Lai ADN

Lai ADN Lai ADN Bởi: Nguyễn Lân Dũng Lai ADN Nguyên tắc tiến hành sau: ADN tổng số tách xử lý với enzym cắt hạn chế (có trường hợp không cần xử lý với enzym cắt hạn chế) sau điện di gel agarose chuyển lên màng lai Mẫu dò (probe) chuẩn bị lai với màng ADN Kết phép lai cho biết khác biệt mẫu ADN khác Phép lai tiến hành dựa vào cấu trúc sợi đôi ADN từ hai sợi đơn với cầu liên kết hydrogene theo nguyên tắc bổ sung Bắt đầu đứt gãy liên kết hydrogene hoá chất (kiềm) hay biến tính nhiệt, lúc hai sợi đơn ADN tách gọi trạng thái biến tính ADN (denature) Nếu thời điểm người ta cho vào ADN đánh dấu biến tính (mẫu dò) sau tạo điều kiện hồi biến xuất (renature), lúc cho phép sợi đơn mẫu dò bắt cặp với sợi đơn mẫu ADN ban đầu (target ADN) Mức độ lai phụ thuộc vào tính đặc hiệu (sự tương đồng) mẫu dò mẫu gốc điều kiện cho phép lai thực (nhiệt độ, nồng độ muối, pH, tỷ lện mẫu dò, kích thước mẫu dò) Như vậy, việc chọn điều kiện xác cho phép lai có ý nghĩa quan trọng cho tính đặc hiệu kết phép lai Sau lai, bước rửa đệm thích hợp để loại mẫu dò dư cuối phép đo xạ đánh dấu (tuỳ theo phương pháp đánh dấu phóng xạ hay hoá chất phát xạ huỳnh quang) để đánh giá mức độ tương đồng phép lai Nói tóm lại số nhân tố tham gia vào kết phép lai là: mẫu dò ADN, phương pháp đánh dấu ADN, mẫu ADN lai điều kiện tiến hành phương pháp đánh giá kết phép lai Chọn mẫu dò: Việc chọn mẫu dò có ý nghĩa quan trọng cho phép lai Nhìn chung nhà phân loại học vi sinh vật thường không trực tiếp thiết kế mẫu dò Về mặt đưa số nội dung chủ yếu tiêu chí chọn mẫu dò theo Stahl Amann (1991) sau: Mẫu dò lai với ADN đích (target) không lai với nguồn ADN khác có mặt mẫu lai Khi phân tích mẫu vi sinh vật với mẫu dò nên đoạn nucleotid đặc trưng cho mẫu phân tích để phân biệt với sinh vật khác Tuy việc chọn mẫu dò mang tính kinh nghiệm, mẫu dò không cần phải toàn gene mà 1/17 Lai ADN đoạn gene mã hoá cho đặc tính đặc trưng cho đối tượng nghiên cứu (có thể yếu tố kháng nguyên bề mặt, độc tố hay gene chức plasmid) Với cách chọn mẫu dò có kích thước nhỏ (14-40 bp), có thuận lợi mẫu dò tổng hợp nhân tạo phép lai thực nhanh (dưới 30 phút) với mẫu dò lớn thời gian kéo dài (khoảng 16 giờ) Hạn chế lớn mẫu dò nhỏ khó khăn đánh dấu dẫn đến giảm tính đặc hiệu phép lai Một cách thường sử dụng thiết kế mẫu dò từ chuỗi ARN thông tin 16S Cách chọn vào đoạn ADN có mặt đại diện mức độ loài, loài hay thuộc chi nghiên cứu Các phương pháp đánh dấu: Các kỹ thuật đánh dấu ADN xem lĩnh vực phát triển mạnh sinh học phân tử Nói chung kỹ thuật đánh dấu chia thành kỹ thuật đánh dấu trực tiếp gián tiếp Trong phương pháp trực tiếp phần đánh dấu để phát gắn vào acid nucleic Đối với phương pháp gián tiếp có phần chức gắn vào acid nucleic phần lại phát gián tiếp dựa vào protein bám đặc hiệu phát kỹ thuật miễn dịch Sau chi tiết phương pháp đánh dấu Đánh dấu trực tiếp: - Bảng đưa loại chất dùng cho phương pháp đánh dấu trực tiếp dựa vào việc nhân ADN đánh dấu lên tăng độ nhạy so với phương pháp đánh dấu thực với mồi đơn lẻ Đối với phương pháp đánh dấu trực tiếp nhóm tạo tín hiệu gắn trực tiếp liên kết hoá trị với nucleic mẫu dò - Đánh dấu trực tiếp bao gồm bước chính: tạo tín hiệu dựa vào liên kết hoá trị nhóm tín hiệu với mẫu dò thực phép lai mẫu nghiên cứu mẫu dò Bảng 1.4 Một