CÁC KỸTHUẬT THAO tác TRÊN ADN

CHUYÊN ĐỀ: DI TRUYỀN HỌC PHÂN TỬ CÁC KỸ THUẬT THAO TÁC TRÊN ADN A Phần MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Trong khoảng thập kỷ qua nhân loại trải qua cách mạng sinh học, vấn đề sinh học phân tử (các trình lưu trữ, truyền đạt biểu thông tin di truyền mức độ phân tử) phận cách mạng Đặc biệt sinh học phân tử phát triển manh mẽ năm qua với phát triển công nghệ sinh học Các kiến thức sinh học phân tử cho phép giải thích mối quan hệ cấu trúc chức đại phân tử sinh học vận hành kiểm soát trình sinh hóa tế bào Trọng tâm sinh học phân tử việc nghiên cứu đại phân tử ADN, ARN Protein trình tái bản, phiên mã dịch mã Trong khuôn khổ chuyên đề xin trình bày số kỹ thuật thao tác ADN như: - Tách chiết tinh ADN - Điện di phân tích axitnucleic - Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Tuy đề cập phần tách biệt, thực tế kỹ thuật phân tích ADN dựa số nguyên lý chung thường sử dụng phối hợp nghiên cứu MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Nâng cao hiểu biết cho người dạy người học kỹ thuật phân tích ADN từ định hướng học sinh tự nghiên cứu với tài liệu để thấy ứng dụng to lớn sinh học phân tử năm qua năm B Phần NỘI DUNG CHƯƠNG TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ADN Hầu hết nghiên cứu phân tích gen bắt dầu việc phải tách chiết tinh ADN từ đối tượng nghiên cứu Dù tách chiết ADN từ vi khuẩn, động vật hay thực vật số bước quy trình cần ‘giải phóng’’ thành phần tế bào vào dung dịch Do vi khuẩn thường tồn dạng tế bào đơn, cấu trúc xương, không tích luỹ chất béo, hợp chất sinh học thứ cấp nên việc tách chiết ADN thường tương đối đơn giản Ngược lại, phần lớn mô thực vật động vật thường cần phải nghiền nhỏ nitơ lỏng thành hạt mịn trước tách ADN Việc tách chiết ADN từ tế bào động vật (ví dụ : từ đuôi chuột) cần enzym phân huỷ mô liên kết giúp tăng hiệu giải phóng tế bào thành phần chúng vào dịch chiết Đặc biệt, tế bào thực vật có thành cứng, nên thường phải sử dụng biện pháo học (ví dụ : sử dụng máy xay, nghiền cối) sử dụng số enzym đặc hiệu phân huỷ thành tế bào trước tách ADN Các tế bào thực vật có đặc điểm phổ biến tích luỹ hợp chất sinh học thứ cấp hàm lượng cao, nên để loại bỏ hợp chất thường phải bổ sung vào dung dịch chiết số hợp chất, ví dụ CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) giúp tăng hiệu loại bỏ hợp chất polysaccharide polyphenol Các quy trình tách chiết ADN đơn giản vi khuẩn Đầu tiên tế bào vi khuẩn xử lý với enzym lysozyme giúp phân huỷ lớp petidoglycan thành tế bào Sau đó, mẫu xử lý tiếp với hợp chất tẩy làm phân rã cấu trúc lipid màng tế bào Các chất tạo phức kiểu EDTA (ethylenediamine tetraacetate) thường đựơc sử dụng để loại bỏ ion kim loại Trong bước vậy, ADN giải phóng vào dịch chiết sau tinh Có hai phương pháp phổ biến dùng phối hợp để tinh ADN ly tâm chiết xuất dung môi Nguyên lý phương pháp ly tâm dịch chiết tế bào ‘quay’’ tốc độ cao lực ly tâm làm lắng đọng thành phần tế bào có khối lượng kích thước lớn Chẳng hạn, thành phần vi khuẩn bị phân giải hầu hết thành phần tế bào dạng hoà tan dịch chiết chúng có kích thước nhỏ, ADN số chất có khối lượng phân tử lớn lắng xuống đáy ống ly tâm Lúc này, dịch chiết mang thành phần tế bào bị phân huỷ dễ dàng hút loại bỏ Hạt kết tủa mang ADN sau hoà tan trở lại dung dịch đệm phù hợp Tuy nhiên, thường lẫn ARN protein Các hợp chất sau loại bỏ nhờ sử dụng dung môi thích hợp Trong bước tinh ADN, phenol dung môi có hiệu cao dùng rộng rãi, độc khả hoà tan gây biến tính mạnh prtein Việc sử dụng phenol giúp hoà tan tách bỏ protein khỏi ADN Khi bổ sung phenol vào nước, hai chất lỏng trộn với thành dung dịch đồng nhất, mà thay vào phenol tách thành lớp riêng lớp nước Tuy vậy, lắc mạnh, hai lớp dịch hoà vào thành hỗn hợp ‘tạm thời’’ ; lúc đó, protein hoà tan vào phenol Sau đó, đưa dung dịch hỗn hợp trạng thái tĩnh, hai pha phenol nước lại tách Lúc nay, pha phenol mang nhiều phân tử protein dạng hoà tan, hầu hết ADN ARN có pha nước Việc hút nước (lớp trên) khỏ hỗn hợp giúo tách axit nucleic khỏi protein Để giảm tối đa lượng protein sót lại, bước chiết xuất phenol thực lặp lại nhiều lần Một số quy trình tách chiết ADN gần nhằm tránh phenol (vì tính độc nó) có số cải tiến Phổ biến việc sử dụng cột chứa chất liên kết đặc hiệu ADN Trong đó, hai nhóm chất thông dụng silic dioxide hợp