Đề tài Tính toán thiết kế hệ thống xử lý nước ngầm nhiễm phèn tại Huyện Hoocmon

ĐẶT VẤN ĐỀ Vi sinh vật sinh vật có kích thước nhỏ mà mắt thường nhìn thấy được, quan sát kính hiển vi phân bố khắp nơi môi trường đất, nước, không khí môi trường sinh vật, hàng hóa, lương thực, thực phẩm Trong số vi sinh vật có vi sinh vật mà có mặt chúng môi trường với số lượng, nồng độ định gây cho môi trường bị ô nhiễm mặt vi sinh vật Tuy nhiên khảo sát nhóm vi sinh vật xem môi trường có bị ô nhiễm mặt vi sinh vật hay không việc gặp nhiều khó khăn mặt kinh tế để đảm bảo an toàn cho người làm việc nhiều vi sinh vật nguy hiểm sức khỏe người Vậy làm để kiểm tra môi trường có bị ô nhiễm mặt vi sinh vật hay không? Đó nhờ vào vi sinh vật thị Vậy vi sinh vật thị gì? Nó có đặc điểm nào? Bao gồm nhóm điển hình cách xác định sao? Đó vấn đề đáng quan tâm, chọn chủ đề “Vi sinh vật thị” làm đề tài tiểu luận NỘI DUNG Khái niệm vi sinh vật thị Vi sinh vật thị đối tượng vi sinh vật có yêu cầu định điều kiện sinh thái liên quan đến nhu cầu dinh dưỡng, hàm lượng oxy, khả chống chịu hàm lượng định yếu tố độc hại môi trường sống diện chúng biểu thị tình trạng điều kiện sinh thái môi trường sống nằm giới hạn nhu cầu khả chống chịu đối tượng vi sinh vật Đặc điểm vi sinh vật thị Đặc điểm vi sinh vật thị nhóm thường xuyên có mặt phân người, động vật máu nóng, nước thải, thực phẩm chất lượng,…, không diện mẫu Vi sinh vật thị thường có số lượng lớn mẫu ô nhiễm lớn vi sinh vật gây bệnh khác, môi trường phải không sinh sản tăng số lượng Đặc biệt chúng phải dễ phát khả đề kháng phải giống với vi sinh vật gây bệnh Các nhóm vi sinh vật thị 3.1 Vi sinh vật thị bao gồm nhóm sau: Nhóm Coliforms đặc trưng Escherichia coli (E coli) Nhóm Staphylococcus đặc trưng Staphylococcus aureus (S aureus) Nhóm Streptococcus đặc trưng Streptococcus faecalis (S faecalis) Nhóm Clostridium đặc trưng Clostridium perfringens (C perfringents) Nhóm Coliforms Coliforms từ lâu xem vi sinh vật thị thích hợp chất lượng nước, chúng dùng rộng rãi dễ phát định lượng Chúng dùng để thị khả có mặt vi sinh vật khác nước Chỉ số Coliforms cao diện vi sinh vật gây bệnh cao - Nguồn gốc Vào cuối năm 1800 Von Fritsch mô tả Klebsiella pneumoniae Klebsiella rhinoscleromatis vi sinh vật đặc trưng tìm thấy phân người (Geldreich 1978) Năm 1885 Percy Grace Frankland thường xuyên xét nghiệm vi khuẩn nước London Robert Kouch sử dụng chất keo rắn nấu phương tiện truyền thống để đếm vi khuẩn (Hutchinson Ridgway 1977) Đầu thập niên 1900 (Cabelli, 1977), ông cho vắng mặt coliforms dấu hiệu cho thấy không xuất bệnh vi khuẩn gây nên, sau sản xuất khí đốt với việc giới thiệu ống Durham (Durham năm 1893) khái niệm nhóm vi khuẩn Coliforms vi khuẩn khác dạng coli sử dụng nước Anh năm 1901 Năm 1908 Bergey deehan xác định có 256 loài khác nhóm vi khuẩn Coliforms Năm 1909 MacConkey công nhận 128 loài khác nhóm vi khuẩn Coliforms Đến đầu thập niên 1920, khác biệt dạng vi khuẩn coli đem sản xuất indole, hóa lỏng gelatin, lên men đường sucrose