Lai ADN – Phần 4 doc

Lai ADN – Phần 4 + Phân tích RELPs với kỹ thuật lai ADN. Giới thiệu phương pháp: Như đã trình bày, sự phức tạp trong kỹ thuật RELP đã tạo ra những khó khăn cho việc xác định các tác nhân gây bệnh trong các nghiên cứu về dịch tễ học. Điều này còn khó khăn và phức tạp hơn trong khi so sánh các kết quả thu được trên các bản gel khác nhau hoặc tại các phòng thí nghiệm khác nhau. Nguyên nhân là do số lượng các băng ADN lớn tới mức không thể xác định kích thước của chúng hay các băng thu được không lặp lại các kết quả nghiên cứu. Mặc dù vậy, theo phương pháp này các phổ ADN phức tạp sau khi xử lý với enzym cắt hạn chế sẽ được làm biến tính và chuyển lên màng nitroxenluloza hay nylon. Màng sẽ được lai với mẫu dò thích hợp, kết quả phổ phép lai sẽ rõ và không quá phức tạp do nó chỉ hiển thị các mảnh ADN bắt cặp với mẫu dò. Với một số lượng không lớn các mảnh hiển thị thu được sau phép lai sẽ cho phép xác định được chính xác hơn về kích thước. Điều này làm cơ sở cho so sánh giữa các gel với nhau cũng như kết quả thu được từ các phòng thí nghiệm khác nhau. Khi sử dụng phương pháp này cần chú ý một số mẫu dò sau: 1, Mẫu dò có thể là đoạn RNA ribosom từ một loài sinh vật nào đó: ví dụ rRNA của E.coli có thể được các công ty thương phẩm cung cấp (Boeringer Mannheim), đây là mẫu dò khá thuận lợi và được đánh dấu phóng xạ hay với các cơ chất huỳnh quang. Ưu điểm chính của mẫu dò này ở chỗ phần RNA là đoạn khá bảo thủ do đó mẫu dò có thể dùng lai với các sản phẩm xử lý enzym cắt hạn chế của nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Có một số loài khi lai với mẫu dò chỉ cho một kết quả giống nhau trong khi đó ở loài khác khi lai các chủng với mẫu dò thì lại thu được kết quả khác nhau. Đây là cơ sở cho phương pháp ribotyping. 2, Mẫu dò có thể là đoạn ADN ngẫu nhiên có chức năng không xác định (Tompkins et al., 1986). Mẫu dò này thường được dùng cho các loài có chứa chính các đoạn ADN này. Sử dụng các mẫu dò này đôi khi rất có ý nghĩa trong việc phân biệt các mẫu sau khi tiến hành phương pháp ribotyping (Saunders et al., 1990). 3. Một cách khác nữa cũng được dùng là sử dụng mẫu dò là một đoạn ADN tách dòng từ một gene đã biết. Ví dụ dùng đoạn gene mã hoá cho độc tố ngoại bào (exotoxinA) sử dụng để định typ Pseudomonas aeruginosa (Ogle et al., 1987). Mẫu dò dùng gene mã hoá cho độc tố Cholera được dùng để xác định các typ cho các chủng thuộc họ phảy khuẩn sinh độc tố (Yam, Li Lung & Ng, 1989). Việc sử dụng bất kỳ loại mẫu dò nào cũng tạo ra phổ đặc trưng của phép lai có ý nghĩa cho so sánh giữa các chủng với nhau. Hạn chế chính của kỹ thuật này ở chỗ kết quả thu nhận chỉ khu trú phần gene bắt cặp với mẫu dò mà không đặc trưng cho cả hệ gene. Bảng 1.6. Kết quả thu được khi thực hiện kỹ thuật RFLP với dùng các mẫu dò không phải là ribosom. Đối tượng Tác giả nghiên cứu và tài liệu dẫn Aeromonas spp Altwegg an Luthyhottenstein (1991) Borrelia burgorferi Wallich et al (1992) Candida albicans Schmid et al (1992) Chlamydia trachomatis Scieux et al (1992) Corynebacterium diphtheriae Groman et al (1993) Cryptococcus noeformans Spitzer (1992) Escherichia coli Bohm ADN Karch (1992) Hemophilus influenzae Forbes et al (1992) Histoplasma capsulatum Leathet al (1992) Lactobacillus helveticus Delostreyesgavilan et al (1992) Mycobacterium tuberculosis Mazurek et al (1991) Pseudomonas aeruginosa Tompkins(1991) Salmonella spp Sodati ADN Piffaretti (1991) Staphylococcus aureus Goh et al (1992) - Kỹ thuật ribotyping: Như đã trình bày ở trên mọi mẫu dò đều cho các kết quả có sức thuyết phục tuy nhiên kỹ thuật dùng mẫu dò là đoạn RNA của ribosom đã đưa ra một cách tiếp cận mới trong nghiên cứu dịch tễ phân tử với các vi khuẩn có sự khác biệt lớn trong khi đó các mẫu dò khác chỉ giới hạn với một loài hay chỉ có ý nghĩa cho các chủng trong cùng một loài. Kỹ thuật này lần đầu tiên được