số chất dùng cho đánh dấu trực tiếp 2/17 Lai ADN 3/17 Lai ADN Hình 1.3 Minh hoạ phương pháp đánh dấu trực tiếp (A) gián tiếp (B) Đánh dấu gián tiếp: 4/17 Lai ADN Đánh dấu gián tiếp thực theo bước: thực phép lai mẫu dò mẫu ADN đích, phản ứng nhóm chức protein bám đặc hiệu với nhóm chức tín hiệu thông báo (reporter) cuối tạo tín hiệu từ nhóm chức tín hiệu Bảng 1.5 Liệt kê số hệ thống đánh dấu gián tiếp Mặc dù có nhiều hệ thống đánh dấu phát tín hiệu kinh nghiệm cho thấy hệ thống biotin digoxidenin cho độ nhạy cao Hai hệ thống phát tới mức picrogam acid nucleic Trong trường hợp với biotin có mức độ nhiễu cao biotin có mặt sinh phẩm, digoxigenein không gặp khó khăn Đánh dấu phóng xạ ghi phóng xạ: Phương pháp đánh dấu phóng xạ phương pháp dùng phổ biến phòng thí nghiệm lai ADN với thành phần đánh dấu 32P 35S Kết phép lai mẫu dò ADN đích phát X-phim nhấp nháy lỏng Ưu 5/17 Lai ADN điểm bật phương pháp đánh dấu phóng xạ độ nhạy đạt tới mức picrogam ADN đích Hạn chế phương pháp không đạt thích hợp cần thiết cho thí nghiệm chẩn đoán liên quan tới xác định mẫu vi sinh vật, ví dụ thời gian bán huỷ mẫu dò ngắn, nguy hiểm cho người sử dụng cần yêu cầu an toàn nghiêm ngặt cho phòng thí nghiệm cá nhân sử dụng việc quản lý chất thải Xuất phát từ thực tế mà ngày người ta quan tâm đến phương pháp đánh dấu phi phóng xạ Mục tiêu đạt hệ thống đánh dấu có độ nhạy tương đương với phương pháp dùng chất phóng xạ Bảng liệt kê yêu cầu lý tưởng cho phương pháp đánh dấu mẫu dò: 1, Dễ gắn với acid nucleic theo phương pháp đơn giản có độ lặp lại cao 2, Bền điều kiện lai bảo quản 3, Không bị ảnh hưởng làm ảnh hưởng đến phản ứng lai 4, Có thể thực với điều kiện phản ứng lai dịch thể (liquid phase) hay có chất mang (solid phase) 5, Phương pháp phát nhạy đơn giản 6, Dễ bị loại bỏ sau phản ứng lai 7, Dễ phân biệt mẫu lai mẫu chưa lai điều kiện 8, Có thể ứng dụng với hệ thống tự động hoá Tuy nhiên, theo yêu cầu lý tưởng chưa có hệ thống đánh dấu phi phóng xạ thoả mãn Hiện nay, có nhiều hệ thống đánh dấu phi phóng xạ đạt độ nhạy cao lý phương pháp ứng dụng rộng rãi đặc biệt phương pháp dựa enzym Alkaline phosphatase, Horseradisk peroxidase Tuy nhiên phương pháp sử dụng chất phóng xạ dùng cho số phòng thí nghiệm đặc biệt Chiến lược đánh dấu với chất phi phóng xạ Có phương pháp đánh dấu phi phóng xạ: 1, Dùng chất hoá phát xạ sinh phát xạ, trường hợp chất hoá sinh phát quang tạo xạ ánh sáng sau phương pháp phát xạ 6/17 Lai ADN * Với nguồn chất hoá phát quang có loại AMPPD (Bronstein, Edward & Voyta, 1989) dùng trực tiếp chất cho enzym Alkaline phosphatase phép lai ADN đạt độ nhạy cao thời gian ngắn (Bronstein et al., 1990) * Phương pháp phát xạ sử dụng enzym Alkaline phosphatase sở giải phóng D-luciferin từ chất, ví dụ D-luciferin-O-phosphate (Miska Geiger., 1987) Hai phương pháp tương đối nhạy sử dụng rộng rãi Phương pháp phát dựa vào thay đổi màu: Phương pháp đo màu thực môi trường dịch thể hay chất mang nhạy so với phương pháp phát quang Người ta tạo chất sinh màu có mặt enzym (chẳng hạn Alkaline phosphatase) Lợi phương pháp việc phát đơn giản kết thay đổi màu dễ phát ứng dụng phòng thí nghiệm vi sinh vật Một phương pháp làm tăng độ nhạy phản ứng màu cách thêm enzym kích hoạt phản ứng màu vào hệ thống Một ví dụ cho điều vai trò loại