chất trao đôi anion Các chất dựa silic dioxide có khả liên kết đặc hiệu với ADN nồng độ muối thấp pH cao Trong đó, chất trao đổi anion, diethylaminoethyl –cellulose, tích điện dương liên kết mạnh với khung đường – phosphate phân tử ADN Khi sử dụng chất trao đổi anion nồng độ muối thấp, ADN ‘bắt giữ’’ cột ; nồng độ muối tăng, ADN rửa trôi khỏi cột nồng độ muối cao làm phá vỡ liên kết ion ADN chất Bước việc tinh ADN cần loại bỏ ARN Việc thường thực nhờ enzym ribonuclease (ví dụ : RNaseA) Nhóm enzym có khả nhận biết đặc hiệu ARN ( qua nhóm C2, - OH) phân giải chúng thành đoạn nhỏ, mà không tác động đến phân tử ADN Trong bước xử lý ribonuclease, hỗn hợp ADN ARN đựơc ủ nhiệt độ tối ưu enzym Sau đó, dịch chiết bổ sung thể tích tương đương alcohol (etanol hay isoamylalcohol) Các hợp chất alcolhollmà kết tủa phân tử kích thước lớn mà lúc dịch chủ yếu ADN Các đoạn ARN nhỏ dạng hoà tan nên dễ dàng hút loại bỏ Điểm đáng lưu ý alcohol làm kết tủa đại phân tử cách không đặc hiệu, nên hợp chất hyđrat carbon protein kết tủa với ADN ARN Thế nên, bước kết tủa alcohol thường đựoc thực sau thành phần khác tế bào loại bỏ khỏi dịch chiết nhờ ly tâm và/hoặc chiết xuất phenol Hỗn hợp ADN ARN sau xử lý ribonuclease bổ sung etanol ly tâm để thu kết tủa ADN, ARN dạng hoà tan dịch chiết hút loại bỏ Hạt ADN kết tủa đáy ống ly tâm nhỏ (thậm chí không nhìn thấy mắt thường), chứa hàng triệu phân tử ADN thường đủ cho cho nghiên cứu ADN lúc có mức độ tinh cao, hoà tan trở lại dung dịch đệm nước sử dụng cho thí nghiệm phân tích ADN sau CHƯƠNG ĐIỆN DI PHÂN TÍCH ADN Có nhiều phương pháp khác dùng để phân tích ADN, đến điện di gel phương pháp dùng phổ biến nhờ ưu điểm nhanh đơn giản Nguyên tắc phương pháp : tác động điện trường, phân tử axit nucleic (tích điện âm) khác kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn dạng phân tử (mạch thẳng hay vòng) di chuyển qua hệ mạng gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) với tốc độ di chuyển khác Vì vậy, chúng tách trường điện di ; qua đó, người ta thu thập phân tích phân đoạn ADN gen riêng rẽ Trên trường điện di, phân đoạn ADN có kích thước nhỏ di chuyển nhanh Sau điện di kết thúc, phân tử ADN quan sát nhờ sử dụng thuốc nhuộm phát huỳnh quang, ethidium bromide (EtBr) Mỗi băng điện di thường phản ánh tập hợp phân tử ADN có kích thước Có hai loại gel điện di dùng phổ biến agarose polyacrylamide Trong đó, gen polyacrylamide có độ phân giải cao, kích thước ADN phân tích hẹp Cụ thể, phương pháp phân tách đoạn ADN khác chí cặp nucleotide (1bp), thường dùng phân tích đoạn ADN nhỏ (từ đến 1000bp) Trong đó, gel agarose có độ phân giả thấp đoạn ADN kích thước nhỏ, hiệu phân tách đoạn ADN kích thước lớn (khoảng từ 200bp đến 20kb ; 1kb = 1000bp) Các đoạn ADN kích thước lớn ‘lọt’’ qua lỗ nhỏ gel, kể gel agarose Thay vào đó, chúng (thường dạng mạch thẳng) ‘trườn’’ qua mạng lưới gel cách đầu phân tử trứơc, đầu theo sau Hậu đoạn ADN lớn (từ 10kb đến 10mb ; 1mb = 1000kb) có tốc độ dịch chuyển trường điện di gần tương đương khó phân tách nhờ điện di thông thường Đối với đoạn ADN lớn vậy, người ta dùng phương pháp điện di xung trường (PFGE) Trong phương pháp này, cặp điện cực đặt chéo góc điện di Việc bật tắt phiên hai cặp điện cực làm đoạn ADN lớn thay đổi chiều dịch chuyển Các đoạn ADN có kích thước lớn chậm trình đổi chiều dịch chuyển Nhờ vậy, đoạn có kích thước khác tách khỏi Kỹ thuật PFGE thực tế dùng để xác đinh trực tiếp kích thước nhiễm sắc thể (NST) vi khuẩn NST sinh vật nhân thật bậc thấp, nấm men số nguyên sinh động vật Kích thước hệ gen loài khoảng vài Mb Đối với đoạn ADN có kích thước nhỏ khác vài bp, ví dụ sản phẩm PCR alen thuộc locut, người ta dùng phương pháp điện di biến tính gradient (DGGE) Trong kỹ thuật DGGE, phân tử ADN sợi kép gây biến tính nhiệt hoá chất, ure hay formamide (đôi phối hợp hai phương pháp) đồng thời với trình điện di Nhiệt độ thường trì cao (50 – 650C) ổn định nồng độ ure formamide tăng dần theo chiều song song (DGGE song song) vuông góc (DGGE vuông góc) với chiều điện di Trong DGGE song song, kết điện di hình thành băng tách biệt giống điện di gel agarose Trong DGGE vuông góc, hốn hợp phân tử ADN khác biệt một vài bp phân tán khắp gel tạo nên chuỗi băng dạng đường cong sigma Điện di phân tách đoạn ADN khác kích thước mà hình dạng cấu hình chúng Các phân tử