CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN TRƯỜNG CAO ĐẲNG NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT BẮC BỘ ……………****…………… GIÁO TRÌNH CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT HÀ NỘI 2012 Chƣơng KHÁI QUÁT VỀ CÔNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT 1.1 Giới thiệu chung Công nghệ tế bào thực vật công nghệ quan trọng công nghệ sinh học, tảng để nghiên cứu áp dụng công nghệ khác lĩnh vực công nghệ sinh học nông nghiệp Hiện nay, từ thành tựu công nghệ sinh học nuôi cấy mô tế bào, nuôi cấy hạt phấn ứng dụng nhiều vào lĩnh vực trồng trọt, nhƣ: - Nhân nhanh vô tính giống quý: từ mẫu nuôi cấy ngƣời ta tạo hàng triệu nhƣ đủ thời gian cấy chuyển Tuy nhiên, hệ số cấy chuyển phụ thuộc tuỳ giống, cấy chuyển nhiều lần tạo nhiều biến dị Ví dụ, nhà khoa học kết luận từ chồi dứa đƣa vào nuôi cấy ống nghiệm nhân hàng triệu dứa giống; từ chồi chuối đƣa vào nuôi cấy nhân 2.000 chuối giống, qua số có tỷ lệ biến dị cao - Cải lƣơng giống trồng nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (meristerm): để phục tráng giống quý nhiễm virus ngƣời ta nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng để nhân nhanh Qua số lần nuôi cấy theo kiểu tạo đƣợc hoàn toàn bệnh từ nhiễm virus - Tạo dòng đơn bội từ nuôi cấy bao phấn nuôi cấy tế bào hạt phấn: Ngƣời ta ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy bao phấn hạt phấn để tạo đơn bội từ bao phấn hạt phấn, sau lƣỡng bội hoá tạo thành dòng đồng hợp tử Kĩ thuật thành công nhiều họ cà - Khắc phục lai xa cách thụ phấn ống nghiệm nhờ kĩ thuật nuôi cấy phôi: Nhờ nuôi cấy ống nghiệm khắc phục tính bất hợp giao tử trƣớc sau thụ tinh lai khác xa mặt di truyền - Lai vô tính gọi dung nạp tế bào trần (Protoplast): Nhờ kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mà ngƣời ta tạo thành lai từ giống khác xa mặt di truyền cách dùng enzim để hoà tan màng tế bào cho tế bào trần (không màng) vào nuôi cấy chung môi trƣờng nhân tạo chúng phát triển thành khối mô sẹo (callus), từ chuyển khối callus sang môi trƣờng phân hoá chức tế bào để nuôi cấy thành lai Sơ lược lịch sử phát triển Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dƣới kính hiển vi đƣa khái niệm "tế bào - Cell" Anton Van Leuwen Hoek (1632-1723) thiết kế kính hiển vi khuyếch đại đƣợc 270 lần, lần quan sát thấy vi khuẩn, tế bào tinh trùng tinh dịch ngƣời động vật Năm 1838, Matthias Schleiden Theodore Schwann đề xƣớng học thuyết sinh học gọi Học thuyết tế bào: + Mọi thể sống đƣợc cấu tạo nhiều tế bào + Tế bào đơn vị cấu trúc chức thể sống, hình thức nhỏ sống + Tế bào đƣợc tạo từ tế bào tồn trƣớc Năm 1875, Oscar Hertwig chứng minh quan sát kính hiển vi thụ thai hợp nhân tinh trùng nhân trứng Sau đó, Hermann P., Schneider F.A Butschli O mô tả xác trình phân chia tế bào Năm 1883, Wilhelm Roux lần lý giải phân bào giảm nhiễm quan sinh dục Từ tế bào thực vật nuôi cấy in vitro tái sinh thành thể sống hoàn chỉnh Khả tế bào thực vật đƣợc gọi tính toàn Năm 1902, Haberlandt lần thí nghiệm nuôi cấy mô mầm nhƣng không thành công Năm 1934, Kogl lần xác định đƣợc vai trò IAA, hoocmon thực vật thuộc nhóm auxin có khả kích thích tăng trƣởng phân chia tế bào Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt White đồng thời nuôi cấy mô sẹo thành công thời gian dài từ mô thƣợng tầng (cambium) cà rốt thuốc lá, mô sẹo có khả sinh trƣởng liên tục Năm 1941, Overbeek cs sử dụng nƣớc dừa nuôi cấy phôi non cà rốt Datura Năm 1955, Miller cs phát minh cấu trúc sinh tổng hợp kinetin - cytokinin đóng vai trò quan trọng phân bào phân hoá chồi mô nuôi cấy Đến năm 1957, Skoog Miller khám phá vai trò tỷ lệ nồng độ chất auxin: cytokinin môi trƣờng phát sinh quan (rễ chồi) Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/ nồng độ kinetin) nhỏ nhỏ, mô có xu hƣớng tạo chồi Ngƣợc lại nồng độ IAA/ nồng độ kinetin lớn lớn, mô có xu hƣớng tạo rễ Tỷ lệ nồng độ auxin cytokinin thích hợp kích thích phân hoá chồi rễ, tạo hoàn chỉnh Năm 1949, Limmasets Cornuet phát virus phân bố không đồng thƣờng không thấy có virus vùng đỉnh sinh trƣởng Năm 1952, Morel Martin tạo bệnh virus giống khoai tây từ nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Ngày nay, kỹ thuật với số cải tiến trở thành phƣơng pháp loại trừ bệnh virus đƣợc dùng rộng rãi nhiều loài trồng khác Năm 1952, Morel Martin lần thực vi ghép in vitro thành công Kỹ thuật vi ghép sau đƣợc ứng dụng rộng rãi tạo nguồn giống bệnh virus tƣơng tự virus nhiều trồng nhân giống phƣơng pháp vô tính khác nhau, đặc biệt tạo giống ăn bệnh Năm 1960, Morel thực bƣớc ngoặt cách mạng sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng nhân nhanh loại địa lan Cymbidium, mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực vật Năm 1960, Cocking lần sử dụng enzym phân giải thành tế bào tạo số lƣợng lớn tế bào trần Kỹ thuật sau đƣợc hoàn thiện để tách nuôi tế bào trần nhiều trồng khác Năm 1971, Takebe cs tái sinh đƣợc từ tế bào trần mô thịt (mesophill cell) thuốc Năm 1972, Carlson cs lần thực lai tế bào sôma loài, tạo đƣợc từ dung hợp tế bào trần loài thuốc Nicotiana glauca N langsdorfii Năm 1978, Melchers cs tạo đƣợc lai soma "Cà chua Thuốc lá" lai xa tế bào trần Đến nay, việc tái sinh hoàn chỉnh từ tế bào trần từ lai tế bào trần thành công nhiều loài thực vật Năm 1964, Guha Maheshwari lần thành công tạo đƣợc đơn bội từ nuôi cấy bao phấn cà Datura Kỹ thuật sau đƣợc nhiều tác giả phát triển ứng dụng rộng rãi tạo dòng đơn bội (1x), dòng nhị bội kép (2x), cố định ƣu lai (nuôi cấy bao phấn hạt phấn dòng lai F1 để tạo giống mang tính trạng ƣu lai) Năm 1959, Tulecke Nickell thử nghiệm sản xuất sinh khối mô thực vật quy mô lớn (134 lít) nuôi cấy chìm Năm 1977, Noguchi cs nuôi cấy tế bào thuốc bioreactor dung tích lớn 20,000 lít Năm 1978, Tabata cs nuôi tế bào thuốc quy mô công nghiệp phục vụ sản xuất shikonin Họ chọn lọc đƣợc dòng tế bào cho sản lƣợng sản phẩm thứ cấp (shikonin) cao Năm 1985, Flores Filner lần sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ Hyoscyamus muticus Những rễ sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine tự nhiên