nhóm phosphat phân tử NADP thành NAD Alkaline phosphatase hệ thống phát mẫu dò nucleic Trong hệ thống NAD có vai trò kích hoạt chu trình oxy hoá mà có tham gia alcohol dehydrogenease diaphorase Trong chu trình NAD bị khử thành NADPH + H+ Phản ứng oxy hoá lại kèm theo phản ứng oxy hoá mà NADPH + H+ lại bị oxy hoá thành NAD, phản ứng xảy gắn liền với việc khử ρ-indonitro-tetrazolium màu tím thành formazan Sản phẩm cuối formazan định lượng phép so màu (Self 1985) Cơ chất huỳnh quang phát xạ huỳnh quang theo thời gian Sử dụng chất phát xạ huỳnh quang phương pháp nhạy phát tới phân tử chất phát xạ (fluorescein) Nói chung với mẫu sinh phẩm thường có mức độ nhiễu tín hiệu cao Thực tế cải thiện với chất fluorophore bền bị kích hoạt sóng ánh sáng Sự phát xạ sau ghi lại xạ bị giảm Đối với phương pháp dùng Alkaline phosphatase việc phát nhân tố gắn lanthanide theo thời gian kèm với hoạt tính enzym gọi phương pháp phát quang lanthanide khuyếch đại enzym (EALL: Evangelista, Pollack & Templeton, 1991) Trong trường hợp này, chất khả hình thành phức hệ gắn với lathanide phát xạ Dưới tác dụng Alkaline phosphatase chất lanthalide bị chuyển thành phức hệ hoạt động Phương pháp nhạy hạn chế lớn cần thiết bị kích hoạt đo xạ huỳnh quang 7/17 Lai ADN Quá trình lai: Nói chung trình lai (Hybridization ) tiến hành theo cách sau để định danh hay xác định vi sinh vật: Lai với vi sinh vật (in situ), lai dịch thể lai với chất mang (solid support) Kỹ thuật lai với vi sinh vật (in situ), hình 1.4 Hình 1.4 Minh hoạ kỹ thuật lai in situ với kỹ thuật FISH (fluorescence in situ hybridization) phát vi khuẩn Helicobacter pylori Kỹ thuật thực để định vị chuỗi acid nucleic vi sinh vật sau cố định tiêu hiển vi Tuy nhiên, hầu hết vi sinh vật có khả thấm (hay cho phép) đoạn ngắn oligonucleotid đánh dấu vào tế bào sau cố định mẫu sử dụng mẫu dò đánh dấu với chất nhuộm huỳnh quang đặc biệt nhìn thấy trực tiếp vi sinh vật kính hiển vi huỳnh quang Điều đáng ý phản ứng lai phải tiến hành thiết bị hàn kín nhằm hạn chế việc bay dịch lai Việc bay dịch lai dẫn đến việc bám không đặc hiệu chất nhuộm huỳnh quang với tế bào Nhiệt độ lai phụ thuộc vào oligonucleotid mẫu dò Sau phản ứng lai mẫu phải xem bảo quản tối thời gian tháng Nếu mẫu dò đặc hiệu cho RNA độ nhạy tăng lên lớn có tới hàng ngàn copy RNA tế bào (Stahl Amman, 1991) Lai môi trường dịch thể: Phản ứng lai môi trường dịch thể xảy nhanh nhiều so với môi trường có chất mang pha rắn (soild) Do phân tử ADN đích mẫu dò di động tự môi trường phản ứng đạt kết cao Nói chung với phép lai thực 8/17 Lai ADN dịch thể thời gian kết thúc nhanh từ 5-10 lần so với điều kiện chất mang (Bryan, et al., 1986) Tuy nhiên, bổ sung thêm chất mang làm tăng phản ứng lai Cần thêm bước cuối tách phức hợp mẫu dò-sợi ADN đích Hạn chế mẫu dịch tạo lên đặc hiệu, cần giải pháp làm hạn chế mức độ nhiễu cho thích hợp Hình 1.5 Minh hoạ kỹ thuật lai môi trường dịch thể Trên thực tế hầu hết KIT thương phẩm dùng cho vi sinh vật tiến hành môi trường dịch thể Vi sinh vật mẫu phân giải điều kiện thích hợp để ADN đích lai với mẫu dò Sau bước lai tách phức hệ mẫu dò ADN đích dựa vào thông số phép lai theo kiểu kẹp díp cụ thể Các phép lai theo kiểu kẹp díp (hình 1.9) cần có hai đoạn ADN có trình tự khác nhau; đoạn để bám giữ ADN