịch = 4/1 (V/V) Sau điều chỉnh pH giá trị xác định Các giá trị pH nghiên cứu 2, 3…11, 12 Làm lạnh 50C Sau đem lọc sấy phân tích hàm lượng PS GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page 36 SVTH: NGÔ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ - Thí nghiệm đánh giá tác động nhiệt độ đến trình kết tinh PS: Quá trình kết tinh tốt nhiệt độ thấp nên nhiệt độ nghiên cứu là: 5, 10, 15, 200C Mỗi thí nghiệm lấy 3ml dung dịch A thêm 12 ml etanol 96% V tỷ lệ dung môi/dung dịch = 4/1 (V/V) Các mẫu bảo quản nhiệt độ xác định - Thí nghiệm xác định ảnh hưởng tỷ lệ dung môi (etanol 96%V/V)/dịch chiết: Lấy 5ml dung dịch A vào ống nghiệm thêm vào ống lượng etanol 96% V Các thể tích nghiên cứu là: 5ml, 10ml, 15ml, 20ml (tương ứng với tỷ lệ etanol 96% V/dung dịch (V/V) là: 1/1, 2/1, 3/1, 4/1) Các mẫu làm lạnh 50C - Thí nghiệm xác định ảnh hưởng thời gian đến trình kết tinh PS: Mỗi thí nghiệm lấy 3ml dung dịch A thêm ml cồn 96% V tỷ lệ dung môi/dung dịch = 3/1 (V/V) Các mẫu làm lạnh 50C thời gian khác Thời gian khảo sát 30, 60, 90, 120 phút 2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng số lần kết tinh lại PS Hòa 15ml dung dịch A với 45 ml etanol 96 %V (tỷ lệ dung môi/dung dịch = 3/1 (V/V) Làm lạnh mẫu lưu 50C Lọc thu phần kết tinh đem sấy phân tích hàm lượng PS Phần nước lọc thu đem cất quay chân không đến V = 10ml (làm tăng nồng độ PS nước lọc) Mẫu thêm etanol 96 %V vào với tỷ lệ dung môi/dung dịch = 3/1 (V/V) Quá trình làm lạnh để nhóm PS kết tinh tiến GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page 37 SVTH: NGÔ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ hành lọc rửa Q trình thực đến không quan sát tinh thể dừng lại 2.2.4 Thí nghiệm lựa chọn dung môi rửa tinh thể PS - Để rửa sản phẩm kết tinh hai dung môi aceton n-hexan khảo sát: Lấy 5ml dung dịch A cho mẫu, bổ sung etanol 96 %V (tỷ lệ dung môi/dung dịch=3/1 (V/V) Làm lạnh mẫu 50C Sau lấy lọc, thí nghiệm chia làm trường hợp: + Trường hợp 1: Không rửa + Trường hợp 2: Rửa axeton + Trường hợp 3: Rửa n-hexan Sau sản phẩm sấy khơ phân tích hàm lượng PS 2.3 Phương pháp định lượng nhóm PS Xác định hàm lượng PS phương pháp phenol – sulfuric: Dựa hấp thụ bước sóng mà phức chất tạo phenol cacbohydratehấp thụ cực đại Hàm lượng PS xác định cách so sánh độ hấp thụ mẫu thực so với mẫu chuẩn đo máy quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến UV-1650PC - Pha phenol 5%: Cân 5g phenol, hịa tan hồn tồn nước cất bình định mức 100ml ta dung dịch phenol nồng độ % khối lượng GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page 38 SVTH: NGƠ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ - Cân xác 0,25g D-glucose, hịa tan nước cất định mức đến vạch bình định mức 250ml ta có dung dịch B nồng độ 1mg/ml + Lấy 50ml dung dịch B vào bình định mức 500ml nước cất đến vạch Dung dịch D-glucose có nồng độ 100 µg/ml (dung dịch C) Lần lượt lấy 25, 50, 75, 100 ml dung dịch C vào bình định mức 100ml đến vạch nước cất ta có dung dịch D-glucose có nồng độ tương ứng là: 25, 50, 75, 100µg/ml Tiến hành tương tự để pha mẫu chuẩn có nồng độ khác theo yêu cầu Hình 2.3 Các mẫu chuẩn - Dựng đường chuẩn: Lấy ml mẫu cho vào ống nghiệm, thêm vào ống nghiệm 1ml dung dịch phenol 5% ml