Thuc vat chuyen gen ung dung trong tp

Ngay nay, trên thế giới, sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học đã tạo ra nhiều nhiều loại cây trồng, vật nuôi mang nhiều đặc tính vượt trội hơn các giống truyền thống cả về năng suất và phẩm chất. Một mặt dân số thế giới đang ngày càng tăng nhanh, mặt khác con người có yêu cầu ngày càng cao về thực phẩm, vì vậy những tiến bộ vượt bậc này đã mang lại lợi ích to lớn về kinh tế cho các nước phát triển và sản xuất đủ lương thực cho các nước nghèo góp phần đảm bảo an ninh lương thực trên thế giới. Trong đề tài này tôi giới thiệu phương pháp và kỹ thuật di truyển tạo ra một số loại cây chuyển gen được ứng dụng trong thực phẩm trên thế giới và ở Việt Nam.

LỜI MỞ ĐẦU Ngay nay, giới, phát triển mạnh mẽ Công nghệ sinh học tạo nhiều nhiều loại trồng, vật nuôi mang nhiều đặc tính vƣợt trội giống truyền thống suất phẩm chất Một mặt dân số giới ngày tăng nhanh, mặt khác ngƣời có yêu cầu ngày cao thực phẩm, thành tựu mang lại lợi ích to lớn kinh tế cho nƣớc phát triển sản xuất đủ lƣơng thực cho nƣớc nghèo góp phần đảm bảo an ninh lƣơng thực giới Trong đề tài giới thiệu phƣơng pháp kỹ thuật di truyển tạo số loại chuyển gen đƣợc ứng dụng thực phẩm giới Việt Nam Tôi xin chân thành cảm ơn T.S Nguyễn Thúy Hƣơng giúp đỡ nhiều trình hoàn thành đề tài i MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU i DANH MỤC BẢNG .v DANH MỤC HÌNH vi CHƢƠNG 1:LỊCH SỬ RA ĐỜI VÀ PHÁT TRIỂN CỦA THỰC PHẨM CHUYỂN GEN 1.1 Giới thiệu: 1.2 Lịch sử đời : .1 1.3 Tình hình phát triển thực phẩm chuyển gen giới Việt Nam .3 1.3.1 Tình hình giới 1.3.2 Tình hình Việt Nam: CHƢƠNG 2:THỰC PHẨM CHUYỂN GEN CÓ NGUỒN GỐC TỪ THỰC VẬT 2.1 Định nghĩa 2.2 Những đặc tính thực phẩm chuyển gen 2.2.1 Tăng tính kháng thích nghi với môi trƣờng .7 2.2.2 Nâng cao chất lƣợng sản phẩm: 11 2.3 Phƣơng pháp chung kỹ thuật .13 ii 2.3.1 Phƣơng pháp chung 13 2.3.2 Kỹ thuật bản: 14 2.4 Phƣơng pháp kiểm tra xác định thực phẩm chuyển gen 28 2.4.1 Phƣơng pháp kiểm tra dựa vào DNA: 29 2.4.2 Phƣơng pháp kiểm tra dựa vào protein: .35 CHƢƠNG 3: AN TOÀN SINH HỌC ĐỐI VỚI THỰC PHẨM CHUYỂN GEN .39 3.1 Các quy định thực phẩm chuyển gen .39 3.1.1 Định thƣ Cartagena an toàn sinh học .39 3.1.2 Đánh giá rủi ro thực phẩm chuyển gen 40 3.1.3 Quy định ghi nhãn cho thực phẩm chuyển gen: 42 3.2 Các nhà khoa học, thực phẩm chuyển gen ngƣời tiêu dùng 47 CHƢƠNG 4: MỘT SỐ THÀNH TỰU VỀ THỰC VẬT CHUYỂN GEN 52 4.1 Golden rice (gạo vàng) – Thực phẩm chuyển gen tƣơng lai 52 4.1.1 Vitamin A ( Retinol, Axerotol, Xeroptol, Xerophtalmie) .52 4.1.1.1 Giới thiệu 52 4.1.2 Gạo vàng .55 4.1.3 Gạo vàng .57 4.2 Chuyển gen Anti – ACO giữ hoa lâu tàn gen CryIA(c) kháng sâu vào hoa cúc [2] 59 4.2.1 Cơ sở khoa học thực tiễn việc chuyển gen vào hoa cúc 59 4.2.2 Phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 60 4.3 Chuyển gen cryIA(b,c) kháng sâu vào lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens[2] 63 4.3.1 Cơ sở khoa học thực tiễn việc chuyển gen kháng sâu đục thân vào lúa .63 iii 4.3.2 Tạo dòng lúa biến đổi gen kháng sâu đục thân qua trung gian A tumefaciens chọn lọc mannose 65 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN .69 Tài liệu tham khảo 70 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Diện tích trồng CNSH năm 2007 giới .4 Bảng 2.1 Hoạt tính số enzyme DNA polymerase chịu nhiệt khác 33 Bảng 3.1 Ví dụ sản phẩm công nghệ sinh học thực phẩm .51 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Diện tích trông CNSH giới (1996-2007) .3 Hình 2.1 Đu đủ biến đổi gen có khả kháng virus gây bệnh đốm vòng 10 Hình 2.2 Vi khuẩn A.tumefaciens .15 Hình2.3 Khối u thực vật A.tumefaciens 15 Hình 2.4 Công thức cấu tạo opine (octopin, nopalin) 15 Hình 2.5 Sơ đồ gen Ti-plasmid 16 Hình 2.6 Các bƣớc biến nạp T-DNA vào kí chủ 18 Hình 2.7 Sơ đồ plasmid tái tổ hợp nguyên tắc Ti-plasmid 20 Hình 2.8 Quá trình tạo chuyển gen nhờ A.tumefaciens 20 Hình 2.9 Súng bắn gen (hãng Biorad) 21 Hình 2.10: Sơ đồ nguyên lý hoạt động súng bắn gen 22 Hình 2.11: Qui trình chuyển gen