đích gắn vào chất mang đoạn mẫu dò Điều quan trọng hai đoạn ADN phải có trình tự khác cho dù chúng gắn với hai vùng khác đoạn ADN đích theo nguyên tắc bổ sung Mẫu dò đánh dấu bổ sung vào dung dịch có đoạn ADN đích nghiên cứu Như theo hình vẽ phức hợp ADN mẫu dò đánh dấu để phát gắn với ADN đích phức hợp mẫu dò- ADN đích gắn vào chất mang hình thành Phức hợp tách khỏi dung dịch có mặt chất thích hợp để phát mẫu dò đánh dấu Khi dùng hệ thống phát dựa vào hoá chất huỳnh quang hay tạo màu dùng thiết bị phát kết cách tự động Kỹ thuật lai dựa vào màng: Tác giả giới thiệu kỹ thuật cố định ADN màng Nygaard Hall (1963, 1964) Sau Southern (1975) người mô tả việc tách ADN khỏi gel sau 9/17 Lai ADN điện di chuyển chúng lên màng nitrocellulose Các đoạn ADN đích phát kỹ thuật lai bước tiến quan trọng sinh học phân tử Từ năm 1977 đến có nhiều cải tiến phép lai bước chuyển ADN lên màng tác giả khác như: Meinkoth Wahl (1984) Người ta sử dụng số màng nynol, màng nitrocellulose hoạt hoá hay có độ bền cho phép lai Đối với công việc định loại vi sinh vật với kỹ thuật cố định màng cho phép lai ADN cần chấm mẫu (là ADN sạch, hay tế bào vi sinh vật sinh phẩm có vi sinh vật nghiên cứu) lên màng thích hợp Mẫu ly giải ADN bị biến tính, sau ADN cố định màng đưa vào tủ xấy 80oC đưa vào xử lý với tia UV trường hợp sử dụng màng lynon Mẫu dò đánh dấu sau đưa vào dung dịch Bước tiền lai thực để hạn chế mẫu bám vào không đặc hiệu Sau bước lai, màng sau lai rửa để loại mẫu dò dư Bước rửa để đánh giá mức độ bám đặc hiệu phép lai Sau mẫu dò đánh dấu lai với vị trí ADN mẫu màng phát hệ thống phát tương thích Toàn trình lai màng Meinkoth Wahl (1984) mô tả chi tiết Khi phát typ vi sinh vật, phải sử dụng kỹ thuật Southern Trong phương pháp ADN nhiễm sắc thể tinh xử lý với enzym cắt hạn chế thích hợp, sau mẫu lại điện di gel agarose tạo dấu vân (finger print) nhiễm sắc thể Sau điện di gel đặt màng nitrocellulose hay màng nylon nằm số lớp giấy Lớp giấy lọc phía đặt phần gel màng kẹp giấy lọc hình 1.6 Hình 1.6 Mô tả phương pháp chuyển ADN lên màng cho kỹ thuật Southern Blot Kết đệm từ phía thấm cách tự nhiên lên Điều giúp cho việc chuyển mảnh ADN từ gel lên màng bám chặt vào màng với kích thước phiên gel sau điện di (mô tả chi tiết theo Sambrook 1989) 10/17 Lai ADN Phương pháp truyền thống cải tiến dùng màng nylon để chuyển ADN điều kiện biến tính (Read Mann 1985) Thời gian chuyển vài qua đêm Việc cố định ADN màng thực sau cách xử lý nhiệt hay tia UV trình bày Tuy nhiên, nhiều phương pháp cải tiến thực nhanh chuyển điện di (Bittner, Kupfere, Morris, 1980) hay sử dụng bơm chân không (Medveczky, 1987; Olszewsk, 1988) Trong nhiều trường hợp dùng điện để chuyển ADN từ gel agarose lên màng trước tiên gel phải xử lý biến tính làm trung hoà trở lại Gel đặt hai điện có giấy thấm (hình 1.7) Hình 1.7 Minh hoạ bước chuyển ADN lên màng Sau nguồn điện nối lúc ADN chuyển lên màng Thời gian chuyển phụ thuộc vào kích thước đoạn ADN thường dao động khoảng 1-3 Phương pháp thực theo chiều thẳng đứng hay chiều nằm ngang Hiện có số thiết bị bán thị trường dùng cho kỹ thuật Với thiết bị nằm thẳng đứng, toàn ngâm đệm tăng cường độ dòng điện (chú ý làm tăng nhiệt độ), phương pháp cần dùng nhiều đệm Ngược lại theo phương pháp nằm ngang hay phương pháp semi-dry, gel