dung dịch H2SO4 96% lắc ống nghiệm Đặt mẫu vào cốc nước sơi cách thủy phút, sau để nguội mẫu đến nhiệt độ phòng (250C) 30 phút Lấy mẫu chuẩn nồng độ 100 µg/ml quét phổ chế độ toàn dải để xác định bước sóng dung dịch hấp thụ cực đại 486nm (hình) Đo độ hấp thụ quang (A) dung dịch chuẩn bước sóng xác định GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page 39 SVTH: NGƠ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ Sau dựng đường chuẩn dựa mối quan hệ nồng độ mẫu độ hấp thụ quang tìm Hình 2.4 Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại - Chuẩn bị mẫu thực: Lấy ml dung dịch cần xác định nồng độ đưa vào bình định mức 50ml định mức đến vạch Lấy 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm, thêm vào ống nghiệm 1ml dung dịch phenol 5%, ml dung dịch H2SO4 96%, lắc Quá trình đun cách thủy làm nguội đo mật độ quang giống hệt mẫu chuẩn 2.4 Xây dựng cơng thức tính tốn a Tính tốn hàm lượng PS  Khối lượng PS có sản phẩm tính theo cơng thức sau: m= ∗ ∗ ∗ ∗ , ( ) (3.1) GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page 40 SVTH: NGÔ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ Trong đó: m: khối lượng PS sản phẩm (g) C: nồng độ PS mẫu (đã xác định sở đường chuẩn) (μg/ml) V: thể tích lượng dịch pha (V=100ml) n: tỉ lệ khối lượng sản phẩm PS kết tinh tổng/khối lượng PS lấyra pha 162/180 = hệ số để chuyển đổi từ D-glucose tự xác định, thành glucose khan tìm thấy PS 1/106: hệ số chuyển từ (μg) sang (g)  Hàm lượng PS sản phẩm sau kết tinh tính: HL = ∗ 100 , (%) Trong đó: HL: hàm lượng PS kết tinh (%) : khối lượng PS kết tinh (g), tính theo (3.1) : khối lượng kết tinh thu (g) b Tính hiệu suất kết tinh PS η= ∗ 100 , (%) Trong : η: hiệu suất kết tinh PS (%) GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page 41 SVTH: NGƠ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ : khối lượng PS sản phẩm kết tinh (g) m : khối lượng PS mẫu 2.5 Xây dựng quy hoạch thực nghiệm cho q trình kết tinh PS Tối ưu hóa phương pháp quy hoạch thực nghiệm thống kê Các thơng số để tối ưu hóa là: tỷ lệ dung môi/dung dịch (V/V), pH, nhiệt độ ( 0C) Bảng 2.1 Kế hoạch bậc hai tối ưu với k=3 N0 x0 x1 x2 x3 x1x2 x1x3 x2x3 x'1 x'2 x'3 y 1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 0,27 0,27 0,27 y1 +1 -1 -1 -1 -1 +1 0,27 0,27 0,27 y2 -1 +1 -1 -1 +1 -1 0,27 0,27 0,27 y3 +1 +1 -1 +1 -1 -1 0,27 0,27 0,27 y4 -1 -1 +1 +1 -1 -1 0,27 0,27 0,27 y5 +1 -1 +1 -1 +1 -1 0,27 0,27 0,27 y6 -1 +1 +1 -1 -1 +1 0,27 0,27 0,27 y7 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0,27 0,27 0,27 y8 -1,215 0 0 0,746 -0,73 -0,73 y9 10 +1,215 0 0 0,746 -0,73 -0,73 y10 11 -1,215 0 0 -0,73 0,746 -0,73 y11 12 +1,215 0 0 -0,73 0,746 -0,73 y12 13 0 -1,215 0 -0,73 -0,73 0,746 y13 GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page 42 SVTH: NGÔ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ 14 0 +1,215 0 -0,73 -0,73 0,746 y14 15 0 0 0 -0,73 -0,73 -0,73 y15 2.5.1 Tính hệ số phương trình hồi quy 2.5.1.1 Tính chất ma trận trực giao cấp Ma trận khơng trực giao vì: ∑ ≠ ∑ ≠ Để thuận tiện cho việc tính tốn đưa trực giao Muốn phải biến đổi bình phương dạng : = Khi ∑ − ∑ =∑ = − − ̅ ̅ = =0 2.5.1.2 Tính hệ số phương trình hồi quy Tính trực giao ma trận kế