súng bắn gen 23 Hình 2.12 Tế bào trần 24 Hình 2.13 Lớp phospholipid kép màng sinh chất .25 Hình 2.14 Cuvette nhựa có điện cực 26 Hình 2.15 Máy xung gen (Gene pulser) (Hãng Biorad) .26 Hình 2.16 Sơ đồ máy xung điện .26 Hình 2.17 Sơ đồ minh họa plasmid chứa DNA ngoại lai qua lỗ tạm thời màng bào chất 27 Hình 2.18 Vi tiêm gen ngoại lai vào nhân protoplast 28 Hình 2.19 Các bƣớc tiến hành phƣơng pháp Southern blot .30 Hình 2.20 Sự hình thành nút cài tóc mồi chứa trình tự đối xứng bậc hai .32 Hình 2.21 Sự bổ sung hai mồi tạo nên primer dimer 32 Hình 2.22 Ba giai đoạn chu kì phản ứng PCR .34 Hình 2.23 Quan hệ thời gian nhiệt độ chu kì phản ứng PCR 34 Hình 2.24 Phản ứng PCR với lƣợng sản phẩm tăng theo cấp số nhân .35 Hình 2.25 Sơ đồ mô tả phƣơng pháp Western blot 36 vi Hình 4.1 Cấu trúc retinol, dạng phổ biến vitamin A thực phẩm 53 Hình 4.2 Các dạng cấu tạo phân tử caroten 53 Hình 4.3 Ba vectơ dùng chuyển gen tạo β – carotene vào nội nhũ gạo .56 Hình 4.4 Quá trình tổng hợp β – carotene gạo vàng 57 Hình 4.5 Cấu trúc DNA dùng gạo vàng 58 Hình 4.6 A: gạo thƣờng; B: gạo vàng 1; C: gạo vàng .58 Hình 4.7 Giống hoa cúc nghiên cứu chuyển gen 60 Hình 4.8 Cấu trúc plasmit pART27 mang gen Bt ( cryIA (c)) .61 Hình 4.9 Sơ đồ vecto pUBB - Man .66 Hình 4.10 Sơ đồ vecto pUBC - Man 66 vii Chương 1: Lịch sử đời phát triển thực phẩm chuyển gen CHƢƠNG 1:LỊCH SỬ RA ĐỜI VÀ PHÁT TRIỂN CỦA THỰC PHẨM CHUYỂN GEN 1.1 Giới thiệu: Dân số giới ngày tăng nhanh, đặc biệt nƣớc nghèo Vì vậy, yêu cầu đặt cần phải sản xuất đủ lƣơng thực để đảm bảo sống Cây trồng truyền thống không giải đƣợc vấn đề Do đó, ngành công nghệ gen dựa thành tựu khoa học tạo sinh vật chuyển gen (GMO: Genetically Modified Organism) (cây trồng, vât nuôi,… ) xuất cao, đảm bảo an ninh lƣơng thực đa dạng sản phẩm thực phẩm phục vụ sống ngƣời Mặt khác, thực phẩm có nguồn gốc từ sinh vật chuyển gen (hay gọi tắt thực phẩm chuyển gen) với đa dạng nhiều đặc tính tốt nhƣ: cà chua chuyển chín chậm bảo quản đƣợc lâu hơn, cà chua chuyển gen có khả tạo lƣợng folate đáp nhu cầu thể ngƣời …đáp ứng nhu cầu ngày cao khách hàng, đem lại lợi ích lớn cho nƣớc phát triển Bên cạnh đó, thực phẩm chuyển gen đem lại hy vọng cho nƣớc phát triển: lúa chuyển gen Bt có khả kháng loại sâu bệnh giảm chi phí chăm sóc, nông sản chuyển gen chịu hạn… Nhƣ vậy, không mang lại lợi ích trƣớc mắt cho ngƣời, công nghệ gen đem lại lợi ích lâu dài: có trồng, vật nuôi loại thực phẩm chuyển gen đáp ứng nhu cầu, ngƣời giảm bớt việc khai thác nguồn động thực vật tự nhiên, giảm bớt việc đƣa chất độc hại vào đất, nƣớc, không khí … góp phần hạn chế ô nhiễm môi trƣờng, bảo vệ thiên nhiên 1.2 Lịch sử đời : Có nhiều nghiên cứu chuyển gen động thực vật với mục đích tạo sản phẩm thực phẩm dùng cho ngƣời Nhƣng điều kiện khách quan nhƣ Chương 1: Lịch sử đời phát triển thực phẩm chuyển gen chủ quan, tính thị trƣờng hầu hết thực phẩm chuyển gen có nguồn gốc từ thực vật Lý dễ thấy động vật có gen lớn phức tạp chế điều hòa biểu gen chặt chẽ Ở ta xét đến thực phẩm chuyển gen có nguồn gốc từ thực vật Năm 1984, biến nạp vào tế bào trần (protoplast) thực vật đƣợc thực Thành tế bào thực vật đƣợc phân giải enzyme tạo tế bào trần Sau nhờ polyethylene glycol (PEG) xung điện (electroporation) cảm ứng mà đoạn DNA ngoại lai đƣợc đƣa vào tế bào trần (chuyển gen chịu lạnh vào khoai tây – McDaniel, 1984) Năm 1987, phƣơng pháp biến nạp phi sinh học đƣợc sử dụng Ở đây, tế bào thực vật đƣợc bắn phá hạt vàng wolfram bọc DNA ngoại lai Nhờ phƣơng pháp mà biến nạp thành công mầm quan trọng nhƣ lúa, ngô lúa mỳ Năm 1989, thành công việc chuyển gen mã hóa kháng thể vào thực vật, mà ngƣời ta tạo nên sản phẩm gen nhƣ mong muốn Kết mở khả hoàn toàn mẽ cho việc sản xuất vaccine khả chống bệnh thực vật Năm 1994, sản phẩm thực phẩm chuyển gen đƣợc bán Mỹ Đó cà chua FlavrSavr™ mang gen chín chậm lần đƣợc sản xuất hàng loạt Cũng năm nhà khoa học Nhật Mỹ nghiên cứu chuyển đổi gen từ bắp sang lúa nhằm cải tiến chế quang hợp Các nghiên cứu ban đầu làm tăng suất lúa 20% Hiện nhà khoa học