màng kẹp giấy lọc tẩm ướt đệm thích hợp Trường hợp cần đệm cường độ dòng điện 1mA/cm2 thích hợp Trong trường hợp chuyển ADN lên màng áp lực chân không, việc thiết lập hệ thống trình bày mà gel đặt màng sử dụng lực hút chân không để đưa ADN lên màng Dùng lực hút chân không đạt hiệu chuyển ADN lên 11/17 Lai ADN màng cao phương pháp thấm tự nhiên Hiệu tối đa cho chuyển gel với trường hợp geneom sau xử lý enzym cắt hạn chế đạt sau Phân tích RELPs với kỹ thuật lai ADN Giới thiệu phương pháp: Như trình bày, phức tạp kỹ thuật RELP tạo khó khăn cho việc xác định tác nhân gây bệnh nghiên cứu dịch tễ học Điều khó khăn phức tạp so sánh kết thu gel khác phòng thí nghiệm khác Nguyên nhân số lượng băng ADN lớn tới mức xác định kích thước chúng hay băng thu không lặp lại kết nghiên cứu Mặc dù vậy, theo phương pháp phổ ADN phức tạp sau xử lý với enzym cắt hạn chế làm biến tính chuyển lên màng nitroxenluloza hay nylon Màng lai với mẫu dò thích hợp, kết phổ phép lai rõ không phức tạp hiển thị mảnh ADN bắt cặp với mẫu dò Với số lượng không lớn mảnh hiển thị thu sau phép lai cho phép xác định xác kích thước Điều làm sở cho so sánh gel với kết thu từ phòng thí nghiệm khác Khi sử dụng phương pháp cần ý số mẫu dò sau: 1, Mẫu dò đoạn RNA ribosom từ loài sinh vật đó: ví dụ rRNA E.coli công ty thương phẩm cung cấp (Boeringer Mannheim), mẫu dò thuận lợi đánh dấu phóng xạ hay với chất huỳnh quang Ưu điểm mẫu dò chỗ phần RNA đoạn bảo thủ mẫu dò dùng lai với sản phẩm xử lý enzym cắt hạn chế nhiều loài vi khuẩn khác Có số loài lai với mẫu dò cho kết giống loài khác lai chủng với mẫu dò lại thu kết khác Đây sở cho phương pháp ribotyping 2, Mẫu dò đoạn ADN ngẫu nhiên có chức không xác định (Tompkins et al., 1986) Mẫu dò thường dùng cho loài có chứa đoạn ADN Sử dụng mẫu dò có ý nghĩa việc phân biệt mẫu sau tiến hành phương pháp ribotyping (Saunders et al., 1990) Một cách khác dùng sử dụng mẫu dò đoạn ADN tách dòng từ gene biết Ví dụ dùng đoạn gene mã hoá cho độc tố ngoại bào (exotoxinA) sử dụng để định typ Pseudomonasaeruginosa (Ogle et al., 1987) Mẫu dò dùng gene mã hoá cho độc tố Cholera dùng để xác định typ cho chủng thuộc họ phảy khuẩn sinh độc tố (Yam, Li Lung & Ng, 1989) Việc sử dụng loại 12/17 Lai ADN mẫu dò tạo phổ đặc trưng phép lai có ý nghĩa cho so sánh chủng với Hạn chế kỹ thuật chỗ kết thu nhận khu trú phần gene bắt cặp với mẫu dò mà không đặc trưng cho hệ gene Bảng 1.6 Kết thu thực kỹ thuật RFLP với dùng mẫu dò ribosom Kỹ thuật ribotyping: Như trình bày mẫu dò cho kết có sức thuyết phục nhiên kỹ thuật dùng mẫu dò đoạn RNA ribosom đưa cách tiếp cận nghiên cứu dịch tễ phân tử với vi khuẩn có khác biệt lớn mẫu dò khác giới hạn với loài hay có ý nghĩa cho chủng 13/17 Lai ADN loài Kỹ thuật lần Grimont mô tả năm 1986 nhanh chóng trở thành phương pháp hữu hiệu cho nghiên cứu dịch tễ học vi sinh vật mức độ phân tử Tính hợp lý cho việc sử dụng kỹ thuật chỗ gene mã hoá cho RNA ribosom có độ bảo thủ cao Cũng phát thấy thay đổi chút trình tiến hoá chuỗi ADN vi khuẩn nghiên cứu Gene RNA ribosom tổ chức thành operon mà gene riêng rẽ mã cho RNA kích thước 5S, 16S 23S chúng cách đoạn ADN spacer không mã cho gene Nếu dùng mẫu dò hỗn hợp 16S 23S kết phép lai hiển thị mảnh tương ứng với phần gene dùng mẫu dò đoạn gene tách