Vi khuẩn Ralstonia solanacearum là vi khuẩn gây bệnh mạch dẫn gây hại trên 200 loài thực vật. Halted đã nghiên cứu bệnh này năm 1892, năm 1896 E.F.Smith nghiên cứu, mô tả và định tên là Pseudomonas solanacearum. Những năm sau đó, bệnh héo rũ được nhiều nhà khoa học trên thế giới đi sâu, nghiên cứu một cách toàn diện như Kelman 1953, Hayward 1964, Cook and Backer 1983, Yabuuchi 1992, 1995 (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998) 7.Bệnh có nhiều tên gọi như: Southern wilt (theo cách gọi của người Hoa Kỳ), Bacterial wilt (theo cách gọi của người Anh), ở Việt Nam được gọi với tên là bệnh héo xanh, héo rũ. Bệnh này có nguồn gốc trong đất, phổ biến và gây tổn thất nghiêm trọng trong sản xuất nông nghiệp, nhất là đối với các cây trồng có ý nghĩa kinh tế như lạc, cà chua, khoai tây làm giảm đáng kể đến năng suất và chất lượng của nông sản phẩm. Vi khuẩn Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Raltonia solanacearum Smith) .... và biện pháp phòng trừ 726 thường gặp ở dạng đơn lẻ, ghép đôi hoặc bốn hiếm khi thấy chúng kết hợp thành chuỗi.. Ở Việt Nam vi khuẩn R. solanacearum gây hại trên nhiều loại cây trồng. Bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) là một trong những loại bệnh hại phổ biến trên cà chua, cà, lạc, khoai tây, thuốc lá ở vùng Hà Nội và phụ cận (Đỗ Tấn Dũng, 1998). Đỗ Tấn Dũng, 2002 trong kết quả nghiên cứu về bệnh héo rũ hại cây trồng cạn và biện pháp phòng chống cho rằng: sử dụng các vi sinh vật đối kháng bằng cách xử lý củ giống trước khi trồng và đưa vi sinh vật đối kháng vào vùng rễ cây khoai tây ngay từ giai đoạn đầu sau trồng 710 ngày sẽ có khả năng hạn chế và giảm tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn trên đồng ruộng. Biện pháp dùng hóa chất bảo vệ thực vật phòng chống bệnh HXVK được cho là ít có hiệu quả do vi khuẩn này có nguồn gốc từ đất xâm nhiễm gây bệnh và sinh sản trong hệ thống bó mạch của cây. Xử lý đất bằng các loại thuốc xông hơi ít có tác dụng hạn chế bệnh (Murakoshi, 1984). Dùng các chế phẩm kháng sinh được coi là biện pháp có triển vọng, do thuốc kháng sinh được hấp phụ tốt, chuyển dịch trong mạch dẫn, trong mô cây dễ dàng. Farag(1982) và Wang (1982) cho biết việc khảo nghiệm thuốc trừ bệnh HXVK cho lạc đã được tiến hành từ những năm 1960 1970. Một số thuốc có hiệu quả là Clopicrin liều lượng 300 kg ha xử lý đất trước khi trồng lạc 10 ngày cho hiệu quả tốt. Một số thuốc khác như: Thiabendazol (C5H6N6S2 ) có thể giảm tỷ lệ bệnh xuống 50% nhưng do thuốc này có độ độc cấp tính cao với con người và gia súc nên cho đến nay thuốc này chưa thể áp dụng vào sản xuất (Tan, 1990). Trong thực tế sản xuất, phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn là vấn đề rất khó khăn. Vi khuẩn gây bệnh R. solanacearum là loài có nhiều chủng sinh lý và nòi sinh học khác nhau, phân bố ký chủ rộng, tồn tại lâu trong tàn dư thực vật và trong đất. Vì vậy bước đầu nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn hại cây khoai tây và biện pháp phòng trừ để nâng cao hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh trên cây khoai tây vùng Hà Nội và các vùng phụ cận là điều cấp thiết hiện nay. 2. Phân loại Phân loại theo đặc tính gây hại có hai cách Race và Biovar: Phân loại theo Race dựa trên phạm vi kí chủ được chia làm 4 loại như sau : Race 1: Tấn công cây trên vùng