Hiện nay, công nghệ nuôi cấy tế bào mô (ví dụ, mô rễ nhân sâm) bioreactor dung tích lớn đƣợc thƣơng mại hoá mức công nghiệp để sản xuất sinh dƣợc Năm 1981, sở quan sát biến dị xảy phổ biến nuôi cấy mô tế bào với phổ biến dị tần số biến dị cao, Larkin Scowcroft đƣa thuật ngữ "biến dị dòng soma" (Somaclonal Variation) để thay đổi di truyền tính trạng xảy nuôi cấy mô tế bào in vitro Từ dòng tế bào biến dị di truyền ổn định nhân nhanh, tạo dòng giống đột biến có suất, hàm lƣợng hoạt chất hữu ích cao, kháng số điều kiện bất lợi nhƣ bệnh, mặn, hạn,… 1.2 Học thuyết tế bào Năm 1662, Robert Hooke thiết kế kính hiển vi đơn giản quan sát đƣợc cấu trúc miếng bấc bần bao gồm nhiều hạt nhỏ, ông gọi hạt nhỏ tế bào (cells) Năm 1675, Anton Van Leeuwenhoek xác nhận thể động vật bao gồm tế bào Ông quan sát dƣới kính hiển vi thấy máu động vật có chứa hồng cầu ông gọi tế bào máu Nhƣng đến năm 1838, Matthias Jacob Schleiden (nhà thực vật học) 1839, Theodor Schwann (nhà động vật học) thức xây dựng học thuyết tế bào Schleiden Schwann khẳng định rằng: Mỗi thể động thực vật bao gồm thể tồn hoàn toàn độc lập, riêng rẽ tách biệt, tế bào Có thể nói Schleiden Schwann hai ông tổ học thuyết tế bào Tuy nhiên, hai ông tác giả phát biểu nguyên tắc đó, mà diễn đạt nguyên tắc rõ ràng hiển nhiên tới mức đƣợc phổ biến rộng rãi cuối đƣợc đa số nhà sinh học thời thừa nhận 1.2.1 Tính toàn tế bào (cell totipotency) Haberlandt (1902) ngƣời đề xƣớng phƣơng pháp nuôi cấy tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn tế bào Theo ông tế bào thể sinh vật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh.Nhƣ tế bào riêng rẽ thể đa bào chứa đầy đủ toàn lƣợng thông tin di truyền cần thiết sinh vật gặp điều kiện thích hợp tế bào phát triển thành thể sinh vật hoàn chỉnh Hơn 50 năm sau, nhà thực nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật đạt đƣợc thành tựu chứng minh cho khả tồn phát triển độc lập tế bào Tính toàn tế bào thực vật đƣợc bƣớc chứng minh Nổi bật công trình: Miller Skoog (1953) tạo đƣợc rễ từ mảnh mô cắt từ thân thuốc lá, Reinert Steward (1958) tạo đƣợc phôi cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi cấy dung dịch, Cocking (1960) tách đƣợc tế bào trần Takebe (1971) tái sinh đƣợc hoàn chỉnh từ nuôi cấy tế bào trần thuốc Kỹ thuật tạo dòng (cloning) tế bào đơn đƣợc phân lập điều kiện in vitro chứng minh thực tế tế bào soma, dƣới điều kiện thích hợp, phân hóa để phát triển thành thể thực vật hoàn chỉnh Sự phát triển thể trƣởng thành từ tế bào đơn (hợp tử) kết hợp phân chia phân hóa tế bào Để biểu tính toàn thế, tế bào phân hóa trải qua giai đoạn phản phân hóa (dedifferentiation) sau giai đoạn tái phân hóa (redifferentiation) Hiện tƣợng tế bào trƣởng thành trở lại trạng thái phân sinh tạo mô callus không phân hóa (undifferentiation) đƣợc gọi phản phân hóa, khả để tế bào phản phân hóa tạo thành hoàn chỉnh (whole plant) quan thực vật đƣợc gọi tái phân hóa Ở động vật, phân hóa đảo ngƣợc trở lại Nhƣ vậy, phân hóa tế bào kết phát triển thể bậc cao, thƣờng đƣợc gọi cytodifferentiation 1.2.3 Thể bội gen Gen định tính trạng thực vật Có tính trạng tƣơng ứng với gen nhƣng có nhiều tính trạng liên quan đến nhiều gen, tính trạng gọi tính trạng đơn gen tính trạng đa gen Hai gen nằm vị trí định nhiễm sắc thể tƣơng đồng gọi allen Tuy tham gia định tính trạng nhƣng allen qui định đặc điểm riêng Ví dụ màu hoa, allen mang thông tin di truyền cho hoa màu đỏ , allen cho hoa màu trắng.Trƣờng hợp ta có cá thể dị hợp tử tính trạng màu hoa, allen mang thông tin di truyền cho màu đỏ ta có cá thể đồng hợp tử Đối với cá thể dị hợp tử, allen allen trội, allen lại allen lặn Allen trội định tính trạng Có trƣờng hợp trội hoàn toàn trội không hoàn toàn Trội không hoàn toàn tổ hợp allen cho tính trạng trung gian Thể bội danh từ số nhiễm sắc thể có tế bào, mô, cá thể thực vật với qui định chung tế bào sinh sản có nhiễm sắc thể đƣợc gọi thể đơn bội Hợp tử, sản phẩm dung hợp giao tử đơn bội, nhị bội với số nhiễm sắc thể 2n Tất tế bào soma hình thành phân chia hợp tử nhị bội Trên thực tế tìm thấy lúc nhiều mức bội thể khác mô khác thể thực vật.(4n, 8n) Đólà tƣợng đa bội hóa nội giảm phân Khoảng nửa thực vật bật cao mức đa bội thể Số nhiễm sắc thể loài X ( số đơn bội nhỏ dãy đa bội), cá thể có X nhiễm sắc thể đƣợc gọi thể bội để phân biệt với thể đơn bội Ví dụ : lúa mì có 2n=42 Trên thực tế thể lục bội 6X, số nhiễm sắc thể loài X=7 Thể đơn bội lúa có n=3X=21 nhiễm sắc thể 1.2.4 Thể bào tử thể giao tử Thể bào tử gồm có hợp tử tất tế bào sản sinh từ hợp tử kể hạt phấn túi phấn noãn Thể giao tử gồm có hạt phấn nảy mầm tất tế bào sản sinh ra, bao gồm giao tử Khi giao tử khác giống dung hợp, thể bào tử 2n đƣợc tái lập Ở thực vật bậc cao, thể giao tử thƣờng không tế bào tế bào giao tử Ở thực vật bậc cao, thể giao tử ( trƣờng hợp đặc biệt, phát triển thành bào tử đơn bội) chứa n nhiễm sắc thể Thể bào tử đơn bội hoa nhƣng bào tử hình thành sức sống Tạo thể bào tử đơn bội đơn bội kép mục đích nuôi cấy túi phấn hạt phấn 1.2.5 Sinh sản hữu tính sinh sản vô tính Sinh sản vô tính tƣợng thể tạo thể từ phần quan sinh dƣỡng mình, tham yếu tố quy định giới tính, thể sinh hoàn toàn giống hệt thể mẹ Sinh sản vô tính có nhiều hình thức Ở sinh vật đơn bào có phân đôi tế bào Một số thể đa bào bậc thấp tế bào sinh dƣỡng phân chia tạo nhánh sau tách khỏi thể nhƣ thủy tức chẳng hạn, mẫu thể mẹ đứt mọc thể khác kiểu nhƣ tảo lam Một số khác có hẳn loại tế bào sinh sản riêng nhƣng mà hoàn toàn tính chất giới tính mà từ thể mẹ tạo mà Đó tƣợng sinh sản vô tính bào tử Bào tử thể đơn bào môi trƣờng bất lợi chúng tự rút nƣớc khỏi tế bào, trở thành dạng tiềm sinh đợi thời để sống lại Ở sinh vật đa bào túi đựng tế bào gọi bào tử vô tính Đến mùa sinh sản chúng phát tán tế bào môi trƣờng xung quanh Khi gặp điều kiện thuận lợi bào tử tạo thể Ở thực vật khác, tồn hai kiểu sinh sản vô tính hữu tính Sinh sản vô tính từ phần thể mẹ tách tạo thể Sinh sản hữu tính phải có tham gia yếu tố quy định giới tính, bao gồm đực Các yếu tố thể hay khác thể, chất yếu tố nhiễm sắc thể giới tính quy định Sinh sản hữu