Voges – Proskauer nhằm xác định ô nhiễm faecal (Hendricks 1978) Năm 1938 Parr có phát minh lên tới đỉnh điểm thử nghiệm IMVIC (Indole, Methyl đỏ, voges – Proskauer muối acid Citric) Việc thử nghiệm cho thấy khác biệt dạng vi khuẩn Coliforms phân, dạng vi khuẩn đất trung gian, sử dụng ngày hôm - Đặc điểm Coliforms trực khuẩn Gram âm, hình gậy, không sinh bào tử, có phản ứng oxidase âm tính thể hoạt tính β - galactosidase có khả sinh hơi, acid aldehyde lên men đường lactose vòng 24 – 48 nhiệt độ 36 ± oC Coliforms có khả phát triển môi trường muối mật chất hoạt tính bề mặt khác có tính chất ức chế tương tự Nhóm Coliforms gồm chi: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter Tuy nhiên , theo phương pháp phân loại nhóm không đồng Nhóm bao gồm vi khuẩn có khả lên men lactose Escherichia cloacae, Citrobacter freundii tìm thấy phân môi trường nước giàu chất dinh dưỡng, đất xác thực vật nước uống có nồng độ dinh dưỡng tương đối cao Ngoài ra, nhóm bao gồm loài Seratia fonticola, Rabnella aqualiris, Buttiaxella agrestis thấy phân thấy nước uống có chất lượng tốt + Coliforms chịu nhiệt: Vi khuẩn coliforms chịu nhiệt coliforms có khả lên men đường lactose 44 - 45 oC; nhóm bao gồm Escherichia, Kiebsiella, Enterobacter, Citrobacter Khác với E.Coli, coliforms chịu nhiệt xuất xứ từ nguồn nước giàu chất hữu nước thải công nghiệp từ xác thực vật thối rữa đất Coliforms chịu nhiệt không tái phát triển hệ thống phân phối nước ngoại trừ nước chứa đủ chất dinh dưỡng nhiễm bẩn, nhiệt độ nước cao 13 oC nước chlor thừa Trong đại đa số trường hợp, đậm độ Coliforms chịu nhiệt có liên quan trực tiếp đến đậm độ E.Coli Vì vậy, việc sử dụng dạng vi khuẩn để đánh giá chất lượng nước chấp nhận + Coliforms phân: nhóm Coliforms chịu nhiệt có khả lên men sinh indol ủ nhiệt độ 44oC khoảng 24 canh trypton Nguồn gốc Coliforms từ ruột người động vật máu nóng Do đó, có mặt nhóm Coliforms phân nghĩa môi trường bị nhiễm vi sinh vật đường ruột + E coli Bucher tìm năm 1885 Escherich nghiên cứu đầy đủ năm 1886 E coli bình thường sống ruột già Trong tiếng Latin ruột già colum Vì tôn trọng nhà khoa học nên người ta lấy tên ông ghép vào chữ ruột già theo ngữ pháp sở hữu cách tiếng Latin, nên loại vi khuẩn gọi Escherichia coli Như có mặt vi khuẩn môi trường bên chứng tỏ môi trường có khả ô nhiễm từ phân E coli thành viên họ Enterobacteriace đặc trưng tính chất có enzyme β – galactosidase β – glucoronidase Nó phát triển nhiệt độ 44 – 45 oC môi trường tổng hợp, lên men lactose mannitol có sinh sinh acid, sinh indol từ tryptophan Tuy nhiên số chủng phát triển nhiệt độ 37 oC không phát triển 44 – 45oC số không sinh E coli không sinh oxidase phân hủy urea E coli có mặt nhiều phân người động vật máu nóng Mật độ chúng lên đến 109 vi khuẩn/gam Vi khuẩn dùng để đánh giá mức độ ô nhiễm phân, thường tạo khuẩn lạc thành ruột không gây nguy hiểm 3.2 cho sức khỏe Nhóm staphylococcus Staphylococcus cầu khuẩn Gram dương không tạo bào tử, có đường kính khoảng 1µm, không di động xếp theo