hoạch hóa làm giảm nhiều khó khăn việc tính tốn hệ số phương trình hồi quy, ma trận hệ số phương trình chuẩn (X*X) trở thành ma trận đường chéo phần tử số thí nghiệm N ma trận kế hoạch Các phần tử đường chéo ma trận nghịch đảo (X*X)-1 có giá trị: Cij= Vì ma trận hệ số B tính sau: GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page 43 SVTH: NGƠ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ ∑ ⋯ ⎡ ⎢ B= = (X*X)-1X*Y = ⎢ ⋮ … ⎢ ⎣0 ⋯ 0⎤ ∑ ⎥ ∑ ⋮⎥ … ⎥ ∑ ⎦ ⎡ ⎢∑ =⎢ ⎢ … ⎢∑ ⎣ ⎤ ⎥ ⎥ ⎥ ⎥ ⎦ Như vậy, hệ số của phương trình hồi quy bj xác định tích vơ hướng cột y với cột tương ứng xj, sau đem chia cho số thí nghiệm ma trận kế hoạch hóa bj = ∑ bju = b’0 = bjj = ∀j = 1,k ∑ ∑ ∑( ) ∀j,u = 1,k j≠u ∑ ∑ ∑( ) ∀j = 1,k Phương trình hồi quy tuyến tính mô tả hệ : ŷ = b0 + ∑ bjxj + ∑ , bjuxjxu + ∑ bjjxj2 Với k = phương trình có dạng : ŷ = b0+b1x1+b2x2+b3x3+b12x1x2+b13x1x3+b23x2x3 +b11x21+b22x22+b33x23 Trong giá trị hàm mục tiêu ŷ hiệu suất trình kết tinh PS 2.5.2 Kiểm tra ý nghĩa hệ số bj phương trình hồi quy GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page 44 SVTH: NGƠ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ Để kiểm tra ý nghĩa hệ số bj phương trình hồi quy phải tính phương sai lặp Sau hồn thành tất thí nghiệm, phải làm thêm m thí nghiệm lặp tâm kế hoạch với giá trị ứng với thí nghiệm lặp tâm là: , , … Hệ số bj phương trình hồi quy độc lập với xác định với độ xác (Sbj) Nghĩa độ lệch chuẩn hệ số bj có chung giá trị: = ∑ ∀ j = 1,k Giá trị phương sai lặp tính theo cơng thức: = ∑ ( − −1 ) Ở đây: m – số thí nghiệm tâm phương án yoa- giá trị hàm mục tiêu thực nghiệm thứ a tâm kế hoạch y0 - giá trị trung bình m thực nghiệm tâm kế hoạch: y0 = ∑ Tính có nghĩa hệ số bj kiểm định theo chuẩn số Student xác định sau: tbj = Trong đó: bj – hệ số thứ j phương trình hồi quy Sbj – độ lệch quân phương hệ số bj GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page 45 SVTH: NGÔ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ Tra bảng Student với mức ý nghĩa p, bậc tự lặp fll = m-1, ta giá trị chuẩn số Student tp(fll) Kiểm tra tính tương hợp hệ số bj: - Nếu tbj ≥ tp.fll hệ số bj có nghĩa giữ lại - Nếu tbj < tp.fll ngược lại hệ số bj khơng có nghĩa bị loại khỏi phương trình hồi quy 2.5.3 Kiểm tra tương hợp phương trình hồi quy với thực nghiệm Sau kiểm tra ý nghĩa hệ số bj, viết phương trình hồi quy với hệ số có nghĩa kiểm tra tính tương hợp phương trình hồi quy với thực nghiệm Phương sai dư tính theo cơng thức: S2dư = ∑ ( −ŷ ) Trong đó: yi – giá trị hàm mục tiêu từ thực nghiệm ŷi – giá trị hàm mục tiêu tính theo phương trình hồi quy thực nghiệm sau thay biến xj tương ứng thí nghiệm vào N – số thí nghiệm l – số hệ số có nghĩa phương trình hồi quy Sự tương hợp mơ hình, kiểm ta nhờ chuẩn số Fisher: F= Với ư phương sai dư phương sai lặp tính GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page 46 SVTH: NGƠ VĂN THƯỚC – VŨ TRÍ KỶ Tra bảng chuẩn số Fisher mức có ý nghĩa, bậc tự dư fl = N-l bậc tự lặp f2 = m-1 ta F1-p(f1,f2) So sánh chuẩn số Fisher tính với chuẩn số tra bảng, nếu: - F ≤ F1-p(f1,f2) phương trình hồi quy tương hợp với thực nghiệm - F > F1-p(f1,f2) phương trình hồi quy khơng tương hợp với thực nghiệm GVHD: TS NGUYỄN THỊ THU HUYỀN Page 47