Nghiên cứu quá trình thủy phân vỏ sầu riêng bằng chủng nấm mốc trichoderma harzianum và ứng dụng sản xuất sinh khối protein đơn bào

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG LÊ THỊ NHƯ NGUYỆT TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN VỎ SẦU RIÊNG BẰNG CHỦNG NẤM MỐC TRICHODERMA HARZIANUM VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT SINH KHỐI PROTEIN ĐƠN BÀO Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 60.54.01.01 TÓM TẮT THẠC SĨ KỸ THUẬT Hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh Đà Nẵng - Năm 2017 Công trình hoàn thành ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trương Thị Minh Hạnh Phản biện 1: TS Nguyễn Thị Trúc Loan Phản biện 2: PGS.TS Trần Thị Xô Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Kỹ thuật họp Đại học Đà Nẵng vào ngày 26 tháng năm 2017 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Ngày nay, với tốc độ tăng sản lượng lương thực, thực phẩm không theo kịp tốc độ tăng dân số; phân phối nguồn protein không đồng nơi giới; môi trường ô nhiễm làm dần nguồn lợi thức ăn từ tự nhiên làm thiếu hụt nguồn protein đa bào Do đó, ưu điểm protein đơn bào khả sinh sản phát triển nhanh, hàm lượng protein cao, thành phần cân đối đầy đủ, dễ điều khiển chất lượng cách thay đổi điều kiện nuôi cấy tác động vào hệ gene, chủ động sản xuất, chiếm diện tích mở tiềm thay nguồn protein đa bào vi sinh vật nguồn cung cấp thức ăn tương lai [3] Protein đơn bào (Single-cell protein – SCP) thuật ngữ thường dùng để phần protein thu sinh khối khô tế bào tổng lượng protein tách chiết từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật, sử dụng làm nguồn thức ăn cho người hay nguồn thức ăn chăn nuôi Các protein đơn bào có thành phần protein cao (60-80% khối lượng khô tế bào), chất béo, cacbohydrat, axit nucleic, vitamin chất khoáng Chúng chứa nhiều axit amin thiết yếu lysin methionin [9] Công nghệ sản xuất protein đơn bào công nghệ nuôi cấy thu sinh khối vi sinh vật Nó đời coi phương pháp hứa hẹn giải vấn đề thiếu protein toàn giới Công nghệ sản xuất protein đơn bào bao gồm trình chuyển vị sinh học, biến đổi sản phẩm phụ giá trị chi phí thấp, thường chất thải, trở thành sản phẩm với giá trị dinh dưỡng giá trị thị trường cao Hiện nay, xenluloza từ nguồn nông nghiệp lâm nghiệp nguồn nhiên liệu tái tạo nhiều hành tinh này, đồng thời nguồn nguyên liệu tiềm cho sản xuất protein đơn bào Trong đó, vỏ trái sầu riêng phụ phẩm sầu riêng chiếm phần lớn trọng lượng trái, sau thu hoạch lấy phần thịt để chế biến phần vỏ trái phần nhỏ đem phơi khô để đốt, phần lớn lại bị vứt bỏ đi, trở thành nguồn gây ô nhiễm môi trường lớn Do đó, việc nghiên cứu xử lý, tận dụng vỏ trái sầu riêng vấn đề cấp thiết đặt Trong vỏ trái sầu riêng có tổ hợp nhiều nhóm vi sinh vật tự nhiên chúng thường không đặc hiệu nên trình phân huỷ phải lâu Vỏ trái sầu riêng có thành phần khó phân hủy lignin với hàm lượng cao Nếu nhanh chóng phân hủy thành phần