Phương pháp phân tích vi sinh vi khuẩn Solancearum

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum là vi khuẩn gây bệnh mạch dẫn gây hại trên 200 loài thực vật. Halted đã nghiên cứu bệnh này năm 1892, năm 1896 E.F.Smith nghiên cứu, mô tả và định tên là Pseudomonas solanacearum. Những năm sau đó, bệnh héo rũ được nhiều nhà khoa học trên thế giới đi sâu, nghiên cứu một cách toàn diện như Kelman 1953, Hayward 1964, Cook and Backer 1983, Yabuuchi 1992, 1995 (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998) 7.Bệnh có nhiều tên gọi như: Southern wilt (theo cách gọi của người Hoa Kỳ), Bacterial wilt (theo cách gọi của người Anh), ở Việt Nam được gọi với tên là bệnh héo xanh, héo rũ. Bệnh này có nguồn gốc trong đất, phổ biến và gây tổn thất nghiêm trọng trong sản xuất nông nghiệp, nhất là đối với các cây trồng có ý nghĩa kinh tế như lạc, cà chua, khoai tây làm giảm đáng kể đến năng suất và chất lượng của nông sản phẩm. Vi khuẩn Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Raltonia solanacearum Smith) .... và biện pháp phòng trừ 726 thường gặp ở dạng đơn lẻ, ghép đôi hoặc bốn hiếm khi thấy chúng kết hợp thành chuỗi.. Ở Việt Nam vi khuẩn R. solanacearum gây hại trên nhiều loại cây trồng. Bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) là một trong những loại bệnh hại phổ biến trên cà chua, cà, lạc, khoai tây, thuốc lá ở vùng Hà Nội và phụ cận (Đỗ Tấn Dũng, 1998). Đỗ Tấn Dũng, 2002 trong kết quả nghiên cứu về bệnh héo rũ hại cây trồng cạn và biện pháp phòng chống cho rằng: sử dụng các vi sinh vật đối kháng bằng cách xử lý củ giống trước khi trồng và đưa vi sinh vật đối kháng vào vùng rễ cây khoai tây ngay từ giai đoạn đầu sau trồng 710 ngày sẽ có khả năng hạn chế và giảm tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn trên đồng ruộng. Biện pháp dùng hóa chất bảo vệ thực vật phòng chống bệnh HXVK được cho là ít có hiệu quả do vi khuẩn này có nguồn gốc từ đất xâm nhiễm gây bệnh và sinh sản trong hệ thống bó mạch của cây. Xử lý đất bằng các loại thuốc xông hơi ít có tác dụng hạn chế bệnh (Murakoshi, 1984). Dùng các chế phẩm kháng sinh được coi là biện pháp có triển vọng, do thuốc kháng sinh được hấp phụ tốt, chuyển dịch trong mạch dẫn, trong mô cây dễ dàng. Farag(1982) và Wang (1982) cho biết việc khảo nghiệm thuốc trừ bệnh HXVK cho lạc đã được tiến hành từ những năm 1960 1970. Một số thuốc có hiệu quả là Clopicrin liều lượng 300 kg ha xử lý đất trước khi trồng lạc 10 ngày cho hiệu quả tốt. Một số thuốc khác như: Thiabendazol (C5H6N6S2 ) có thể giảm tỷ lệ bệnh xuống 50% nhưng do thuốc này có độ độc cấp tính cao với con người và gia súc nên cho đến nay thuốc này chưa thể áp dụng vào sản xuất (Tan, 1990). Trong thực tế sản xuất, phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn là vấn đề rất khó khăn. Vi khuẩn gây bệnh R. solanacearum là loài có nhiều chủng sinh lý và nòi sinh học khác nhau, phân bố ký chủ rộng, tồn tại lâu trong tàn dư thực vật và trong đất. Vì vậy bước đầu nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn hại cây khoai tây và biện pháp phòng trừ để nâng cao hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh trên cây khoai tây vùng Hà Nội và các vùng phụ cận là điều cấp thiết hiện nay. 2. Phân loại Phân loại theo đặc tính gây hại có hai cách Race và Biovar: Phân loại theo Race dựa trên phạm vi kí chủ được chia làm 4 loại như sau :  Race 1: Tấn công cây trên vùng địa lý, tấn công vào các loại cây trồng khác nhau như lạc, khoai tây , cà chua…  Race 2: Vi khuẩn tấn công trên các cây thuộc họ chuối như chuối tam bội, chuối lá, chuối sợi.  Race 3: Tấn công trên cây khoai tây khác với race 1 , race 3 thì cây thường bị tấn công nơi có nhiệt độ thấp và vĩ độ cao  Race 4: Tấn công trên các cây họ dâu như dầu tằm …. Phân loại theo Biovar:  Phân loại dựa vào đặc điểm sinh lý sinh hóa khác nhau của các mẫu phân lập gồm có 5 Biovar khác nhau cho từng loại race, có thể nhận dạng dựa vào 3 nhóm Disacharides và 3 nhóm rựou 6 cacbon . Phân loại theo vật chủ kí sinh