Grimont mô tả năm 1986 và nhanh chóng trở thành phương pháp hữu hiệu hiện nay cho nghiên cứu dịch tễ học vi sinh vật ở mức độ phân tử. Tính hợp lý cho việc sử dụng kỹ thuật này là ở chỗ gene mã hoá cho RNA ribosom có độ bảo thủ cao. Cũng có thể phát hiện thấy những thay đổi chút ít trong quá trình tiến hoá đối với các chuỗi ADN trong các vi khuẩn nghiên cứu. Gene RNA ribosom được tổ chức thành các operon mà các gene riêng rẽ mã cho các RNA kích thước 5S, 16S và 23S chúng được cách nhau bằng các đoạn ADN spacer không mã cho gene nào. Nếu dùng mẫu dò hỗn hợp giữa 16S và 23S thì kết quả phép lai sẽ hiển thị các mảnh tương ứng với phần của gene này trong khi dùng mẫu dò là đoạn của các gene đã được tách dòng có thể đưa đến kết quả hiển thị cả phần gene tương đồng và chuỗi spacer. Như vậy sự khác nhau của kết quả phụ thuộc vào loại mẫu dò sử dụng. - Yêu cầu kỹ thuật: Để thu được kết quả tối ưu cần có các yêu cầu kỹ thuật cụ thể cho từng bước thực hiện. Đầu tiên là phải tạo ra được phổ dấu vân tay thu được sau khi xử lý mẫu với enzym cắt hạn chế. Phổ vân tay tối ưu khi các mảnh cắt phải được tách rõ và phân bố đồng đều về kích thước trên gel. Số lượng các mảnh ADN thu được phụ thuộc vào mẫu ADN và loại enzym cắt hạn chế được sử dụng. Thông thường phải chọn một số mẫu xử lý thử trước với từng loại enzym (hay đồng thời xử lý với một số enzym). Có thể thấy rõ là các enzym có 5 nucleotid tại vị trí cắt sẽ tạo ra sản phẩm nhiều mảnh hơn các enzym có 6 nucleotid tại vị trí nhận biết. Thực tế cũng cho thấy khi dùng enzym cắt hạn chế (một hay đồng thời vài loại) để thu được phổ các đoạn cắt hợp lý cho việc phân tích ribotyping thì các kết quả này cũng rất khác nhau. Như vậy, điều quan trọng nên tiến hành trước các phép phân tích này, phải chọn được một số chủng đặc trưng và thử với một số enzym cắt hạn chế để chọn giải pháp cho nghiên cứu dịch tễ học với kỹ thuật này. Trong một số trường hợp kết quả phân tích khi chỉ tiến hành với 1 hay 2 enzym cắt hạn chế có thể không đưa ra được kết quả chính xác. Như vậy, khi có được kết quả hợp lý sau khi xử lý các mẫu ADN với enzym cắt hạn chế thì tiến hành các bước chuyển các đoạn ADN trên gel lên màng theo các phương pháp đã được mô tả ở trên. Phương pháp chuyển bằng chân không là hợp lý hơn cả vì kết quả cho việc chuyển các băng có kích thước gần nhau lại được tách ra sắc nét trên màng. Khi thực hiện phép lai nên chú ý nếu như dùng nguồn ARN ribosom của một chủng nào đó đánh dấu làm mẫu dò thì cần phải thay đổi điều kiện lai như nhiệt độ để phép lai được thực hiện tốt với các đoạn ADN từ các chủng vi sinh vật khác nhau. Có một số phương pháp đánh dấu mẫu dò là ADN ribosom. Phương pháp đánh dấu phóng xạ (Grimont, 1986), đây là phương pháp có ưu thế là chỉ cần vài bước đơn giản cho phép lai và rửa mẫu nhưng lại mang nhiều hạn chế như: thời gian bán huỷ ngắn, yêu cầu an toàn cho phòng thí nghiệm riêng biệt, nguy hiểm cho người dùng và gặp khó khăn với việc xử lý chất thải phóng xạ. Mới đây có một số phương pháp đánh dấu mẫu dò phi phóng xạ được sử dụng khá thành công. Pitcher (1987) đã mô tả phương pháp tổng hợp mẫu dò gắn với bilatin để phát hiện ARN ribosom của Providencia stuartii. Chất kích hoạt quang hoá đã được Koblavi và Grimont mô tả (1990). ARN ribosom cũng được đánh dấu bằng acetylaminofluorence (AAF) do Grimont (1989) mô tả. Công ty Eurogeneetik (Bỉ) đã cung cấp phức hợp AAF-rARN trên thị trường. Gần đây Gustafero và Persing (1992) đã đưa ra một phương pháp mới mà ở đây phức hợp horseradisk-peroxysase-polyethyleneimine với rARN và kích hoạt bằng quang hoá. Các mẫu dò được đánh dấu bằng các chất phi phóng xạ này có thể cho kết quả nhanh tương đương với trường hợp dùng các chất phóng xạ. Như vậy kết quả tiến hành phép lai các mẫu của các chủng khác nhau trong cùng gel chuyển lên có thể so sánh với nhau khi dùng kỹ thuật này. Trong trường hợp xác định