Thuc tap Kĩ thuật di truyền 2016

CHƯƠNG TRÌNH THỰC TẬP KỸ THUẬT DI TRUYỀN (1 TÍN CHỈ) Số tiết 15 Số tiết quy đổi: 30 tiết Bài Kỹ thuật tách chiết DNA từ thực vật/động vật (5 tiết) Bài 2: Kỹ thuật nhân dòng gen sử dụng vector plasmid (5 tiết) Bài Kỹ thuật điện di ADN gel agarose (5 tiết) Bài Kỹ thuật PCR (5 tiết) Bài Kỹ thuật thị phân tử (5 tiết) Bài Kỹ thuật điện di DNA gel agarose (5 tiết)Kỹ thuật nhân dòng gen sử dụng vector plasmid (5 tiết) Bài Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (5 tiết) BÀI KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT DNA TỪ THỰC VẬT/ĐỘNG VẬT Mục đích, yêu cầu - Sinh viên nắm quy trình tách chiết ADNDNA tổng số điển hình thực vật/động vật - Biết cách sử dụng máy đo quang phổ để xác định hàm lượng ADNDNA đánh giá độ ADNDNA tách chiết - Giải thích vai trò hóa chất, đệm chiết bước quy trình tách ADNDNA Kỹ thuật tách chiết DNA 2.1 Quy trình tách chiết DNA từ mô thực vật (mô khoai tây/lúa) a/ Nguyên liệu: Mô khoai tây/lúa Để tăng hiệu tách chiết DNA, không chọn mô già (chứa nhiều chất trao đổi thứ cấp) chọn vào lúc trước quang hợp Lá sau lấy rửa nhiều nước cất vô trùng, xử lý cồn 25% phút tráng lại nước cất vô trùng Bảo quản 0C Đối với mô in vitro cần lấy lượng cần thiết cho tách chiết mà không cần xử lý mẫu b/ Hóa chất thiết bị - Đệm chiết DNA Tris-HCl pH 8.,0 0.,2M EDTA 25mM pH 8.,0 SDS 1% NaCl 250mM - Đệm hòa tan DNA Tris-HCl pH 8.,0 20mM EDTA pH 8.,0 10mM - Hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) - Hỗn hợp Chloroform: Isoamylalcohol (24:1) - Ethanol 70% 100%, SDS 10%, Sodium acetate 5M pH 5.,0 - Đệm TE (10mM Tris-HCl; 1mM EDTA) - Cối chày sứ vô trùng, khay đá để đựng mẫu trình tách chiết DNA - Pipet, đầu típ loại, ống eppendorff 1.,5ml, cuvette… - Máy li tâm, máy đo quang phổ c/ Tiến hành thí nghiệm Lấy mẫu lúa/khoai tây, cắt nhỏ kéo vô trùng cho vào cối Cho vào 300 µl đệm chiết, nghiền nát cối chày sứ thành dung dịch đồng thể Cho tiếp 400µl đệm chiết vào cối, nghiền trộn sau đặt đá phút Ly tâm 13.000 rpm phút Chuyển phần dịch sang ống eppendorf Thêm vào 700µl hỗn hợp Phenol: Chloroform:Isoamylalcohol (25:24:1) Trộn nhẹ nhàng cách đảo ngược ống sau li tâm 13.000 phút Hút 500 µl phần dịch sang ống eppendorf Bổ sung 600µl Chloroform: Isoamyl alcohol (24 :1) trộn bước 10 Ly tâm 13000rpm/5 phút hút 400 µl dịch lớp sang ống eppendorff 11 Thêm 800µl cồn tuyệt đối, trộn để đá phút 12 Ly tâm 13.000 rpm 10 phút, chắt bỏ cồn để thu tủa DNA đáy ống 13 Cho vào 500µl Ethanol 70%, voltex ly tâm 13.000 vòng phút 14 Chắt bỏ ethanol, làm khô tủa DNA không khí (hoặc ủ 50-600C phút) 15 Hòa tan DNA 50µl TE bảo quản -200C Bảo quản DNA 2.2 Quy trình tách chiết DNA từ tế bào động vật (mẫu máu toàn phần) a/ Vật liệu Mẫu máu: Máu động vật chống đông dung dịch K, bảo quản 40C b/ Hóa chất * Dung dịch A (Lysis buffer) • sucrose 0.32 M (27.38 g) • Tris-Cl 0.01 M, pH 7.,5 • MgCl2 mM • Triton X100 1% *Dung dịch K (dung dịch bảo quản máu) • NaCl 0.,075 M • EDTA 0.,025M, pH 8.,0 *Dung dịch B • Tris-HCl 0.,02 M , pH 7.,5 • Na2EDTA 0.,05 M • NaCl 0.,15M * Dung dịch SDS 10% bổ sung trước sử dụng lượng 1/10 thể tích dung dịch B * Dung dịch Proteinase K (20 mg/ml) bổ sung trước sử dụng lượng 1/100 thể tích dung dịch B 16 c/ Thiết bị, máy móc - MicropPipette, đầu tip, ống eppendorff 1.,5ml - Máy ly tâm - Đèn UV, máy chụp ảnh d/ Tiến hành thí nghiệm Lấy 0.,3 ml máu toàn phần cho vào ống eppendorf 1.,5ml Cho vào 0.,7 ml dung dịch lysis buffer (đặt đá) Voltex nhẹ Ly tâm 10.000 vòng/ phút 40C phút, thu lấy tủa tế bào a (Quá trình lặp lại vài lần tủa tế bào có màu trắng) Cho 0.,5 ml dung dịch đệm B, bổ sung 50 µl SDS 10% ul Proteinase K (20 mg/ml) Ủ 550C từ 3-5h lắc nhẹ tế bào bị phá vỡ hoàn toàn Cho 0.,7 ml Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1) Voltex nhẹ Ly tâm 13.000 vòng/phút phút Thu phần dịch phía cho vào ống eppendorf Lặp lại bước đến bước từ đến lần Cho 0.,4 ml Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1) 10 Voltex nhẹ 11 Ly tâm 13.000 vòng/ phút phút, thu 0.,4 ml dịch phía chuyển vào ống eppendorf 12 Cho vào 0.8 ml Ethanol, lắc nhẹ để -20 C 15 