rút ngắn thời gian lên men tạo đường glucoza - nguồn dinh dưỡng để sản xuất protein đơn bào Sử dụng nấm Trichoderma để ủ vỏ trái sầu riêng khả phân hủy nhanh thành phần lignin, có hệ enzym phong phú gồm xenlulaza, chitinaza, xylanaza, proteaza, pectinaza, amylaza nên có khả phân giải tốt chất xơ, chitin, lignin, pectin phế thải hữu thành đơn chất dinh dưỡng, giúp trình tạo thành đường glucoza nhanh hiệu [20] Từ vấn đề việc nghiên cứu sản xuất protein đơn bào từ phế phẩm nông nghiệp mang tính cấp thiết phù hợp với nhu cầu phát triển ngành công nghệ thực phẩm ngành nông nghiệp Việt Nam giai đoạn tương lai Chính lí mà đề tài " Nghiên cứu trình thủy phân vỏ sầu riêng chủng nấm mốc Trichoderma harzianum ứng dụng sản xuất sinh khối protein đơn bào" thực với mục đích tận dụng, tái chế phế phẩm nhằm làm giảm tác hại đến môi trường Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình sản xuất protein đơn bào từ vỏ trái sầu riêng quy mô phòng thí nghiệm Đối tượng nghiên cứu Vỏ sầu riêng thu nhận vùng Đăklăk, chủng nấm mốc Trichoderma Harzianum, chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae Bộ môn Công nghệ Sinh học cung cấp Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu tổng quan lý thuyết để có sở nghiên cứu thực nghiệm Phương pháp hóa học Phương pháp vi sinh Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu vỏ sầu riêng thu gom Đăklăk; chủng nấm mốc Trichoderma harzianum; nấm men Saccharomyces cerevisiae Bộ môn Công nghệ sinh học cung cấp Phòng thí nghiệm khoa Hóa - Trường Đại học Bách Khoa ĐHĐN Chỉ nghiên cứu quy mô phòng thí nghiệm Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu * Ý nghĩa khoa học - Xác định thành phần hóa học vỏ sầu riêng - Xác định điều kiện để thủy phân vỏ sầu riêng nấm Trichoderma Harzianum với quy mô phòng thí nghiệm - Ứng dụng sản xuất protein đơn bào từ dịch đường sau trình thủy phân vỏ sầu riêng * Ý nghĩa thực tiễn - Tận dụng phế liệu ngành nông nghiệp để tạo nguồn nguyên liệu để sản xuất protein đơn bào - Góp phần vào việc giải toán môi trường xử lý nguồn phế liệu từ vỏ trái sầu riêng thành sản phẩm có ích cho kinh tế, cho ngành nông nghiệp hạn chế gây ảnh hưởng đến môi trường Kết cấu luận văn Luận văn gồm có chương sau: Mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận Chương 4: Kết luận kiến nghị Tài liệu tham khảo Quyết định giao đề tài luận văn Phụ lục CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ PROTEIN ĐƠN BÀO 1.1.1 Protein đơn bào 1.1.2 Công nghệ sản xuất protein đơn bào 1.1.3 Quy trình sản xuất protein đơn bào từ vi sinh vật 1.1.4 Các nhóm vi sinh vật sử dụng để sản xuất protein đơn bào 1.1.5 Saccharomyces cerevisiae 1.1.6 Các nguồn nguyên liệu để sản xuất protein đơn bào 1.2 TỔNG QUAN VỀ VỎ SẦU RIÊNG 1.3 TỔNG QUAN VỀ NẤM TRICHODERMA 1.4 TỔNG QUAN VỀ CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nước 1.