nghiên cứu lúa theo ba hƣớng: Chuyển khả tạo nốt sần từ họ đậu sang lúa Đƣa vi khuẩn cố định đạm vào lúa Chuyển gen cố định đạm vào lúa Ngoài ra, hƣớng nghiên cứu kháng bệnh lúa đƣợc nhà khoa học viện lúa quốc tế IRRI nghiên cứu đạt đƣợc thành công định Chương 1: Lịch sử đời phát triển thực phẩm chuyển gen Hiện có nhiều loại trồng dùng thực phẩm đƣợc chuyển gen nhƣ ngô, lúa, khoai tây, đậu tƣơng chuyển gen Bt kháng sâu bệnh, đậu tƣơng chuyển gen có hàm lƣợng chất béo không no cao … [3] 1.3 Tình hình phát triển thực phẩm chuyển gen giới Việt Nam 1.3.1 Tình hình giới Hình 1.1 Diện tích trông CNSH giới (1996-2007) [16] Từ năm 1996 đến năm 2007, sau 12 năm đƣợc đƣa vào canh tác đại trà, mang lại lợi ích ổn định bền vững, trồng chuyển gen đƣợc trồng ngày nhiều toàn giới tiếp tục đƣợc mở rộng Năm 2007 diện tích đất canh tác công nghệ sinh học lên tới 114.3 triệu Cây trồng công nghệ sinh học mang lại nhiều lợi ích kinh tế môi trƣờng cho nông dân nƣớc công nghiệp nhƣ nƣớc phát triển, hàng triệu ngƣời nông dân nghèo đƣợc hƣởng lợi ích từ phúc lợi xã hội nhân đạo, góp phần giúp họ xóa bỏ nghèo đói Chương 4: Một số thành tựu thực vật chuyển gen lutein, thí nghiệm gạo vàng tạo chủ yếu β – carotene (vectơ chuyển vào có gen tổng hợp enzyme lycopene β – cyclase) Hình 4.4 Quá trình tổng hợp β – carotene gạo vàng Phytoene desaturase, δ – carotene desaturase lycopene β – cyclase: enzyme cần thiết có thực vật để tổng hợp β – carotene; CtrI: có vai trò thay cho enzyme gạo vàng Kết quả: gạo vàng có chứa 1.6 µg carotenoid tổng/g khối lƣợng khô hạt [P Beyer, 2002] Các nhà khoa học cho lƣợng thấp không đủ cung cấp nhu cầu cho thể ngƣời ngày đời gạo vàng 4.1.3 Gạo vàng Dr Rachel Drake đồng nghiệp công ty Hạt Giống Syngenta nghiên cứu kỹ Gạo Vàng để tìm hiểu nguyên nhân loại Gạo Vàng 57 Chương 4: Một số thành tựu thực vật chuyển gen chứa β- carotene Họ đặc biệt ý đến gen Gạo Vàng Gen thứ gọi phytoene synthase đƣợc trích từ doffodils Gen thứ hai gọi carotene synthetase đƣợc lấy từ vi khuẩn đất, Erwinia uredovora Bà Drake khám phá enzym tạo gen phytoene synthase nguyên nhân chủ yếu làm cản trở Gạo Vàng sản xuất chất β – carotene Do đó, họ cố gắng tìm kiếm gen từ loại thảo mộc khác doffodils hoạt động tốt lúa Cuối họ tìm thấy gen phytoene synthase bắp làm cho Gạo Vàng chứa đến 37 µg carotenoid tổng/g khối lƣợng khô hạt, có 31 µg β – carotene (nguồn provitamine sinh vitamine A nhiều nhất) Cơ thể ngƣời chuyển đổi β – carotene thành vitamine A Kết nghiên cứu đƣợc đăng tải tạp chí Nature Biotechnology ngày 27/3/2005 Đoạn gen đƣợc chuyển vào gạo vàng giống với gạo vàng 1, khác gen phytoene synthase (CtrI) có nguồn gốc từ bắp (ở gạo vàng gen phytoene synthase có nguồn gốc từ doffodils) có tác dụng tổng hợp β – carotene tốt Hình 4.5 Cấu trúc DNA dùng gạo vàng [Paine, 2005] Glu: promoter glutenin gạo Glut01 (1568-2406 nucleotide); SSUctrI: kết hợp chức đậu Hà Lan RUBISCO peptide có cấu trúc siêu phân tử dạng hạt với ctrI Erwinia uredovora Hình 4.6 A: gạo thƣờng; B: gạo vàng 1; C: gạo vàng 58 Chương 4: Một số thành tựu thực vật chuyển gen 4.2 Chuyển gen Anti – ACO giữ hoa lâu tàn gen CryIA(c) kháng sâu vào hoa cúc [2] 4.2.1 Cơ sở khoa học thực tiễn việc chuyển gen vào hoa cúc Nhờ vào thành tựu ngành công nghệ sinh học nói chung công nghệ gen nói riêng nên thập kỉ qua nhiều gen quý đƣợc chuyển vào số loại trồng nhằm tạo trồng mang gen có đặc tính mong muốn Chỉ vòng 15 năm phát triển nhà khoa học giới tạo 60 loài trồng mang gen ngoại lai đặc trƣng có đặc tính quan trọng nhƣ: kháng sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, kháng thuốc trừ sâu Bt, chịu lạnh Ở Việt Nam, số Viện nghiên cứu nhƣ: Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Sinh học nhiệt đới, Viện lúa Đồng Sông Cửu Long… có thành tựu công nghệ gen đáng ghi nhận, tạo trồng chuyển gen nhƣ: lúa mang gen kháng bện bạc (Phan Tố Phƣợng CS), họ cải mang gen kháng sâu kháng chất diệt cỏ(Đặng Trọng Lƣơng CS)… Bên cạnh số lƣơng thực rau đƣợc biến đổi gen, việc nghiên cứu chuyển gen vào đối tƣợng