phút (Bước quan sát thấy tủa DNA dạng chùm sợi màu trắng) 13 Ly tâm 13.000 vòng/ phút phút 14 Thu tủa, rửa tủa Ethanol 70%, sau ly tâm 13.000 vòng/ phút phút 15 Làm khô DNA 16 Hòa tan DNA TE nước cất vô trùng 17 Bảo quản DNA e/ Những điểm cần lưu ý - - Quá trình thao tác với mẫu máu cần phải lưu ý đeo găng tay để tránh bệnh truyền nhiễm lây qua tiếp xúc - - Quá trình tách chiết dễ dàng chất lượng ADNDNA tốt lấy máu tươi Máu chống đông không bảo quản tủ lạnh sâu bị vỡ hồng cầu ảnh hưởng đến chất lượng ADNDNA - -Lưu ý phải rửa tế bào bạch cầu kỹ không lẫn hồng cầu - - Khi tủa Ethanol Isopropanol quan sát ADNDNA kết tủa dạng sợi trắng 3 Xác định hàm lượng độ ADNDNA Để xác định hàm lượng độ ADNDNA có nhiều phương pháp sử dụng bao gồm: phương pháp mật độ quang (đo độ hấp phụ), phương pháp điện di, phương pháp nhuộm phân tử ADNDNA fluorescent Tuy nhiên xác định hàm lượng độ ADNDNA sử dụng máy đo quang phổ đơn giản sử dụng phổ biến phòng thí nghiệm Máy đo quang phổ thiết bị thường sử dụng để xác định hàm lượng số chất Protein, ADNDNA, chlorophil, tinh bột… dung dịch dựa vào mức độ hấp thụ cực đại bước sóng ánh sáng khác tương ứng với loại dung dịch Dựa vào công thức đồ thị chuẩn xác định hàm lượng chất Hiện nay, số máy đại hiển thị thông số dung dịch cần đo hàm lượng protein, ADNDNA, polysacharide… Hàm lượngNồng độ ADNDNA xác định công thức: [ADNDNA] = OD260 × 50 × X x conversion factor(µg) Trong đó: - X: số lần pha loãng từ dung dịch ADNDNA gốc ban đầu - 50 (ng/µl µg/ml): hệ số nồng độ dsDNA A260 dsDNA = 50 ng/µl (hoặc µg/ml) - conversion factor: hệ số chuyển đổi Khi sử dụng cuvette có đường kính 10 mm (độ dài mà ánh sáng qua mẫu 10 mm – path lenghth) hệ số Khi sử dụng cuvette khác, với độ dài ánh sáng qua mẫu thay đổi hệ số thay đổi Giả sử với mẫu, sử dụng cuvette có path length = 10 mm hệ số chuyển đổi 1, sử dụng cuvette có path lenghth = mm hệ số chuyển đổi 10/2 = lúc giá trị OD bị giảm 10/2 = lần - Đơn vị nồng độ DNA: ng/µl µg/ml Hàm lượng DNA xác định công thức: Nồng độ DNA x tổng thể tích mẫu Độ ADNDNA xác định tỉ số OD 260/OD280 Nếu tỉ số > 1,7 dung dịch ADNDNA đem đo coi Khái niệm lượng protein lại dung dịch DNA DNA tách Những điểm cần lưu ý - Tất thao tác trình tách chiết ADNDNA phải thực điều kiện lạnh (0-40C) - Nếu mục đích tách chiết ADNDNA cho phản ứng nhân gen (PCR) không cần lượng ADNDNA thật lớn độ cao Trong trường hợp cần phải làm ADNDNA cần lặp lại nhiều bước Phenol: Chloroform: Isoamylacohol (25:24:1) để loại bỏ hết protein lại mẫu BÀI KỸ THUẬT NHÂN DÒNG GEN SỬ DỤNG VECTOR PLASMID Mục đích, yêu cầu - Sinh viên nắm thành phần môi trường biết cách pha chế môi trường nuôi cấy vi khuẩn - Sinh viên hiểu giải thích nguyên lý kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp dựa sở Kit nhân dòng (Cloning KIT) - Giải thích nguyên lý trình nuôi cấy vi khuẩn, chọn lọc thể tái tổ hợp - Giải thích trình biến nạp nhờ sốc nhiệt - Biết cách cấy vi khuẩn môi trường lỏng môi trường đặc - Biết cách bảo quản lưu giữ vi khuẩn - Giải thích trình chọn lọc - Giải thích nguyên lý bước thí nghiệm vai trò hoá chất sử dụng - Sinh viên phải ghi chép đầy đủ bước trình thực tập giải thích trình Vật liệu, hóa chất dụng cụ Vật liệu • Clone Jet TM PCR Cloning Kit - pJET1.2/blunt cloning vector (50 ng/µl) - 2X Reaction Buffer - T4 DNA Ligase (5u/µl) - pJET1.2 Forward Sequencing Primer (10 µM) - pJET1.2 Reverse Sequencing Primer (10 µM) - Control PCR production (24 ng/µl) - Water, nuclease-free • DNA ngoại đoạn DNA thu PCR (sử dụng Taq DNA polymerase) • Tế bào E coli khả biến (E coli TOP10) Hóa chất • Tryptone, cao nấm men, NaCl, NaOH, agar, Ampicillin, Kanamycin, S.O.C… Dụng cụ, thiết bị - Ống phản ứng: ống PCR 0.2 mL 0.5 mL - Micropippet đầu côn tương ứng - Ống Eppendorf 1.5 mL, mL vô trùng - Box cấy vô trùng, máy lắc… - Máy ổn nhiệt (Water bath) - Tủ định ổn Cách tiến hành thí nghiệm 3.1 Chuẩn bị môi trường • Môi trường S.O.C Thành phần Tryptone Yeast extract NaCl 1M KCl 1M MgCl2 1M MgSO4 H2O 1M Glucose* * bổ sung sau hấp Nồng độ sử dụng 2% 0.5% 10mM 2.5mM 10mM 10mM • Môi trường LB đặc • Thành phần Trypton NaCl Cao