tính có nhiều kiểu Kiểu sơ khai tiếp hợp, tƣợng hai tế bào đực, trao đổi nhân cho Sau sinh sản hữu tính bào tử nhƣ rêu, dƣơng xỉ, Lên tới lớp thụ tinh với tham gia giao tử đực cái, loại giao tử nằm tế bào khác 1.3 Cấu trúc tế bào thực vật Hình ảnh tế bào thực vật đƣợc minh họa hình 1.1 Một tế bào đơn thực vật thƣờng có đƣờng kính khoảng từ 20-40 µm dài 100-200 µm Cấu trúc tế bào thực vật tƣơng tự tế bào đặc trƣng eukaryote Tuy nhiên, tế bào thực vật có số đặc điểm riêng biệt nhƣ thành tế bào dày, không bào lớn có lục lạp Tế bào thực vật đƣợc bọc chung quanh thành tế bào Lớp thành tế bào chứa pectin để giúp liên kết với tế bào bên cạnh Lớp thành tế bào màng tế bào Màng tế bào hoàn toàn khác với thành tế bào hình dạng, thành phần chức Trong thành tế bào cứng rắn, có cấu trúc tƣơng đối dày màng tế bào chất lại mỏng (khoảng 75 A0 ) mềm dẻo Màng tế bào bao gồm protein lipid thành tế bào carbohydrate tự nhiên Thành tế bào có chức nâng đỡ cho màng tế bào điều hòa vận chuyển chất vào khỏi tế bào Không bào (vacuole) có vai trò tiếp nhận chất thải trao đổichất chất thứ cấp thực vật Ở tế bào non không bào thƣờng nhỏ nhiều Khi tế bào lớn dần già không bào mở rộng lên kết thành khối Ở tế bào thực vật trƣởng thành, không bào chiếm tới 90% thể tích tế bào Không bào đƣợc bọc chung quanh màng huyết tƣơng (plasma) Thành phần không bào lớn nƣớc chứa chất hòa tan nhƣ ion vô cơ, amino acid, acid hữu cơ, sắc tố hòa tan nƣớc (anthocyanin) chất không hòa tan dạng tinh thể hình kim Ngoài ra, không bào chứa protein nhƣ hydrolyse, catalase photphatase Phần bào tan muốn đề cập đến lipid chung quanh tất cấu trúc nhân màng tế bào Lục lạp (chloroplast) vị trí quang hợp tế bào thực vật, chứa chlorophyll sắc tố lục phản ứng với ánh sáng để sản xuất carbohydrate Nhân (nuclear) trung tâm điều khiển tế bào chứa DNA để phiên mã dịch mã thành protein Các protein tổng hợp đƣợc xếp đóng gói túi máy Golgi Nội sinh chất (endoplasmic reticulum) mạng lƣới ống nhỏ nối liền phần khác tế bào Ribosome đƣợc tập trung bề mặt mạng lƣới nội sinh chất tham gia vào hoạt động sinh tổng hợp protein Ty thể (mitochondrion) chứa vật liệu di truyền nhiều enzyme quan trọng trao đổi chất tế bào Hình 1.1 Cấu trúc tế bào thực vật 1.4 Môi trường nuôi cấy Mặc dù nhu cầu dinh dƣỡng loại mô nuôi cấy khác nhƣng môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật đặc trƣng chứa thành phần sau: - Các nguyên tố đa lượng Bao gồm loại muối nitrogen, potassium, calcium, phosphorus, magnesium sulfur Đây sáu nguyên tố cần thiết cho sinh trƣởng thực vật bậc cao - Các nguyên tố vi lượng Bao gồm loại muối sắt, kẽm, mangan, boron, copper, molybdenum cobalt dạng vết - Các phụ gia hữu Một lƣợng nhỏ loại vitamin (myo-inositol, thiamine, nicotinic acid, pyridoxine, riboflavin…), amino acid (thƣờng cho phép bỏ qua nhƣng số trƣờng hợp đặc biệt dùng), phụ gia hữu không xác định khác (malt, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein, nƣớc dừa…) - Các chất kích thích sinh trưởng thực vật Thành phần phụ gia quan trọng định kết nuôi cấy chất điều hòa sinh trƣởng Các auxin (IAA dạng tƣơng tự đƣợc tổng hợp nhân tạo nhƣ 2,4-D , NAA , IBA , …), cytokinin (zeatin, 2i-P dạng tƣơng tự đƣợc tổng hợp nhân tạo nhƣ kinetin, BA …) nhóm chất kích thích sinh trƣởng phát sinh hình thái chủ yếu nuôi cấy mô quan thực vật - Nguồn carbon Thƣờng sử dụng sucrose làm nguồn carbon thay cho nguồn carbon đƣợc thực vật cố định từ khí quang hợp Trong đa số thí nghiệm nuôi cấy, tế bào thực vật khả quang hợp Glucose thƣờng đƣợc đƣa vào môi trƣờng cho hiệu tƣơng đƣơng sucrose, fructose cho hiệu - Các tác nhân làm rắn (tạo gel) môi trường Thƣờng sử dụng agar, loại polysaccharide thu đƣợc từ số loài tảo thuộc ngành tảo đỏ (Rhodophyta) Một số hợp chất khác đƣợc thử nghiệm thành công nhƣ alginate, phytagel, methacel gel-rite Murasghige Skoog (1962) xây dựng môi trƣờng dinh dƣỡng (gọi môi trƣờng MS) thích hợp cho hầu hết thí nghiệm nuôi cấy tế bào thực vật Thành phần môi trƣờng nuôi cấy đƣợc trình bày bảng 1.1 Bảng 1.1 Thành phần môi trƣờng Murashige Skoog (1962) CÂU HỎI ÔN TẬP Tóm tắt sơ lƣợc lịch sử phát triển công nghệ sinh học nói chung công nghệ tế bào thực vật nói riêng Trình bày tính toàn tế bào (cell totipotency) So sánh hình thức sinh sản hữu tính sinh sản vô tính thực vật Mô tả cấu trúc tế bào thực vật Phân tích vai trò yếu tố cấu thành môi trƣờng nuôi cấy mô, tế bào thực vật tái tổ hợp giảm phân chu trình hữu tính thể lai F1, tạo phân ly vƣợt giới hạn để khám phá tổ hợp gen Các dòng tế bào khác chọn lọc điều kiện in vitro chứng minh lực ứng dụng cho nông nghiệp công nghiệp Các tái sinh biểu tính trạng kháng chất diệt cỏ, pathotoxin, muối phèn Hơn nữa, khả biến dị nuôi cấy tế bào thể vai trò hữu ích việc tổng hợp chất thứ cấp liên quan đếm phạm vi thƣơng mại Hinh 6.1 Biểu đồ khai thác hiệu tác động nhân tế bào chất Các kỹ thuật ứng dụng cho việc cảm ứng biến dị dòng soma dòng giao tử dễ dàng công nghệ DNA tái tổ hợp Đặc biệt, cải thiện trồng mang tính trạng đa gen (polygenic traits) phƣơng pháp tạo giống trồng truyền thống không truyền thống đƣợc chứng minh khó khăn Biến dị dòng soma kỹ thuật thích hợp cho công nghệ di truyền trồng CÂU HỎI ÔN TẬP Khái quát vấn đề nuôi cấy tế bào thực vật đơn Trình bày đặc tính tế bào thực vật đƣợc nuôi cấy Nêu yêu cầu nguyên liệu điều kiện nuôi cấy Vì xuất biến dị dòng tế bào? Trình bày nguyên tắc chọn dòng tế bào Trình bày cách chọn dòng tế bào trƣờng hợp tác nhân chọn lọc có tác nhân chọn lọc Trình bày phƣơng pháp nuôi cấy tế bào sản xuất hợp chất tự nhiên Nêu ứng dụng biến dị dòng soma dòng giao tử công tác giống trồng Chƣơng NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT VÀ VẤN ĐỀ LÀM SẠCH VIRUS Ở THỰC VẬT 7.1 Tầm quan trọng Tạo giống chống chịu bệnh virus hƣớng nghiên cứu khả quan Nhƣng thực tế, chọn tạo giống gặp nhiều khó khăn thiếu nguồn gen có khả chống chịu với loại bệnh virus khác Bên cạnh đó, việc tạo giống lƣu niên gặp trở ngại nhiều thời gian công sức Gần đây, kỹ thuật gen mở triển vọng tạo giống miễn dịch di truyền với số loại virus cách chuyển gen protein