địa lý, tấn công vào các loại cây trồng khác nhau như lạc, khoai tây , cà chua… Race 2: Vi khuẩn tấn công trên các cây thuộc họ chuối như chuối tam bội, chuối lá, chuối sợi. Race 3: Tấn công trên cây khoai tây khác với race 1 , race 3 thì cây thường bị tấn công nơi có nhiệt độ thấp và vĩ độ cao Race 4: Tấn công trên các cây họ dâu như dầu tằm …. Phân loại theo Biovar: Phân loại dựa vào đặc điểm sinh lý sinh hóa khác nhau của các mẫu phân lập gồm có 5 Biovar khác nhau cho từng loại race, có thể nhận dạng dựa vào 3 nhóm Disacharides và 3 nhóm rựou 6 cacbon . Phân loại theo vật chủ kí sinh
PHỤ LỤC Lời Mở Đầu - Cây lạc nông nghiệp ngắn ngày, thực phẩm có giá trị kinh tế cao ngày trồng phổ biến nhiều nước giới Việt Nam hện đứng thứ 10 giới thứ châu Á diện tích trồng lạc - Cây khoai loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng Việt Nam, năm 2009 diện tích trồng khoai tây đạt 35000 ha, sản lượng đạt 370000 - Tuy nhiên suất lạc, khoai tây nước ta thấp Phát triển mở rộng diện tích giống lạc, khoai tây có suất cao, chất lượng tốt, chống chịu sâu bênh hướng nghiên cứu nhằm đẩy mạnh sản xuất lạc, khoai tây nước ta Trong sản xuất lạc, khoai tây bệnh héo xanh vi khuẩn Raltonia solanacearum Smith bệnh gây hại nghiêm trọng đến suất chất lượng - Bên cạnh số dịch hại như: sâu đục trái, bệnh sương mai, bệnh thối trái, bệnh xoăn bệnh héo xanh vi khuẩn (Pseudomonas solanacearum) dịch hại quan trọng phổ biến cà chua Bệnh gây hại suốt thời kỳ sinh trưởng cà, thường hại nhiều giai đọan hoa kết trái trở Nếu bị nhiễm sớm giai đọan con, thường làm cho toàn héo rũ nhanh, gục xuống chết Nếu lớn bị nhiễm bệnh héo rũ trước, héo cành hay vài nhánh nhỏ, sau phía tiếp tục héo cụp xuống, cuối dẫn đến tòan bị héo rũ, gẫy gục, rũ xuống chết Mặc dù bị héo thân cành cà chua giữ mầu xanh, người ta gọi bệnh héo xanh (hay bệnh héo rũ tái xanh vi khuẩn) Tuy bị héo, phần gốc rắn (chứ không bị thối số bệnh nấm gây ra), vỏ thân bị xù xì Nếu cắt ngang thân cành thấy bó mạch dẫn mô gỗ có mầu nâu đen, bên bó mạch chứa đầy dịch nhờn vi khuẩn Bóp nhẹ chỗ bó mạch có mầu nâu đen thấy dịch nhờn vi khuẩn mầu trắng sữa chẩy Còn ngâm đọan cắt vào ly nước trong, sau vài phút bạn thấy dịch vi khuẩn mầu trắng sữa, đùn chẩy qua miệng cắt ngòa Qua thực tế kiểm tra đồng ruộng vùng chuyên canh rau tỉnh phía Nam cho thấy:Bệnh thường phát sinh, phát triển gây hại nặng điều kiện nhiệt độ không khí cao, ẩm độ không khí cao Như vậy, ẩm ướt mùa mưa điều kiện tốt cho bệnh phát sinh, phát triển gây hại nặng Ngoài chân ruộng hay vùng mà bà thường trồng lọai thuộc họ cà cà chua, cà pháo, cà tím họ đậu đỗ đậu que, đậu cô ve tần ô (cải cúc) thường dễ bị bệnh gây hại nặng hơn; vì, lọai ký chủ bệnh, từ lây truyền bệnh cho cà chua Vi khuẩn gây bệnh xâm nhập vào cà chua khỏe thông qua vết thương giới người vô ý tạo trình chăm sóc, côn trùng, tuyến trùng gây vùng rễ, gốc thân, cuống cà qua lỗ hở tự nhiên - Xuất phát từ thực tiễn, đồ án chọn thực đề tài: quy trình phân tích vi khuẩn Raltonia solanacearum Smith gây bệnh héo trồng Chương I: Tổng quan Vi khuẩn Ralstonia solanacearum Lịch sử phát - Vi khuẩn Ralstonia solanacearum vi khuẩn gây bệnh mạch dẫn gây hại 200 loài thực vật Halted nghiên cứu bệnh năm 1892, năm 1896 E.F.Smith nghiên cứu, mô tả định tên Pseudomonas solanacearum Những năm sau đó, bệnh héo rũ nhiều