hoa nhằm kéo dài tuổi thọ hoa cắt đƣợc quan tâm Để giải vấn đề này, nay, số hƣớng nghiên cứu tạo giống ăn mang gen chín chậm nhờ phƣơng pháp chuyển gen đƣợc tiến hành nhiều nơi giới Trên thực tế, ngƣời ta chủ yếu sử dụng gen ACC oxidase(ACO) để ức chế trình chín quả, đặc biệt loại có thời gian bảo quản ngắn, khó vận chuyển nhƣ:cà chua, dƣa đỏ, dâu tây, nho, đu đủ,… Ngoài ra, gen ACO đƣợc ứng dụng để kéo dài thời gian tồn hoa, lá, cây, ngăn cản già hóa… Tất thể chuyển gen mang gen antisense ACC oxidase ACC synthase đƣợc xác định có giản đáng kể trình chín quả: dƣa đỏ hàm lƣợng ethylen nội sinh giảm 1% so với đối chứng không chuyển gen anhtisense ACO; đào , antisense ACO đƣợc chuyển gen có giảm mức độ ethylene chậm lại hóa già tràng hoa so với không đƣợc chuyển gen…; cà chua 59 Chương 4: Một số thành tựu thực vật chuyển gen chuyển gin chín chậm, nhờ antisense trình mềm quả, thay đổi màu sắc … chậm đối chứng nhiều Do vậy, nội dung nghiên cứu đề tài nhằm giải : Chuyển gen anti – ACO vào giống hoa cúc vàng nhằm kéo dài tuổi thọ hoa cắt hoa Chuyển gen Bt (cryIA(c)) vào giống hòa cúc vàng nhằm tăng tính kháng sâu hoa 4.2.2 Phƣơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 4.2.2.1 Đối tượng vật liệu Giống hoa cúc HCT1 HCV1 Hình 4.7 Giống hoa cúc nghiên cứu chuyển gen Plasmit pAnti – ACO 2300 Plasmit pART 27 mang gen Bt (cry IAc) 60 Chương 4: Một số thành tựu thực vật chuyển gen Hình 4.8 Cấu trúc plasmit pART27 mang gen Bt ( cryIA (c)) 4.2.2.2 Chuẩn bị mẫu tiền nuôi cấy trước biến nạp Lá non in vitro đƣợc cắt nhỏ thành kích thƣớc 0.8 x 0.8 cm Mẫu đƣợc đặt môi trƣờng ( B3, MS đặc bổ sung 2,0mg/l BAP 1,0 mg/l NAA cho giống HCV1) kháng sinh Nuôi 2-3 ngày điều kiện nhiệt độ 250C, chiếu sáng 16h/ngày, dùng làm nguyên liệu cho biến nạp 4.2.2.3 Phương pháp biến nạp Nuôi cấy vi khuẩn Vi khuẩn Agrobacterium đƣợc nuôi cấy theo phƣơng pháp Nancy L.Mathis Maud A Whinchee (Mỹ) Ly tâm dịch nuôi để thu lấy tế bào vi khuẩn Lây nhiễm đồng nuôi cấy Thời gian lây nhiễm: 30’; thời gian đồng nuôi cấy: ngày tối 280C Chọn lọc tái sinh: Sử dụng kháng sinh chọn lọc thích hợp 4.2.2.4 Kiểm tra có mặt gen ngoại lai có trồng Chọn lọc: Chủng vi khuẩn Agrobacterium LBA 4404 AA3 có mang vectơ plasmit pART 27 có chứa gen nptII (Neomycin phosphotransferase II) gen Cry IA 61 Chương 4: Một số thành tựu thực vật chuyển gen (c) (kháng sâu) thay phần T-AND Còn chủng vi khuẩn Agrobacterium LBA 4404 AA3 có mang vectơ plasmit Anti – ACO 2300 có chứa gen nptII (Neomycin phosphotransferase II) gen Anti-ACO (giữ hoa lâu tàn) thay phần T-AND Vì vậy, chúng đƣợc chuyển vào tế bào hoa cúc trình biến nạp Gen nptII gen CryIAC, Anti-ACO đƣợc điều khiển promotor CAMV 35S Promotor hoạt động tốt gen thực vật Do vậy, đƣợc biến nạp biểu kiểu hình , gen cho tính trạng: kháng Kanamycin môi trƣờng chọn lọc, hai gen CryIA(c) tạo protein Bt có khả kháng lại số sâu hại gen anti – ACO giữ cho hoa tƣơi lâu Kháng sinh Kanamycin với nồng độ 50mg/l đƣợc sử dụng làm yếu tố chọn lọc Quá trình chọn lọc đƣợc tiến hành cụm chồi 18 ngày tuổi Kháng sinh Kanamycin ức chế trình sinh tổng hợp protein thực vật sau 14ngày xuất nhiều chồi có biểu bạch tạng Sau 35 ngày, biểu dạng bạch tạng 100% Mặt khác, chồi biến nạp phát triển bình thƣờng: thân xanh tốt Tính kháng có đƣợc tế bào mang gen ngoại lai ntpII đƣợc điều khiên promotor CAMV35S Khi promotor hoạt động, gen nptII mã hóa cho neomycin phosphotransferase (APH[3’]-II) làm hoạt tính kháng sinh nên phát triển đƣợc 4.2.2.5 Kiểm tra có mặt promotor 35S cúc biến nạp Đoạn CAMV 35S promotor điều khiển hoạt động gen cryIA(c), antiACO và4 gen nptII Để xác định có mặt đoạn promotor này, tiến hành làm phản ứng PCR với cặp mồi 35S1/35S2 để nhạn trình tự đặc trƣng Nếu mẫu AND cho phản ứng dƣơng tính chứng tỏ đoạn promotor 35S đƣợc chuyển thành công vào hoa cúc Sau thực phản ứng PCR, điện di sản phẩm gel Agarose so sánh với marker 1kb 62 Chương 4: Một số thành tựu thực vật chuyển gen 4.3 Chuyển gen cryIA(b,c) kháng sâu vào lúa thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens[2] 