vỏ virus gen iARN vào trồng, làm có khả bất hoạt gen mARN virus Tuy nhiên, nhiều vấn đề kỹ thuật lý luận nan giải Hình 7.1.Các dạng cấu tạo virus Do vậy, phƣơng pháp có hiệu tạo vật liệu nhân giống bệnh virus qua nuôi cấy đỉnh chồi, đỉnh sinh trƣởng kết hợp với xử lý hoá chất, nhiệt độ Những phƣơng pháp giúp loại trừ bệnh virus khác khỏi vật liệu nhân giống tạo giống bệnh loạt trồng, chủ yếu khoai tây, khoai lang, sắn, tỏi, ăn có múi, chuối, nho, mơ, mận, hoa nhƣ cúc, cẩm chƣớng Phƣơng pháp cho phép loại bỏ hầu hết bệnh virus, viroid tác nhân gây bệnh tƣơng tự virus (Vasil Thorpe, 1994) Chóp đỉnh sinh trƣởng đƣợc coi bệnh virus Mẫu mô nuôi cấy nhỏ gần đỉnh sinh trƣởng khả bệnh lớn Dƣờng nhƣ có tƣơng quan tỷ lệ thuận kích thƣớc mẫu với khả tái sinh bệnh (Stone, 1982; Green Lo, 1989) Nhƣng vài trƣờng hợp, việc loại trừ virus khó khăn không phụ thuộc vào kích thƣớc mẫu số virus có khả sinh sản chuyển dịch nhanh chóng đến vùng sinh trƣởng (Theiley cs, 1984) Ngƣời ta quan sát thấy mật độ virus cao vùng chóp đỉnh sinh trƣởng số loài dƣới kính hiển vi điện tử (Toussaint cs, 1984) Do vậy, việc kết hợp kỹ thuật nuôi cấy với yếu tố kìm hãm virus nhƣ hoá chất, nhiệt độ tăng cƣờng khả loại trừ bệnh virus tạo giống bệnh trồng Hình 7.2 Cà chua bị bệnh virus đốm vàng Hầu hết trồng nông-lâm nghiệp bị nhiễm hệ thống gây bệnh nhƣ nấm, virus, vi khuẩn, mycoplasma nematodes Các tác nhân gây bệnh gây chết cây, nhƣng thƣờng xuyên làm giảm suất chất lƣợng trồng Trong tác nhân gây bệnh khác gần nhƣ xâm nhiễm vào thể thực vật qua nhân giống sinh dƣỡng, bệnh virus lại xuất trồng nhân giống hạt nhƣ nhân giống sinh dƣỡng Mặc dù trồng bị nhiễm bệnh vi khuẩn nấm phản ứng với việc xử lý hợp chất diệt khuẩn (bactericidal) diệt nấm (fungicidal), nhƣng ngƣời ta chƣa thể sản xuất hợp chất thƣơng mại diệt virus để chữa bệnh cho trồng nhiễm virus Để sản xuất bệnh virus, thông thƣờng ngƣời ta chọn nhiều khỏe mạnh sau nhân giống chúng phƣơng thức sinh dƣỡng, tạo quần thể khoẻ mạnh Nhƣng nơi mà quần thể dòng hoàn toàn bị nhiễm bệnh virus có cách thu đƣợc bệnh thông qua nuôi cấy mô Các mô phân sinh đỉnh bị nhiễm bệnh thƣờng bệnh chứa nồng độ virus thấp Tuy nhiên, nồng độ virus tăng lên tƣơng ứng với việc tăng khoảng cách tính từ đỉnh phân sinh Các lý khác mô phân sinh không bị virus xâm nhiễm là: (a) virus di chuyển dễ dàng thể thực vật thông qua hệ thống mạch dẫn cấu trúc mà đỉnh phân sinh không có, (b) hoạt tính trao đổi chất cao trình phân chia tế bào phân sinh ngăn cản chép virus, (c) nồng độ auxin nội sinh cao đỉnh chồi ức chế sinh sản virus Morel Martin (1952) ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để loại bỏ xâm nhiễm virus thực vật Họ nuôi cấy đỉnh phân sinh tách từ Dahlia bị nhiễm virus thu đƣợc bệnh Sau đó, tiến loại bỏ virus kỹ thuật nuôi cấy mô đƣợc ứng dụng rộng rãi nông nghiệp Nuôi cấy đỉnh phân sinh cho phép thu đƣợc bệnh khác nhƣ bệnh viroid (dạng virus-tác nhân gây bệnh chứa đoạn ngắn RNA), mycoplasma, vi khuẩn, nấm 7.2 Nguyên lý làm virus Danh từ làm virus nội dung công việc Đó việc phải giải phóng thực vật bị nhiễm virus khỏi virus Ở đề cập tới trồng nhân giống vô tính phƣơng thức nhân giống nguyên nhân truyền bệnh từ hệ sang hệ khác Vì vậy, biện pháp làm bệnh virus phải kết hợp với biện pháp trì tính bệnh Cả hai biện pháp nằm phạm vi phục tráng giống, ngƣời ta gọi biện pháp giữ bệnh Bên cạnh hai nhiệm vụ trì đặc tính giống tính đồng giống nhiệm vụ chủ yếu công tác phục tráng giống cung cấp đƣợc tập đoàn bố mẹ hạt giống virus Kinh nghiệm thực tế cho hay biện pháp phục tráng giống có hiệu biện pháp đƣợc thực cách triệt để có trách nhiệm Làm virus đƣợc coi mục tiêu công tác phục tráng giống Bên cạnh xử lý nhiệt xác định tính bệnh, phƣơng pháp để thu đƣợc virus bao gồm chủ yếu nuôi cấy đỉnh phân sinh Đƣơng nhiên kỹ thuật nuôi cấy đỉnh phân sinh đƣợc thực theo mục đích khác nên phức tạp tốn nhân giống vô tính Vì thế, ngƣời ta phân biệt rõ nuôi cấy đỉnh phân sinh công tác phục tráng giống nói chung làm virus nói riêng Mục đích công tác bảo vệ thực vật (trong nuôi cấy đỉnh phân sinh nuôi cấy mô) phân biệt rõ với công tác trì giống Trong công tác bảo vệ thực vật yêu cầu lớn làm virus, nhƣng thực tế điều hầu nhƣ đạt đƣợc Vì phải kết hợp nhiều biện pháp để đảm bảo kết Xử lý nhiệt, nuôi cấy đỉnh phân sinh xác định (thử) virus phải đƣợc thực theo chu trình kín Các nhà trì giống đòi hỏi phải có thể thực virus, để thông qua phƣơng pháp nhân in vitro nhân thành số lƣợng mà không bị tái nhiễm Các nhà nuôi cấy mô thực vật quan tâm đến phƣơng pháp nhân giống in vitro, mà lý việc làm virus trồng Vì hiệu kinh tế, ngƣời ta giới hạn việc nhân giống in vitro trồng mà chúng phƣơng pháp cổ điển để nhân nhanh giống làm virus không thực đƣợc Phƣơng pháp nhân giống in vitro loại trừ đƣợc nguy tái nhiễm tỏ ƣu việt phƣơng pháp cổ điển Tuy theo kinh nghiệm thực tiễn, trồng đƣợc nhân giống in vitro mang nhiều tác nhân gây bệnh Đa số trồng thƣơng mại (commercial crop plants), đặc biệt nhân giống vô tính chứa virus nội hấp (systemic virus), virus ảnh hƣởng xấu đến suất Vì vậy, việc sản xuất nguyên liệu thực vật virus gần virus cần thiết trƣớc chúng đƣợc nhân giống để đƣa thị trƣờng Ở nhiều loài, phƣơng thức cho hiệu cao xử lý nhiệt quan khác lúc sinh trƣởng mạnh Tuy nhiên, số virus phƣơng thức hoàn toàn không thích hợp phải sử dụng số phƣơng thức khác Phƣơng thức cho hiệu cao nuôi cấy đỉnh phân sinh, thƣờng kết hợp với xử lý hóa học xử lý nhiệt Các phƣơng pháp cho phép thu đƣợc cá thể virus mà nấm nhân tố gây bệnh khác Từ năm 1952, 1953 Morel Martin thành công việc loại trừ số virus khoai tây thƣợc dƣợc (Dahlia variabilis) cách nuôi cấy đỉnh phân sinh, điều đáng tiếc chồi không tạo rễ ngƣời ta phải ghép lên mầm khoẻ mạnh Tuy nhiên, sau sở kết Morel Martin ngƣời ta đƣa nhiều phƣơng pháp sản xuất trồng virus có khả tạo rễ nhiều loài thực vật khác dòng đƣợc sử dụng rộng rãi thị trƣờng Nuôi cấy đỉnh phân sinh nuôi cấy mẫu nhỏ chồi đỉnh lên môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp để chúng sinh trƣởng tạo hoàn chỉnh Phần mô thƣờng đƣợc dùng