nấm men Agar Môi trường chọn lọc 100ml 2g 0.5g 0.05g 0.25ml 1ml 1ml 20 mM ml Hàm lượng 10 g/l 10 g/l g/l 20 g/l LB đặc + 100 mg/L Ampicillin 3.2 Thực phản ứng nối đoạn DNA vào vector nhân dòng • Thực phản ứng nối (ligation) đoạn DNA vào vector nhân dòng pJET1.2/blunt - - Phản ứng tạo sản phẩm đầu Thành phần Thể tích 2X Reaction Buffer 10 µl PCR product 1-2 µl * Water, nuclease-free DNA Blunting Enzyme µl Tổng thể tích 18 µl Trộn nhẹ, spin 3-5s Ủ 70oC phút Đặt đá Thực phản ứng nối: bổ sung vào ống phản ứng thành phần sau: - Thành phần Thể tích pJET1.2/blunt cloning vector (50 ng /µl) µl T4 DNA ligase µl Tổng thể tích 20 µl Trộn nhẹ, spin 3-5s Ủ hỗn hợp phản ứng nhiệt độ phòng (22 oC) 5’ (Chú ý: thời gian ủ kéo dài lên đến 30 phút để đạt hiệu biến nạp cao) 3.3 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ - Lấy tế bào khả biến khỏi tủ lạnh sâu: -800C, để tan từ từ đá - Bổ sung µl sẩn phẩm lai vào 50 µl tế bào khả biến, trộn - Để đá lạnh từ 20-30 phút Sốc nhiệt 45 giây nhiệt độ 420C - Bổ sung 500 µl môi trường S.O.C nuôi lắc 200rpm 370C 3.4 Nuôi cấy vi khuẩn biến nạp môi trường chọn lọc - Lấy 50, 100, 150 µl dịch vi khuẩn nuôi cấy trải môi trường chọn lọc: - Nuôi cấy 370C qua đêm (12-16 h) 3.5 Quan sát kết Quan sát hình thái, màu sắc khuẩn lạc môi trường chọn lọc Những điểm cần lưu ý - Quá trình lai DNA hiệu sản phẩm PCR vừa nhân Không nên sử dụng sản phẩm PCR để lâu - Vi khuẩn E.coli thuộc loại Gram âm, có khả gây bệnh thao tác phải lưu ý tránh lây nhiễm cho người giảm tạp nhiễm cho thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn khác - Để đảm bảo cho thí nghiệm thành công cần lưu ý khử trùng môi trường tốt để tránh tạp nhiễm - Khi lấy tế bào khả biến khỏi tủ lạnh sâu phải để tan từ từ đá - Lưu ý thời gian nhiệt độ trình biến nạp Bài KỸ THUẬT ĐIỆN DI DNA TRÊN GEL AGAROSE Mục đích, yêu cầu - Sinh viên phải hiểu nguyên lý trình điện di - Biết cách sử dụng máy điện di, nguồn điện chiều - Biết cách tạo gel, nhuộm màu sử dụng máy chụp ảnh Vật liệu, hóa chất dụng cụ - a Vật liệu: ADN tách chiết từ b Hóa chất: - Đệm chạy điện di TAE TBE - Đệm mẫu (loading dye) - Dung dịch Ethilium Bromide 0,01 % Chạy điện di gel agarose 3.1 Đổ gel agarose % Cân gam agarose cho vào lọ thủy tinh chịu nhiệt Đổ 100 ml dung dịch TAE 1X, lắc Cho vào lò vi sóng, đun cho agarose tan hoàn toàn Chuẩn bị khuôn lược, đặt thăng Để agarose nguội từ từ đến 600C, bổ sung µl ethilium bromide, lắc đổ nhẹ nhàng liên tục vào khuôn, tránh tạo bọt Để cho agarose đông lại (15 phút), tháo bỏ lược, cho khuôn gel vào bể điện di 3.2 Chạy điện di Đổ đầy đệm TAE 1X ngập khay điện di Cắt mảnh parafin, hút 2µl dung dịch đệm mẫu (loading dye) cho mẫu DNA Hút 5µl dung dịch ADN trộn với dung dịch đệm mẫu nhỏ vào giếng điện di Cắm điện cực cho dòng điện chạy từ (-)  (+) tính từ giếng Bật nguồn điện di đặt cố định theo hiệu điện cường độ dòng điện 3.3 Chụp ảnh Sau chạy điện di xong (vệt màu di chuyển khoảng 2/3 chiều dài gel), lấy gel khỏi máy điện di, nhẹ nhàng lấy riêng phần gel agarose Quan sát gel đèn tử ngoại (UV) chụp ảnh Những điểm cần lưu ý - Trước đổ gel vào khuôn cần để nguội khoảng 600C, đổ nóng làm hỏng khuôn - Ethilium bromide chất độc, gây ung thư thao tác cần phải đeo găng tay Hộp đựng chất cần phải bảo quản riêng tránh ánh sáng BÀI 33 KỸ THUẬT PCR Mục đích, yêu cầu - Qua thực hành sinh viên hiểu rõ nguyên lý kỹ thuật PCR - Sinh viên nắm phải biết vai trò thành phần tham gia phản ứng PCR - Biết cách vận hành đặt chương trình chu trình nhiệt cho máy PCR - Quan sát sản phẩm PCR sau điện di Nguyên tắc Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra hiệu nhân dòng gen sử dụng vector nhân dòng hiệu biến nạp vector nhân dòng vào vi khuẩn PCR Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen housekeeping khoai tây phản ứng PCR Quá trình lặp lại nhiều lần để tổng hợp hàng triệu đoạn gen từ vài phân tử ban đầu, qua phát đoạn gen mục tiêu đèn UV sau điện di Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 3.1 Nguyên liệu: ADN tách chiết từ Khuẩn lạc mọc đĩa môi trường chọn lọc sau biến nạp 3.2 Hóa chất thiết bị: - Cặp mồi Forward