dòng đưa đến kết hiển thị phần gene tương đồng chuỗi spacer Như khác kết phụ thuộc vào loại mẫu dò sử dụng Yêu cầu kỹ thuật: Để thu kết tối ưu cần có yêu cầu kỹ thuật cụ thể cho bước thực Đầu tiên phải tạo phổ dấu vân tay thu sau xử lý mẫu với enzym cắt hạn chế Phổ vân tay tối ưu mảnh cắt phải tách rõ phân bố đồng kích thước gel Số lượng mảnh ADN thu phụ thuộc vào mẫu ADN loại enzym cắt hạn chế sử dụng Thông thường phải chọn số mẫu xử lý thử trước với loại enzym (hay đồng thời xử lý với số enzym) Có thể thấy rõ enzym có nucleotid vị trí cắt tạo sản phẩm nhiều mảnh enzym có nucleotid vị trí nhận biết Thực tế cho thấy dùng enzym cắt hạn chế (một hay đồng thời vài loại) để thu phổ đoạn cắt hợp lý cho việc phân tích ribotyping kết khác Như vậy, điều quan trọng nên tiến hành trước phép phân tích này, phải chọn số chủng đặc trưng thử với số enzym cắt hạn chế để chọn giải pháp cho nghiên cứu dịch tễ học với kỹ thuật Trong số trường hợp kết phân tích tiến hành với hay enzym cắt hạn chế không đưa kết xác Như vậy, có kết hợp lý sau xử lý mẫu ADN với enzym cắt hạn chế tiến hành bước chuyển đoạn ADN gel lên màng theo phương pháp mô tả Phương pháp chuyển chân không hợp lý kết cho việc chuyển băng có kích thước gần lại tách sắc nét màng Khi thực phép lai nên ý dùng nguồn ARN ribosom chủng đánh dấu làm mẫu dò cần phải thay đổi điều kiện lai nhiệt độ để phép lai thực tốt với đoạn ADN từ chủng vi sinh vật khác 14/17 Lai ADN Có số phương pháp đánh dấu mẫu dò ADN ribosom Phương pháp đánh dấu phóng xạ (Grimont, 1986), phương pháp có ưu cần vài bước đơn giản cho phép lai rửa mẫu lại mang nhiều hạn chế như: thời gian bán huỷ ngắn, yêu cầu an toàn cho phòng thí nghiệm riêng biệt, nguy hiểm cho người dùng gặp khó khăn với việc xử lý chất thải phóng xạ Mới có số phương pháp đánh dấu mẫu dò phi phóng xạ sử dụng thành công Pitcher (1987) mô tả phương pháp tổng hợp mẫu dò gắn với bilatin để phát ARN ribosom Providencia stuartii Chất kích hoạt quang hoá Koblavi Grimont mô tả (1990) ARN ribosom đánh dấu acetylaminofluorence (AAF) Grimont (1989) mô tả Công ty Eurogeneetik (Bỉ) cung cấp phức hợp AAF-rARN thị trường Gần Gustafero Persing (1992) đưa phương pháp mà phức hợp horseradisk-peroxysase-polyethyleneimine với rARN kích hoạt quang hoá Các mẫu dò đánh dấu chất phi phóng xạ cho kết nhanh tương đương với trường hợp dùng chất phóng xạ Như kết tiến hành phép lai mẫu chủng khác gel chuyển lên so sánh với dùng kỹ thuật Trong trường hợp xác định xác kết mảnh lai với mẫu dò tiến hành so sánh kết thu từ phòng thí nghiệm khác + Ứng dụng kỹ thuật ribotyping: Xác định typ vi khuẩn kỹ thuật ribotyping có số ưu điểm so với số kỹ thuật định typ khác chỗ: Thực tế gene ribosom bền chúng nằm nhiễm sắc thể Hầu hết vi sinh vật chứa nhiều phiên operon ribosom lai với mẫu dò thích hợp kết tạo số mảnh lai có kích thước khác Hiện nay, nguồn rARN E.coli đánh dấu mẫu dò phổ biến thương mại hoá 15/17 Lai ADN Hình 1.8 Kết ribotyping với Helicobacter pylori Do tính đa dạng phức tạp kỹ thuật định typ theo ribosom thực tế nhìn kết mắt thường khó phát khác hay giống chủng loài tiến hành nghiên cứu dịch tễ học diện rộng Owen cộng (1992) nghiên cứu khả trợ giúp computer để so sánh kết thu nghiên cứu chủng Helicobacterpylori Tương tự Bialkowska-Hobranska