hướng, thường tạo thành cụm trông giống chùm nho Là mộ vi khuẩn tiếng tỷ lệ gây bệnh cao, có khả gây nhiều bệnh nặng đề kháng kháng sinh mạnh Các nhà vi khuẩn học lùng danh Robert Kouch Louis Pasteur quan tâm nghiên cứu dạng vi khuẩn Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn chia thành nhóm tụ cầu khuẩn có men coagulase tụ cầu khuẩn men coagulase - Tụ cầu khuẩn có men cosgulase: nuôi môi trường nuôi cấy có máu, khuẩn lạc màu - vàng nên hay gọi tụ cầu vàng Tụ cầu khuẩn men coagulase: nuôi cấy môi trường nuôi cấy có máu, khuẩn lạc màu trắng ngà nên hay gọi tụ cầu trắng Staphylococcus phân lập chủ yếu từ da chất nhầy người động vật máu nóng Do đó, sử dụng nhóm vi khuẩn để kiểm tra xem môi trường hay mẫu thực phẩm có nhiễm vi sinh vật gây bệnh hay không, có đảm bảo vệ an toàn thực phẩm hay không Staphylococcus aureus tụ cầu khuẩn dùng làm vi sinh vật thị phổ biến Staphylococcus aureus vi khuẩn Gram dương, hiếu khí kỵ khí tùy ý, nuôi cấy môi trường thạch máu, số dòng vi khuẩn làm tan máu, tạo sắc tố vàng 3.3 sau – ngày nuôi cấy nhiệt độ phòng Nhóm Streptococcus Streptococcus vi khuẩn Gram dương, dạng hình cầu hay ovan, xếp thành chuỗi từ – tế bào thành chuỗi tế bào Trên môi trường thạch máu vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc nhỏ, đặc biệt gây dung huyết Vi khuẩn lên men đường mannitol, sorbitol, melibinose,… Vi khuẩn Streptococcus phân bố rộng rãi tự nhiên đường tiêu hóa, hô hấp phần ống tiêu hóa da thể người, động vật Streptococcus phân liên cầu khuẩn kỵ khí tùy ý có nguồn gốc từ phân Chúng có hình ovan, Gram dương, thường tụ thành đôi hay chuỗi ngắn, không sinh bào tử, số dòng có khả sinh vỏ nhầy Khuẩn lạc có màu hồng đến đỏ đậm khử triphenyl tetrazolium chloride Chúng âm tính với phản ứng catalase, phát triển môi trường chứa 6,4% muối NaCl, pH = 9,6 nhiệt độ 45oC Chỉ số Coliforms phân Streptococcus phân dùng để thị nguồn gốc ô nhiễm từ người hay động vật Khi tỷ số 0,7 nghĩa ô nhiễm từ động vật, lớn từ người 3.4 Nhóm Clostridium Clotridium vi khuẩn Gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, đa số có khả di động Chúng vi khuẩn hoại sinh có khả phân hủy protein saccharide để sinh lượng tổng hợp tế bào Một số loài chuyển hóa không hoàn toàn protein gây mùi khó chịu Clotridium diện đất, số loài gây bệnh cho người, động vật số loài gây hư hỏng thực phẩm Clotridium xác định mật độ cách nuôi môi trường ferri amonium citrate disodium sulfite ủ 37 oC – ngày Khuẩn lạc Clotridium màu đen phản ứng ion sulfite (S 2-) ion sắt (Fe2+) có môi trường Clotridium perfringens loài kỵ khí không bắt buộc, tạo tử môi trường nhân tạo, quan sát môi trường Ellner, môi trường bổ sung muối mật bicarbonate hay quinoline Độc tố chúng có thẻ gây hoại tử ngộ độc thực phẩm Mặc dù sinh bào tử khiến chúng đề kháng mạnh với môi trường vi khuẩn đối tượng đáng tin cậy cho việc xác định vùng biển nhiễm phân Một số phương pháp xác định vi sinh vật thị 4.1 Phương pháp đếm khuẩn lạc 4.1.1 Môi trường hóa chất Môi trường sử dụng Plate Count