Reverse o Po-miR9-II (R): 5’-gaGAGCGAAGGAATGCTTAGAAAtcaaagagaatcaatga-3’ o Po-miR9-III (F): 5’-gaGAACGAAGGAATGGTTAGAATtcacaggtcgtgatatg-3’ - Đệm chạy PCR 10X dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) Mg2+ Enzym DNA polymerase (Taq) Pipet, đầu tip loại, ống eppendorff 50 µl khử trùng Máy PCR, máy điện di ADNDNA, máy chụp gel Tiến hành thí nghiệm 4.1 Chuẩn bị phản ứng PCR - Sử dụng mồi Po-ef1α có trình tự: F: TTGGAAACGGATATGCTCCA 10 R: TCCTTACCTGAACGCCTGTCA - Thành phần phản ứng PCR: Thành phần H2O, nuclease-free PCR buffer dNTP Forward primer Reverse primer Dream Taq polymerase ADNDNA khuôn mẫu Nồng độ gốc 10X mM 10 pM 10 pM unit/µl Tổng số Thể tích cần lấy (µl) 14.5 2,0 2,0 0,2 0,2 0,1 1,0 20 µl 4.2 Thực phản ứng PCR máy chu kỳ nhiệt Bước 1: 950C phút Bước 2: 94 C 30 giây Bước 3: Tm 30 giây Bước 4: 72 C phút Lặp lại từ bước 2-5 (35 chu kỳ) Bước 5: 720C phút Bước 6: C 4.3 Chạy điện di agarose kiểm tra sản phẩm PCR Các bước chạy điện di thực theo bước thực tập 52, sử dụng agarose 12%, hiệu điện 70V, ladder 1kb Sản phẩm mong muốn có kích thước 174 bp Những điểm cần lưu ý - PCR kỹ thuật đại tương đối dễ thực nhiên để đảm bảo cho thí nghiệm thành công, sinh viên cần tuân thủ bước theo hướng dẫn - PCR phản ứng enzym thành phần tham gia phản ứng (đặc biệt enzym) cần phải thực điều kiện lạnh để tránh biến tính - PCR phản ứng nhạy dễ bị tạp nhiễm ADNDNA từ nhiều nguồn khác Do trình thao tác sinh viên phải đeo găng tay thí nghiệm sử dụng tip mới, khử trùng - Sinh viên cần phải ghi chép cẩn thận bước thành phần phản ứng (rất quên bỏ sót trình thao tác) 11 BÀI KỸ THUẬT RAPD TRONG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Mục đích, yêu cầu - Qua thực hành sinh viên hiểu rõ nguyên lý kỹ thuật RAPD - Sinh viên nắm phải biết vai trò thành phần tham gia phản ứng PCR - Biết cách vận hành đặt chương trình chu trình nhiệt cho máy PCR - Quan sát sản phẩm PCR sau điện di Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 2.1 Nguyên liệu: ADNDNA tách chiết từ 2.2 Hóa chất thiết bị: - Mồi 10 base - Đệm chạy PCR 10X - dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) - Mg2+ - Enzym DNA polymerase (Taq) - MicropPipette, đầu tip loại, ống eppendorff 50 µl khử trùng - Máy PCR, máy điện di ADNDNA, máy chụp gel Tiến hành thí nghiệm 3.1 Chuẩn bị phản ứng PCR - Sử dụng mồi OPE18 có trình tự: CGACTGCAGA - Thành phần phản ứng PCR: Thành phần H2O, nuclease-free PCR buffer Nồng độ gốc 10X Thể tích cần lấy (µl) 12.7 2,0 12 dNTP Mg2+ Primer Dream Taq polymerase ADNDNA khuôn mẫu Tổng số mM 25 mM 10 pM unit/µl Chu kỳ nhiệt: 2,0 2,0 0,2 0,1 1,0 20 20 µl Bước 1: 950C phút Bước 2: 94 C 30 giây Bước 3: Tm (32 C) 30 giây Bước 4: 72 C phút Lặp lại từ bước 2-5 (40 chu kỳ) Bước 5: 720C phút Bước 6: C 3.2 Chạy điện di agarose kiểm tra sản phẩm PCR Các bước chạy điện di thực theo bước thực tập 2, sử dụng agarose 2%, hiệu điện 70V, ladder 1kb Phân tích kết RAPD Bản gel chạy điện di sản phẩm kỹ thuật RAPD phân tích cách ghi điểm cho có mặt hay mặt vạch băng hàng Các băng dễ dàng chuyển sang dạng số liệu nhị nguyên (có băng = 1, băng = 0) Số liệu sau xử lý phần mềm chuyên dụng (ví dụ: NTSYS pc, PopGene ) Những điểm cần lưu ý - RAPD kỹ thuật dựa PCR điểm lưu ý cho PCR cần lưu tâm kỹ thuật - Việc ghi điểm dễ dàng thực kết điện di cho vạch băng rõ ràng sáng, ngược lại, việc ghi điểm cho vạch băng khó xác Các điều kiện để lựa chọn ghi điểm cho vạch băng: o + Tính lặp lại (yêu cầu phải lặp lại thí nghiệm) o + Độ đậm o + Kích thước o + Sự phân ly mong muốn quan sát 13 Bài KỸ THUẬT ĐIỆN DI DNA TRÊN GEL AGAROSE Mục đích, yêu cầu - Sinh viên phải hiểu nguyên lý trình điện di - Biết cách sử dụng máy điện di, nguồn điện chiều - Biết cách tạo gel, nhuộm màu sử dụng máy chụp ảnh Vật liệu, hóa chất dụng cụ a Vật liệu: - DNA tách chiết từ - Sản phẩm PCR - Sản phẩm kỹ thuật RAPD b Hóa chất: - Đệm chạy điện di TAE TBE - Đệm mẫu (loading dye) - Dung dịch Ethilium Bromide % Chạy điện di gel agarose 3.1 Đổ gel agarose % Cân gam agarose cho vào lọ thủy tinh chịu nhiệt Đổ 100 ml dung dịch TAE 1X, lắc Cho vào lò vi sóng, đun cho agarose tan