PHỤ LỤC

Lời Mở Đầu

- Cây lạc là cây nông nghiệp ngắn ngày, cây thực phẩm có giá trị kinh tế cao và ngày càng được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới Việt Nam hện đứng thứ 10 thế giới và thứ 5 châu Á về diện tích trồng lạc

- Cây khoai là loại cây thực phẩm có giá trị dinh dưỡng ở Việt Nam, năm 2009 diện tích trồng khoai tây đạt 35000 ha, sản lượng đạt 370000 tấn

- Tuy nhiên năng suất lạc, khoai tây của nước ta còn thấp Phát triển và mở rộng diện tích giống lạc, khoai tây mới có năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu sâu bênh là

1 trong những hướng nghiên cứu nhằm đẩy mạnh sản xuất lạc, khoai tây ở nước ta Trong sản xuất lạc, khoai tây bệnh héo xanh vi khuẩn Raltonia solanacearum Smith

là bệnh gây hại nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng

- Bên cạnh một số dịch hại như: sâu đục trái, bệnh sương mai, bệnh thối trái, bệnh xoăn lá thì bệnh héo xanh vi khuẩn (Pseudomonas solanacearum) cũng là một dịch hại quan trọng và khá phổ biến trên cây cà chua Bệnh có thể gây hại trong suốt thời

kỳ sinh trưởng của cây cà, nhưng thường hại nhiều ở giai đọan ra hoa kết trái trở đi Nếu bị nhiễm sớm ở giai đọan cây con, thường làm cho toàn bộ lá héo rũ rất nhanh, cây gục xuống và chết Nếu cây đã lớn mới bị nhiễm bệnh thì lá ngọn héo rũ trước,

có thể héo một cành hay một vài nhánh nhỏ, sau đó các lá phía dưới tiếp tục héo và cụp xuống, cuối cùng dẫn đến tòan bộ cây bị héo rũ, gẫy gục, rũ xuống và chết Mặc

dù bị héo nhưng bộ lá và thân cành của cây cà chua vẫn còn giữ được mầu xanh, vì thế người ta gọi là bệnh héo xanh (hay bệnh héo rũ tái xanh vi khuẩn) Tuy bộ lá của cây bị héo, nhưng phần gốc của cây vẫn rắn chắc (chứ không bị thối như một số bệnh

do nấm gây ra), và vỏ thân bị xù xì Nếu cắt ngang thân cành sẽ thấy bó mạch dẫn

mô gỗ có mầu nâu đen, bên trong bó mạch chứa đầy dịch nhờn vi khuẩn Bóp nhẹ chỗ bó mạch có mầu nâu đen có thể thấy dịch nhờn vi khuẩn mầu trắng sữa chẩy ra Còn nếu ngâm đọan cắt vào ly nước trong, sau vài phút bạn sẽ thấy dịch vi khuẩn mầu trắng sữa, đùn chẩy qua miệng cắt ra ngòa Qua thực tế kiểm tra đồng ruộng ở những vùng chuyên canh rau của các tỉnh phía Nam cho thấy:Bệnh thường phát sinh, phát triển và gây hại nặng trong điều kiện nhiệt độ không khí cao, ẩm độ không khí cao Như vậy, ẩm ướt của mùa mưa là điều kiện tốt cho bệnh phát sinh, phát triển và gây hại nặng Ngoài ra ở những chân ruộng hay những vùng mà bà con thường trồng các lọai cây thuộc họ cà như cà chua, cà pháo, cà tím họ đậu đỗ như đậu que, đậu

cô ve tần ô (cải cúc) cũng thường dễ bị bệnh gây hại nặng hơn; vì, những lọai cây này cũng là ký chủ của bệnh, từ đó lây truyền bệnh cho cây cà chua Vi khuẩn gây bệnh xâm nhập vào trong cây cà chua khỏe thông qua những vết thương cơ giới do con người vô ý tạo ra trong quá trình chăm sóc, do côn trùng, do tuyến trùng gây ra tại vùng rễ, gốc thân, cuống lá của cây cà hoặc qua những lỗ hở tự nhiên trên cây