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên liệu a Vỏ sầu riêng Sầu riêng trồng nhiều vùng miền Trung - Tây Nguyên Vỏ sầu riêng thu nhận Đăklăk, sau thu vỏ rửa nhiều lần với nước để loại bỏ tạp chất đem sấy 110°C đến đạt độ ẩm không đổi Sau đó, đem nghiền với kích thước 0,1cm bảo quản bao bì nilon để sử dụng các nghiên cứu b Chủng Trichoderma harzianum, Chủng Sacharomyces cerevisiae - Chủng Trichoderma harzianum, chủng Sacharomyces cerevisiae bảo quản nhiệt độ -20 0C Bộ môn Công nghệ sinh học, Đại học Bách khoa Đà Nẵng cung cấp Sau hoạt hóa, chủng vi sinh vật bảo quản nhiệt độ 4°C để nghiên cứu 2.1.2 Hóa chất nghiên cứu 2.1.3 Thiết bị thí nghiệm 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phân tích thành phần hoá học của vỏ trái sầu riêng 2.2.2 Phân tích đánh giá chất lượng dung dịch đường sau thủy phân Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp DNS [20] 2.2.3 Phương pháp hoạt hóa Nhân giống Trichoderma harzianum phòng thí nghiệm a Phương pháp hoạt hóa Trichoderma harzianum phòng thí nghiệm + Thành phần môi trường PDA dùng để hoạt hóa giống nhân giống - Khoai tây : 200g - Dextrose (D-glucoza) : 20g - Agar : 20g - Nước : 1000 ml - Hấp khử trùng 121 C 15-20 phút, pH = 5,2 Quá trình hoạt hóa thực theo phương pháp pha loãng thập phân b Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào cách đếm khuẩn lạc phát triển môi trường thạch + Nguyên tắc: Pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp Tiến hành đếm bào tử nồng độ liên tiếp Đối với nấm mốc, khuẩn lạc thường to có nhiều sợi, nên phải pha loãng đến nồng độ 10-5-10-8 để dễ quan sát đếm khuẩn lạc mọc bề mặt nuôi cấy Mỗi khuẩn lạc tượng trưng cho bào tử Số tế bào tính công thức: Số tế bào/ml mẫu =n×D / V (Công thức 2.6) c Phương pháp lên men bán rắn thu nhận enzym xenlulaza Phối trộn môi trường lên men bán rắn thích hợp, làm ẩm nước cất, sau chuyển môi trường vào bình tam giác có dung tích 250 ml Hấp khử trùng 121°C 30 phút, làm nguội Chuyển bào tử nấm mốc vào bình tam giác tủ cấy vô trùng Nuôi nhiệt độ 30°C sau thời gian nuôi cấy thích hợp tiến hành thu enzym 2.2.4 Phương pháp thu nhận enzym Sau thời gian nuôi cấy nấm mốc môi trường bán rắn tiến hành thu nhận enzym Tiến hành lên men bán rắn điều kiện tối ưu tiến hành thu nhận dịch enzym xenlulaza đem xác định hoạt tính enzym 2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính enzym xenlulaza của Tricoderma harzianum Xác định hoạt độ của enzym xenlulaza dựa vào lượng đường khử tạo thành [6] + Nguyên lý: Phương pháp dựa vào phân hủy chất CMC enzym cacboxymetyl xenlulaza pH=5, 50oC Lượng đường khử sinh phản ứng với axit 2-hydroxy-3,5 dinitrosalicylic, màu sinh sau phản ứng xác định phương pháp so màu quang phổ bước sóng 540 nm Hoạt độ enzym tính đơn vị/ml môi trường gam chế phẩm Từ kết đo OD xác định hàm lượng đường sau tính hoạt tính enzym 2.2.6 Phương pháp thủy phân bột vỏ sầu riêng chế phẩm enzym thu nhận từ trình nuôi Trichoderma harzianum Chuẩn bị chế phẩm enzym Quá trình thủy phân bột vỏ sầu riêng thực theo