hoàn toàn 14 10 11 12 Chuẩn bị khuôn lược, đặt thăng Để agarose nguội từ từ đến 60 0C, bổ sung ethilium bromide đạt nồng độ 0.5 µg/ml, lắc đổ nhẹ nhàng liên tục vào khuôn, tránh tạo bọt Để cho agarose đông lại (khoảng 15 phút), tháo bỏ lược, cho khuôn gel vào bể điện di 3.2 Chạy điện di Đổ đầy đệm TAE 1X ngập khay điện di Cắt mảnh parafin, hút 2µl dung dịch đệm mẫu (loading dye) cho mẫu DNA Hút 5µl dung dịch DNA trộn với dung dịch đệm mẫu nhỏ vào giếng điện di Cắm điện cực cho dòng điện chạy từ (-)  (+) tính từ giếng Bật nguồn điện di đặt cố định theo hiệu điện cường độ dòng điện 10 3.3 Chụp ảnh Sau chạy điện di xong (vệt màu di chuyển khoảng 2/3 chiều dài gel), lấy gel khỏi máy điện di, nhẹ nhàng lấy riêng phần gel agarose Quan sát gel đèn tử ngoại (UV) chụp ảnh Những điểm cần lưu ý - Trước đổ gel vào khuôn cần để nguội khoảng 600C, đổ nóng làm hỏng khuôn - Ethilium bromide chất độc, gây ung thư thao tác cần phải đeo găng tay Hộp đựng chất cần phải bảo quản riêng tránh ánh sáng 15 BÀI KỸ THUẬT NHÂN DÒNG GEN SỬ DỤNG VECTOR PLASMID Mục đích, yêu cầu - Sinh viên nắm thành phần môi trường biết cách pha chế môi trường nuôi cấy vi khuẩn - Sinh viên hiểu giải thích nguyên lý kỹ thuật tạo ADN tái tổ hợp dựa sở Kit tách dòng (Cloning KIT) - Giải thích nguyên lý trình nuôi cấy vi khuẩn, chọn lọc thể tái tổ hợp - Giải thích trình biến nạp nhờ sốc nhiệt - Biết cách cấy vi khuẩn môi trường lỏng môi trường đặc - Biết cách bảo quản lưu giữ vi khuẩn - Giải thích trình chọn lọc “trắng/xanh”, chọn lọc dương tính “sống/chết” - Giải thích nguyên lý bước thí nghiệm vai trò hoá chất sử dụng - Sinh viên phải ghi chép đầy đủ bước trình thực tập giải thích trình Vật liệu, hóa chất dụng cụ Vật liệu 16 • Clone Jet TM PCR Cloning Kit - pJET1.2/blunt cloning vector (50 ng/µl) - 2X Reaction Buffer - T4 DNA Ligase (5u/µl) - pJET1.2 Forward Sequencing Primer (10 µM) - pJET1.2 Reverse Sequencing Primer (10 µM) - Control PCR production (24 ng/µl) - Water, nuclease-free • DNA ngoại đoạn DNA thu PCR (sử dụng Taq ADN polymerase) • Tế bào E coli khả biến (E coli TOP10) Hóa chất • Các hóa chất dùng để pha môi trường nuôi cấy: Tryptone, cao nấm men, NaCl, NaOH, agar, Ampicillin, Kanamycin, X-gal, IPTG, S.O.C… Dụng cụ, thiết bị - Ống phản ứng: ống PCR 0.2 mL - Pipet đầu côn tương ứng - Ống Eppendorf 1.5 mL, mL vô trùng - Bình nón 250ml, đĩa petri, que cấy vô trùng - Box cấy vô trùng, máy lắc… - Máy ổn nhiệt (Water bath) Cách tiến hành thí nghiệm 3.1 Chuẩn bị môi trường • Môi trường LB lỏng Thành phần Trypton NaCl Cao nấm men • Môi trường LB đặc • Thành phần Trypton NaCl Cao nấm men Agar Môi trường chọn lọc Hàm lượng 10 g/l 10 g/l g/l Hàm lượng 10 g/l 10 g/l g/l 20 g/l LB đặc + 100 mg/L Ampicillin LB đặc + 100 mg/L Ampicillin + IPTG + X-gal 17 3.2 Thực phản ứng nối đoạn DNA vào vector nhân dòng • Thực phản ứng nối (ligation) đoạn DNA vào vector nhân dòng pJET1.2/blunt - Phản ứng tạo sản phẩm đầu Thành phần Thể tích 2X Reaction Buffer 10 µl PCR product 1-2 µl * Water, nuclease-free DNA Blunting Enzyme µl Tổng thể tích 18 µl - Trộn nhẹ, spin 3-5s - Ủ 70oC phút Đặt đá - Thực phản ứng nối: bổ sung vào ống phản ứng thành phần sau: Thành phần Thể tích pJET1.2/blunt cloning µl vector (50 ng /µl) T4 DNA ligase µl Tổng thể tích 20 µl - Trộn nhẹ, spin 3-5s - Ủ hỗn hợp phản ứng nhiệt độ phòng (22 oC) 5’ (Chú ý: thời gian ủ kéo dài lên đến 30 phút để đạt hiệu biến nạp cao) • Thực phản ứng nối (ligation) đoạn DNA vào vector nhân dòng pCR2.1 - Thành phần Thể tích Water - µl 10X Ligation Buffer pCR2.1 vector (25 ng/ µl PCR product 1-2 µl T4 DNA ligase µl Tổng thể tích 10 µl Trộn nhẹ, spin 3-5s Ủ hỗn hợp phản ứng 14oC tối thiểu (thường để qua đêm) 3.3 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ - Lấy tế bào khả biến khỏi tủ lạnh sâu: -800C, để tan từ từ đá - Bổ sung 2µl sản phẩm lai (sử dụng vector pCR2.1) µl sẩn phẩm lai (sử dụng vector pJET1.2/blunt) vào 50 µl tế bào khả biến, trộn - Để đá lạnh từ 20-30 phút Sốc nhiệt 45 giây nhiệt độ 420C - Bổ sung 500 µl môi trường S.O.C nuôi lắc 200rpm 370C 3.4 Nuôi cấy vi khuẩn biến nạp môi trường chọn lọc - Lấy 50, 100, 150 µl dịch vi khuẩn nuôi cấy trải môi trường chọn lọc: LB + 100 mg/L Ampicillin (sử dụng vector pJET1.2/blunt) LB + 100 mg/L Ampicillin + 0.5 mM IPTG + 80 mg/L X-gal (sử dụng vector pCR 2.1) - Nuôi cấy 370C qua đêm (12-16 h) 3.5 Quan sát kết 18 Quan sát hình thái, màu sắc khuẩn lạc môi trường chọn lọc Những điểm cần lưu ý - Quá trình lai DNA hiệu sản phẩm PCR vừa nhân Không nên sử dụng sản phẩm PCR để lâu - Vi khuẩn E.coli thuộc loại Gram âm, có khả gây bệnh thao tác phải lưu ý tránh lây nhiễm cho người giảm tạp nhiễm cho thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn khác - Để đảm bảo cho thí nghiệm thành công cần lưu ý khử trùng môi trường tốt để tránh tạp nhiễm - Khi lấy tế bào khả biến khỏi tủ lạnh sâu phải để tan từ từ đá - Lưu ý thời gian nhiệt độ trình biến nạp BÀI KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀO TẾ BÀO THỰC VẬT NHỜ VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS Mục đích, yêu cầu - - Sinh viên biết cách chuẩn bị môi trường nuôi cấy nắm vai trò loại môi trường - - Thực hiểu rõ bước quy trình chuyển gen vào trục phôi đậu cô velá thuốc Dụng cụ, hoá chất - Nước cất, dao, panh, kéo, đĩa petri, giấy cấy, ống đong, cốc đong, bình tam giác loại, đầu típ effendoff loại, vải lau máy lau bình mẫu cấy hấp khử trùng - Hoá chất nuôi cấy mô - Acetoxyringone, X-Gluc, Cefotaxime (500mg/ml), Kanamycin (50mg/ml)acid amin lọc qua màng 0.22µm - Cuvet để đo OD - Bình môi trường để cấy vật liệu - 19 - Micropippet loại Vật liệu Mẫu thực vật - - Lá mầm đậu tương nảy mầm sau 3-5 ngày môi trường MS.cây thuốc in vitro 4-5 tuần tuổi, mở hết, khỏe mạnh - Trục phôi/lá mầm tách từ hạt đậu tương sau ngâm qua đêm nước cất vô trùng Vector chuyển gen - - Vi khuẩn Agrobacterium tumefacien chủng GV 3101 mang vector pBin 19 có kích thước 11777 bp, mang gen kháng kháng sinh Kanamycin, nptII lac Z’ - Môi trường (a) Môi trường LB lỏngYM Tripton (pepton) Mannitol NaCl Yeast extractCao nấm men K2HPO4 (10% w/v stock)pH KH2PO4 ((10% w/v stock) NaCl (10% w/v stock) MgSO4.7H2O (10% w/v stock) 1L10, g/l 10g10 ,0 g/l 0.4g5, g/l ml7,0 ml ml ml 20 - pH 6.8 - Agar 20g/L - Hấp vô trùng Sau hấp, bổ sung 50mg/l Kanamycin vào môi trường môi trường khoảng 50-60o - Ngoài Kanamycin kháng sinh chọn lọc bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ 75 mg/l (Loại kháng sinh lượng kháng sinh chọn lọc phụ thuộc vào đặc điểm vector chuyển gen) (b) Môi trường RMOP RMOP-S - 1L Nồng độ sử dụng Sucrose 30g 3% Myo-inositol 100mg 0.1% MS Macro 10x 100ml 1x MS Micro 1000x 1ml 1x Fe2EDTA Iron 100x 10ml 1x Thiamine-HCl 1mg 1mg NAA (1mg/ml) 0.1mg 100µl BA (1mg/ml) 1ml 1mg pH 5.8 Agar 8g/L (làm đông môi trường) Hấp vô trùng Đối với môi trường RMOP-S bổ sung kháng sinh sau sau môi trường đạt 50-60oC: o 500mg/L cefotaxime o 50 mg/L kanamycin (c) Môi trường MST MST-S - 1L Nồng độ sử dụng Sucrose 30g 3% MS Macro 10x 100ml 1x MS Micro 1000x 1ml 1x Fe2EDTA Iron 100x 10ml 1x pH 5.8 Agar 8g/L (làm đông môi trường) Hấp vô trùng Đối với môi trường MST-S bổ sung kháng sinh sau sau môi trường đạt 50-60oC: o 500mg/L cefotaxime o 50 mg/L kanamycin (d) Các dung dịch mẹ MS Macro 10x (Murashige and Skoog, 1962) 10x (g/L) KNO3 19.0 NH4 N03 16.5 CaCl2.2H2O 4.4 MgS04.7H2O 3.7 KH2PO4 1.7 Nồng độ sử dụng 1x mM 18.8 20.6 3.0 1.5 1.25 21 - - Bảo quản điều kiện 4oC Các hóa chất thay thế: o CaCl2: 3.3g/L o MgSO4: 1.8g/L MS Micro 1000x (Murashige and Skoog, 1962) 10x (g/L) MnS04.4H20 22.3 ZnS04.7H20 8.6 H3BO3 6.2 KI 0.83 Na2MoO4.2H2O 0.25 CuSO4.5H2O 25mg CoCl2.6H2O 25mg o Bảo quản điều kiện C Các hóa chất thay thế: o MnSO4.H2O: 16.9g/L Nồng độ sử dụng 1x mM 100 30 100 5.0 1.0 0.1 0.1 FeSO4EDTA Iron 100x - FeS04.7H20 Na2EDTA Bảo quản điều kiện 4oC, bình tối g/L 2.78 3.72 1x mM 0.1 0.1 (b) Môi trường LB đặc: Thành phần giống môi trường LB đặc bổ sung thêm 20 g/l agar (c ) Môi trường pha loãng vi khuẩn: MS + vitamin môi trường B5 + 5mg/l BA + 0.1 mg/l NAA + 20 mg/l Adenine sulphate + 200 µM Acetosirigone + 30 g/l saccaroza, chuẩn pH = 5,7 – 5,8 (d) Môi trường đồng nuôi cấy: MS + vitamin môi trường B5 + 5mg/l BA + 0.1mg/l NAA + 20mg/l