nhà khoa học giới sâu, nghiên cứu cách toàn diện Kelman 1953, Hayward 1964, Cook and Backer 1983, Yabuuchi 1992, 1995 (Vũ Triệu Mân Lê Lương Tề, 1998) [7].Bệnh có nhiều tên gọi như: Southern wilt (theo cách gọi người Hoa Kỳ), Bacterial wilt (theo cách gọi người Anh), Việt Nam gọi với tên bệnh héo xanh, héo rũ Bệnh có nguồn gốc đất, phổ biến gây tổn thất nghiêm trọng sản xuất nông nghiệp, trồng có ý nghĩa kinh tế lạc, cà chua, khoai tây làm giảm đáng kể đến suất chất lượng nông sản phẩm Vi khuẩn Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Raltonia solanacearum Smith) biện pháp phòng trừ 726 thường gặp dạng đơn lẻ, ghép đôi bốn thấy chúng kết hợp thành chuỗi Ở Việt Nam vi khuẩn R solanacearum gây hại nhiều loại trồng Bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) loại bệnh hại phổ biến cà chua, cà, lạc, khoai tây, thuốc vùng Hà Nội phụ cận (Đỗ Tấn Dũng, 1998) Đỗ Tấn Dũng, 2002 kết nghiên cứu bệnh héo rũ hại trồng cạn biện pháp phòng chống cho rằng: sử dụng vi sinh vật đối kháng cách xử lý củ giống trước trồng đưa vi sinh vật đối kháng vào vùng rễ khoai tây từ giai đoạn đầu sau trồng 7-10 ngày có khả hạn chế giảm tác hại bệnh héo xanh vi khuẩn đồng ruộng Biện pháp dùng hóa chất bảo vệ thực vật phòng chống bệnh HXVK cho có hiệu vi khuẩn có nguồn gốc từ đất xâm nhiễm gây bệnh sinh sản hệ thống bó mạch Xử lý đất loại thuốc xông có tác dụng hạn chế bệnh (Murakoshi, 1984) Dùng chế phẩm kháng sinh coi biện pháp có triển vọng, thuốc kháng sinh hấp phụ tốt, chuyển dịch mạch dẫn, mô dễ dàng Farag(1982) Wang (1982) cho biết việc khảo nghiệm thuốc trừ bệnh HXVK cho lạc tiến hành từ năm 1960 - 1970 Một số thuốc có hiệu Clopicrin liều lượng 300 kg/ xử lý đất trước trồng lạc 10 ngày cho hiệu tốt Một số thuốc khác như: Thiabendazol (C5H6N6S2 ) giảm tỷ lệ bệnh xuống 50% thuốc có độ độc cấp tính cao với người gia súc nên thuốc chưa thể áp dụng vào sản xuất (Tan, 1990) Trong thực tế sản xuất, phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn vấn đề khó khăn Vi khuẩn gây bệnh R solanacearum loài có nhiều chủng sinh lý nòi sinh học khác nhau, phân bố ký chủ rộng, tồn lâu tàn dư thực vật đất Vì bước đầu nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn hại khoai tây biện pháp phòng trừ để nâng cao hiệu phòng trừ bệnh héo xanh khoai tây vùng Hà Nội vùng phụ cận điều cấp thiết Phân loại Phân loại theo đặc tính gây hại có hai cách Race Biovar: Phân loại theo Race dựa phạm vi kí chủ chia làm loại sau : Race 1: Tấn công vùng địa lý, công vào loại trồng khác lạc, khoai tây , cà chua… Race 2: Vi khuẩn công thuộc họ chuối chuối tam bội, chuối lá, chuối sợi Race 3: Tấn công khoai tây khác với race , race thường bị công nơi có nhiệt độ thấp vĩ độ cao Race 4: Tấn công họ dâu dầu tằm … Phân loại theo Biovar: Phân loại dựa vào đặc điểm sinh lý sinh hóa khác mẫu phân lập gồm có Biovar khác cho loại race, nhận dạng dựa vào nhóm Disacharides nhóm rựou cacbon Phân loại theo vật chủ kí sinh Mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum Đặc điểm Vi khuẩn R solanacearum Smith vi khuẩn Gram âm, có hình gậy ngắn, tròn hai đầu - Kích thước chúng khoảng 1,0 - 1,5 x 0,5 - 06µm Chúng có từ đến vài tiên mao chuyển động - Khuẩn lạc có bề mặt trơn, nhẵn, gồ ghề, chảy không chảy, có màu trắng, trắng đục phớt hồng môi trường TZC - Cả nguồn vi khuẩn có tính độc cao