quy trình sau: Bột vỏ sầu riêng bổ sung enzym xenlulaza dung dịch đệm na-axetat Tiến hành thủy phân nhiệt độ 500C pH = 5, làm nguội tiến hành lọc, ly tâm loại bã thu dịch thủy phân từ vỏ sầu riêng 2.2.7 Phương pháp sản xuất protein đơn bào từ dịch đường sau thủy phân * Nuôi cấy nhân giống nấm men 11 Woatthichai Narkrugsa and Nuanphan Naranong vỏ sầu riêng gồm 30,92% xenluloza, 17,99% hemixenluloza, 7,69% lignin, 6,92% ẩm, 3,15% protein, 4,01% tro, 0,26% lipit, 27,81% xơ thô 57,85% cacbohydrat tổng [21] Như vậy, vỏ sầu riêng thu nhận từ Đăk Lăk, hàm lượng xenluloza chiếm 54,5% xem nguồn nguyên liệu tiềm cho việc thủy phân thu nhận dịch đường phục vụ cho trình thu nhận protein đơn bào chế phẩm, sản phẩm lên men khác; hàm lượng lignin chiếm 15,6% cao ảnh hưởng đến trình thủy phân lignin liên kết chặt chẽ với xenluloza cản trở trình xúc tác enzym xenlulaza nên cần xử lý vỏ sầu riêng để giảm hàm lượng lignin tạo thuận lợi cho trình thủy phân Trong đề tài theo đề xuất chúng tôi, để trình thủy phân bột vỏ sầu riêng đạt hiệu tốt cần phải loại bỏ lignin có vỏ sầu riêng trước để phá vỡ liên kết xenluloza lignin Rồi tiến hành thủy phân, enzym xenlulaza tiếp xúc với mạch xenluloza bột vỏ sầu riêng tốt 3.2 QUÁ TRÌNH CHUẨN BỊ GIỐNG TRICHODERMA HARZIANUM Để trình thủy phân vỏ sầu riêng tốt nhất, cần khảo sát trình sinh enzym xenlulaza nấm Trichoderma harzianum 3.2.1 Khảo sát trình hoạt hóa nhân giống nấm Trichoderma harzianum Nấm mốc Trichoderma harzianum phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng cung cấp Giống dạng bào tử bảo quản môi trường đặc thù riêng nhiệt độ -20°C 12 Để thực trình hoạt hóa sử dụng môi trường thạch PDA Giống gốc sau giải đông, cấy trang hộp petri có môi trường hấp khử trùng nuôi 30°C Sau 24 từ lúc bắt đầu nuôi cấy, quan sát thấy khuẩn lạc bắt đầu xuất hiện, có màu trắng, dạng tròn, bề mặt nhẵn kích thước khuẩn lạc nhỏ Sau 48 từ lúc bắt đầu nuôi cấy nhiệt độ 30°C môi trường thạch PDA quan sát ta thấy khuẩn lạc có kích thước lớn, viền có màu trắng sữa, bên có màu vàng nhạt, bề mặt sần sùi kích thước khuẩn lạc không đồng Qua trình hoạt hóa giống có số nhận xét sau: - Nấm mốc Trichoderma harzianum phát triển tốt môi trường PDA - Sự phát triển tế bào nấm mốc sau thời gian nuôi cấy không giống Có khuẩn lạc có kích thước lớn, phát triển từ tế bào nấm mốc mạnh Có khuẩn lạc có kích thước bé, phát triển từ tế bào nấm mốc yếu Sự chênh lệch kích thước khuẩn lạc đĩa nuôi cấy lớn, điều cho thấy trình bảo quản làm suy yếu tế bào nấm mốc mức độ suy giảm không giống tế bào 3.2.2 Xác định bào tử nấm mốc phương pháp đếm gián tiếp cách nuôi cấy thạch đĩa Tiến hành nhân sinh khối cấp Trichoderma harzianum môi trường PDA lỏng hấp khử trùng 1210C 15-20 phút, pH = 5,2 Sau 48 kết thúc trình nhân sinh khối cấp 1, tiến hành pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp Tiến hành đếm bào tử 13 nồng độ liên tiếp Đối với nấm mốc, khuẩn lạc thường to có nhiều sợi, nên