- Xuất phát từ thực tiễn, đồ án đã chọn và thực hiện đề tài: quy trình phân tích vi khuẩn Raltonia solanacearum Smith gây bệnh héo trên cây trồng

Chương I: Tổng quan về Vi khuẩn Ralstonia solanacearum

1. Lịch sử phát hiện

- Vi khuẩn Ralstonia solanacearum là vi khuẩn gây bệnh mạch dẫn gây hại trên

200 loài thực vật Halted đã nghiên cứu bệnh này năm 1892, năm 1896 E.F.Smith nghiên cứu, mô tả và định tên là Pseudomonas solanacearum Những năm sau đó, bệnh héo rũ được nhiều nhà khoa học trên thế giới đi sâu, nghiên cứu một cách toàn diện như Kelman 1953, Hayward 1964, Cook and Backer 1983, Yabuuchi

1992, 1995 (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998) [7].Bệnh có nhiều tên gọi như: Southern wilt (theo cách gọi của người Hoa Kỳ), Bacterial wilt (theo cách gọi của người Anh), ở Việt Nam được gọi với tên là bệnh héo xanh, héo rũ Bệnh này có nguồn gốc trong đất, phổ biến và gây tổn thất nghiêm trọng trong sản xuất nông nghiệp, nhất là đối với các cây trồng có ý nghĩa kinh tế như lạc, cà chua, khoai tây làm giảm đáng kể đến năng suất và chất lượng của nông sản phẩm Vi khuẩn Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Raltonia solanacearum Smith) và biện pháp phòng trừ 726 thường gặp ở dạng đơn lẻ, ghép đôi hoặc bốn hiếm khi thấy

chúng kết hợp thành chuỗi Ở Việt Nam vi khuẩn R solanacearum gây hại trên nhiều loại cây trồng Bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) là một trong những loại bệnh hại phổ biến trên cà chua, cà, lạc, khoai tây, thuốc lá ở vùng Hà Nội và phụ cận (Đỗ Tấn Dũng, 1998) Đỗ Tấn Dũng, 2002 trong kết quả nghiên cứu về bệnh héo rũ hại cây trồng cạn và biện pháp phòng chống cho rằng: sử dụng các vi sinh vật đối kháng bằng cách xử lý củ giống trước khi trồng và đưa vi sinh vật đối kháng vào vùng rễ cây khoai tây ngay từ giai đoạn đầu sau trồng 7-10 ngày sẽ có khả năng hạn chế và giảm tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn trên đồng ruộng Biện pháp dùng hóa chất bảo vệ thực vật phòng chống bệnh HXVK được cho là ít

có hiệu quả do vi khuẩn này có nguồn gốc từ đất xâm nhiễm gây bệnh và sinh sản trong hệ thống bó mạch của cây Xử lý đất bằng các loại thuốc xông hơi ít có tác dụng hạn chế bệnh (Murakoshi, 1984) Dùng các chế phẩm kháng sinh được coi

là biện pháp có triển vọng, do thuốc kháng sinh được hấp phụ tốt, chuyển dịch trong mạch dẫn, trong mô cây dễ dàng Farag(1982) và Wang (1982) cho biết việc khảo nghiệm thuốc trừ bệnh HXVK cho lạc đã được tiến hành từ những năm

1960 - 1970 Một số thuốc có hiệu quả là Clopicrin liều lượng 300 kg/ ha xử lý đất trước khi trồng lạc 10 ngày cho hiệu quả tốt Một số thuốc khác như: Thiabendazol (C5H6N6S2 ) có thể giảm tỷ lệ bệnh xuống 50% nhưng do thuốc này có độ độc cấp tính cao với con người và gia súc nên cho đến nay thuốc này chưa thể áp dụng vào sản xuất (Tan, 1990) Trong thực tế sản xuất, phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn là vấn đề rất khó khăn Vi khuẩn gây bệnh R solanacearum là loài có nhiều chủng sinh lý và nòi sinh học khác nhau, phân bố

ký chủ rộng, tồn tại lâu trong tàn dư thực vật và trong đất Vì vậy bước đầu nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn hại cây khoai tây và biện pháp phòng trừ để nâng cao hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh trên cây khoai tây vùng Hà Nội và các vùng phụ cận là điều cấp thiết hiện nay