4.3.1 Cơ sở khoa học thực tiễn việc chuyển gen kháng sâu đục thân vào lúa Lúa (Oryza sativar L.) loại trồng quan trọng Hơn nửa dân số giới sử dụng lúa nhƣ nguồn cung cấp lƣơng thực Ở Việt Nam, lúa đƣợc trồng rộng rãi nguồn lƣơng thực quan trọng Tuy nhiên, suất lúa phụ thuộc nhiều vào điều kiện ngoại cảnh nhƣ khí hậu, thời tiết, đặc điểm thổ nhƣỡng sâu bệnh Hiện nay, phát triển công nghệ sinh học, đặc biệt kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật di truyền kỹ thuật phân tử cho phép nhà tạo giống nâng cao tính chống chịu trồng cách nhanh chóng Chuyển gen thông qua A tumefaciens ngày đƣợc ứng dụng rộng rãi để chuyển hay nhiều gen vào trồng Tính ƣu việt hệ thống chuyển gen hiệu tạo chuyển gen bền vững cao, chuyển đoạn AND có kích thƣớc tƣơng đối lơn, không cần đến thiết bị nhƣ hệ thống nuôi cấy phức tạp Ngoài ra, lƣợng gen chuyển tạo thuận lợi việc phân tích nhƣ biển gen chuyển gen Những năm gần đay bắt đầu có kết nghiên cứu khả chuyển gen thông qua A tumefaciens lúa chuyển gen thành công lúa japonica lúa indica, lúa indica có khả tái sinh chuyển gen thấp so với lúa japonica Mục đích nghiên cứu dùng phƣơng pháp chuyển gen thông qua A tumefaciens để tạo lúa mang gen kháng sâu bện đặc biệt gen kháng sâu đục thân Vì loại sâu hại này, biện pháp phòng trừ dùng giống kháng không đem lại kết Hơn 30 năm qua Viện Nghiên cứu Lúa quốc tế chọn lọc tính kháng sâu đục thân cho 30.000 giống lúa nhƣng chƣa tìm giống kháng (IRRI, 1995) Do vậy, chuyển gen kháng sâu đục thân vào lúa công nghệ gen phuong pháp nhiều hứa hẹn, việc tạo giống lúa biến đổi gen kháng sâu đục thân giúp giảm lƣợng thuốc trừ sâu, tiết kiệm chi phí giảm ô nhiễm môi trƣờng 63 Chương 4: Một số thành tựu thực vật chuyển gen Một số tác giả thông báo tạo đƣợc dòng lúa japonica indica chuyển gen Bt kháng đƣợc sâu đục thân màu hồng, sâu đục thân sọc, sâu đục thân màu vàng sâu (Fujimote CS, 1993; Duan CS, 1996; Nayak CS, 1997; Datta CS, 1998) Wu CS, 2002 báo cáo giống lúa japonica chuyển gen cryIA(b) tạo đƣợc tính kháng sâu đục thân ổn định hệ R6 điều kiện thí nghiệm đồng Tuy nhiên, chƣa thấy có báo cáo việc tạo dòng lúa biến đổi gen Bt giống có đặc tính nông học tốt Hơn nữa, chuyển gen trồng, hệ thống chọn lọc biến đổi gen thông dụng sử dụng thuốc kháng sinh thuốc trừ cỏ Các tế bào biến đổi gen có khả phát triển bình thƣờng môi trƣờng nuôi cấy có chứa chất kháng sinh (thƣờng dùng hygromycin) chất trừ cỏ (thƣờng dùng PPT) Việc sử dụng hệ thống chọn lọc gây nhiều lo ngại tính an toàn trồng biến đổi gen môi trƣờng sức khỏe ngƣời Nhằm khắc phục nhƣợc điểm này, gần phƣơng pháp chon lọc đƣợc ứng dụng, hệ thống chọn lọc mannose Hệ thống chọn lọc dựa việc sử dụng gen pmi- đƣợc phân lập từ Escherichia coli- làm gen thị để điều khiển tạo enzyme phosphomannose isomerase (Miles Guest, 1984) Trong môi trƣờng nuôi cấy có thêm mannose, tế bào đối chứng không mang gen pmi, enzyme hexokinase tế bào làm biến đổi mannose thành mannose-6-phosphate nguồn carbon mà tế bào không sử dụng nên không phát triển đƣợc Ngƣợc lại, tế bào có mang gen pmi, enzyme phosphomannose isomerase đƣợc tạo làm chuyển hóa mannose-6-phosphate nguồn carbon mà tế bào sử dụng cho sinh trƣởng phát triển Vì vậy, có trồng có mang gen pmi có khả phát triển bình thƣờng môi trƣờng nuôi có chứa mannose, gen pmi không phát triển đƣợc Hệ thống chọn lọc mannose đƣợc áp dụng tạo biến đổi gen củ cải đƣờng (Joersbo CS, 1998), bắp, lúa mì (Wright CS,2001) lúa indica (Hoa Bong, 2003) Trong nghiên cứu này, tạo biến nạp gen cryIA(b) cryIA(c) kháng sâu Agrobacterium xử dụng hai hệ thống chọn lọc mannose 64 Chương 4: Một số thành tựu thực vật chuyển gen chọn lọc kháng sinh giống lúa có đặc tính nông học phẩm chất tốt Mục đích so sánh hai hệ thống chọn lọc nhằm tìm phƣơng pháp tối ƣu cho công nghệ chuyển gen lúa giải pháp khắc phục mối lo ngại tính an toàn biến đổi gen 4.3.2 Tạo dòng lúa biến đổi gen kháng sâu đục thân qua trung gian A tumefaciens chọn lọc mannose 4.3.2.1 Vật liệu phương pháp Thiết kế vector chứa