nguồn có tính độc thấp có lông nhỏ rìa (Mehan, 1994) - Vi khuẩn R solanacearum có khả ký sinh 200 loài trồng, rừng thuộc 35 họ thực vật khác (Kelman, 1953) Chương II: Quy trình phân tích vi khuẩn Ralstonia solanacearum Sơ đồ tổng quát: Nguồn Mẫu Phân Lập Xác định hình thái, câu trúc, đặc điểm sinh hóa Khảo sát đặc điểm có hại Vi Sinh Vật Định danh VI Sinh Vật sinh học phân tử Kết luận Phương pháp truyền thống: Nguyên tắc xác định: 1.1 Phân lập môi trường phù hợp (TZC) - Từ bị bệnh héo xanh, chọn chủng độc trữ 40C với môi trường King’s B agar - Khẳng định phương pháp sinh hóa phù hợp - Kết luận có diện Raltonia Solanacearum 25 gam mẫu hay không? Để xác định vi khuẩn Raltonia Solanacearum kỹ thuật, phải đảm bảo nguyên tắc: -Đúng vị trí: Lấy nơi có biểu bệnh, nơi nhiễm bệnh nên lấy ranh giới nơi lành nơi tổn thương -Đúng thời gian: Lấy lúc nhiễm bệnh có nhiều vi khuẩn chưa dùng thuốc bảo vệ thực vật -Phải vô khuẩn: Không để vi khuẩn từ bên nhiễm vào mẫu bệnh làm sai kết không gây nhiễm khuẩn thêm cho mẫu -Sau bệnh phẩm lấy xong cho vào dụng cụ vô trùng, dán nhãn đề tên lấy mẫu, tên chất thử, thời gian lấy mẫu… Đóng gói quy cách mang xét nghiệm Đa số mẫu bệnh cần nuôi cấy nên phải giữ cho VSV sống đến lúc làm xét nghiệm Muốn mẫu bệnh phải chuyển làm xét nghiệm Nếu chưa có điều kiện phải giữ mẫu bệnh môi trường dung dịch bảo quản nhiệt độ thích hợp 1.2 Môi trường nuôi cấy Ralstonia solanacearum: -Vi khuẩn hình gậy 0,5 × 1,5 µm, háo khí, chuyển động có lông roi (1 - 3) đầu Nhuộm gram âm Trên môi trường Kelman (1954) khuẩn lạc màu trắng kem nhẵn bóng, nhờn (vi khuẩn có tính độc gây bệnh) Nếu khuẩn lạc chuyển sang màu nâu, nhăn nheo isolate vi khuẩn tính độc Để phát dòng vi khuẩn có tính độc thường dùng môi trường chọn lọc TZC Trên môi trường isolate vi khuẩn có tính độc có khuẩn lạc màu hồng, rìa trắng Vi khuẩn phát triển thích hợp pH 7-7,2 Nhiệt độ thích hợp 24-37oC Nhiệt độ gây chết 52oC Đây vi khuẩn đa thực: hại 200 loài trồng -Môi trường Tetrazolium chloride (Kelman 1954) - Peptone 10 - Casein hydrolysate g - Glucose g - Agar 17 g - Triphenyl tetrazolium chloride 0,05 g - Nước cất L - (Bổ sung 1ml dịch 0,5 % TZC vô trùng 100 ml môi trường khử trùng trước đổ đĩa petri) - Môi trường nuôi cấy tăng sinh khối: Môi trường SPA - Thành phần môi trường (gam/lít) - Pepton:5,00 - Sacharoza:20,00 - K2H PO4:0,50 - MgSO4.7H2O:0,25 - Thạch:15,00 - Nước cất: lít pH: 7,2-7,4 (pH môi trường điều chỉnh HCl 1N NaOH 1N) 1.3 Quy trình xác đinh: Sử dụng thử nghiệm phản sinh hóa Kết Quả Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mẫu - Đầu tiên từ thân bệnh chọn và cắt một đoạn thân dài khoảng 3-4cm Dùng giấy hoặc thấm cồn 70o lau đoạn thân đã cắt để khử trùng Dùng dao mổ đã khử trùng ngọn lửa đèn cồn để nguội tiến hành cắt đoạn thân đã khử trùng thành từng miến nhỏ dày khoảng 6-7mm Cho các miến đã cắt ở vào ống nghiệm chứa 10ml nước muối sinh lý 0.90/0 để yên đợi cho địch vi khuẩn ứa từ các miến làm đục môi trường Đưa mẫu cấy Cấy mẫu - Dùng que cấy vòng đã khử trùng ngọn lủa đèn cồn và để nguội nhúng vào dung dịch vi khuẩn sau đó cấy ria lên mặt thạch của đĩa Pitri chứa môi trường TZC, 10 thực hiện khoảng 10 cho tới 15 đĩa Pitri để đảm bảo đủ mẫu cho các thí nghiệm sinh hóa tiếp theo - Ủ các đĩa Pitri đã cấy mẫu ở nhiệt độ 25-30oC vòng 48h Chọn khuẩn lạc và kiểm