ADN dạng mạch vòng duỗi xoắn bị ‘đứt gãy’’ số nucleotide di chuyển chậm trường điện di so với phân tử ADN dạng mạch thẳng có khối lượng Trong khi, phân tử ADN dạng siêu xoắn (kích thước thu nhỏ) thường di chuyển nhanh trường điện di so với phân tử ADN dạng vòng duỗi xoắn có mức độ cuộn xoắn thấp có khối lượng CHƯƠNG KĨ THUẬT PCR KHÁI NIỆM CHUNG Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction-PCR) Kary Mullis phát minh năm 1985 Đây phương pháp invitro để nhân nhanh đoạn ADN đó, có độ nhạy cao mà cần khối lượng mẫu ban đầu hạn chế NGUYÊN LÝ Kỹ thuật tổng hợp ADN thể tuân thủ nguyên tắc chép ADN thể như: Đoạn cần nhân mở xoắn thành hai mạch đơn, cần có cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược), cần nguyên liệu điều kiện môi trường thích hợp enzym ADN polymerase Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác dùng nhiệt độ cao (940C) tháo xoắn thay cho helicase kết hợp với enzym AND polymerase chịu nhiệt hệ thống điều nhiệt thích hợp cho giai đoạn phản ứng tổng hợp với đoạn mồi thiết kế chủ động Nhờ kỹ thuật PCR mà với lượng nhỏ ADN ban đầu thu đủ lượng ADN cần thiết để tiến hành thí nghiệm ADN CÁC ĐIỀU KIỆN CỦA PHẢN ỨNG PCR: Một phản ứng PCR điển hình bao gồm thành phần sau: - ADN (0,01-0,1µg) - Mồi (20pmol) - Mồi (20pmol) - Tris-HCl (20mM; pH=8,0) - MgCl2 n(2mM) - KCl (25mM) KCl (10mM) (NH4)2SO4 (10mM) - Deoxynucleotit triphotphat (50µg loại dATP, dGTP, dCTP, dTTP) - ADN polymerase chịu nhiệt (2 đơn vị) - Tổng thể tích phản ứng 50-100µl Khi phản ứng PCR chuẩn bị xong thường phủ lớp dầu khoáng, dùng nắp đậy máy đốt nóng để ngăn cản bốc mẫu trình gia nhiệt Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR điểm hình thường là: - 900C , 30 giây- biến tính ADN - 600C, 30 giây- gắn mồi - 720C, phút- tổng hợp Giai đoạn biến tính gắn mồi thường ngắn phù hợp để phá hủy tái tạo liên kết hyđro hai mạch ADN Các protocol trước thường có giai đoạn biến tính 940C, phút để đảm bảo ADN khuôn hoàn toàn tách Hiện thường không việc xử lý nhiệt độ cao, lâu thường gây vết đứt ADN khuôn Chiều dài sản phẩm PCR xác định thời gian đoạn tổng hợp phản ứng Hầu hết polymerase sử dụng phản ứng PCR tái invitro với tốc độ khoảng 500-1000bp/phút Thời gian giai đoạn tổng hợp thay đổi phụ thuộc vào độ dài sản phẩm PCR 3.1 ADN khuôn: Gần loại ADN nào, dù mạch thẳng, mạch vòng, ADN plasmit, ADN hệ gen, cADN… làm khuôn cho phản ứng PCR ADN lấy từ nguồn không quan trọng, yêu cầu vị trí gắn mồi trình tự chúng nguyên vẹn Đã có mẫu ADN mà tuổi đến 7000 năm sử dụng thành công phản ứng PCR Chúng ta xem xét việc nhân bội phân tử ADN đích Khi lượng phân tử ADN ban đầu nhỏ, nhiễm (có mặt ADN mà không quan tâm) trở thành vấn đề Đặc tính nhân bội kỹ thuật PCR có nghĩa là, chí nhiễm ADN phá hỏng thí nghiệm Nhiễm từ nhiều nguồn gốc khác nhau, kể từ nhà nghiên cứu thực thí nghiệm, từ ống nghiệm, từ đầu týp, chí từ enzym mà dung môi dùng thí nghiệm Trong thí nghiệm PCR điển hình, khoảng 0,1-1µg hệ gen thêm vào phản ứng để thực PCR với số chu kỳ mà có đủ vật liệu cho thí nghiệm Điều giúp giảm thiểu khả nguồn nhiễm nhân bội Lượng ADN tương ứng với trình tự đích? Nếu bạn thêm µg ADN hệ gen người tương ứng với 1x10-6 /(6,4 x109 x 650) = 2,4 x 10-19mol Vì ADN người chứa khoảng 6,4 x109 bp khối lượng trung bình cặp bazơ 650 Da nên 1µg ADN người tương ứng với 2,4x10-19mol x x1023 (số Avogadro) = khoảng 144000 phân tử Một đoạn ADN hệ gen dài 1000bp nhân bội triệu lần (sau 25 chu kỳ PCR) sinh khoảng 10µg đoạn ADN Lượng nhỏ đủ để nhận biết cách nhuộm ethidium bromide sau điện di 3.2 Mồi oligonucleotit: Thành công phản ứng PCR gần phụ thuộc vào mồi Các cặp mồi cần thiết kế để mồi nhận biết sợi có nghĩa ADN mà ta cần tái bản, mồi nhận biết sợi đối nghĩa Các mồi có đặc điểm sau: - Dài khoảng 17-30 nucleotit - Có hàm lượng GC khoảng 50% - Nhiệt độ giai đoạn gắn mồi cặp mồi (được tính từ phương trình 2(AT) +4(CG) thí nghiệm phải nhau) - Trình tự nucleotit phải đảm bảo mồi không gắn vào trình tự lặp lại ADN đích - Từng mồi không chứa đoạn trình tự bổ trợ Ví dụ, trình tự 5’GAGATCGATGCATCGATCTC-3’ mồi PCR tốt (vì dài 20 nucleotit, GC chiếm 50% không chứa trình tự lặp lại) lại mang trình tự bổ trợ hai đầu tạo cấu trúc cặp tóc đầu 5’ gắn kết với đầu 3’ Khi phản ứng PCR không diễn - Hai mồi cặp không bổ trợ đầu 3’ hai mồi không bổ trợ Ví dụ hai