gen kháng sâu cryIA(b) cryIA(c) với gen chọn lọc pmi Để tạo dòng lúa biến đổi gen kháng sâu hệ thống chọn lọc mannose, ngƣời ta thiết kế hai vectơ Vecto pUBB-Man : đƣợc thiết kế cách dùng vector pCaCar (Hoa ctv., 2003) nhƣng gen crtI psy vecto nạt đƣợc lấy enzyme giới han Hind III + BamHIvà thay vào ubiquitin promoter-cry1A(b) Để thực mục tiêu này, ubiquitin-cry1A(b) từ vector pUBB (do Dr Altosaar cung cấp) đƣợc tách enzyme gƣới hạn HindIII+ SpeI đoạn AND gần 2,2kb có mang ubiquitin promoter đƣợc chọn Vector pUBB đƣợc cắt với SpeI+ BamHI để chọn đoạn DNA khoảng 1,9kb có mang gen cry1A(b) Hai đoạn DNA 2,2kb 1,9kb đƣợc gắn đồng thời vào vị trí tƣơng ứng Hind III BamHI vector pCaCar Vector pUBB-Man chuyển vào tế bào có khả tiếp nhận DNA ngoại nhập (competent cell) A tumefaciens chủng LBA 4404 (Hoekema CS, 1984) 65 Chương 4: Một số thành tựu thực vật chuyển gen Hình 4.9 Sơ đồ vecto pUBB - Man Vector pUBC-Man : đƣợc thiết kế băng cách dùng vecto pCaCar (Hoa CS, 2003) nhƣng gen crtI psy vecto đƣợc lấy enzyme gƣới hạn Hind III+BamHI thay vào ubiquitin-cry1A(c) đƣợc cắt từ vector pUBC (do Dr Altosaar cung cấp) Các công đoạn cắt, ghép đƣợc thực nhƣ để tạo vector pUBC-Man đƣợc chuyển vào A tumefaciens chủng LBA 4404 (Hoekema CS, 1984) Hình 4.10 Sơ đồ vecto pUBC - Man 66 Chương 4: Một số thành tựu thực vật chuyển gen Giống lúa phương pháp chuyển gen Phôi non giống lúa IR64 phôi già từ hạt gạo KDML105, Một Bụi đƣợc tách nuôi cấy môi trƣờng tạo mô sẹo Chọn mô sẹo có khả sinh phôi để chủng với vi khuẩn A tumefaciens chủng LBA 4404 Phƣơng pháp chuyển gen đƣợc thực theo Hoa Bong (2003) Chọn lọc đƣợc tiến hành cách hai tuần môi trƣờng MS (Murashige Skoog, 1962) có chứa 30g/l sucrose 25g/l mannose (D(+)-mannose 99+%, Heros Organics, Geel, Belgium) vòng chọn lọc thứ nhất, 15 g/l sucrose 25 g/l mannose vòng chọn lọc thứ ba Các kháng mannose đƣợc kiểm tra lại xét nghiệm chlorophenol red (CR) (Hoa Bong, 2003) trƣớc chuyển trồng đất Tách DNA phân tích Southern blot DNA đƣợc trích từ theo phƣơng pháp McCouch CS (1998) 10 micrograms DNA đƣợc cắt đoạn với EcoRI BamHI (hai điểm cắt) để xác định diện gen Cry1A(b) dòng lúa chuyển gen vecto pUBB-Man cắt đoạn với KpnI (một điểm cắt) để xác định số copy Tƣơng tự DNA dòng lúa chuyển gen vector pUB-Man đƣợc cắt đoạn với EcoRI BamHI XhoI (hai điểm cắt) để xác định diện gen cry1A(c) cắt với KpnI (1 điểm cắt) để xác định số copy DNA cắt đoạn đƣợc chạy điện qua 0,8% agarose gel trƣớc chuyển mao dẫn cố định màng nylong (Hybond- N+, Amersham) Gen cry1A(c) cry1A(c) đƣợc đánh dấu DIG (Boeheringer, Rotkreuz, Switzer1) đƣợc dùng làm mẫu dò lai (probe) Lai, rửa, phát xác định gen đƣợc thực theo phƣơng pháp Wiinn ctv (1996) Kết chuyển gen kháng sâu đục thân vào lúa Kết nghiên cứu cho thấy chọn lọc mannose cho hiệu chuyển gen tƣơng đối cao Các phát triển môi trƣờng mannose đƣợc kiểm định có mang gen pmi qua xét nghiệm PCR phân tích phƣơng pháp Southern blot.Các dòng lúa kháng sâu đƣợc tạo ứng dụng hệ thống chọn lọc mannose sinh trƣởng phát triển bình thƣờng Nghiên cứu cho thấy lợi điểm phƣơng pháp biến đổi gen Agrobacterium Gen chuyển đƣợc gắn vào gen lúa theo phƣơng thức đơn giản 67 Chương 4: Một số thành tựu thực vật chuyển gen locus, tái xếp, điều liên qua đến tính ổn định biểu gen chuyển dòng biến đổi gen Kết đƣợc chuyển nạp gen sống phát triển môi trƣờng chọn lọc có chứa mannose đƣợc kiểm định phân tích Southern khẳng định có diên gen cryIA( c) cryIA(b) Gen kháng sâu cryIA(c ) hoạt động hữu hiệu lúa tạo tính kháng sâu đục thân cao, dòng biến đổi gen kháng sâu đạt tỉ lệ cao tính kháng sâu hẳn giống chuẩn 68 Chương 5: Kết luận CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN Ngƣời ta tạo thành công loại gạo vàng chứa provitamin A phƣơng pháp chuyển gen góp phần bổ sung Vitamin A phần ăn hàng ngày Tuy nhiên, gạo vàng biện pháp để làm giảm bớt bệnh thiếu vitamin A cho nhiều trẻ em phụ nữ giới Gạo vàng giàu vitamin A dự kiến đƣợc cấp phép vào năm 2012 [3] Đối với hoa cúc, ngƣời ta hoàn thiện đƣợc qui trình tái sinh từ mẫu bƣớc đầu chuyển gen anti – ACO gen Bt cryIA(c) vào hai giống hoa cúc HCV1 HCT1 Đồng thời xác định có mặt gen ngoại lai anti – ACO gen Bt hoa cúc chuyển gen PCR lai phân tử AND Southern blot Đã thu đƣợc hoa cúc mang gen anti – ACO hoa cúc mang gen Bt Đối với lúa chuyển gen kháng sâu, kết đƣợc chuyển nạp gen sống phát triển môi trƣờng chọn lọc có chứa mannose đƣợc kiểm định phân tích Southern khẳng định có diên gen cryIA( c) cryIA(b) Chuyển gen thông qua Agrobacterium chọn lọc mannose đảm bảo tạo chuyển gen ”sạch”, không chứa gen kháng kháng sinh Kết tạo dòng lúa kháng sâu đục thân Trong tƣơng lai, Việt Nam đƣa trồng công nghệ sinh học vào canh tác năm tới Đây điều đáng mừng cho nông nghiệp nƣớc ta Hiện nay, sản phẩm từ sinh vật chuyển gen nói chung từ thực vật chuyển gen nói riêng vô phong phú đa dạng, điều chứng tỏ khả tuyệt vời ngành công nghệ sinh học giúp nhân loại giải vấn đề khó khăn lớn cho sức khỏe ngƣời nhƣ lĩnh vực nông nghiệp Tuy nhiên, cần phải theo dõi rủi ro tiềm tàng công tác thử nghiệm sản xuất sản phẩm biến đổi di truyền liên hệ đến sức khỏe ngƣời môi trƣờng 69 Chương 5: Kết luận Tài liệu tham khảo Tài liệu nước 1.Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2005 Sinh học phân tử Nhà xuất Giáo Dục Lê Trần Bình, 2005, Nghiên cứu áp dụng công nghệ gen để tạo chuyển gen nâng cao sức chống chịu sâu bệnh ngoại cảnh bất lợi Trần Hồng Hà., 2004, An toàn sinh học: đánh giá quản lý rủi ro sinh vật biến đổi gen, Nhà xuất Bộ tài nguyên môi trƣờng Nguyển Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh, Cao Cƣờng., 2002, Công nghệ gen, Nhà xuất đại học Quốc gia TP.HCM Nguyễn Đức Lƣợng, 2006, Công nghệ vi sinh tập 2, Nhà xuất Đại học Quốc gia TP.HCM Đồng Thị Thanh Thu, 2004 Giáo trình sinh hóa bản, Tủ sách trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp 2005, Công nghệ sinh học tập 2, Nhà xuất Giáo dục Tài liệu nước Al-Babili S., E Hobeika, P Beyer, 1996 Plant Physiol, vol 112,1398 Bernard R.Glick, Jack J.Pasternak, 2003 Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA 3rd Edition ASM Press, USA 10 Bevan M., 1984 Nucleic Acids Res., vol 12, 8711 11 Beyer P., Ye, X., Al-Babili, S., Klöti, A., Zhang, J., Lucca, P & Potrykus, I.2000 Engineering the provitamin A (ß-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid- free) rice endosperm Science, vol 287, 303-305 12 Beyer P., Salim Al-Babili, Xudong Ye, , Paola Lucca, Patrick Schaub, Ralf Welsch Ingo Potrykus, 2002 Golden Rice: Introducing the ßCarotene Biosynthesis Pathway into Rice Endosperm by Genetic Engineering to Defeat Vitamin A Deficiency J Nutr Vol 132, 506-510 13 Burkhardt P et al., 1997 Plant J., vol11, 1071 70 Chương 5: Kết luận 14 Bonk M et al., 1997 Eur J Biochem, vol 247, 942 15 Cartagena Protocol on Biosafety to the Convention on Biological Diversity,2000, Adopted at the Convention on Biological Diversity, 29/1/2000, Montreal, Canada http://www.biodiv.org/biosafety/protocol.asp 16 Clive Jame, 2007 Brief 37: Global Status of Commercialized Biotech/GM CropsSambrook, J va, ISAAA 17 Grant J P., 1991 The State of the World’s Children Oxford Univ Press, Oxford 18 Makrides SC, 2003 Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells Elsevier Science B V USA 19 Sambrook, J Russel, D., 2002 Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd Cold Spring Harbor Laboratory Press 20 Schledz M et al., 1996 Plant J, vol 10, 781 21 Sommer A, 1988 J Nutr, vol 119, 96 22 Yanish-Perron C., J Vieira, J C Messing, 1985 Gene, vol33, 103 Tài liệu web 23 http://biologi.uio.no/plfys/haa/gen/gmo.htm 24 http://www.agbiotech.com/vn 25 http://www.egohabitat.com 26 http://www.shikshasetu.in/engineering/biotech/articles/article4.htm 27.http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/transgenese/agrobacterium/agro.ht 28 http://www.sonongnghiep.hochiminhcity.gov.vn 71 [...]