2. Phân loại

Phân loại theo đặc tính gây hại có hai cách Race và Biovar:

- Phân loại theo Race dựa trên phạm vi kí chủ được chia làm 4 loại như sau :

 Race 1: Tấn công cây trên vùng địa lý, tấn công vào các loại cây trồng khác nhau như lạc, khoai tây , cà chua…

 Race 2: Vi khuẩn tấn công trên các cây thuộc họ chuối như chuối tam bội, chuối lá, chuối sợi

 Race 3: Tấn công trên cây khoai tây khác với race 1 , race 3 thì cây thường bị tấn công nơi có nhiệt độ thấp và vĩ độ cao

 Race 4: Tấn công trên các cây họ dâu như dầu tằm …

- Phân loại theo Biovar:

 Phân loại dựa vào đặc điểm sinh lý sinh hóa khác nhau của các mẫu phân lập gồm có 5 Biovar khác nhau cho từng loại race, có thể nhận dạng dựa vào 3 nhóm Disacharides và 3 nhóm rựou 6 cacbon

- Phân loại theo vật chủ kí sinh

Mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum

3. Đặc điểm

Vi khuẩn R solanacearum Smith là vi khuẩn Gram âm, có hình gậy ngắn, tròn ở hai đầu

- Kích thước của chúng trong khoảng 1,0 - 1,5 x 0,5 - 06µm Chúng có từ một đến vài tiên mao và luôn chuyển động

- Khuẩn lạc có bề mặt trơn, nhẵn, ít khi gồ ghề, hơi chảy hoặc không chảy, có thể

có màu trắng, trắng đục hoặc phớt hồng trên môi trường TZC

- Cả nguồn vi khuẩn có tính độc cao và nguồn có tính độc thấp đều có lông nhỏ ở rìa (Mehan, 1994)

- Vi khuẩn R solanacearum có khả năng ký sinh trên 200 loài cây trồng, cây rừng thuộc hơn 35 họ thực vật khác nhau (Kelman, 1953)

Chương II: Quy trình phân tích vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Sơ đồ tổng quát:

Nguồn Mẫu

Phân Lập

Xác định hình thái, câu trúc, và đặc điểm

sinh hóa

Khảo sát đặc điểm có hại Vi Sinh Vật

1. Phương pháp truyền thống:

Phân lập trên môi trường phù hợp (TZC)

- Từ cây bị bệnh héo xanh, chọn chủng độc rồi trữ 40C với môi trường King’s B agar

- Khẳng định bằng các phương pháp sinh hóa phù hợp

- Kết luận có sự hiện diện của Raltonia Solanacearum trong 25 gam mẫu hay không?

Để xác định vi khuẩn Raltonia Solanacearum đúng kỹ thuật, phải đảm bảo 3 nguyên tắc:

-Đúng vị trí: Lấy ở nơi đang có biểu hiện bệnh, trong các nơi nhiễm bệnh thì nên lấy ở ranh giới giữa nơi lành và nơi tổn thương

-Đúng thời gian: Lấy đúng lúc cây nhiễm bệnh có nhiều vi khuẩn hoặc khi chưa dùng thuốc bảo vệ thực vật

-Phải vô khuẩn: Không để vi khuẩn từ bên ngoài nhiễm vào mẫu bệnh làm sai kết quả và không gây nhiễm khuẩn thêm cho mẫu

-Sau khi bệnh phẩm lấy xong cho vào các dụng cụ vô trùng, dán nhãn đề tên cây lấy mẫu, tên chất thử, thời gian lấy mẫu… Đóng gói đúng quy cách rồi mang về xét nghiệm Đa số mẫu bệnh cần được nuôi cấy nên phải giữ cho VSV còn sống đến lúc làm xét nghiệm Muốn vậy thì mẫu bệnh phải được chuyển và làm xét