mồi : 5’-GATCGATCGATACGTGATCC-3’ 5’- CGTAGCTAGCTAGGATCACG-3’ dường cặp mồi tốt Tuy nhiên, đầu 3’ hai mồi lại bổ trợ tạo primerdime tái chu kỳ phản ứng PCR: 5’-GATCGATCGATACGTGATCC-3’ 3’- GCACTAGGATCGATCGATGC-5’ PCR ↓ 5’-GATCGATCGATACGTGATCCTAGCTAGCTACG-3’ 3’-CTAGCTAGCTATGCACTAGGATCGATCGATGC-5’ 3.3 Ghép đôi sai mồi: Các mồi oligonucleotit dùng cho kỹ thuật PCR phải ghép đôi xác với trình tự đích Điều đặc biệt có ý nghĩa cố tạo đột biến biến đổi có chủ ý đoạn trình tự ADN nhân bội, muốn tìm trình tự gen tương đồng với trình tự biết Vị trí mồi phải ghép đôi thật xác với trình tự đích đầu 3’ Nếu đầu 3’ không ghép đôi xác polymerase không tiếp tục tổng hợp hiệu thí nghiệm hỏng hoàn toàn Để hiểu cách sử dụng PCR để gây tạo đột biến sản phẩm, cần tìm hiểu kĩ mồi Mồi không khởi đầu trình tái ADN mà chúng lồng ghép vào sản phẩm cuối Như vậy, thay đổi bazơ mồi ADN khuôn đưa vào sản phẩm Vì gây tạo đột biến đầu 3’ nên vị trí thích hợp để biến đổi đầu 5’ mồi Trong trường hợp hình, sử dụng mồi có chứa trình tự bổ sung đầu 5’ Ở mồi 1, trình tự nhận biết cho enzym giới hạn EcoRI đầu 5’ đoạn trình tự dùng để nhận biết gen GAL4 Trình tự nhận biết EcoRI không kết đôi xác với trình tự đích không đủ để ngăn cản kết hợp đặc hiệu mồi trình tự có mặt tất sản phẩm PCR Mồi chứa 10 Các dNTP gồm loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP nguyên liệu tham gia tạo nên mạch ADN Nồng độ tối ưu dNTP thường dùng 100 – 200M Tuy nhiên, nồng độ dNTP thấp (10 – 100M) Taq ADN polymerase hoạt động xác 3.6 Dung dịch đệm (buffer) Thành phần dung dịch phản ứng PCR thường phụ thuộc vào loại enzym ADN polymerase sử dụng PCR, quan trọng ion Mg2+ Ví dụ, thành phần dung dịch đệm 10X cho phản ứng PCR sử dụng Taq ADN polymerase bao gồm; Tris-HCl 100M với pH = 25 0C KCl 500M Gelatin 0,01% MgCl2 2mM Nồng độ ion magie có vai trò quan trọng thành công phản ứng PCR Magie cần cho ADN polymerase hoạt động chức phản ứng PCR cụ thể cần nồng độ ion magie khác Nếu nồng độ magie thấp, phản ứng không thành công polymerase không hoạt hóa thích hợp Nếu nồng độ magie cao, phản ứng tính đặc hiệu nhiều sản phẩm tạo Nồng độ magie tối ưu xác định dựa vào kinh nghiệm với mồi thường khoảng 0,5 – 5mM Đệm muối phản ứng (Tris KCl) thường giữ ổn định số protocol giảm bớt mức độ KCl để kích thích polymerase bám mạch khuôn lâu tăng số lượng sản phẩm CÁC GIAI ĐOẠN CỦA PCR: Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, chu kỳ gồm bước chính: 4.1 Gây biến tính ADN: Dùng nhiệt để tách hai mạch ADN đích Nhiệt độ thường dùng khoảng 940C 4.2 Gắn mồi: Hai mạch ADN đích làm lạnh có mặt mồi Các mồi nhận biết gắn vào mạch ADN theo nguyên tắc bổ sung Các mồi thiết kế cho đầu 3’ định hướng đoạn trình tự cần nhân nên trình tổng hợp ADN diễn hai mạch, qua suốt vùng trình tự Nhiệt độ để gắn 16 mồi phụ thuộc vào độ dài, trình tự mồi mức độ đặc hiệu cần thiết phản ứng PCR cụ thể Nhiệt độ gắn mồi thường dao động từ 45-600C 4.3 Kéo dài chuỗi: ADN polymerase gắn vào đầu 3’ tự mồi sử dụng dNTP để tổng hợp đoạn theo chiều 5’-3’ Những thí nghiệm PCR thường dùng đoạn Klenow ADN polymerase I làm enzym tái bị phân hủy nhiệt giai đoạn biến tính nên thường phải bổ sung enzym Việc phát sử dụng Taq ADN polymerase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus bước đột phá Taq ADN polymerase giữ nguyên hoạt tính nhiệt độ đến 940C Điều có nghĩa bổ sung enzym trình phản ứng xảy Taq ADN polymerase có hoạt tính tối ưu 720C 17 Sau chu kỳ đầu, hai phân tử ADN tạo Vị trí gắn kết mồi nơi khởi đầu trình tổng hợp mạch theo nguyên tắc bổ sung với trình tự nucleotit mạch khuôn Quá trình tổng hợp mạch kết thúc nào? Nếu nhìn kết phản ứng PCR gen agarose, thấy có băng nhất, chứng tỏ đoạn ADN phản ứng tạo đồng nhất, nghĩa chúng bắt đầu kết thúc điểm Để tìm hiểu điều này, theo dõi vài chu kỳ phản ứng PCR Hình: Các sản phẩm sau ba chu kỳ phản ứng PCR Ở chu kỳ đầu, hai mạch ADN tách bắt đầu tái từ điểm gắn mồi Hai mạch có đầu 5’ xác định mồi đầu 3’ chưa xác định Quá trình tổng hợp không kết thúc điểm xác định dừng lại giai đoạn biến tính chu kỳ Mỗi mạch tạo chu kỳ thành khuôn để 18 gắn mồi trình tổng hợp mạch mạch khuôn giới hạn hai đầu 3’ , 5’ Điều xảy trình tái dừng lại không trình tự để tái tiếp Vậy là, chu kỳ tạo phân tử ADN có đầu 5’ xác định đầu 3’ chưa xác định chắn Các phân tử tiếp tục làm khuôn