Agar (PCA) có pH 7,0 ± 0,2 Môi trường pha chế, phân phối vào bình thủy tinh hay ống nghiệm hấp khử trùng 121oC 15 phút Các bình ống nghiệm chứa môi trường chưa sử dụng bảo quản tủ lạnh – oC Trước sử dụng môi trường phải đun chảy làm nguội 45oC bể điều nhiệt Ngoài môi trường trên, sử dụng môi trường khác Tryptose Glucose Agar, Nutrient Agar Dung dịch nước muối pepton SPW (Saline Pepton Water) dùng pha loãng chứa 8,5g NaCl 1g peptone 100ml nước Dung dịch chứa bình chứa 0,5 – 1,0 lít, hấp khử trùng pân phối thành thể tích xác ml vào ống nghiệm vô trùng 4.1.2 Quy trình phân tích - Chuẩn bị mẫu trước phân tích: Trước tiến hành phân tích, thực việc đồng mẫu sau: mẫu dạng rắn dùng dụng cụ kéo, kẹp khử trùng cân xác 10g mẫu vào bao PE Tất thao tác cần phải tiến hành điều kiện vô trùng Thêm vào lượng mẫu 90ml dung dịch pha loãng SPW Thực việc đồng mẫu máy dập mẫu Thời gian dập mẫu phụ thuộc vào tính chất lý mẫu, không 2,5 phút Trong trường hợp máy dập mẫu thực thao tác đồng sau: xát nhuyễn mẫu điều kiện vô trùng Cân xác điều kiện vô trùng nước SPW hấp khử trùng Lắc thời gian định Đối với mẫu dạng lỏng, hút 10ml cho vào bình tam giác chứa 90ml nước SPW hấp khử trùng, lắc Sau làm đồng phương pháp trên, dung dịch thu có nồng độ pha loãng 10 lần so với ban đầu Dịch mẫu đồng tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân cách dùng pipet vô trùng (hoặc pipetman với đầu tip vô trùng) chuyển 1ml dịch vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng Trộn mẫu ống nghiệm cho đồng máy rung (vortex) hay dùng pipet hút đảo dịch mẫu lên xuống – 10 lần Dung dịch mẫu có độ pha loãng 10-2 Sau sử dụng pipetman có đầu tip vô trùng chuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm thứ chứa dung dịch pha loãng thao tác tương tự để có dịch mẫu với độ pha loãng 10 -3 Tiếp tục thực tương tự để có độ pha loãng cần thiết Lưu ý dùng pipet đầu tip pipetman nguy bị nhiễm trình thao tác (chạm tay, chạm mặt ống nghiệm, mặt bình chứa, ), cần phải thay pipet - đầu tip vô trùng khác Cấy mẫu: Chọn hay độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa 25 – 250 tế bào vi sinh vật 1ml để cấy lên đĩa petri Dùng pipet vô trùng pipetman với đầu tip vô trùng chuyển 1ml dịch mẫu pha loãng chọn vào đĩa petri vô trùng Tương ứng với nồng độ pha loãng cấy - đĩa Sau cấy đổ vào đĩa 10 – 15ml môi trường PCA đun chảy ổn định 45oC Trộn dịch mẫu với môi trường cách xoay tròn đĩa petri xuôi ngược chiều kim đồng hồ, chiều – lần sau đổ môi trường Đặt đĩa mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc Lật ngược ủ đĩa tủ ấm nhiệt độ 30 ± 10oC vòng 72 Nhiệt độ thời gian ủ thay - đổi theo quy định tiêu chuẩn Cách tính kết quả: A (CFU/g hay CFU/ml)x R Trong đó: A tổng số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) 1g 1ml mẫu N tổng số khuẩn lạc đếm đĩa chọn n1 số lượng đĩa cấy chọn độ pha loãng thứ i V thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào đĩa fi độ pha loãng tương ứng R tỷ lệ khẳng định 4.2 Phương pháp MPN (Most Probale Number) Phương