vòm phân sinh (meristem dome) cộng thêm cặp Tùy thuộc vào loài khác mà đỉnh phân sinh có chiều dài từ 0,1-0,5 mm, số tác giả yêu cầu nuôi cấy vòm phân sinh, nhiên số tác giả lại thu đƣợc virus từ đỉnh sinh trƣởng có chiều dài 0,5 mm Chồi đỉnh đỉnh sinh trƣởng sau cắt thƣờng phải khử trùng bề mặt, nhƣng giai đoạn không cần thiết Các kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng khác tùy thuộc loài Môi trƣờng agar thƣờng không thích hợp cho sinh trƣởng nuôi cấy, có "cầu giấy lọc" (filter paper bridge) với phần chân đƣợc nhúng môi trƣờng lỏng chứa ống nghiệm nuôi cấy thích hợp Chỉ cầu giấy lọc nhƣ rễ phát triển tốt, sẵn sàng để đƣa đất Rất nhiều loại môi trƣờng đƣợc dùng nuôi cấy đỉnh phân sinh nhƣng môi trƣờng chung thích hợp cho loài Môi trƣờng chứa nguyên tố đa lƣợng vi lƣợng Knop Berthlot (không có beryllium titanium), glucose 40 g/L, thiamine 105g/L myo- inositol 10-3 g/L pH 5,5 đƣợc dùng cho nhiều loài NAA nồng độ 10-3 mg/L cần thiết cho hình thành rễ ban đầu, nhƣng sau phải cấy chuyển sang môi trƣờng NAA Các số liệu điều kiện chiếu sáng nhiệt độ lý tƣởng đƣợc công bố ít, trƣớc Hollings (1968) đƣa nhiệt độ nuôi 20oC dƣới ánh sáng đèn huỳnh quang với thời gian chiếu sáng 22 giờ/ngày Thời gian để đỉnh phân sinh tạo chồi rễ từ vài tuần đến vài tháng tùy loài Hiện nay, ba biện pháp làm virus tỏ có hiệu lƣơng thực thực phẩm, xử lý nhiệt, nuôi cấy đỉnh phân sinh chọn lọc phƣơng pháp thử virus Mỗi biện pháp thu đƣợc kết định, nhƣng sử dụng cách tổng hợp ba biện pháp ngƣời ta thu đƣợc kết virus thực Mức độ hữu hiệu trình làm virus thực tiễn phụ thuộc vào yếu tố sau: - Khả xử lý nhiệt - Khả nuôi cấy đỉnh phân sinh - Phƣơng pháp thử virus có độ xác cao - Hệ số nhân giống vô tính cao - Trồng vật liệu bệnh ban đầu dƣới điều kiện cách ly tốt, tránh đƣợc tái nhiễm - Mức độ (diện tích) trồng trọt cho phép cung cấp đủ giống năm Những điều kiện đƣợc thực mức độ khác loài trồng khác Việc làm virus thay việc phân tích virus loài trồng, phân tích virus cần đƣợc thực trƣớc để từ mà tìm biện pháp thích hợp để bảo đảm trồng bệnh 7.3 Phương pháp làm virus 7.3.1 Các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus Không phải tất loài sau trình xử lý phối hợp nhiệt nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng virus, cần phải tiến phải xét nghiệm khoảng thời gian từ lúc tái sinh cho tái xét nghiệm phải từ đến tháng để thể virus tồn thực vật đạt đƣợc nồng độ cần thiết cho việc xét nghiệm đảm bảo độ xác Xét nghiệm virus khuôn khổ qui trình làm virus hoàn toàn khác trình phân tích virus trồng Đối với việc làm virus độ xác phƣơng pháp thử virus loài xét nghiệm mang ý nghĩa định cần đƣợc xét nghiệm theo nhiều phƣơng pháp khác cần ý tới phƣơng pháp xét nghiệm loài virus phổ biến có ý nghĩa kinh tế Đối với việc phân tích virus loài trồng ngƣời ta ý tới số lƣợng nhƣ phân loại chúng Độ nhạy cảm phƣơng pháp xét nghiệm có vai trò thứ yếu, sau số phƣơng pháp xét nghiệm virus đƣợc ứng dụng trồng trọt loài hoa: 7.3.1.1 Xét nghiệm thị Dùng dịch ép thực vật cần đƣợc xét nghiệm gây bệnh thị thích hợp dùng phƣơng pháp ghép chứng minh đƣợc bệnh virus Chỉ sau thực phƣơng pháp thử kết luận bệnh virus thực đảm bảo tính xác Phƣơng pháp thử thị đƣợc coi phƣơng pháp xác định phƣơng pháp nhạy cảm nhất, nhiên kết xét nghiệm phụ thuộc yếu tố khác Trong trƣờng hợp xét nghiệm hàng loạt công việc gây bệnh nhân tạo số lƣợng thị 10.000 đến 100.000 thời gian nhiều tháng độ xác phƣơng pháp giảm tiến phải thí nghiệm lặp lại Tuổi trồng nhƣ trạng thái sinh lý chúng mùa khác năm ảnh hƣởng nhiều đến tính xác phƣơng pháp xét nghiệm Vì lý đó, trƣờng hợp phải xét nghiệm hàng loạt phƣơng pháp dùng thị không đảm bảo phƣơng pháp miễn dịch Nếu xét nghiệm số lƣợng vừa phải ví dụ 1.000 cá thể phƣơng pháp dùng thị không cần thay phƣơng pháp khác công việc tiến hành thời vụ thích hợp Triệu chứng bệnh lý quan sát đƣợc sau 3-5 ngày song thông thƣờng sau hai tháng cần diện tích nhà kính rộng thời gian tƣơng đối dài chi phí cho xét nghiệm phƣơng pháp thị thƣờng đắt gấp ba lần so với phƣơng pháp huyết 7.3.1.2 Phương pháp huyết Tính đặc hiệu cao phƣơng pháp huyết đặc điểm quan trọng Ngoài ra, phƣơng pháp cho phép xác minh nhanh tồn virus phân loại chúng Kết thu đƣợc chậm sau 48 Chi phí cho xét nghiệm thấp, để chứng minh virus không cần có nhà kính trồng Phƣơng pháp huyết lại có độ xác cao, nhiên ngƣời ta chƣa sản xuất đƣợc kháng thể tất loài virus kể có huyết chƣa nói kết xét nghiệm hoàn toàn bảo đảm Vì với phƣơng pháp ngƣời ta xác minh đƣợc đặc tính gây bệnh loài virus thực vật chủ, có nhiều phƣơng pháp huyết khác đƣợc ứng dụng xét nghiệm hàng loạt hoa, có phƣơng pháp kết tủa giọt, xét nghiệm khuyếch tán agar gel hai chiều, xét nghiệm latex, xét nghiệm miễn dịch hƣớng tâm Mỗi phƣơng pháp có ƣu nhƣợc điểm đặc trƣng thông số độ xác thƣờng thu đƣợc với dãy nồng độ dịch ép từ thực vật virus phân lập Nhiều nghiên cứu cho thấy coi độ nhạy cảm thƣờng thu đƣợc pha loãng dịch ép nhiều lần hoàn toàn cho phép tin tƣởng vào kết xét nghiệm hàng loạt Vì cần chọn phƣơng pháp thích hợp cho xét nghiệm hàng loạt 7.3.1.3 Xét nghiệm kính hiển vi điện tử Kính hiển vi điện tử với hoàn chỉnh kỹ thuật sau ứng dụng phƣơng pháp nhúng đƣa vào xét nghiệm hàng loạt với số lƣợng mẫu vừa phải Khi chứng minh virus hình đũa hình sợi hoa phong lan hoa huệ kính hiển vi điện tử mang lại kết đáng tin cậy xét nghiệm hàng loạt Khó khăn chủ yếu chi phí cho thiết bị số lƣợng mẫu đƣợc xét nghiệm bị hạn chế, đồng thời loại virus đƣợc chứng minh loại hình đũa hình sợi Nếu virus tồn dạng cầu khó phát giống quan tử tế bào thực vật bình thƣờng 7.3.1.4 Xét nghiệm phương pháp PCR Hiện nay, phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến công nghệ sinh học có nhiều tiềm ứng dụng khuếch đại gen phản ứng trùng hợp polymerase (polymerase chain reaction) máy PCR Bằng cách thiết kế cặp mồi (primers) đặc hiệu gen gây bệnh virus, ngƣời ta khuếch đại gen (nếu có) từ DNA hệ gen thực vật đƣợc xử lý làm virus Nếu không xuất sản phẩm PCR đặc trƣng gen virus sau phân tích điện di agarose gel ta kết luận đƣợc làm bệnh