Adenine sulphate + 200 µM Acetosirigone + 30g/l saccaroza + 7g/l agar, chuẩn pH = 5,7 – 5,8 (đ) Môi trường tái sinh diệt vi khuẩn, chọn lọc: MS + vitamin B5 + mg/l BA + 0.1mg/l NAA + 20mg/l Adenine sulphate + 30g/l saccaroza + 75 mg/l Kanamycin + g/l agar Chuẩn pH = 5,7 – 5,8 Quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium vào mầm/trục phôi đậu tươngcây thuốc (CAMBIA) Cấy vạch vi khuẩn môi trường YM 2-3 ngày, 28oC Đồng nuôi cấy RMOP 22 3-11 ngày tối Chọn lọc RMOP-TCH cấy chuyển tuần lần Chuyển vào môi trường MST-TCG Chuyển nhà kính Sơ đồ quy trình chuyển gen vào thuốc (CAMBIA) Ngày 1: Chuẩn bị vi khuẩn: - Cấy vạch vi khuẩn đĩa môi trường YM bổ sung 50mg/L Kanamycin - Nuôi cấy điều kiện 28oC 2-3 ngày Ngày 3: Chuyển gen Lấy khuẩn đĩa môi trường nuôi cấy sử dụng que cấy vô trùng, hòa vào 20 ml môi trường Minimal A - Điều chỉnh mật độ đến OD600 = 0.9-1.0 Lấy khỏe mạnh mở hết từ thuốc in vitro 4-5 tuần tuổi, cắt thành mảnh có đường kính 0.5-1cm môi trường RMOP lỏng, sau cắt xong, mảnh giữ môi trường RMOP lỏng Đổ 20ml dịch khuẩn chuẩn bị vào đĩa petri sâu Chuyển khoảng 20 mảnh vào đĩa dịch khuẩn Lắc nhẹ để đảm bảo dịch khuẩn tiếp xúc với vết cắt sau để yên khoảng phút - Lấy mảnh khỏi dịch khuẩn, thấm khô giấy lọc vô trùng Đặt khoảng 10 mẩu vào đĩa môi trường RMOP đặc (mặt tiếp xúc với môi trường) Ủ tối khoảng 2-3 ngày Đây giai đoạn đồng nuôi cấy Ngày 6: Chọn lọc Chuyển mẫu lên môi trường tái sinh chọn lọc RMOP-S, mặt tiếp xúc với môi trường 23 - Đặt đĩa nuôi cấy 2-3 tuần điều kiện sáng (16h sáng/ngày), 28oC - Cấy chuyển tuần lần Chồi thuốc hình thành: - Khi chồi thuốc hình thành, chuyển sang bình môi trường chọn lọc MST-S - Đặt bình nuôi cấy điều kiện 16h sáng/ngày 1-2 tuần Khi rễ hình thành chuyển trồng đất nhà kính Các cáy trì điều kiện nuôi cấy mô, tuần cấy chuyển lần Các sau sử dụng phương pháp khác để kiểm tra hiệu chuyển gen Bước Nuôi cấy vi khuẩn chuẩn bị huyền phù vi khuẩn Cách 1: - Nuôi vi khuẩn môi trường LB lỏng (280C, 24-36 giờ, 200 vòng/phút) - Chuẩn bị môi trường dùng để pha loãng vi khuẩn - Lấy 10ml dịch vi khuẩn ly tâm để lấy sinh khối tế bào vi khuẩn tốc độ 5000 vòng/phút phút điều kiện nhiệt độ phòng pha 30ml môi trường pha loãng vi khuẩn Cách 2: - Nuôi vi khuẩn môi trường LB đặc (280C, 24-36 giờ) Lấy sinh khối khuẩn mặt đĩa thạch pha 30ml môi trường pha loãng vi khuẩn Chuẩn OD600 đến 0,02 Bước Chuẩn bị mẫu lây nhiễm Lá mầm đậu tương nảy mầm sau 3-5 ngày môi trường MS mầm/trục phôi tách từ hạt đậu tương ngâm qua đêm nước cất vô trùng Bước Nhiễm mẫu với vi khuẩn Ngâm mẫu dịch khuẩn thời gian 1-2 giờ, vớt ra, để khô giấy thấm vô trùng Bước Nuôi cấy mẫu môi trường đồng nuôi cấy - Sau lây nhiễm, cấy mẫu vào môi trường đồng nuôi cấy - Điều kiện nuôi cấy: tối, 22 ÷ 240C 72 Bước 5: Diệt khuẩn 24 Các mẫu sau thời gian đồng nuôi cấy rửa nước cất vô trùng Rửa lại mẫu nước cất có bổ sung 500 mg/ l cefotaxine nhiều lần dịch rửa Thấm khô mẫu giấy thấm vô trùng nuôi cấy môi trường diệt khuẩn, điều kiện tối, 25 0C Một tuần diệt khuẩn lần – tuần khuẩn Bước 6: Chuyển mẫu qua môi trường chọn lọc, tái sinh Mẫu sau diệt khuẩn chuyển qua môi trường chọn lọc, tái sinh tạo hoàn chỉnh (cây T0) Điều kiện nuôi cấy : 250C, 16h sáng/8h tối Chu kỳ chuyển -3 tuần/ lần 2-3 tháng Bước Xác định kết chuyển gen phương pháp phân tích biểu gen gus nhuộm hóa mô tế bào Đánh giá biểu gen gus mẫu chuyển gen theo phương pháp Jefferson cs (1987) - Cho phận T0 (thân, rễ, lá, hoa) vào ống falcon - Bổ sung dung dịch 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide (X-GLUC) đến ngập mẫu - Bọc kín ống falcon giấy bạc - Ủ qua đêm nhiệt độ 370C, điều kiện tối - Hút bỏ dịch nhuộm - Bổ sung ethanol 700C, lắc nhẹ, ngâm khoảng 15-60 phút (có thể dài hơn) Thao tác tiến hành nhiều lần đến thấy mẫu có mầu trắng (hết chlorophyll) - Quan sát mắt thường soi mẫu kính hiển vi soi để quan sát nhuộm mầu GUS  Nếu có chuyển gen gen biểu vị trí mà tế bào chuyển gen có mầu xanh chàm đặc trưng  Nếu gen biểu mẫu cấy mầu xanh chàm 25 [...]... 