Định danh VI Sinh Vật bằng sinh học phân

tử

Kết luận

nghiệm ngay Nếu chưa có điều kiện phải giữ mẫu bệnh trong môi trường hoặc dung dịch bảo quản ở nhiệt độ thích hợp

1.2 Môi trường nuôi cấy Ralstonia solanacearum:

-Vi khuẩn hình gậy 0,5 × 1,5 µm, háo khí, chuyển động có lông roi (1 - 3) ở đầu Nhuộm gram âm Trên môi trường Kelman (1954) khuẩn lạc màu trắng kem nhẵn bóng, nhờn (vi khuẩn có tính độc gây bệnh) Nếu khuẩn lạc chuyển sang màu nâu, nhăn nheo là isolate vi khuẩn mất tính độc Để phát hiện dòng vi khuẩn có tính độc thường dùng môi trường chọn lọc TZC Trên môi trường này isolate vi khuẩn

có tính độc sẽ có khuẩn lạc ở giữa màu hồng, rìa trắng Vi khuẩn phát triển thích hợp ở pH 7-7,2 Nhiệt độ thích hợp 24-37oC Nhiệt độ gây chết 52oC Đây là vi khuẩn đa thực: hại trên 200 loài cây trồng

-Môi trường Tetrazolium chloride (Kelman 1954)

- Peptone 10

- Casein hydrolysate 1 g

- Glucose 5 g

- Agar 17 g

- Triphenyl tetrazolium chloride 0,05 g

- Nước cất 1 L

- (Bổ sung 1ml dịch 0,5 % TZC vô trùng trong 100 ml môi trường đã khử trùng trước khi đổ ra đĩa petri)

- Môi trường nuôi cấy tăng sinh khối: Môi trường SPA

- Thành phần môi trường (gam/lít)

- Pepton:5,00

- Sacharoza:20,00

- K2H PO4:0,50

- MgSO4.7H2O:0,25

- Thạch:15,00

- Nước cất: 1 lít pH: 7,2-7,4 (pH môi trường được điều chỉnh bằng HCl 1N hoặc NaOH 1N)

1.3 Quy trình xác đinh:

Thuyết minh quy trình

Chuẩn bị mẫu

- Đầu tiên từ thân cây bệnh chọn và cắt một đoạn thân dài khoảng 3-4cm

- Dùng giấy hoặc bông thấm cồn 70o lau đoạn thân đã cắt để khử trùng

- Dùng dao mổ đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn để nguội tiến hành cắt đoạn thân đã khử trùng thành từng miến nhỏ dày khoảng 6-7mm

- Cho các miến đã cắt ở trên vào ống nghiệm chứa 10ml nước muối sinh lý 0.90/0 để yên đợi cho địch vi khuẩn ứa ra từ các miến cây làm đục môi trường

- Đưa mẫu đi cấy

Cấy mẫu

- Dùng que cấy vòng đã khử trùng trên ngọn lủa đèn cồn và để nguội nhúng vào dung dịch vi khuẩn sau đó cấy ria lên mặt thạch của đĩa Pitri chứa môi trường TZC,

Sử dụng các thử nghiệm phản sinh

hóa Kết Quả

thực hiện khoảng 10 cho tới 15 đĩa Pitri để đảm bảo đủ mẫu cho các thí nghiệm sinh hóa tiếp theo

- Ủ các đĩa Pitri đã cấy mẫu ở nhiệt độ 25-30oC trong vòng 48h

Chọn khuẩn lạc và kiểm tra sinh hóa

- Sau 48h tiến hành quan sát hình thái các khẩn lạc hình thành, ghi nhận các khuẩn lạc trơn, màu trắng kem, trung tâm có màu hồng đó chính là hình dạng khuẩn lạc của

R solanacearum

- Từ các đĩa Pitri có xuất hiện khuẩn lạc, chọn các khuẩn lạc đồng nhất có hình dạng như trên để tiến hành các phản ứng sinh hóa

- Các thí nghiệm sinh hóa được sử dụng cho R solanacearum gồm có: nhuộm Gram, Catalase, O/F, Urease, Citrate, Oxidase, thử nghiệm di động, thử nghiệm thủy phân lipid, thủy phân tinh bột, thử nhiệm Indole, thủy phân Gelatin