phải pha loãng đến nồng độ 10-5-10-8 để dễ quan sát đếm khuẩn lạc mọc bề mặt nuôi cấy Mỗi khuẩn lạc tượng trưng cho bào tử Kết số bào tử mọc đĩa thạch sau: Ở mật độ pha loãng (D) 10-7 lần số khuẩn lạc đĩa petri theo thứ tự đĩa là: 67, 58, 45 khuẩn lạc đó: n = ( 67 + 58 + 45 )/ = 56,67 Suy số tế bào/ml mẫu N = x 107 = 5,667x108 tế bào/ml Từ kết tính toán việc kết hợp tham khảo số tài liệu trình thu nhận enzym xenlulaza từ nấm Trichoderma harzianum nghiên cứu Châu Thị Tiến (2013) [25], nghiên cứu F Deschamps, C Giuliano (1985) [22] Các tác giả sử dụng mật độ bào tử từ 106 - 108 bào tử/ml giống để lên men thu nhận xenlulaza Với kết này, sử dụng giống cấp để lên men thu enzym xenlulaza 3.2.3 Khảo sát khả sinh enzym xenlulaza của nấm Trichoderma harzianum Sử dụng môi trường nuôi cấy nấm mốc PDA Tiến hành khảo sát khả phát triển nấm mốc môi trường Tốc độ sinh trưởng phát triển nấm mốc nhanh, hệ sợi nấm mọc bao phủ đĩa petri vòng ngày sau thời gian bề mặt khuẩn lạc chuyển từ màu xanh nhạt hình b sau ngày nuôi cấy chuyển qua màu xanh đậm * Xác định khả sinh enzym xenlulaza phương pháp khuếch tán đĩa thạch 14 Để thuận lợi cho việc quan sát, xác định hoạt độ, chủng nấm cấy chấm điểm (4 điểm) hộp petri Nuôi 30°C sau 72 tiến hành quan sát hình thái nấm mốc thử khả sản sinh enzym xenlulaza, sử dụng thuốc thử lugol nhỏ trực tiếp lên môi trường thạch để kiểm tra khả thủy phân enzym xenlulaza Qua trình thí nghiệm ta kết luận: Khả phát triển nấm Trichoderma harzianum nhanh mạnh mẽ, khả thủy phân tương đối tốt Với kết thí nghiệm thu được, qua chứng tỏ nấm Trichoderma harzianum tiết enzym xenlulaza phân giải CMC môi trường PDA có bổ sung 1% CMC 3.3 QUÁ TRÌNH THU NHẬN ENZYM XENLULAZA TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN Theo tài liệu tham khảo số nghiên cứu giới nước nghiên cứu F Deschamps, C Gulinano, 1985, nghiên cứu M Moosavi, Nasab 2007 đối tượng nấm mốc [18], lựa chọn nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum môi trường bán rắn thời gian 144 giờ, nhiệt độ 30oC, độ ẩm 60%, tỉ lệ giống 5% với mật độ tế bào 5,667 x 108, tỉ lệ bột vỏ sầu riêng bổ sung vào môi trường 9% Thành phần môi trường bán rắn gồm: bột cám (60%), (NH4)2SO4 1%, Bột vỏ sầu riêng (9%), bổ sung thêm trấu Sau thời gian lên men, thu nhận dịch thô xác định hoạt tính enzym xenlulaza cách sử dụng dịch thô enzym thủy phân CMC 1% môi trường sodium axetat pH = 5, thu nhận dịch sau thủy phân sau tiến hành xác định hàm lượng đường khử (thử định 15 lượng) phương pháp so màu sử dụng axit dinitrosalycilic (DNS) Bột vỏ sầu riêng trấu kích thích khả sinh tổng hợp enzym xenlulaza thành phần có xenluloza, nhiên trấu môi trường khó phân hủy vi sinh vật, cần thời gian dài chủ yếu người ta sử dụng trấu chất độn tăng khả xâm nhập chất khí vào môi trường giúp cho vi sinh vật hoạt động hiệu Do thành phần trấu bị ảnh hưởng trình lên men thu nhận enzym xenlulaza nên bỏ qua ảnh hưởng Môi trường sau lên men bán rắn