tra sinh hóa - Sau 48h tiến hành quan sát hình thái các khẩn lạc hình thành, ghi nhận các khuẩn lạc trơn, màu trắng kem, trung tâm có màu hồng đó chính là hình dạng khuẩn lạc của R solanacearum - Từ các đĩa Pitri có xuất hiện khuẩn lạc, chọn các khuẩn lạc đồng nhất có hình dạng để tiến hành các phản ứng sinh hóa - Các thí nghiệm sinh hóa được sử dụng cho R solanacearum gồm có: nhuộm Gram, Catalase, O/F, Urease, Citrate, Oxidase, thử nghiệm di động, thử nghiệm thủy phân lipid, thủy phân tinh bột, thử nhiệm Indole, thủy phân Gelatin Đọc kết quả và khẳng định - Sau tiến hành các phản ứng sinh hóa nếu khết quả là: Gram âm, Catalase dương tính, Oxidative dương tính, Fermentative âm tính, Urease dương tính, Citrate dương tính, di động dương tính, thủy phân tinh bột âm tính, thủy phân lipid dương tính, Indole âm tính, Gelatin âm tính thì kết luận chính là R solanacearum Thí nghiệm: Kết quả Thí nghiệm Kết quả Nhuộm Gram (-) Catalase + O/F [Oxidative] + O/F [ Fermentative] _ Urease + Citrate + Indole _ Gelatin _ 11 Thủy phân tinh bột _ Thủy phân lipid + Di động + Nhuộm Gram: Thử nghiệm gram - Cơ sở sinh hóa: vi khuẩn gram dương sau nhuộm gram bắt màu tím có vách peptidoglycan dày giữ màu tím dung dịch gentians sau rửa cồn vi khuẩn gram âm có vách peptiddolycan mỏng không giữ màu tím gentians rửa cồn bắt màu hồng nhuộm với dung dịch fuchsin sau Vi khuẩn Ralstonia solanacerum vi khuẩn gram âm sau nhuộm gram soi kính hiển vi quan học thấy tế bào vi khuẩn bắt màu hồng dung dịch fuchsin Thử nghiệm Catalase: - Thí nghiệm nhằm mục đích phát vi sinh vật có khả sản xuất enzyme catalase nhỏ dung dịch hydrogen penroxide (H2O2) 30% Tạo nước với oxy làm xủi bọt H2O2 -> H2O + O2 Thử nghiệm Urease: - Thử nghiệm nhằm xác định ralstonia solanacearum có khả phân hủy urea thành ammonia (NH3) CO2 xúc tác enzyme urease vi khuẩn ralstonia solanacearum tiết ra, NH3 sinh làm cho môi trường khiềm hóa với thị màu phenol red môi trường kiềm chuyển từ màu vàng ban đầu san màu đỏ hồng (NH2)2CO + H2O -> 2NH3 + CO2 Thử nghiệm citrate: - Cơ sở sinh hóa thử nghiệm viêc sử dụng citrate nguồn carbon 12 - Để nuôi cấy vi sinh vật, vi sinh vật sử dụng citrate sinh CO2 làm kiềm hóa môi trương nuôi cấy, đồng thời vi sinh vật sử dụng muối ammonium làm nguồn nito tạo NH3 làm kiềm hóa môi trường với thuốc thử Bromothymol blue môi trường khiềm tạo phức màu xanh dương Thử nghiệm Indol - Tryptophan aminoacid bị oxy hóa số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo sản phẩm chứa gốc indol - Các hợp chất trung gian trình thủy giải tryptophan acid indolpyruvic, từ indol hình thành thông qua trình khử amin, hình thành skatol (methy indol) trình khử carboxyl acid indol acetic - Enzyme tryptophanase xúc tác phản ứng khử amin tryptophan tách nhân thơm khỏi phân tử tryptophan hình thành indol Việc phát indol thực phản ứng phân tử với thuốc thử chứa pdimethylaminobenzaldehyde (p-DMAB) Nhân pyrrol indol chứa nhóm –CH2 kết hợp với nhân benzene p-DMAB tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ Thử nghiệm Gelatin - Thử nghiệm nhằm xem xét khả Ralstonia Solanacearum tiết gelatinase thủy giải gelatin có môi trường để làm nguồn lượng Gelatin protein có khối lượng phân tử lớn môi trường nuôi cấy chứa gelatin dạng đông đặc sau nuôi cấy với vi khẩn có khả tiết enzyme gelatinase khoản thời gian xát