... một vị trí bất kỳ trong DNA của tế bào thực vật Cách tiến hành: Các tế bào chủ và DNA ngoại lai đƣợc tạo thành dịch huyền phù và cho vào trong một cuvette nhựa có điện cực Hình 2.14 Cuvette nhựa có điện cực Ðể tạo ra xung điện cao thế trong một thời gian ngắn ngƣời ta sử dụng một thiết bị gọi là máy xung gen (gene pulser) Hình 2.16 Sơ đồ cơ bản của máy xung điện Hình 2.15 Máy xung gen (Gene pulser) (Hãng... cellulose thông qua Agrobacterium, virus và bắn gen hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen bằng xung điện, siêu âm và vi tiêm Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự biểu hiện tạm thời của gen Các DNA (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ chƣa đảm bảo là đã liên kết ổn định với genome 13 Chương 2: Thực phẩm chuyển gen có nguồn gốc từ thực vật Các DNA (trừ virus)... nguyên tắc Ti-plasmid [27] Hình 2.8 Quá trình tạo cây chuyển gen nhờ A.tumefaciens [12] 2.3.2.2 Phương pháp chuyển gen trực tiếp a) Chuyển gen bằng súng bắn gen 20 Chương 2: Thực phẩm chuyển gen có nguồn gốc từ thực vật Phƣơng pháp chuyển gen nhờ súng DNA là một kỹ thuật tƣơng đối còn mới mẻ nhƣng đã đƣợc chứng minh là có tiềm năng lớn Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đƣa thông tin di truyền... vật biến đổi gen còn đƣợc gọi sinh vật biến đổi di truyền hay sinh vật sửa đổi gen hoặc sinh vật công nghệ sinh học [2] Thực phẩm chuyển gen (GMF - Genetically Modified Food) là thực phẩm đƣợc tạo ra từ các sinh vật biến đổi gen hay có chứa thành tố của chúng [2] 2.2 Những đặc tính mới của thực phẩm chuyển gen 2.2.1 Tăng tính kháng và thích nghi với môi trƣờng 2.2.1.1 Kháng thuốc diệt cỏ Trong sản xuất... công nghệ gen, Việt Nam ta còn rất non trẻ chỉ mới bắt đầu nghiên cứu trong những năm gần đây chủ yếu trên đối tƣợng là thực vật Các cây trồng chuyển gen ở nƣớc ta chỉ nằm trong khuôn khổ nghiên cứu và gieo trồng thử nghiệm trong các phòng thí nghiệm Sau đây là một số nghiên cứu đã đƣợc Việt Nam tiến hành: Tạo một số dòng lúa mang gen bar kháng thuốc trừ cỏ và nghiên cứu sự di truyền của gen này đến... nhiệt đới TP. HCM) 5 Chương 1: Lịch sử ra đời và phát triển của thực phẩm chuyển gen Một số kết quả nghiên cứu về chuyển gen kháng sâu Bt vào hai giống lúa thơm bằng phƣơng pháp bắn gen (Viện Sinh học nhiệt đới TP. HCM, Viện lúa quốc tế) Tạo cây lúa chuyển gen nàng hƣơng chợ đào kháng cao đối với sâu đục thân bằng phƣơng pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens (Viện Sinh học nhiệt đới, TP. HCM,... PHẨM CHUYỂN GEN CÓ NGUỒN GỐC TỪ THỰC VẬT 2.1 Định nghĩa Sinh vật biến đổi gen (GMO - Genetically Modified Organism) (bao gồm động vật, thực vật và vi sinh vật) là một trong những nhóm sản phẩm chính của công nghệ sinh học hiện đại, đƣợc con ngƣời tạo ra nhờ sử dụng các kỹ thuật phân tử để đƣa gen mới vào bộ gen của sinh vật nhận Quá trình chỉnh sửa này chỉ diễn ra trên phạm vi một vài gen Vì vậy, thuật... phosphotransferase, gen tạo khả năng kháng kanamycin của tế bào thực vật chuyển gen Trình tự ori cần thiết cho sự sao chép và nhân đôi của plasmid trong E.coli Trình tự vai phải của vùng T-DNA: vùng này tuyệt đối cần thiết cho quá trình chuyển gen xảy ra Một số vectơ có thể có trình tự cả hai vai Vùng polylinker (multiple cloning site) để thuận tiện cho việc cắt và chèn gen vào plasmid Khả năng chuyển gen tự nhiên... giống lúa biến đổi gen giàu vi chất dinh dƣỡng (Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long) Bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen vào một số cây họ đậu nhờ Agrobacterium tumefaciens (Viện sinh học nhiệt đới TP. HCM) [28] Trong tƣơng lai, Việt Nam có thể sẽ đƣa cây trồng công nghệ sinh học vào canh tác trong 1 hoặc 2 năm tới Đây là điều đáng mừng cho nền nông nghiệp nƣớc ta 6 Chương 2: Thực phẩm chuyển gen có nguồn gốc... 2: Thực phẩm chuyển gen có nguồn gốc từ thực vật Nguyên lý hoạt động Hình 2.10: Sơ đồ nguyên lý hoạt động súng bắn gen Nguyên lý chung của phƣơng pháp này là sử dụng áp lực xung của khí helium hoặc gas để gia tốc các hạt vi đạn Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thƣớc 6“x7“x10“ nối với hai bơm chân không DNA ngoại lai đƣợc trộn ở một tỉ lệ nhất định với hạt tungsten (hoặc vàng)