ta thấy có trạng thái dính cục, màu xanh đậm, chứng tỏ nấm Trichoderma Harzianum phát triển môi trường bán rắn có chứa vỏ sầu riêng Sau đó, ta tiến hành thu nhận enzym xenlulaza cách trộn 5g canh trường sau lên men cho vào 45ml dung dịch đệm Na-axetat 50mM, pH=5 lắc máy lắc với số vòng 150 vòng/phút phút, lọc thu dịch thô, tủa dịch lọc cồn lạnh 960 với tỷ lệ cồn : enzym (3:1) Sau đó, tiến hành ly tâm lạnh 4500 vòng/ phút 15 phút Thu kết tủa hòa lại với đệm Na-axeta 50mM, pH=5 thể tích ban đầu Dịch enzym thu tiến hành pha loãng 10 lần đo hoạt tính phương pháp DNS Kết thu được thể hiển bảng 3.3 Để xác định nồng độ đường glucoza tiến hành xây dựng đồ thị đường chuẩn glucoza hình 3.8 Kết xây dựng đồ thị đường chuẩn glucoza 16 Hình 3.8 Đồ thị đường chuẩn glucoza Từ đồ thị hình 3.5 ta thu phương trình đường chuẩn dạng y = 1,534x + 0,129 Với y mật độ quang OD (540 nm), x nồng độ đường glucoza (mg/ml), R2 hệ số tương quan Dựa vào phương trình đường chuẩn ta xác định nồng độ đường glucoza trình thủy phân nghiên cứu Dịch enzym thu nhận có hoạt tính 9,27 đvht/ml 3.4 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH THUỶ PHÂN VỎ SẦU RIÊNG Từ kết thu từ phần 3.3, tiến hành sử dụng dịch enzym có hoạt tính cao 9,27 đvht/ml để thủy phân Dịch enzym sau thu nhận bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 4°C, sau dịch enzym sử dụng cho suốt trình thủy phân 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ vỏ sầu riêng/enzym đến chất lượng dung dịch thủy phân Tỷ lệ enzym/cơ chất yếu tố quan trọng ảnh hưởng lớn đến trình thủy phân Với loại enzym chất khác cần 17 xác định tỷ lệ enzym/cơ chất (v/w) thích hợp để việc thủy phân đạt hiệu cao Tiến hành thủy phân bột vỏ sầu riêng với mẫu bình tam giác, lượng chất (bột vỏ sầu riêng 5g) thời gian thủy phân ngày, nhiệt độ 50°C, tỷ lệ enzym/ chất 4/5; 4,5/5; 5/5; 5,5/5; 6/5 (v/w), bổ sung đệm Na-axetat 50mM định mức đến thể tích 100ml Dịch thủy phân thu nhận đem xác định hàm lượng đường khử phương pháp DNS Kết trình bày hình 3.11 Hình 3.11 Ảnh hưởng tỉ lệ enzym/ vỏ sầu riêng đến trình thủy phân Từ đồ thị hình 3.12, ta thấy tăng tỷ lệ enzym/cơ chất hàm lượng đường khử tăng lên nhiên tăng lên mức độ không thay đổi, từ tỷ lệ thể tích 5,0/5 đến 5,5/5 (v/w) hàm lượng đường đạt 5,95 (mg/ml) hàm lượng đường không tăng Kết cho thấy, thể tích enzym 5ml/ 5g chất bột vỏ sầu riêng hoạt lực enzym đủ để phân giải chất hoàn toàn, tỷ lệ khác thừa thiếu enzym chất làm cho vận 18 tốc phản ứng chậm lại nên hàm lượng đường tạo thành thấp Điều phù hợp với mô hình Michaelis-menten, không cần thiết phải tăng thể tích enzym lên cho trình thủy phân 3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hàm lượng đường của dung dịch thủy phân Thời gian thủy phân xenluloza có ảnh hưởng lớn đến trình thủy phân, định đến hiệu suất thủy phân, khả tạo thành đường khử Khảo sát thủy phân bột vỏ sầu riêng mốc thời gian 4, 5, 6, 7, 8, ngày với mẫu bình tam giác, trọng