định môi trường xẽ chuyển từ dạng đông đặc ban đầu san dạng lỏng gelatin bị phân giải làm cấu trúc dạng đông đăc ban đầu Kết thí nghiệm với vi khuẩn R Solanacearum không làm cho môi trường hóa lỏng sau ngày nuôi cấy Thử nghiệm tinh bột - Xác định R Solanacearum có khả sinh hệ enzyme amylase thủy phân tinh bột thành glucose hay không? - Tinh bột đại phân tử có cấu trúc từ đơn phân glucose gồm có dạng amylose amylopectin Amylose phân tử tinh bột dạng thẳng không phân 13 nhánh, cấu tạo từ 200 – 300 đơn vị, amylopectin phân tử phân nhánh Tinh bột dễ dàng bị thủy phân R Solanacearum có khả sản sinh enzyme amylase để tạo thành dextrin, maltose glucose - Để phát khả thủy phân tinh bột, sử dụng Iodine chất thị Khi có diện tinh bột, iodine tạo phức màu nâu Khi tinh bột bị thủy phân, iodine không tạo phức nâu nên biến - Kết sau nuôi cấy R Solanacearum sau 24 30oC cho kết âm tính, toàn đĩa xuất màu nâu phức hợp iodine tinh bột Thử nghiệm khả di động - Vi khuẩn R Solanacearum cấy sâu vào môi trường thạch mềm (chứa 0.5% agar) để kiểm tra khả di động R Solanacearum, vi khuẩn có tiên mao có khả di chuyển, trông môi trường thạch mềm làm cho môi trường đục từ vết cấy lan rộng xung quanh, vi khẩn tiên mao khả di chuyển phát triển vết cấy làm đục môi trường vị trí vết cấy không lan rộng xung quanh Kết thử nghiệm với R Solanacearum cho thấy môi trường từ vết cấy bị đục lan rộng xung quanh vết cấy, ta kết luận dương tính 14 2.2 Phương pháp đại - Tinh tổng DNA gen vi khuẩn thực cách sử dụng Winzax ® ADN hệ gen purifications Kit (Promega, Madison, WI) Tất PCR thực cho khối lượng cuối 25 ml, có chứa X Taq polymerase đệm (100 mM Tris-HCL pH 8.5, 500 mM KCl); 30 ng DNA mục tiêu nước cất qua Milli-Q Hệ thống nước (nước Milli-Q, Millipore, Bedford, MS) Các mẫu trình khuếch đại thermocycler PT-100TM (MJ Research, Watertown, Mass) sử dụng nguộn điện 85 V Sau chạy điện di, gel nhuộm màu, destained chụp ảnh hệ thống LPix từ Loccus® 15 Các điểm đánh dấu sử dụng 100 bp-Ladder® (Promega, Madison, WI) Sự khác biệt cho mồi sau: Xác định với cặp mồi đặc hiệu loài - Từ DNA tinh khiết đoạn rDNA từ vùng 16S khuếch đại PCR, sử dụng mồi PS-1 (5 'AGT CGA ACG GCA GCG GGG G 3') PS-2 (5 'GGG GAT TTC ACA TCG GTC TTG CA '), mà ủ với trình tự cụ thể cho R solanacearum (Pastrik & Mays, 2000) Các phản ứng thực bao gồm: 1.5 mM MgCl 2, 0,1 mM nucleotide deoxy (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 0,2 mM oligonucleotide, 0,5 U enzyme polymerase Taq DNA Ban đầu mẫu đun nóng đến 95ºC phút, sau nộp cho 35 chu kỳ 95ºC 30 s cho biến tính, 30 giây 68ºC cho ủ mồi 72ºC 45 s gia hạn, với phần mở rộng cuối 72ºC phút điều khiển tích cực tinh DNA từ chủng UNB 575, UNB 1018 UNB 1173 R solanacearum (Bảng 1), kiểm định âm tính nước vô trùng Sơ đồ quy trình: Sinh Khối Ly tâm PCR Giải trình tự gen - So sánh với ngân hàng gen Sinh khối : Sau định danh sơ , nuôi cấy thu sinh khối đưa phá vỡ tế bào dung dung dịch tách chiết DNA lắc kỹ chuyển sang bếp nhiệt 5- 10 phút Làm lạnh nhanh để phá vỡ tế bào phá hủy hoạt tính sinh học tránh gây ảnh hưởng đến phản ứng PCR Ly tâm: Ly tâm dung dịch tách chiết 1300 vòng / phút phút PCR: lấy 25 ul mẫu phản ứng PCR với cặp mồi Tiếp đến chu trình nhiệt PCR:Các phản ứng thực bao gồm: 1.5 mM MgCl 2, 0,1 mM nucleotide deoxy (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 