pháp MPN hay phương pháp có số xác xuất lớn nhất, số tối khả dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật có xác xuất lớn thể tích dung dịch mẫu 4.3 4.4 Phương pháp định lượng dựa kết loạt thí nghiệm lặp lại nồng độ pha loãng khác Thông thường, việc định lượng lặp lại lần độ pha loãng khác liên tiếp Quy trình thực theo phương pháp sau: cho ống nghiệm có chứa môi trường chọn lọc thích hợp với mộ thể tích xác dung dịch mẫu độ pha loãng liên tiếp (thường 10-1, 10-2, 10-3) ủ nhiệt độ thời gian thích hợp Ghi nhận số ống dương tính độ pha loãng Đối với bước khẳng định, chuyển phần ống dương tính bước xác định sang ống nghiệm chứa môi trường khẳng định ủ thời gian nhiệt độ thích hợp Sau thời gian ủ, đếm số ống dương tính Sử dụng số liệu tra bảng Mac Crady để suy số vi sinh vật trình bày dạng bảng MPN 100ml hay MPN 1g mẫu Cần lưu ý bảng MPN cung cấp dạng số MPN 100ml dung dịch dùng để phân tích liều lượng 10ml, 1ml 0,1 ml Việc sử dụng liều lượng khác dễ gây ảnh hưởng đến nồng độ môi trường ảnh hưởng đến kết Do đó, phân tích thường dùng độ pha loãng bậc 10 Số liệu bảng MPN 100ml dung tích mẫu 10ml, 1ml 0,1ml tương đương với MPN/ml mẫu chưa pha loãng 1ml mẫu độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Trường hợp mẫu có mậc độ vi sinh vật cao pha loãng cần tính thêm hệ số pha loãng Phương pháp MPN sử dụng phổ biến định lượng Coliforms tổng số, Coliforms phân, E coli vi sinh vật khác Phương pháp ELISA Là phương pháp hấp thu miễn dịch dùng enzyme Đây phương pháp hiệu nhanh chóng phát vi sinh vật Nguyên tắc phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên đĩa giếng Nếu có diện kháng nguyên mục tiêu kháng nguyên bị giữ lại bề mặt giếng Các kháng nguyên sau phát kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme horseradish perosidase hay alkaline phosphatase Khi bổ sung chất đặc hiệu enyme vào enzyme xúc tác tạo sản phẩm có màu phát sáng Dựa vào thay đổi màu hay ánh sáng mà khẳng định có mặt định lượng kháng nguyên cần tìm Hiện phương pháp ELISA thương mại hóa dạng kít Chỉ sau thời gian vài xác định vi sinh vật mẫu Tuy nhiên, phương pháp cần tăng sinh trước đưa vào phản ứng Kháng nguyên sử dụng phương pháp ELISA dạng môt phần vi sinh vật độc tố chúng tạo tùy thuộc vào thiết kế Hiện phương pháp ELISA có kít thương mại định danh E.coli, Staphylococcus, Salmonella Phương pháp lai phân tử Phương pháp lai phân tử thực dựa tính chất DNA: tách mạch nhiệt độ cao lắp ráp nhiệt độ giảm xuống Tính chất tìm thấy RNA Phương pháp thực cách phá vỡ tế bào vi sinh vật để thu nhận rRNA Sau đó, đưa đầu dò đoạn DNA đặc thù có gắng mẫu dò dung dịch, nhiệt độ đưa xuống nhiệt độ tách mạch DNA, đoạn DNA đặc thù gắn vào vị trí định rRNA Thực phản ứng với mẫu dò xác định có mặt nồng độ rRNA có dung dịch phản ứng 4.5 - - Hiện có kít phát nhanh vi sinh vật phương pháp lai phân tử Các đối tượng phát E.coli, staphylococcus, salmonella Phương pháp PCR kết hợp điện di Phương pháp PCR phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa khuôn môt trình tự đích DNA ban đầu thành hàng triệu nhờ enzyme polymerase cặp mồi Kỹ thuật Karl Mullis cộng phát năm 1985 Phản ứng PCR thực dựa vào nhiệt độ tách mạch DNA Sau hạ thấp nhiệt độ xuống mồi đoạn olygonucleotide gắn vào vị trí đặc hiệu để đảm bảo cho phản ứng tổng hợp diễn enzyme polymerase Quá trình lặp lại đạt đến số lượng DNA cần thiết Phản ứng PCA gồm nhiều chu kỳ nối Mỗi chu kỳ gồm bước: Bước biến tính: dung dịch phản ứng gồm thành phần cần thiết cho chép, phân tử DNA biến tính nhiệt độ cao Tm phân tử Mạch đôi DNA tách Thời gian kéo dài tù 30 – 60s Bước lai: nhiệt độ hạ thấp Tm cho phép bắt cặp xảy mồi mạch khuôn Nhiệt độ dao động từ 40 – 70oC, thời gian kéo dài từ 30 – 60s Bước tổng hợp: nhiệt độ tăng lên 72 oC giúp cho enzyme DNA-polymerase hoạt động tốt Thời gian bước tùy thuộc vào trình tự DNA cần khuếch đại, thường từu 30 giây đến phút Sau thực phản ứng PCR xong, DNA cho chạy điện di gel aragose Nguyên tắc phương pháp phân tử điện di di chuyển cực trái dấu dung dịch đệm DNA tích điện âm di chuyển cực dương Sau thời gian định, dừng vị trí gel Nếu nhuộm gel với tuốc nhuộm Ethydium bromide quan sát vị trí DNA ta UV Phương pháp cho kết nhanh không cần thời gian tăng sinh, tiện lợi việc phát vi sinh vật kó nuôi cấy, hóa chất tồn trữ lâu tốn mặt nhân Nó sử dụng phát hiện, S Aurius nhiều loài vi sinh vật khác KẾT LUẬN Vi sinh vật thị đóng vai trò quan trọng việc xác định mức độ ô nhiễm môi trường, thực phẩm Có nhóm vi sinh vật thị là: Coliforms, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium Một số phương pháp xác định vi sinh vật thị là: phương pháp đếm khuẩn lạc, phương pháp MPN, phương pháp ELISA, phương pháp lai phân tử, phương pháp PCR kết hợp điện di Thông qua vi sinh vật thị ta đánh giá mức độ ô nhiễm môi trường cách dễ dàng hơn, tốn giảm thiểu nguy gây nguy hiểm sức khỏe cho người thao tác kiểm nghiệm Vi sinh vật thị trở thành công cụ đắc lực hỗ trợ cho việc xác định mức độ ô nhiễm môi trường độ an toàn vệ sinh thực phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Đoàn Chiến Thắng (2012), Bài giảng Vi sinh môi trường, Đại học Tây Nguyên Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Bá Hiên, Hoàng Hải, Vũ Thị Hoan (2006), Giáo trình Vi sinh vật công nghiệp, NXB Giáo dục Tài liệu internet http://vi.wikipedia.org/wiki/Streptococcus http://doc.edu.vn/tai-lieu/khoa-luan-tong-quan-ve-cac-vi-sinh-vat-chi-thi-va-bienphap-kiem-soat-vi-sinh-vat-trong-thuc-pham-52394/ http://vi.wikipedia.org/wiki/tụ_cầu_khuẩn [...]...TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Tài liệu tiếng việt 1 Đoàn Chiến Thắng (2012), Bài giảng Vi sinh môi trường, Đại học Tây Nguyên 2 Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Bá Hiên, Hoàng Hải, Vũ Thị Hoan (2006), Giáo trình Vi sinh vật công nghiệp, NXB Giáo dục 2 Tài liệu internet 3 http://vi.wikipedia.org/wiki/Streptococcus 4 http://doc.edu.vn/tai-lieu/khoa-luan-tong-quan-ve-cac-vi-sinh-vat-chi-thi-va-bienphap-kiem-soat-vi-sinh-vat-trong-thuc-pham-52394/