lượng chất (bột vỏ sầu riêng 5g), 5ml enzym/cơ chất (v/w) để theo dõi trình thủy phân chọn mốc thời gian thích hợp cho trình thủy phân sau Dịch lọc thu pha loãng 10 lần sau xác định mật độ quang OD bước sóng 540 nm Từ kết đo OD tính hàm lượng đường khử dịch đường Kết thể hình 3.12 Hình 3.12 Ảnh hưởng yếu tố thời gian đến hàm lượng đường 19 dung dịch thủy phân Khi thời gian tăng hàm lượng đường tăng lên nhiên đến giới hạn định hàm lượng đường không tăng lên Hàm lượng đường khử tăng dần đạt cao 168 (7 ngày) nồng độ đường khử đạt 6.08 mg/ml, sau thời điểm hàm lượng đường không tăng nữa, trình thủy phân hoàn toàn, lượng chất phân giải hết Tuy nhiên thời điểm thủy phân ngày, nồng độ đường khử tăng so với thời gian thủy phân ngày với nồng độ đường khử 6.14 mg/ml Để tiết kiệm chi phí cho trình thủy phân, ta dừng lại thời điểm ngày phù hợp Vậy, kết thủy phân vỏ sầu riêng enzym xenlulaza điều kiện tốt tiến hành thủy phân với tỷ lệ thể tích enzym/ vỏ sầu riêng 5/5 (v/w) thời gian ngày nhiệt độ 500C thu dịch đường thủy phân có hàm lượng đường 6,14 mg/ml 3.5 QUÁ TRÌNH LÊN MEN TẠO SINH KHỐI PROTEIN ĐƠN BÀO 3.5.1 Hoạt hoá giống Sacharomyces cerevisiae Giống sau rã đông nhiệt độ phòng, môi trường Hansen hấp khử trùng đổ vào ống thạch nghiêng ta cấy nấm men từ ống giống vào ống thạch nghiêng, nuôi tủ ấm 1÷2 ngày 300C sau bảo quản tủ lạnh 40C để dùng dần 3.5.2 Nhân giống cấp - Pepton : 10 g - Glucose : 30 g - Nước mềm vừa đủ : 1000 ml 20 - Dùng dung dịch có tỷ lệ 150ml nước malt + 50ml dịch thủy phân từ vỏ sầu riêng thu từ thực nghiệm PH môi trường = 4.5 Sau nhân giống cấp 1, tiến hành pha loãng nồng độ 10-7 đếm số khuẩn lạc mọc đĩa thạch kết sau: Ở mật độ pha loãng (D) 10-7 lần số khuẩn lạc đĩa petri là: 40, 46, 39 khuẩn lạc đó, áp dụng công thức 2.6, ta có số tế bào/ml mẫu là: 41,67.107 (tế bào/ml) Dựa theo kết nghiên cứu Morris, G J., Coulson, G E., and Clarke, K J., 1988, ta thấy, tác giả sử dụng mật độ tế bào từ 106 – 108 để nghiên cứu trình [23] Vì vậy, số khuẩn lạc thí nghiệm đảm bảo yêu cầu cho trình nhân giống cấp tạo sinh khối protein 3.5.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung dịch nấm men đến trình nhân sinh khối protein đơn bào Tỷ lệ dịch nấm men ảnh hưởng đến trình tăng sinh khối nấm men Chọn tỷ lệ dịch nấm men 5, 7, 9, 11, 13 (%) Cố định thành phần môi trường: - Pepton - Glucose : 10 g : 30 g - Dịch thủy phân từ vỏ sầu riêng: 200ml - Nước mềm vừa đủ: 1000 ml, PH môi trường = 4,5 Sau 48 giờ, lọc sấy khô sinh khối ta thu kết hình 3.16: 21 Hình 3.16 Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men đến trình tạo sinh khối protein Theo hình 3.16 ta thấy, tăng lượng dịch nấm men lên đến 11% sinh khối tăng theo, tỷ lệ dịch nấm men bổ sung 11% đạt khối lượng sinh khối cao nhất, đến tỷ lệ 13% lượng sinh khối tạo thành giảm sút nguồn dinh dưỡng cung cấp cho trình tăng sinh khối protein không đủ nên hàm lượng protein giảm sút Vì vậy, ta chọn tỷ lệ bổ sung dịch nấm men 11% phù hợp 3.5.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến trình lên men tạo sinh khối Thời gian lên men ảnh hưởng lớn đến trình tăng sinh khối nấm men Nếu trình tăng sinh khối ngắn, lượng sinh khối không tăng nhiều, kéo dài thời gian nuôi cấy, nấm men già chết ảnh hưởng đến chất lượng protein đơn bào thu Chọn thời gian nuôi cấy 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 Sau trình lên men tạo sinh khối, thu dịch, lọc, sấy khô, ta thu sinh khối protein có khối lượng mẫu biểu diễn đồ thị hình 3.18 22 Hình 3.18 Ảnh hưởng thời gian đến trình tạo sinh khối protein Theo hình 3.18 ảnh hưởng thời gian lên men đến trình tạo sinh khối, ban đầu tăng thời gian từ 24 đến 48 khối lượng sinh khối tăng dần theo, kéo dài thời gian đến 60 khối lượng sinh khối bắt đầu giảm nấm men bị già yếu chết làm giảm khối lượng sinh khối thu Ta chọn thời gian phù hợp thời điểm 48 trình lên men 3.5.5 Kết trình lên men tạo sinh khối protein điều kiện tốt Trên sở phân tích có kết phần 3.4.3, tiến hành lên men tạo sinh khối kết hợp điều kiện Tiến hành lên men thời gian 48 với tỷ lệ dịch nấm men 11%, lượng sinh khối thu sau trình lên men 15,18 g/l 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ A KẾT LUẬN Sau trình nghiên cứu, rút kết luận: Đã xác định thành phần hóa học bột vỏ sầu riêng nghiên cứu là: độ ẩm 7,1%, xenluloza 54,5%, lignin 15,6%, protein 6,65%, lipit 4,2%, đường khử 0,5%, tro 6,5% Đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm enzym xenlulaza nấm mốc Trichoderma hazianum có hoạt lực 9,27 (đvht/ml) Thủy phân vỏ sầu riêng enzym xenlulaza với tỷ lệ thể tích enzym/ vỏ sầu riêng 5/5 (v/w) thời gian ngày nhiệt độ 500C thu dịch đường thủy phân có hàm lượng đường 6,14 mg/ml Quá trình lên men dịch đường thủy phân từ vỏ sầu riêng tạo sinh khối protein từ nấm men Sacharomyces cerevise sau 48 nuôi cấy với tỷ lệ nấm men bổ sung 11% thu sản phẩm có khối lượng sinh khối protein 15,18g/l 24 B KIẾN NGHỊ Vì điều kiện nghiên cứu hạn chế xin đề xuất hướng phát triển đề tài sau: Đề tài nghiên cứu phòng thí nghiệm đối tượng vỏ sầu riêng, cần mở rộng số phế thải nông nghiệp khác Khảo sát thêm số chủng vi sinh vật khác để xem xét trình thu sinh khối protein từ dịch thủy phân vỏ sầu riêng Đi sâu khảo sát điều kiện thu sinh khối protein để đưa quy mô sản xuất lớn ... 3 Chính lí mà đề tài " Nghiên cứu trình thủy phân vỏ sầu riêng chủng nấm mốc Trichoderma harzianum ứng dụng sản xuất sinh khối protein đơn bào" thực với mục đích tận dụng, tái chế phế phẩm nhằm... tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình sản xuất protein đơn bào từ vỏ trái sầu riêng quy mô phòng thí nghiệm Đối tượng nghiên cứu Vỏ sầu riêng thu nhận vùng Đăklăk, chủng nấm mốc Trichoderma Harzianum, ... phân vỏ sầu riêng nấm Trichoderma Harzianum với quy mô phòng thí nghiệm - Ứng dụng sản xuất protein đơn bào từ dịch đường sau trình thủy phân vỏ sầu riêng * Ý nghĩa thực tiễn - Tận dụng phế