ngƣợc lại, đƣợc xử lý mang virus Phƣơng pháp có độ nhạy cao, xác tốn phƣơng pháp nói Hiện nay, ngƣời ta sản xuất thiết bị phân tích PCR có độ nhạy cao gọi Realtime- PCR (PCR thời gian thực hay gọi PCR định lƣợng) cho phép phân tích với nồng độ virus vô thấp sinh vật bị nhiễm bệnh Kỹ thuật khắc phục đƣợc thời gian chờ đợi virus sinh sản tới nồng độ đủ cao để đảm bảo độ xác phƣơng pháp xét nghiệm Phƣơng pháp phân tích PCR đƣợc ứng dụng rộng rãi để chẩn đoán bệnh ngƣời nhƣ sốt xuất huyết Dengue, viêm gan B, viêm gan C, Chlamydia Và rõ ràng hữu ích việc ứng dụng để xét nghiệm thực vật bị nhiễm bệnh virus, vi khuẩn vi nấm 7.3.2 Xử lý nhiệt Quá trình xử lý nhiệt đƣợc coi nhƣ biện pháp làm bệnh có sở thực tiễn Những mía mắc bệnh cho suất cao sau ngâm nƣớc nóng, nghiên cứu vấn đề cho thấy dùng không khí nóng thuận lợi hầu hết trồng chúng chịu đựng tốt virus bị loại trừ Những hiểu biết trình làm bệnh thông qua xử lý nhiệt chƣa đầy đủ Ngƣời ta nêu giả thiết chung virus bị ức chế sinh sản nhiệt độ từ 34-40oC Quá trình sinh trƣởng thực vật xử lý nhiệt bị ức chế nhƣng phận vừa đƣợc sinh trƣởng thƣờng nghèo virus Kết xử lý nhiệt cho thấy thể thực vật đƣợc bảo tồn trạng thái tối thích thời gian dài nhiệt độ cao Tốt nên xử lý với chu kỳ quang 16 giờ/ngày Nhiệt độ phải đƣợc kiểm tra liên tục máy ghi tự động để đảm bảo cung cấp lƣợng nhiệt cần thiết, độ ẩm tƣơng đối phải đạt trung bình 50% Để đảm bảo phân bố nhiệt độ đồng phòng cần phải có quạt gió Mỗi loài hoa thƣờng mẫn cảm khác nhiệt độ cao xử lý, ví dụ: hoa cúc có khả chịu đựng nhiệt lớn: 38oC thời gian nửa năm hoa anh túc Hoa thủy tiên chịu đƣợc nhiệt độ 34oC thời gian từ 4-6 tuần Trong số trƣờng hợp, ngƣời ta phải phối hợp xử lý nhiệt với nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng vi ghép để loại trừ bệnh virus (Walkey, 1980; Kartha, 1986; Brown cs, 1988) Ƣu kỹ thuật sau qua xử lý nhiệt, mẫu nuôi cấy (hoặc vi ghép) thƣờng có kích thƣớc lớn Green Lo (1989) tạo giống khoai lang bệnh virus (bệnh vàng lụi) nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng kích thƣớc nhỏ (0,3 mm) nuôi cấy đỉnh chồi kích thƣớc lớn (1,0 - 2,5 cm) sau xử lý mẹ 370 C đến hai tháng (hình 9) Kết tƣơng tự nhận đƣợc sắn (Kartha Gambong, 1975) Cây mẹ phần mẹ đƣợc xử lý nhiệt độ cao cách tăng nhiệt cách từ từ đạt nhiệt độ tới hạn Nhiệt độ ức chế loại trừ virus khỏi vùng sinh trƣởng mạnh nhƣng không ảnh hƣởng đến sinh trƣởng Cây đƣợc lƣu giữ nhiệt độ tới hạn khoảng thời gian xác định, sau tách nuôi cấy chồi đỉnh sử dụng vi ghép Tỷ lệ bệnh mẫu phụ thuộc vào thời gian xử lý nhiệt độ tới hạn phụ thuộc vào khả chịu nhiệt giống (Converse Tanne, 1984; Lozoya-Saldana Merlin -Lara, 1984) Xử lý nhiệt có tác dụng tốt với đa số trƣờng hợp, song mô tế bào nhiễm virus nhƣng không bị loại trừ nhiệt độ cao chủng virus có khả sinh sản nhiệt độ (Dawson, 1976) Kết hợp xử lý nhiệt độ thấp với nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng đƣợc sử dụng thành công để loại trừ virus khỏi khoai tây hoa cúc (Paduch-Cichal Kryczynski, 1987) Bên cạnh đó, ngƣời ta sử dụng kết hợp số hoá chất ức chế virus nhƣ ribavirin, vidarabine có gốc adenine để tạo giống bệnh (Cassells Long, 1980; Stone, 1982) Các hoá chất chống virus thƣờng độc cho mô nên ứng dụng kỹ thuật hạn chế 7.3.3 Nuôi cấy đỉnh phân sinh Ngƣời ta chứng minh đƣợc nồng độ virus thực vật giảm dần phận gần đỉnh sinh trƣởng riêng đỉnh phân sinh hoàn toàn virus Thực tế đƣợc ứng dụng để làm virus cách tách đỉnh sinh trƣởng điều kiện vô trùng nuôi cấy chúng thành thực vật hoàn chỉnh Việc phân lập đỉnh phân sinh có kích thƣớc 0,01-0,1 mm khó khăn việc tái sinh thành hoàn chỉnh đạt đƣợc với tần số thấp (0,2-5%) ngƣời ta thƣờng phân lập chồi gọi đoạn đỉnh (shoot tips) có kích thƣớc từ 0,1- mm qua tính bệnh mẫu vật nuôi cấy bị giảm xuống nhƣng tốc độ tái sinh đƣợc tăng lên phƣơng pháp đƣợc ứng dụng thực tiễn Khái niệm virus thực vật nghĩa cần phải có đỉnh phân sinh hoàn toàn sạch, phần tử virus mà đƣợc hoàn thiện trình phân hóa tế bào chƣa phân hóa Vì vậy, thực tiễn phải giới hạn nồng độ virus khối lƣợng mô phân hóa mức định cần có thực vật virus Việc phối hợp xử lý nhiệt với nuôi cấy đỉnh phân sinh phƣơng pháp thuận lợi thông qua xử lý nhiệt trình sinh sản virus chồi bị ức chế mạnh thông qua trình phân hóa đỉnh phân sinh tính virus đƣợc đảm bảo với độ xác suất cao, không đề cập đến vấn đề chọn môi trƣờng thích hợp Thông thƣờng ngƣời ta xử dụng môi trƣờng Murashige-Skoog White Theo quan điểm lý thuyết kinh nghiệm thực tiễn ngƣời ta thu đƣợc kết khác phòng thí nghiệm, việc nuôi cấy đỉnh phân sinh đƣợc thực quan điểm sản xuất lớn cần phải ý mặt sau đây: (a) đảm bảo độ đồng giống tất khâu nuôi cấy, (b) đảm bảo tốc độ sinh trƣởng nhanh số lƣợng đỉnh phân sinh lớn đồng thời (c) kết đƣa đất cần phải đƣợc bảo đảm Các đỉnh sinh trƣởng sau phân lập cần đƣợc nuôi buồng nuôi hoàn toàn khống chế mặt khí hậu: nhiệt độ 22oC 16 chiếu sáng 1.000-3.000 lux Khi đƣa tái sinh từ đỉnh phân sinh đất cần phải phủ nilon để chúng thích nghi dần với độ ẩm không khí thấp Tốt nên trồng buồng nuôi cách ly có thông khí hoàn toàn rệp Từ tháng 10 đến tháng cần phải chiếu sáng thêm, nhƣng mùa hè lại phải che bớt ánh sáng 7.4 Kết thực tiễn sản xuất 7.4.1 Tạo giống bệnh 7.4.1.1 Cây khoai tây Khoai tây trồng châu Âu đƣợc nhân giống vô tính bị virus phá hoại nhiều Trong thời gian qua việc làm virus khoai tây đƣợc ứng dụng cách chậm chạp trình trì giống Ngƣời ta ý nhiều tới việc tạo giống bệnh qui trình thử virus trồng khu vực bệnh để tránh tái nhiễm thông qua loài rệp Qui trình đƣợc sử dụng chủ yếu giết thảo truyền bệnh vào củ khoai tây Qui trình nâng cao hiệu suất thông qua xử lý nhiệt nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Quá trình xử lý nhiệt 32 38oC thời gian ngày đến tuần sau nuôi cấy đỉnh phân sinh loại trừ đƣợc virus A, xoăn lá, X Y virus M S đƣợc giảm cách đáng kể Các ảnh hiển vi điện tử đỉnh sinh trƣởng khoai tây có độ lớn từ 80-100 µm cho thấy chúng chứa tiêu tới 12 thể virus X Tuy vậy, sau trình phân loại từ đỉnh phân sinh thu đƣợc tỷ lệ phần trăm định virus 7.4.1.2 Cây