để gắn mồi chu kỳ Ở chu kỳ 3, trình tổng hợp tạo phân tử ADN có trình tự hai đầu xác gen đích Các chu kỳ nhân gen đích theo cấp số nhân Sau 25 chu kỳ, thu khoảng 30 triệu gen đích Tất phản ứng PCR có chứa lượng không đáng kể phân tử ADN có đầu chưa thật Tuy nhiên, điều không ảnh hưởng đến kết phản ứng BẢNG SỐ BẢN SAO GEN ĐÍCH ĐƯỢC TẠO RA QUA CÁC CHU KỲ CỦA CỦA KỸ THUẬT PCR Theo Richard, 2004 Số chu kỳ Đoạn ADN đích, mạch kép tạo Số phân tử ADN mạch Tổng số phân tử kép có kích thước lớn ADN 2 4 8 16 22 10 32 52 12 64 114 14 128 240 16 256 494 18 512 10 1.004 20 1.024 11 2.026 22 2.048 12 4.072 24 4.096 13 8.166 26 8.192 19 14 16.356 28 16.384 15 32.738 30 32.768 16 65.504 32 65.536 17 131.038 34 131.072 18 262.108 36 262.144 19 524.250 38 524.288 20 1.048.536 40 1.048.576 21 2.097.110 42 2.097.152 22 4.194.260 44 4.194.304 23 8.388.526 46 8.388.608 24 16.777.168 48 16.777.216 25 33.554.382 50 33.554.432 26 67.108.812 52 67.108.864 27 134.217.674 54 134.217.728 28 268.435.400 56 268.435.456 29 536.870.854 58 536.870.912 30 1.073.741.764 60 1.073.741.824 ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA KỸ THUẬT PCR 5.1.Ưu điểm - Thời gian thực cực nhanh : Chỉ cần để khuyếch đại trình tự ADN quan tâm, so với phương pháp tạo dòng kỹ thuật tái tổ hợp ADN phải tuần lâu - Đơn giản tốn Nó thực ống nghiệm plastic nhỏ gồm thành phần tối thiểu sử dụng đồng thời Trong đó, phương pháp tạo dòng điển hình cần vật liệu đắt tiền màng, nucleotide triphosphate mang dấu phóng xạ việc thực cần thao tác khéo léo đặc biệt - Độ tinh mẫu không cần cao: PCR thực với mẫu nucleic acid thô Ví dụ, mẫu hay dấu vết phân tích pháp y Điều ngược với kỹ thuật tái tổ hợp ADN, đoạn gen vector cần tương đối tinh khiết - PCR giúp phân biệt gen đột biến đoạn, thêm đoạn 20 hay đột biến điểm - Dùng để định lượng so sánh cách cho tiến hành khuyếch đại đồng thời trình tự đích trình tự chứng có nồng độ biết Nhờ ưu trên, PCR hấp dẫn nhà nghiên cứu từ lúc đời việc khyếch đại trình tự nucleic acid đặc hiệu chẩn đoán phân tử Giới hạn phương pháp phải biết trình tự nucleotit (hoặc phần) đoạn cần khuyếch đại Nó không thay kỹ thuật tái tổ hợp ADN mà góp phần đáng kể bổ sung cho kỹ thuật 5.2 Hạn chế Do độ nhạy cao nên PCR vừa đơn giản, có khuynh hướng sử dụng rộng rãi lại gặp không khó khăn a Trong thực nghiệm kích thước trình tự cần khuyếch đại giới hạn Trừ vài trường hợp cá biệt, PCR không hoạt động với phân tử ADN có kích thước lớn 3kb PCR cho kết tốt độ dài ADN 1,5 kb b Sự ngoại nhiễm vấn đề lớn đặt PCR gắn liền với khả khuyếch đại phương pháp Vấn đề cấp thiết ứng dụng chẩn đoán, dự phòng hậu nghiêm trọng Nguồn ngoại nhiễm lớn sản phẩm khuyếch đại lần thao tác trước Người ta chứng minh việc mở nắp ống nghiệm sau lần khuyếch đại khoảng không gian kín phòng thí nghiệm khiến cho phân tử khuyếch đại thoát bay lơ lửng không khí bám vào tường, cửa, thiết bị, dụng cụ thí nghiệm,…rồi nhiễm vào phản ứng tiến hành sau Có thể khắc phục phần vấn đề số biện pháp sau - Các công đoạn thao tác khác thiết lập phản ứng PCR phân tích sản phẩm khuyếch đại phải tiến hành địa điểm cách xa 21 - Dụng cụ để thiết lập phản ứng (micropipette) không sử dụng vào thao tác khác Đầu típ sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh nhiễm đầu micropipette phân tử khuyếch đại hút dung dịch phản ứng - Dùng tia tử ngoại để loại bỏ phân tử lại từ lần khuyếch đại trước - Tất thành phần phản ứng chia thành lượng nhỏ, tính toán cho đủ với 1, lần thao tác - Ngoài hãng sản xuất đưa thị trường nhiều hệ thống chép cho phép loại bỏ hoàn toàn ngoại nhiễm Ví dụ: Perkin – Elmer – Cetus đề suất sử dụng dUTP thay dTTP, việc thay không ảnh hưởng đến phản ứng Trước lần phản ứng kế tiếp, người ta cho thêm vào dung dịch phản ứng uracyglycosylase; enzyme phân hủy tất ADN có mang dUTP nhiễm từ lần trước Đồng thời, enzyme phân hủy nhiệt từ lần biến tính Các hệ thống gặp phải bất lợi lớn phổ biến giá thành cao c Các sai sót gây Taq polymerase Sự chép Taq polymerase cho tỷ lệ sai cao (10 - nghĩa 10.000 nucleotit enzyme gắn sai nuclêôtit) Đặc tính không nghiêm trọng ta cần xem xét kích thước hay có mặt sản phẩm khuyếch đại, có ý nghĩa lớn cần xác định xác trình tự nucleotit ADN Ta loại bỏ hoàn toàn sai sót mà giảm bớt; Ví dụ cân nồng độ nuclêôtit phản ứng, xác định trình tự nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước đến trình tự thức sử dụng ADN polymera chịu nhiệt có tính trung thực cao như: VentTM, Pfu, Ultma ADN polymerase ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT PCR 6.1 PCR việc chẩn đoán bệnh di truyền Khả nhân bội trình tự ADN đặc hiệu giúp trở thành công cụ có giá trị việc chẩn đoán dị tật di truyền đột biến Vì cần phải biết trình tự 22 ADN nhân bội trước tiến hành PCR nên vị trí đột biến phải biết trước Ưu trội PCR cần lượng nhỏ ADN để chẩn đoán Các tế bào máu, niêm mạc vật liệu thích hợp để chẩn đoán người lớn ; bào thai (gọi chẩn đoán in utero), cần lượng nhỏ lông tơ màng đệm PCR sử dụng để phát đột biến xen/mất đoạn đột biến điểm Nhiều kỹ thuật phát đột biến nhờ sử dụng PCR phát triển Ở đây, bàn đến vài kỹ thuật số 6.1.1 Đột biến xen/mất đoạn Hội chứng Waardenburg bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể thường, đặc trưng tật điếc hình thành sắc tố không bình thường Khoảng 2% số người điếc bệnh Dấu hiệu kèm theo thường thấy túm tóc trắng trước trán lông mi trắng Một số dang hội chứng Waardenburg đột biến gen PAX – gen quy định nhân tố phiên mã tham gia điều hòa phát triển phôi Một đột biến phát bệnh nhân mắc hội chứng Waardenburg đoạn 18bp vùng mã hóa nơi gắn kết nhân tố phiên mã Bằng PCR phát đoạn bệnh nhân mắc hội chứng Waardenburg khác PCR đoạn trình tự ADN bình thường gen cho sản phẩm đoạn ADN gồm 156bp trình tự đột biến sinh đoạn ADN ngắn (138bp) Dễ dàng tách hai đoạn ADN gel poly Acrylamide agarose Như vậy, phát đột biến dựa vào kích thước sản phẩm PCR Trong trường hợp này, bệnh biểu trội nên hầu hết người mắc bệnh dị hợp tử, mang gen bình thường gen đột biến Sản phẩm PCR thể dị hợp tử sinh hai đoạn ADN kích thước khác (156 138bp) 6.1.2 Đột biến điểm Phương pháp dùng để phát đột biến điểm Các mồi tạo đoạn ADN có kích thước nhau, người mang đột biến 23 người bình thường Khi cần phải phân tích trình tự ADN tốn thời gian Vậy, cách sử dụng PCR để phát đột biến điểm? Phương pháp PCR alen đặc hiệu khai thác đặc tính là, để tổng hợp ADN hiệu nhờ ADN polymerase mồi phải ghép đôi xác đầu 3’ PCR alen đặc hiệu phát đột biến gen - globin gây bệnh hồng cầu hình liềm Để phát đột biến điểm, phải thiết kế mồi tham gia vào hai phản ứng PCR Một mồi chung cho hai phản ứng, hai mồi lại (mồi mồi 2) dùng để phát trình tự bình thường trình tự đột biến PCR trình tự ADN bình thường diễn với mồi mồi Với mồi phản ứng không thành công ghép đôi sai trình tự bình thường đầu 3’ mồi Tương tự, PCR với trình tự ADN đột biến thất bại với mồi và thành công với mồi Hình: Dùng PCR phát đột biến điểm Ở đây, so sánh trình tự ADN bình thường với cá thể đồng hợp tử đột biến Nếu cá thể dị hợp tử hai phản ứng PCR diễn bình thường Để đảm bảo phản ứng PCR thực xác, người ta thường đưa 24 vào thí nghiệm mồi đối chứng – mồi nhân vùng gen không liên quan Vì vậy, có mặt băng điện di – băng PCR đối chứng Công việc lại tìm xem có hay băng bổ sung 6.2 Tách dòng sản phẩm PCR Chúng ta thấy, tách dòng sản phẩm PCR cách xen thêm trình tự cho enzym giới hạn nhận biết vào đầu 5’ mồi Cũng tách dòng trực tiếp sản phẩm PCR cách lợi dụng ưu hoạt tính tranferase kết thúc chuỗi Taq ADN polymerase để bổ sung a vào đầu 3’ sản phẩm PCR Kết là, hầu hết phân tử ADN nhân bội nhờ Taq ADN polymerase có đầu 3’ – A so le Trong trình gọi tách dòng TA, đầu so le gắn với vectơ mạch thẳng T mang đầu so le 3’ – T hai đầu nhằm tách dòng trực tiếp với hiệu cao sản phẩm PCR Điều không xảy với phân tử ADN đầu tù 25 Hình : Tách dòng TA sản phẩm PCR RT-PCR: Như biết, PCR kỹ thuật nhân bội ADN mạch kép Tuy nhiên, vật liệu khởi đầu cho PCR không thiết phải ADN Phản ứng chuỗi trùng hợp –phiên mã ngược hay gọi tắt RT-PCR (revserse transcription – polymerase chain reaction) phát minh sử dụng phương pháp nhân ARN phân tích sau chuyển thành ADN nhờ phiên mã ngược RT-PCR dùng để tách dòng, xây dựng thư viện cADN tổng hợp mẫu dò Kỹ thuật gồm hai phần : Tổng hợp ADN từ ARN nhờ phiên mã ngược (RT) nhân bội phân tử ADN đặc hiệu phản ứng PCR Hình: RT - PCR Phản ứng RT sử dụng khuôn ARN (ARN tổng số poly-A+ARN), mồi (ngẫu nhiên oligo dT), dNTP, dung môi enzym tái ngược để tổng hợp phân tử ADN mạch đơn bổ trợ với ARN (cADN) Sau cADN làm khuôn cho phản ứng PCR Ở chu kỳ đầu, ADN mạch kép tạo từ ADN mạch đơn thông qua gắn kết mồi bổ trợ khác Taq