chính xác kết quả các mảnh lai với mẫu dò có thể tiến hành so sánh các kết quả thu được từ các phòng thí nghiệm khác nhau. + Ứng dụng kỹ thuật ribotyping: Xác định typ vi khuẩn bằng kỹ thuật ribotyping có một số ưu điểm so với một số kỹ thuật định typ khác ở chỗ: Thực tế là các gene của ribosom khá bền do chúng nằm trên nhiễm sắc thể. Hầu hết các vi sinh vật đều chứa nhiều phiên bản của operon ribosom do đó khi lai với mẫu dò thích hợp thì kết quả là tạo ra một số mảnh lai có kích thước khác nhau. Hiện nay, nguồn rARN của E.coli đánh dấu là mẫu dò khá phổ biến đã được thương mại hoá. Hình 1.8. Kết quả ribotyping với Helicobacter pylori. Do tính đa dạng và phức tạp của kỹ thuật định typ theo ribosom do đó trên thực tế khi nhìn kết quả bằng mắt thường khó có thể phát hiện được sự khác nhau hay giống nhau giữa các chủng trong cùng một loài khi tiến hành nghiên cứu dịch tễ học trên diện rộng. Owen và cộng sự (1992) đã nghiên cứu khả năng trợ giúp của computer để so sánh kết quả thu được khi nghiên cứu các chủng Helicobacter pylori. Tương tự như vậy Bialkowska-Hobranska và cộng sự (1990) dùng thiết bị laze đo mật độ các mảnh ADN lai cùng với sự trợ giúp của computer để phân tích các kết quả thu được từ các chủng cầu khuẩn nha bào gram âm. Phương pháp này có thể đưa ra số liệu chung làm cơ sở cho xác định sự giống nhau giữa các loài khác nhau. Các phân tích thu được từ các số liệu của các các thể khác nhau có thể chỉ ra được các cá thể mới làm cơ sở cho định danh cũng như theo dõi. Mọi nghiên cứu cho thấy một điều quan trọng và có ý nghĩa nhất là cách chọn enzym cắt hạn chế và loại mẫu dò dùng cho phép lai (Saunder và cộng sự 1991). Tóm tắt: Nhìn chung phương pháp lai ADN chứng tỏ ưu thế của nó như là một kỹ thuật quan trọng cho định typ và nghiên cứu dịch tễ học nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Về nguyên tắc phương pháp này cũng có ưu điểm và nhược điểm của nó. Ưu điểm: - Sử dụng cho nhiều đối tượng vi sinh vật. - Có các mẫu dò vạn năng được bán rộng rãi trên thị trường. Kết quả lai có độ lặp lại cao và khá đơn giản cho việc phân tích kết quả. - Có thể sử dụng sự trợ giúp của computer để lưu giữ và phân tích kết quả thí nghiệm. Hạn chế: - Phương pháp sử dụng khá phức tạp và tốn thời gian. - Thông tin kết quả chỉ phản ánh cho đoạn gene lai với mẫu dò sử dụng. Hiện nay, có thể sử dụng các đoạn ADN tổng hợp làm mẫu dò và điều này thực tế đã làm cải thiện nhiều mặt của kỹ thuật lai như: khi có ADN tổng hợp thì không phải thực hiện các kỹ thuật tách và tinh sạch các mảnh ADN tách dòng có thể lẫn ADN plasmid. Mặt khác khi lai với mẫu dò tổng hợp thì phản ứng tiến hành nhanh với độ đặc hiệu cao hơn. Cho dù kỹ thuật này được sử dụng tốt cho nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau nhưng năm 1992 Heimberger và cộng sự đã tiến hành phân tích ADN được xử lý với enzym cắt hạn chế trong trường xung điện (PFGE), kết quả này rất có ý nghĩa cho phép phân tích sâu hơn và phân biệt các [...]...chủng vi sinh vật liên quan đến sự bùng phát dịch đối với các chủng vi sinh vật khác Ribotyping và PFGE có chung nguyên tắc dựa vào sự phân bố của các vị trí enzym cắt hạn chế trên ADN của ribosom Tuy nhiên, sự khác biệt ở chỗ ribotyping phản ánh sự phân bố của vị trí các enzym cắt hạn chế nằm trong các gene mã hoá cho rRNA hay nằm trong vùng nhiễm sắc thể có độ bảo thủ cao, còn . Lai ADN – Phần 4 + Phân tích RELPs với kỹ thuật lai ADN. Giới thiệu phương pháp: Như đã trình bày, sự phức tạp trong. phép lai nên chú ý nếu như dùng nguồn ARN ribosom của một chủng nào đó đánh dấu làm mẫu dò thì cần phải thay đổi điều kiện lai như nhiệt độ để phép lai được thực hiện tốt với các đoạn ADN từ. ánh cho đoạn gene lai với mẫu dò sử dụng. Hiện nay, có thể sử dụng các đoạn ADN tổng hợp làm mẫu dò và điều này thực tế đã làm cải thiện nhiều mặt của kỹ thuật lai như: khi có ADN tổng hợp thì