cộng (1990) dùng thiết bị laze đo mật độ mảnh ADN lai với trợ giúp computer để phân tích kết thu từ chủng cầu khuẩn nha bào gram âm Phương pháp đưa số liệu chung làm sở cho xác định giống loài khác Các phân tích thu từ số liệu các thể khác cá thể làm sở cho định danh theo dõi Mọi nghiên cứu cho thấy điều quan trọng có ý nghĩa cách chọn enzym cắt hạn chế loại mẫu dò dùng cho phép lai (Saunder cộng 1991) Tóm tắt: Nhìn chung phương pháp lai ADN chứng tỏ ưu kỹ thuật quan trọng cho định typ nghiên cứu dịch tễ học nhiều loại vi sinh vật khác Về nguyên tắc phương pháp có ưu điểm nhược điểm Ưu điểm: - Sử dụng cho nhiều đối tượng vi sinh vật 16/17 Lai ADN Có mẫu dò vạn bán rộng rãi thị trường Kết lai có độ lặp lại cao đơn giản cho việc phân tích kết Có thể sử dụng trợ giúp computer để lưu giữ phân tích kết thí nghiệm Hạn chế: - Phương pháp sử dụng phức tạp tốn thời gian Thông tin kết phản ánh cho đoạn gene lai với mẫu dò sử dụng Hiện nay, sử dụng đoạn ADN tổng hợp làm mẫu dò điều thực tế làm cải thiện nhiều mặt kỹ thuật lai như: có ADN tổng hợp thực kỹ thuật tách tinh mảnh ADN tách dòng lẫn ADN plasmid Mặt khác lai với mẫu dò tổng hợp phản ứng tiến hành nhanh với độ đặc hiệu cao Cho dù kỹ thuật sử dụng tốt cho nhiều đối tượng vi sinh vật khác năm 1992 Heimberger cộng tiến hành phân tích ADN xử lý với enzym cắt hạn chế trường xung điện (PFGE), kết có ý nghĩa cho phép phân tích sâu phân biệt chủng vi sinh vật liên quan đến bùng phát dịch chủng vi sinh vật khác Ribotyping PFGE có chung nguyên tắc dựa vào phân bố vị trí enzym cắt hạn chế ADN ribosom Tuy nhiên, khác biệt chỗ ribotyping phản ánh phân bố vị trí enzym cắt hạn chế nằm gene mã hoá cho rRNA hay nằm vùng nhiễm sắc thể có độ bảo thủ cao, PFGE phản ánh phân bố enzym cắt hạn chế phân bố toàn gene nghiên cứu Nghiên cứu Prevost (1992) cho thấy kỹ thuật PFGE hiệu kỹ thuật ribotyping phép phân tích chủng Staphylococus aureus kháng methicillin 17/17 [...]... chủng nào đó đánh dấu làm mẫu dò thì cần phải thay đổi điều kiện lai như nhiệt độ để phép lai được thực hiện tốt với các đoạn ADN từ các chủng vi sinh vật khác nhau 14/17 Lai ADN Có một số phương pháp đánh dấu mẫu dò là ADN ribosom Phương pháp đánh dấu phóng xạ (Grimont, 1986), đây là phương pháp có ưu thế là chỉ cần vài bước đơn giản cho phép lai và rửa mẫu nhưng lại mang nhiều hạn chế như: thời gian bán... tốn thời gian Thông tin kết quả chỉ phản ánh cho đoạn gene lai với mẫu dò sử dụng Hiện nay, có thể sử dụng các đoạn ADN tổng hợp làm mẫu dò và điều này thực tế đã làm cải thiện nhiều mặt của kỹ thuật lai như: khi có ADN tổng hợp thì không phải thực hiện các kỹ thuật tách và tinh sạch các mảnh ADN tách dòng có thể lẫn ADN plasmid Mặt khác khi lai với mẫu dò tổng hợp thì phản ứng tiến hành nhanh với độ... phép lai (Saunder và cộng sự 1991) Tóm tắt: Nhìn chung phương pháp lai ADN chứng tỏ ưu thế của nó như là một kỹ thuật quan trọng cho định typ và nghiên cứu dịch tễ học nhiều loại vi sinh vật khác nhau Về nguyên tắc phương pháp này cũng có ưu điểm và nhược điểm của nó Ưu điểm: - Sử dụng cho nhiều đối tượng vi sinh vật 16/17 Lai ADN Có các mẫu dò vạn năng được bán rộng rãi trên thị trường Kết quả lai. .. cứu Mặc dù vậy, theo phương pháp này các phổ ADN phức tạp sau khi xử lý với enzym cắt hạn chế sẽ được làm biến tính và chuyển lên màng nitroxenluloza hay nylon Màng sẽ được lai với mẫu dò thích hợp, kết quả phổ phép lai sẽ rõ và không quá phức tạp do nó chỉ hiển thị các mảnh ADN bắt cặp với mẫu dò Với một số lượng không lớn các mảnh hiển thị thu được sau phép lai sẽ cho phép xác định được chính xác hơn... này cần rất ít đệm và cường độ dòng điện là 1mA/cm2 là thích hợp Trong trường hợp chuyển ADN lên màng bằng áp lực do chân không, việc thiết lập hệ thống được trình bày mà ở đó gel được đặt trên màng và sử dụng lực hút chân không để đưa ADN lên màng Dùng lực hút chân không đạt được hiệu quả chuyển ADN lên 11/17 Lai ADN màng cao hơn phương pháp thấm tự nhiên Hiệu quả tối đa cho chuyển gel với trường hợp.. .Lai ADN Phương pháp truyền thống này cũng được cải tiến khi dùng màng nylon để chuyển ADN trong điều kiện biến tính (Read và Mann 1985) Thời gian chuyển có thể vài giờ hoặc qua đêm Việc cố định ADN trên màng được thực hiện sau đó bằng cách xử lý nhiệt hay tia UV như đã trình bày ở trên Tuy nhiên,... do chúng nằm trên nhiễm sắc thể Hầu hết các vi sinh vật đều chứa nhiều phiên bản của operon ribosom do đó khi lai với mẫu dò thích hợp thì kết quả là tạo ra một số mảnh lai có kích thước khác nhau Hiện nay, nguồn rARN của E.coli đánh dấu là mẫu dò khá phổ biến đã được thương mại hoá 15/17 Lai ADN Hình 1.8 Kết quả ribotyping với Helicobacter pylori Do tính đa dạng và phức tạp của kỹ thuật định typ theo... Trong nhiều trường hợp dùng điện để chuyển ADN từ gel agarose lên màng thì trước tiên gel phải được xử lý biến tính và được làm trung hoà trở lại Gel được đặt giữa hai bản điện có các bản giấy thấm (hình 1.7) Hình 1.7 Minh hoạ bước chuyển ADN lên màng Sau đó nguồn điện được nối và lúc đó ADN sẽ được chuyển lên màng Thời gian chuyển sẽ phụ thuộc vào kích thước đoạn ADN nhưng thường dao động trong khoảng... phần RNA là đoạn khá bảo thủ do đó mẫu dò có thể dùng lai với các sản phẩm xử lý enzym cắt hạn chế của nhiều loài vi khuẩn khác nhau Có một số loài khi lai với mẫu dò chỉ cho một kết quả giống nhau trong khi đó ở loài khác khi lai các chủng với mẫu dò thì lại thu được kết quả khác nhau Đây là cơ sở cho phương pháp ribotyping 2, Mẫu dò có thể là đoạn ADN ngẫu nhiên có chức năng không xác định (Tompkins... RELPs với kỹ thuật lai ADN Giới thiệu phương pháp: Như đã trình bày, sự phức tạp trong kỹ thuật RELP đã tạo ra những khó khăn cho việc xác định các tác nhân gây bệnh trong các nghiên cứu về dịch tễ học Điều này còn khó khăn và phức tạp hơn trong khi so sánh các kết quả thu được trên các bản gel khác nhau hoặc tại các phòng thí nghiệm khác nhau Nguyên nhân là do số lượng các băng ADN lớn tới mức không ... nghiệm lai ADN với thành phần đánh dấu 32P 35S Kết phép lai mẫu dò ADN đích phát X-phim nhấp nháy lỏng Ưu 5/17 Lai ADN điểm bật phương pháp đánh dấu phóng xạ độ nhạy đạt tới mức picrogam ADN đích... huỳnh quang 7/17 Lai ADN Quá trình lai: Nói chung trình lai (Hybridization ) tiến hành theo cách sau để định danh hay xác định vi sinh vật: Lai với vi sinh vật (in situ), lai dịch thể lai với chất... thích hợp để ADN đích lai với mẫu dò Sau bước lai tách phức hệ mẫu dò ADN đích dựa vào thông số phép lai theo kiểu kẹp díp cụ thể Các phép lai theo kiểu kẹp díp (hình 1.9) cần có hai đoạn ADN có trình