Đọc kết quả và khẳng định

- Sau khi tiến hành các phản ứng sinh hóa nếu khết quả là: Gram âm, Catalase dương tính, Oxidative dương tính, Fermentative âm tính, Urease dương tính, Citrate dương tính, di động dương tính, thủy phân tinh bột âm tính, thủy phân lipid dương tính, Indole âm tính, Gelatin âm tính thì kết luận chính là R solanacearum

Thí nghiệm: Kết quả

Thủy phân tinh bột _

Nhuộm Gram: Thử nghiệm gram

- Cơ sở sinh hóa: vi khuẩn gram dương sau khi nhuộm gram sẽ bắt màu tím do có vách peptidoglycan dày và giữ được màu tím của dung dịch gentians sau khi rửa cồn còn vi khuẩn gram âm có vách peptiddolycan mỏng không giữ được màu tím của gentians khi rửa cồn và sẽ bắt màu hồng khi nhuộm với dung dịch fuchsin ngay sau

đó Vi khuẩn Ralstonia solanacerum là vi khuẩn gram âm vì sau khi nhuộm gram soi dưới kính hiển vi quan học thấy tế bào vi khuẩn bắt màu hồng của dung dịch fuchsin

Thử nghiệm Catalase:

- Thí nghiệm nhằm mục đích phát hiện vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme catalase khi nhỏ dung dịch hydrogen penroxide (H2O2) 30% Tạo ra nước với oxy làm xủi bọt

H2O2 -> H2O + O2

Thử nghiệm Urease:

- Thử nghiệm này nhằm xác định ở ralstonia solanacearum có khả năng phân hủy urea thành ammonia (NH3) và CO2 dưới sự xúc tác của enzyme urease do vi khuẩn ralstonia solanacearum tiết ra, NH3 sinh ra làm cho môi trường khiềm hóa với chỉ thị màu là phenol red trong môi trường kiềm sẽ chuyển từ màu vàng ban đầu san màu

đỏ hồng

(NH2)2CO + H2O -> 2NH3 + CO2

Thử nghiệm citrate:

- Cơ sở sinh hóa của thử nghiệm này là viêc sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất

- Để nuôi cấy vi sinh vật, vi sinh vật sử dụng citrate sẽ sinh ra CO2 làm kiềm hóa môi trương nuôi cấy, đồng thời vi sinh vật sử dụng muối ammonium làm nguồn nito duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa môi trường với thuốc thử là Bromothymol blue trong môi trường khiềm sẽ tạo phức màu xanh dương

Thử nghiệm Indol

- Tryptophan là aminoacid có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo ra sản phẩm chứa gốc indol

- Các hợp chất trung gian trong quá trình thủy giải tryptophan là acid indolpyruvic,

từ đó indol được hình thành thông qua quá trình khử amin, hình thành skatol (methy indol) là quá trình khử carboxyl của acid indol acetic

- Enzyme tryptophanase xúc tác phản ứng khử amin của tryptophan và tách nhân thơm ra khỏi phân tử tryptophan hình thành indol Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng giữa phân tử này với các thuốc thử chứa

p-dimethylaminobenzaldehyde (p-DMAB) Nhân pyrrol của indol chứa nhóm –CH2 sẽ kết hợp với nhân benzene của p-DMAB tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ

Thử nghiệm Gelatin.

- Thử nghiệm nhằm xem xét khả năng Ralstonia Solanacearum có thể tiết ra

gelatinase thủy giải gelatin có trong môi trường để làm nguồn năng lượng Gelatin là một protein có khối lượng phân tử lớn môi trường nuôi cấy chứa gelatin sẽ ở dạng đông đặc sau khi nuôi cấy với vi khẩn có khả năng tiết ra enzyme gelatinase ở một khoản thời gian xát định thì môi trường xẽ chuyển từ dạng đông đặc ban đầu san dạng lỏng do gelatin đã bị phân giải làm mất cấu trúc dạng đông đăc ban đầu Kết quả thí nghiệm với vi khuẩn R Solanacearum không làm cho môi trường hóa lỏng sau 7 ngày khi nuôi cấy

Thử nghiệm tinh bột.

- Xác định R Solanacearum có khả năng sinh hệ enzyme amylase thủy phân tinh bột thành glucose hay không?

- Tinh bột là một đại phân tử có cấu trúc từ các đơn phân là glucose gồm có 2 dạng

là amylose và amylopectin Amylose là phân tử tinh bột dạng thẳng không phân