ADN polymerase 26 Giống phương pháp phân tích mARN khác, RT-PCR dùng để định lượng mARN mẫu ban đầu Kiểu phân tích đặc biệt quan trọng để kiểm tra biến đổi biểu gen Tuy nhiên sản phẩm PCR tăng theo cấp số nhân nên sai khác nhỏ tỉ lệ mẫu nhân lên Vì vậy, RT-PCR cần tối ưu hóa cẩn thận sử dụng để phân tích định lượng mARN Sự định lượng thường hai dạng: tương đối tuyệt đối REAL-TIME PCR: Trong sinh học phân tử, real-time PCR (PCR thời điểm) kỹ thật phòng thí nghiệm dựa phản ứng PCR dùng để nhân bội định lượng đồng thời phân tử ADN đích Nó có khả vừa phát vừa định lượng trình tự đặc hiệu mẫu ADN Quy trình giống nguyên tắc chung kỹ thuật PCR; đặc điểm real-time PCR ADN nhân bội định lượng thời điểm sau chu kỳ phản ứng Hai phương pháp định lượng phổ biến dùng thuốc nhuộm phát huỳnh quang xen vào ADN mạch kép dùng mẫu dò ADN oligonucleotit biến đổi để phát huỳnh quang lai với ADN bổ trợ Thông thường, phản ứng PCR thời điểm kết hợp với RT-PCR để định lượng mARN có hàm lượng nhỏ, giúp nhà nghiên cứu định lượng mức độ biểu gen cách tương đối thời điểm cụ thể tế bào mô cụ thể ADN định lượng thuốc nhuộm ADN mạch kép Thuốc nhuộm ADN mạch kép gắn vào tất phân tử ADN mạch kép tạo phản ứng PCR phát huỳnh quang Hàm lượng ADN tăng lên phản ứng dẫn đến tăng cường độ phát huỳnh quang đo sau chu kỳ phản ứng, nhờ định lượng nồng độ ADN Tuy nhiên, số loại thuốc nhuộm ADN mạch kép, SYRB Green gắn vào tất phân tử ADN mạch kép, kể mồi sản phẩm PCR không đặc hiệu, làm cho việc định lượng xác Để định 27 lượng, phản ứng PCR chuẩn bị theo cách thông thường bổ sung thêm thuốc nhuộm Đo mức độ phát huỳnh quang sau chu kỳ phản ứng so sánh với thang nồng độ ADN pha loãng chuẩn để định lượng Ngoài ra, người ta sử dụng mẫu dò phát huỳnh quang để định lượng ADN xác hơn, giá thành lại cao Mẫu dò thường sử dụng TaqMan®, loại mẫu dò dựa lan truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang lai Mẫu dò TaqMan oligonucleotit có chứa thuốc nhuộm phát huỳnh quang, thường gắn vào bazơ đầu 5’ thuốc nhuộm dập tắt, thường gắn vào đầu 3’ Mẫu dò thiết kế để lai với vùng sản phẩm PCR Khi phát xạ, thuốc nhuộm phát quang bị kích thích, truyền lượng cho phân tử thuốc nhuộm dập tắt bên cạnh không phát sáng, tạo nên chất không phát huỳnh quang Trong trình PCR, enzym polymerase tái khuôn có mẫu dò gắn vào, hoạt tính 5’ -3’ enzym cắt bỏ mẫu dò Động thái tách thuốc nhuộm phát huỳnh quang khỏi thuốc nhuộm dập tắt truyền lượng cộng hưởng huỳnh quang không xảy Sự phát huỳnh quang tăng lên chu kỳ PCR, tỷ lệ với tốc độ mẫu dò bị cắt bỏ đo lường Hình: Real – time PCR sử dụng TaqMan để định lượng 28 C Phần KẾT LUẬN Kết luận vấn đề quan trọng đề tài - Hầu hết nghiên cứu phân tích gen bắt đầu việc phải tách chiết tinh ADN từ đối tượng nghiên cứu Khi ADN có mức độ tinh cao, hoà tan trở lại dung dịch đệm nước sử dụng cho thí nghiệm phân tích ADN sau - Có nhiều phương pháp khác dùng để phân tích ADN, đến điện di gel phương pháp dùng phổ biến nhờ ưu điểm nhanh đơn giản Nguyên tắc phương pháp : tác động điện trường, phân tử axit nucleic (tích điện âm) khác kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn dạng phân tử (mạch thẳng hay vòng) di chuyển qua hệ mạng gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) với tốc độ di chuyển khác Vì vậy, chúng tách trường điện di ; qua đó, người ta thu thập phân tích phân đoạn ADN gen riêng rẽ - Việc đề suất phương pháp PCR tạo bước tiến mang tính cách mạng sinh học phân tử nói riêng sinh học nói chung nhờ việc cho phép phân lập, xác định gen, sâu nghiên cứu chức biểu gen trình phát triển phản ứng gen điều kiện môi trường, cho phép tiến hành nghiên cứu mà trước thực Kỹ thuật ứng dụng nhiều lĩnh vực sinh học phân tử chuẩn đoán bệnh di truyền người, di truyền quần thể, phân tích pháp y an ninh hình sự,…cho kết cao Kiến nghị, đề xuất Trên số kỹ thuật thao tác ADN mà qua đọc tài liệu trình bày được, chưa đầy đủ thiếu sót, mong nhận đánh giá góp ý quý thày cô 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh, 2007, Nhà xuất Đại học sư phạm, Di truyền học tập I, II Võ Thị Hương Lan, 2007, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, Sinh học phân tử Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng, 2009, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, Cơ sở di truyền học phân tử tế bào Lê Duy Thành, 2008, Nhà xuất giáo dục, Cơ sở sinh học phân tử Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp, 2007, Nhà xuất giáo dục, Công nghệ Sinh học tập 30 [...]