thức ăn gia súc Để sản xuất hạt giống trồng làm thức ăn gia súc, ví dụ cỏ ba cần phải có bố mẹ bệnh virus để tránh lây bệnh thông qua hạt giống đảm bảo thu đƣợc suất hạt cao Ngƣời ta nghiên cứu nhiều phƣơng pháp làm virus khác Xử lý lạnh nuôi chồi mang lại tốc độ sinh trƣởng cao, nhƣng virus phần, xử lý nhiệt kết hợp với nuôi cấy đỉnh phân sinh thu đƣợc phần lớn virus 7.4.1.3 Cây hoa bia Các loại bệnh virus hoa bia thƣờng làm giảm suất đáng kể Tiến hành chọn lọc mắt thƣờng, xử lý nhiệt nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, cải tiến dần tình trạng bệnh ngƣời ta giải phóng 66% khỏi virus hop-mosaic (HMV) latent nuôi cấy đỉnh phân sinh, sau làm virus prumis necrotic ringspot (PNRV) xử lý nhiệt thời gian 10 ngày 7.4.1.4 Cây rau Hầu hết loài rau trừ vài trƣờng hợp ngoại lệ đƣợc nhân giống hạt Truyền bệnh virus qua hạt vừa đƣợc chứng minh loài virus gây bệnh khảm xà lách đậu (đậu ăn trắng xanh), trồng cần phải chọn lọc làm giống thông qua biện pháp trồng trọt cách ly để tạo hạt giống virus Đối với loài virus gây bệnh rau khác trình lây lan thƣờng xảy học rệp lá, cần có biện pháp vệ sinh đồng ruộng phòng trừ tác nhân truyền bệnh Ở số rau nhân giống vô tính (nấm rơm, ) cần xử dụng phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh phân sinh xử lý nhiệt để giải phóng virus Đối với nấm rơm làm bệnh phƣơng pháp xử lý nhiệt thời gian gần ngƣời ta tạo đƣợc phƣơng pháp miễn dịch agar gel Ngoài ra, trồng dùng để sản xuất hạt chúng nhân giống vô tính qua nhiều năm, ví dụ nhƣ súp-lơ ngƣời ta cần phải có vật liệu bệnh virus ban đầu Thông qua nuôi cấy mô ngƣời ta tạo đƣợc vài trăm biện pháp thử virus thu đƣợc 3.220 bệnh 7.4.1.5 Cây ăn Cây ăn thƣờng bị virus phá hoại cách mạnh Các thể virus gây bệnh lan truyền nhân giống vô tính mà nhân giống hạt Ngoài ăn thƣờng lâu năm, luôn chịu tác động tác nhân truyền bệnh chúng dễ bị nhiễm bệnh Việc chứng minh virus nhiễm ăn gặp nhiều khó khăn, thời gian ủ bệnh dài khả chống chịu cao gây nhiều khó khăn cho việc làm virus ăn quả, cần tiến hành công tác chống virus gây bệnh ăn cách liên tục Vì việc xử lý nhiệt thân gỗ việc nuôi cấy đỉnh phân sinh chúng khó khăn nhiều so với loài thân thảo từ lâu ngƣời ta xử dụng phƣơng pháp thử để tìm vật liệu bệnh ban đầu Quá trình xử lý nhiệt ăn đến thƣờng đƣợc tiến hành chủ yếu đoạn cành mà mắt chúng đƣợc xử dụng để ghép sau Theo tài liệu tổng hợp Nyland Coheen (1969) vấn đề xử lý nhiệt thân gỗ loại trừ đƣợc bốn loài virus anh đào, loài virus mận, bảy loài virus táo, hai virus nho đất (nho tây), sáu virus đào hai virus phúc bồn tử Thành công xử lý nhiệt ăn không đạt đƣợc 100% Ở đối tƣợng lại chí số loài tới bốn virus không bị hoạt tính xử lý nhiệt Nuôi cấy đỉnh phân sinh ăn tới đƣợc sử dụng đối tƣợng sau: dâu chua, dâu chua đỏ, dâu chua đen táo Thực tiễn cho thấy ăn (cây thân gỗ) việc nuôi cấy đỉnh phân sinh gặp khó khăn khả tái sinh chúng yếu so với thân thảo Các thí nghiệm năm tới chắn nêu kết 7.4.1.6 Cây hoa Ở đối tƣợng hoa gặp nhân giống vô tính thƣờng bị bệnh virus bƣớc đầu ngƣời ta tập trung làm bệnh hoa có ý nghĩa kinh tế quan trọng (ví dụ: hoa cúc, hoa anh túc, hoa thủy tiên ) Hiện nay, ngƣời ta bắt đầu nuôi cấy loài hoa khác Xử lý nhiệt kết hợp với nuôi cấy đỉnh phân sinh đƣợc sử dụng để làm virus hoa anh túc hoa cúc Việc ứng dụng thực tiễn xí nghiệp chuyên sản xuất hoa trở thành quen thuộc năm gần Ở Hà lan, có sở tổ chức trồng hoa chuyên nhận loài vật liệu để làm virus Ở Anh, tổ chức quan tƣơng tự nhƣ Ở Đông Đức (cũ) có xí nghiệp ƣơm thành phố Dresden nhân loài hoa nhƣ cúc, hoa anh túc, hoa thủy tiên để xử lý nhiệt làm virus Các điều kiện để làm virus hoa thƣờng đƣợc thực dễ dàng, loài trồng việc làm virus thƣờng có kết Vì dƣới số biện pháp quan trọng nhƣ xử lý nhiệt, nuôi cấy đỉnh phân sinh xét nghiệm virus đƣợc trình bày đối tƣợng hoa 7.4.2 Kiểm định tính bệnh virus Nếu qui trình làm virus áp dụng đƣợc kỹ thuật xử lý nhiệt nuôi cấy đỉnh phân sinh việc xét nghiệm virus biện pháp kiểm tra cuối trình làm virus, nhƣ có mâu thuẩn với mục đích làm virus ngƣời ta sử dụng 50% tập đoàn trồng bị bệnh làm vật liệu ban đầu coi chúng có phẩm chất tốt, mặt thông qua cải tiến phƣơng pháp xét nghiệm đƣa độ xác phƣơng pháp lên cao ngƣời ta phải tính để số lƣợng virus bảo tồn nồng độ tối thiểu mà phƣơng pháp xét nghiệm không chứng minh đƣợc Vì vậy, theo kinh nghiệm thực tế cần tiến phải xét nghiệm theo phƣơng thức sau: Đƣa vật liệu ban đầu vào xử lý nhiệt thời gian dài để làm virus mẫn cảm nhiệt độ sau dùng phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh phân sinh sau từ 4-6 tháng kể từ ngày nuôi cấy bắt đầu xét nghiệm thời gian đủ virus bảo tồn đủ nồng độ cho phép chứng minh đƣợc Những thể đƣợc xác định bệnh nguồn vật liệu ban đầu để cung cấp mẹ cho sản xuất Khoảng 5-10% số thể đƣợc tách riêng thành tập đoàn nhân mạnh khoẻ (health nucleus clone) để nhà tạo giống cải tiến tính chất theo ý muốn độ chủng (đồng nhất) giống Ngƣời ta kiểm tra thể tất phƣơng pháp xét nghiệm virus có Với hoa nelken ngƣời ta kiểm tra phƣơng pháp huyết loài virus caruation woltle, caruation latent, caruation ringspot xét nghiệm thị Cheuopodium quinoa Vaccara pyramydata nhằm loại trừ virus sinh sản biểu nhận biết đƣợc Những xác minh đƣợc khoẻ đƣợc tiến hành ƣơm cành sau đƣa vào xử lý nhiệt, nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng cuối kiểm tra xét nghiệm virus Đó toàn qui trình làm virus khép kín Ngoài phƣơng pháp trình xét nghiệm kết làm virus phụ thuộc nhiều vào trạng thái cần đƣợc xét nghiệm, nghĩa nồng độ virus có phận khác nhau, tuổi khác nhau, mùa khác Muốn bảo đảm xét nghiệm hàng loạt xác cần phải có nhà nuôi Nhiệt độ ổn định, tƣơng quan ánh sáng ổn định xét nghiệm phải độ tuổi định với nồng độ virus thích hợp cho xét nghiệm, cho phép thu đƣợc kết xét nghiệm xác 7.4.3 Duy trì tính bệnh virus Vấn đề có tầm quan trọng đáng kể vấn đề định cuối thực tiễn nông nghiệp liên quan tới thời gian trì đƣợc trồng virus Đối với thực tiễn sản xuất đƣợc coi bị bệnh xuất giảm xuống Hiện nay, sản xuất nông nghiệp trồng ăn vấn đề chƣa đƣợc giải thỏa đáng