0,2 mM oligonucleotide, 0,5 U enzyme polymerase Taq DNA Ban đầu 16 mẫu đun nóng đến 95ºC phút, sau nộp cho 35 chu kỳ 95ºC 30 s cho biến tính, 30 giây 68ºC cho ủ mồi 72ºC 45 s gia hạn, với phần mở rộng cuối 72ºC phút Giải trình tự gen: Sử dụng phần mềm PAUP4.0 phân tích kết Sử dụng Statgraphics 4.0 xử lý thống kê biểu đồ phân tích chọn dòng vi khuẩn - So sánh với ngân hàng gen: Sau có kết phân tích từ máy giải trình tự động So sánh mức độ đồng hình dị hình dòng vi khuẩn phân lập đồng hình cao tên 99% chấp nhận Xác nhận loài vi khuẩn Chương III Kết luận - Raltonia Solanacearum dòng vi khuẩn có khả gây hại rộng lên nhiều loại ăn ngắn ngày họ cà, khoai tây, ớt, dưa,… gây thiệt hại không nhỏ cho nông nghiệp nước ta giới, chúng tồn lây truyền qua nhiều hệ trồng khác thông qua hạt giống đất trồng, việc phân tích để xác định rõ ràn đặc điểm hình thái cấu trúc số lượng chủng lọi, khả gây hại chửng cần thiết nhằm làm sở cho nghiên cứu đưa biện pháp phòng trừ cụ thể loài vi khuẩn Qua trình nghiên cứu phân tích đưa quay trình với bước lần lược sau: thu mẫu bệnh thân bệnh cần khử trùng mẫu cồn 70oC cách lau mẫu cách không gây chết vi khẩn bên thân mẫu từ thu đươc nguồn vi khuẩn gây bệnh tốt hơn, phương pháp cắt lát ngâm mẫu vào dung dịch nước muối sinh lý để khuất tán vi khuẩn vào môi trường lỏng từ dùng dây cấy ria để lấy dịch vi khẩn đậm đặc cấy ria lên môi trường TZC để phân lập bước đầu sau chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy chuyền lần để hóa, dùng thử nghiệm sinh hóa thử nghiệm kết sau: gram âm, Catalase dương tính, Oxidative dương tính, Fermentative âm tính, Urease dương tính, Citrate dương tính, di động dương tính, thủy phân tinh bột âm tính, thủy phân lipid dương tính, Indole âm tính, Gelatin âm tính Từ kết để khẳng định rõ tiến hành dùng phương pháp phân tích PCR phân tích trình tự rDNA 16s để khẳng định kết luận loài Quá trình nghiên cứu dừng lại phương pháp phân tích đặc điểm hình thái 17 sinh hóa phân loại theo rDNA 16s chưa nghiên cứu phân tích mức độ gây hại khả bị ức chế tác nhân ức chế sinh học vật lý hóa học đề nghị tiếp tục nghiên cứu thêm phần để đưa biện pháp hữu hiệu để phòng trừ bệnh loài vi khuẩn gây Chương IV Tài liệu tham khảo 18 - http://doc.edu.vn/tai-lieu/luan-van-su-dung-cac-dong-vi-khuan-phong-tru-vi-khuan-gaybenh-heo-xanh-tren-ca-chua-1744/ - https://en.wikipedia.org/wiki/Ralstonia_solanacearum http://aciar.gov.au/files/node/10408/mn129a_vietnamese_diagnostic_manual_for_plant_di _18669.pdf - http://www.slideshare.net/haholuki/kiem-nghiem-vi-sinh-vat-part1 19 [...]... tính, thủy phân tinh bột âm tính, thủy phân lipid dương tính, Indole âm tính, Gelatin âm tính Từ kết quả trên để khẳng định rõ hơn chúng tôi tiến hành dùng phương pháp phân tích PCR phân tích trình tự rDNA 16s để khẳng định và kết luận về loài Quá trình nghiên cứu chỉ mới dừng lại ở phương pháp phân tích về đặc điểm hình thái 17 sinh hóa và phân loại theo rDNA 16s chưa nghiên cứu phân tích mức độ... dụng phần mềm PAUP4.0 phân tích kết quả Sử dụng Statgraphics 4.0 xử lý thống kê và biểu đồ phân tích chọn ra dòng vi khuẩn - So sánh với ngân hàng gen: Sau khi có kết quả phân tích từ máy giải trình tự động So sánh mức độ đồng hình dị hình của dòng vi khuẩn phân lập nếu đồng hình cao tên 99% là chấp nhận Xác nhận loài vi khuẩn Chương III Kết luận - Raltonia Solanacearum là dòng vi khuẩn có khả năng gây... chết vi khẩn bên trong thân cây mẫu từ đó sẽ thu đươc nguồn vi khuẩn gây bệnh tốt hơn, tiếp theo bằng phương pháp cắt lát và ngâm mẫu vào dung dịch nước muối sinh lý để khuất tán vi khuẩn vào môi trường lỏng từ đó dùng dây cấy ria để lấy dịch vi khẩn đậm đặc cấy ria lên môi trường TZC để phân lập bước đầu sau đó chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy chuyền lần nữa để thuần hóa, tiếp theo là dùng các thử nghiệm sinh. .. rửa cồn còn vi khuẩn gram âm có vách peptiddolycan mỏng không giữ được màu tím của gentians khi rửa cồn và sẽ bắt màu hồng khi nhuộm với dung dịch fuchsin ngay sau đó Vi khuẩn Ralstonia solanacerum là vi khuẩn gram âm vì sau khi nhuộm gram soi dưới kính hiển vi quan học thấy tế bào vi khuẩn bắt màu hồng của dung dịch fuchsin Thử nghiệm Catalase: - Thí nghiệm nhằm mục đích phát hiện vi sinh vật có khả... Solanacearum có khả năng sinh hệ enzyme amylase thủy phân tinh bột thành glucose hay không? - Tinh bột là một đại phân tử có cấu trúc từ các đơn phân là glucose gồm có 2 dạng là amylose và amylopectin Amylose là phân tử tinh bột dạng thẳng không phân 13 nhánh, cấu tạo từ 200 – 300 đơn vị, amylopectin là phân tử phân nhánh Tinh bột dễ dàng bị thủy phân bởi các R Solanacearum có khả năng sản sinh enzyme amylase... duy nhất 12 - Để nuôi cấy vi sinh vật, vi sinh vật sử dụng citrate sẽ sinh ra CO2 làm kiềm hóa môi trương nuôi cấy, đồng thời vi sinh vật sử dụng muối ammonium làm nguồn nito duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa môi trường với thuốc thử là Bromothymol blue trong môi trường khiềm sẽ tạo phức màu xanh dương Thử nghiệm Indol - Tryptophan là aminoacid có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase... cây trồng khác nhau thông qua hạt giống cũng như đất trồng, vi c phân tích để xác định rõ ràn các đặc điểm về hình thái cấu trúc cũng như số lượng chủng lọi, khả năng gây hại của từng chửng là hết sức cần thiết nhằm làm cơ sở cho các nghiên cứu và đưa ra các biện pháp phòng trừ cụ thể đối với loài vi khuẩn này Qua quá trình nghiên cứu phân tích chúng tôi đưa ra quay trình với từng bước lần lược như... thủy phân tinh bột âm tính, thủy phân lipid dương tính, Indole âm tính, Gelatin âm tính thì kết luận chính là R solanacearum Thí nghiệm: Kết quả Thí nghiệm Kết quả Nhuộm Gram (-) Catalase + O/F [Oxidative] + O/F [ Fermentative] _ Urease + Citrate + Indole _ Gelatin _ 11 Thủy phân tinh bột _ Thủy phân lipid + Di động + Nhuộm Gram: Thử nghiệm gram - Cơ sở sinh hóa: vi khuẩn gram... như trên để tiến hành các phản ứng sinh hóa - Các thí nghiệm sinh hóa được sử dụng cho R solanacearum gồm có: nhuộm Gram, Catalase, O/F, Urease, Citrate, Oxidase, thử nghiệm di động, thử nghiệm thủy phân lipid, thủy phân tinh bột, thử nhiệm Indole, thủy phân Gelatin Đọc kết quả và khẳng định - Sau khi tiến hành các phản ứng sinh hóa nếu khết quả là: Gram âm,... solanacearum có khả năng phân hủy urea thành ammonia (NH3) và CO2 dưới sự xúc tác của enzyme urease do vi khuẩn ralstonia solanacearum tiết ra, NH3 sinh ra làm cho môi trường khiềm hóa với chỉ thị màu là phenol red trong môi trường kiềm sẽ chuyển từ màu vàng ban đầu san màu đỏ hồng (NH2)2CO + H2O -> 2NH3 + CO2 Thử nghiệm citrate: - Cơ sở sinh hóa của thử nghiệm này là vi c sử dụng citrate như nguồn