... polymerase bám trên mạch khuôn lâu hơn và tăng số lượng sản phẩm 4 CÁC GIAI ĐOẠN CỦA PCR: Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ gồm 3 bước chính: 4.1 Gây biến tính ADN: Dùng nhiệt để tách hai mạch của ADN đích Nhiệt độ thường dùng là khoảng 940C 4.2 Gắn mồi: Hai mạch của ADN đích được làm lạnh trong sự có mặt của các mồi Các mồi nhận biết và gắn vào các mạch của ADN theo nguyên tắc bổ sung Các mồi... mặt một băng trên bản điện di – băng PCR đối chứng Công việc còn lại là tìm xem có hay không có băng bổ sung 6.2 Tách dòng các sản phẩm PCR Chúng ta đã thấy, có thể tách dòng các sản phẩm PCR bằng cách xen thêm các trình tự cho enzym giới hạn nhận biết vào đầu 5’ của mồi Cũng có thể tách dòng trực tiếp các sản phẩm PCR bằng cách lợi dụng ưu thế hoạt tính tranferase kết thúc chuỗi của Taq ADN polymerase... sản phẩm PCR Kết quả là, hầu hết các phân tử ADN được nhân bội nhờ Taq ADN polymerase đều có đầu 3’ – A so le Trong quá trình được gọi là tách dòng TA, các đầu so le đó được gắn với vectơ mạch thẳng T mang đầu so le 3’ – T ở cả hai đầu nhằm tách dòng trực tiếp với hiệu quả cao các sản phẩm PCR Điều này không xảy ra với các phân tử ADN đầu tù 25 Hình : Tách dòng TA các sản phẩm PCR 7 RT-PCR: Như chúng... chính xác ở các vị trí khác nhau trong mồi có thể giúp khắc phục vấn đề đó Trong trường hợp này, polymerase sử dụng cho phản ứng PCR phải có khả năng tổng hợp ADN trên khuôn có chứa inosine Taq polymerase có thể thực hiện được nhưng một số polymerase khác không thực hiện được 3.4 Các ADN polymerase chịu nhiệt : Là các enzym xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotit A, T, G, C vào mạch ADN mới đang... phản ứng PCR và phân tích các sản phẩm khuyếch đại phải được tiến hành ở các địa điểm cách xa nhau 21 - Dụng cụ để thiết lập phản ứng (micropipette) không sử dụng vào các thao tác khác Đầu típ sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm đầu micropipette bởi các phân tử khuyếch đại khi hút dung dịch phản ứng - Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuyếch đại trước... đang tổng hợp Ngày nay người ta dùng nhiều loại ADN polymerase: Taq ADN polymerase, Pfu ADN polymerase, T4 ADN polymerase, Tth ADN polymerase nhưng phổ biến là Taq ADN polymerase Taq ADN polymerase được tách chiết từ chủng vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus Vi khuẩn này chịu được nhiệt độ từ 50oC – 800C và sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 700C Taq ADN polymerase là enzym đơn phân, có khối lượng... không phụ thuộc vào mạch khuôn Kết quả là, các sản phẩm PCR do Taq ADN polymerase tạo ra không có đầu bằng mà có một nucleotit A nhô ra ở đầu 3 ’ Đặc điểm này đã được khai thác để tách dòng các sản phẩm PCR Sau Taq ADN polymerase, nhiều ADN polymerase khác cũng được phát hiện và sử dụng Những ADN polymerase đó có những đặc điểm khác biệt Pfu ADN polymerase được tách chiết từ Pyrococcus furiosis có hoạt... kép Thuốc nhuộm ADN mạch kép gắn vào tất cả các phân tử ADN mạch kép được tạo ra trong phản ứng PCR và phát huỳnh quang Hàm lượng ADN tăng lên trong phản ứng dẫn đến sự tăng cường độ phát huỳnh quang đo được sau mỗi chu kỳ phản ứng, nhờ đó có thể định lượng nồng độ ADN Tuy nhiên, một số loại thuốc nhuộm ADN mạch kép, như SYRB Green gắn vào tất cả các phân tử ADN mạch kép, kể cả mồi và các sản phẩm PCR... phải tách chiết và tinh sạch ADN từ các đối tượng nghiên cứu Khi ADN có mức độ tinh sạch cao, được hoà tan trở lại trong dung dịch đệm nước thì có thể sử dụng cho các thí nghiệm phân tích ADN sau đó - Có nhiều phương pháp khác nhau có thể dùng để phân tích ADN, nhưng đến nay điện di trên gel là phương pháp được dùng phổ biến nhất nhờ ưu điểm nhanh và đơn giản Nguyên tắc của phương pháp là : dưới tác. .. phiên mã Bằng PCR có thể phát hiện mất đoạn này ở các bệnh nhân mắc hội chứng Waardenburg khác PCR đoạn trình tự ADN bình thường của gen này cho sản phẩm là đoạn ADN gồm 156bp còn trình tự đột biến sinh ra đoạn ADN ngắn hơn (138bp) Dễ dàng tách hai đoạn ADN này trên gel poly Acrylamide hoặc agarose Như vậy, có thể phát hiện đột biến dựa vào kích thước của các sản phẩm PCR Trong trường hợp này, vì bệnh