5 KỸ THUẬT ĐIỆN DI DNA TRÊN GEL AGAROSE 1 Mục đích, yêu cầu - Sinh viên phải hiểu được nguyên lý của quá trình điện di - Biết cách sử dụng máy điện di, nguồn điện một chiều - Biết cách tạo gel, nhuộm màu và sử dụng máy chụp ảnh 2 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ a Vật liệu: - DNA tách chiết từ bài 1 - Sản phẩm PCR - Sản phẩm kỹ thuật RAPD b Hóa chất: - Đệm chạy điện di TAE hoặc TBE - Đệm mẫu (loading... điện di 3.2 Chạy điện di 6 Đổ đầy đệm TAE 1X ngập khay điện di 7 Cắt một mảnh parafin, hút 2µl dung dịch đệm mẫu (loading dye) cho mỗi mẫu DNA 8 Hút 5µl dung dịch DNA trộn đều với dung dịch đệm mẫu và nhỏ vào các giếng điện di 9 Cắm điện cực sao cho dòng điện chạy từ (-)  (+) tính từ giếng Bật nguồn điện di đặt cố định theo hiệu điện thế hoặc cường độ dòng điện 10 3.3 Chụp ảnh 3 Sau khi chạy điện di. .. trong quá trình thao tác) 11 BÀI 4 KỸ THUẬT RAPD TRONG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN 1 Mục đích, yêu cầu - Qua bài thực hành sinh viên sẽ hiểu rõ hơn nguyên lý của kỹ thuật RAPD - Sinh viên nắm phải biết được vai trò của các thành phần tham gia phản ứng PCR - Biết cách vận hành và đặt chương trình chu trình nhiệt cho máy PCR - Quan sát sản phẩm PCR sau khi điện di 2 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị... 72 C 2 phút Lặp lại từ bước 2-5 (40 chu kỳ) Bước 5: 720C 7 phút 0 Bước 6: 4 C 3.2 Chạy điện di agarose kiểm tra sản phẩm PCR Các bước chạy điện di được thực hiện theo các bước trong bài thực tập 2, sử dụng agarose 2%, hiệu điện thế 70V, ladder 1kb 4 Phân tích kết quả RAPD Bản gel chạy điện di sản phẩm của kỹ thuật RAPD được phân tích bằng cách ghi điểm cho sự có mặt hay không có mặt của các vạch băng... phút Lặp lại từ bước 2-5 (35 chu kỳ) Bước 5: 720C 7 phút 0 Bước 6: 4 C 4.3 Chạy điện di agarose kiểm tra sản phẩm PCR Các bước chạy điện di được thực hiện theo các bước trong bài thực tập 52, sử dụng agarose 12%, hiệu điện thế 70V, ladder 1kb Sản phẩm mong muốn có kích thước 174 bp 5 Những điểm cần lưu ý - PCR là một kỹ thuật hiện đại và tương đối dễ thực hiện tuy nhiên để đảm bảo cho thí nghiệm thành... 0) Số liệu sau đó được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng (ví dụ: NTSYS pc, PopGene ) 5 Những điểm cần lưu ý - RAPD là kỹ thuật dựa trên PCR do vậy những điểm lưu ý cho PCR cũng cần được lưu tâm trong kỹ thuật này - Việc ghi điểm này có thể dễ dàng thực hiện nếu như kết quả điện di cho các vạch băng rõ ràng và sáng, ngược lại, việc ghi điểm cho các vạch băng rất khó chính xác Các điều kiện để lựa chọn... kiện nuôi cấy: trong tối, 22 ÷ 240C trong 72 giờ Bước 5: Di t khuẩn 24 Các mẫu sau thời gian đồng nuôi cấy được rửa bằng nước cất vô trùng Rửa lại mẫu trong nước cất có bổ sung 500 mg/ l cefotaxine nhiều lần cho đến khi dịch rửa trong Thấm khô mẫu trên giấy thấm vô trùng và nuôi cấy trên môi trường di t khuẩn, trong điều kiện tối, ở 25 0C Một tuần di t khuẩn 1 lần trong 3 – 5 tuần cho đến khi sạch khuẩn... tác cần phải đeo găng tay Hộp đựng chất này cần phải bảo quản riêng và tránh ánh sáng 15 BÀI 5 KỸ THUẬT NHÂN DÒNG GEN SỬ DỤNG VECTOR PLASMID 1 Mục đích, yêu cầu - Sinh viên nắm được thành phần môi trường và biết cách pha chế môi trường nuôi cấy vi khuẩn - Sinh viên hiểu và giải thích được nguyên lý kỹ thuật tạo ADN tái tổ hợp dựa trên cơ sở của một Kit tách dòng (Cloning KIT) - Giải thích được nguyên... dòng điện chạy từ (-)  (+) tính từ giếng Bật nguồn điện di đặt cố định theo hiệu điện thế hoặc cường độ dòng điện 10 3.3 Chụp ảnh 3 Sau khi chạy điện di xong (vệt màu di chuyển khoảng 2/3 chiều dài bản gel), lấy bản gel ra khỏi máy điện di, nhẹ nhàng lấy riêng phần gel agarose 4 Quan sát bản gel dưới đèn tử ngoại (UV) và chụp ảnh 4 Những điểm cần lưu ý - Trước khi đổ gel vào khuôn cần để nguội khoảng... và thiết bị: - Mồi 10 base - Đệm chạy PCR 10X - dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) - Mg2+ - Enzym DNA polymerase (Taq) - MicropPipette, đầu tip các loại, ống eppendorff 50 µl khử trùng - Máy PCR, máy điện di ADNDNA, máy chụp gel 3 Tiến hành thí nghiệm 3.1 Chuẩn bị phản ứng PCR - Sử dụng mồi OPE18 có trình tự: CGACTGCAGA - Thành phần phản ứng PCR: Thành phần H2O, nuclease-free PCR buffer Nồng độ gốc 10X