Việc sản xuất dòng Elite qui trình sản xuất khoai tây giống kéo dài nhiều năm, nguy tái nhiễm thông qua yếu tố truyền bệnh tồn phụ thuộc vào điều kiện khí hậu Trong ngành trồng hoa tình hình thuận lợi nhiều Hiện CHLB Đức với tập đoàn nhân (nucleus clone) hoa cúc nelken ngƣời ta trì đƣợc tính bệnh năm rƣỡi, cần năm thay đƣợc hoàn toàn tập đoàn giống Vì vậy, vấn đề nêu đƣợc trả lời tóm tắt nhƣ sau: khối lƣợng chất lƣợng vật liệu có sẵn ban đầu xác định khả sản xuất vụ không bị giảm suất bệnh virus Giảm suất xuất nguồn giống virus bị nhiễm sớm Đối với khoai tây nhiễm chủ yếu yếu tố truyền bệnh sống điều kiện tự nhiên hoa tái nhiễm xảy đƣa giống bệnh vào xí nghiệp sản xuất bị nhiễm sẵn Có thể nói ngành trồng hoa qui trình làm virus đƣợc coi nhƣ mô hình phƣơng pháp Cũng qua nhận thấy phƣơng pháp làm virus biện pháp chữa bệnh lần mà trình phức tạp trồng bị bệnh từ trƣớc Ngƣời ta so sánh bệnh virus thực vật nhân giống vô tính nhƣ bệnh xã hội ngƣời chữa thuốc men mà phải thay đổi thói quen sinh hoạt Ở xí nghiệp công nghiệp sản xuất trồng gọi tiến khoa học kỹ thuật loại stress mà từ cúc mẹ năm cho 100 ƣơm, trƣớc thu đƣợc 15 ƣơm cần 11 ngày để rễ trƣớc cần 21 ngày Để tạo điều kiện cho xí nghiệp sản xuất công nghiệp giống thu đƣợc thành tích to lớn việc đầu tƣ hàng năm cho công tác chống bệnh virus trở nên cần thiết Trong trƣờng hợp nhân giống vô tính in vitro việc làm virus phải đƣợc coi điều kiện trƣớc tiên CÂU HỎI ÔN TẬP Nêu tầm quan trọng phƣơng pháp làm virus thong qua nuôi cấy mô Trình bày nguyên lý làm virus cho thực vật So sánh phƣơng pháp chuẩn đoán bệnh virus thực vật Trình bày kỹ thuật nuôi cấy đỉnh phân sinh Khái quát kết thực tiễn sản xuất phƣơng pháp tạo giống virus nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng TÀI LIỆU THAM KHẢO 1) Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phƣơng Thảo, (2003) Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp Nhà xuất Nông nghiệp 2) Lê Văn Hoàng Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, Nxb Đà nẵng 3) Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật công tác cải tiến giống trồng Nhà xuất Nông nghiệp 4) Nguyễn Văn Uyển, (1996) Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật NXB Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh [...]... phát triển phôi Giai đoạn trƣớc khi hình thành tế bào phôi soma đƣợc gọi là tế bào tiền phôi Tế bào tiền phôi phân chia để hệ thống tế bào phôi trực tiếp gọi là sự phát sinh tế bào phôi trực tiếp Có nhiều tế bào phát sinh tế bào phôi không cần chất kích thích sinh trƣởng, nhiều tế bào cần Auxin để tiến hành phân bào trƣớc khi phát sinh tế bào phôi Có nhiều tế bào hình thành phôi từ mô sẹo, trong trƣờng... những mô trƣởng thành Khi mô có chứa tế bào phôi, kích thích sự phân chia tế bào trong giai đoạn này là cần thiết để duy trì tình trạng phôi và hình thành tế bào phôi soma Tế bào sinh phôi có thể hệ thống ở những tế bào bình thƣờng đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có auxin và có thể không có cytokinin Lƣợng cytokinin có trong tế bào cao thƣờng phát sinh phôi thấp Khi một tế bào phôi đƣợc thu nhận, sự có mặt... đoạn 1 Nhƣ vậy tiến trình hình thành những cụm tế bào giai đoạn 1 từ những tế bào đơn rất quan trọng để phân tích tiến trình phát sinh phôi Một hệ thống đƣợc yêu cầu là có tần suất phát sinh phôi cao từ những tế bào đơn Những tế bào đơn có kích thƣớc nhỏ, tròn và tế bào chất đậm đặc đƣợc gọi là những tế bào giai đoạn 0, thu nhận đƣợc qua lọc, rây Những tế bào giai đoạn 0 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng... tế bào tiền phôi PEDC ( Preembryogenic determined cell) và tế bào phát sinh phôi IEDC ( induced embryogenic determined cell) dùng để phân loại mô, nhƣng thực chất là 1 quá trình tiếp nối nhau, kết thúc sự phát triển là sự hệ thống những tế bào phôi (EC- Embryogenic cell) Những tế bào ở những mô có quan hệ với sự sinh sản nhƣ hạt phấn, chồi mầm có khả năng hệ thống tế bào phôi dễ dàng hơn những tế bào. .. sát toàn bộ tiến trình biệt hoá của tế bào cũng nhƣ cơ chế thể hiện tính toàn năng của tế bào thực vật 2.1.2 Thiết lập hệ thống phát sinh phôi đồng nhất và hiệu suất cao Một hệ thống thích hợp đã đƣợc thiết lập cho mục đích nghiên cứu trên qua việc dùng tế bào dung dịch huyền phù cà rốt Những cụm tế bào phôi đƣợc chọn lọc sau khi lọc qua lƣới để loại bỏ những cụm tế bào to và đƣợc ly tâm trong dung dịch... giống Citrus, ngoài phôi hữu tính còn có các phôi không sinh ra từ tế bào túi phôi mà từ những tế bào soma của phôi tâm (nucellus) là lớp tế bào bao quanh túi phôi của hạt non Sau khi tế bào trứng nằm trong túi phôi đƣợc thụ tinh và phân chia lần thứ nhất, ở phôi tâm có một số tế bào lớn với nhân to và nguyên sinh chất đậm đặc Một số tế bào này bắt đầu phân chia, tạo khối nhỏ rồi dần dần hình thành phôi... quá trình tạo mô sẹo Có 2 bƣớc dẫn đến sự hệ thống phôi: 1 Sự biệt hoá của tế bào có khả năng phát sinh phôi 2 Sự phát triển của những tế bào phôi mới hệ thống Nhƣ vậy có hai môi trƣờng cần thiết cho nuôi cấy phôi: 1 Môi trƣờng cần cho sự phát sinh tế bào phôi 2 Môi trƣờng cần cho sự phát triển những tế bào này thành những tế bào có khả năng phát sinh phôi Bƣớc 1 cần có mặt auxin và bƣớc 2 phải giảm... những cụm tế bào có tần suất khoảng 90% phát sinh phôi Hệ thống này cho thấy thích hợp để nghiên cứu tiến trình phát sinh phôi từ những cụm tế bào có khả năng phát sinh phôi, đƣợc gọi là những cụm tế bào giai đoạn 1 Tuy nhiên từ những cụm tế bào này có thể biệt hoá tạo phôi trong môi trƣờng có auxin và không có chất nào khác, phát sinh phôi có thể ghi nhận đƣợc thông qua xác định những cụm tế bào có khả... nucellar phát triển bằng phân bào nguyên phân bình thƣờng của tế bào nucellus, không có sự tham gia của tế bào sinh dục và không xảy ra phân bào giảm nhiễm nhƣ tế bào mẹ Vì vậy, những cây con phát triển từ phôi nucellar thƣờng giống hệt với cây mẹ về cấu trúc di truyền Sự sinh sản vô tính này có ý nghĩa quan trọng đối với tiến hoá, chọn và tạo giống cây có múi 2.5.2 Nuôi cấy tế bào nucellar và sự hình thành... Tạo mô sẹo phôi hoá (somatic embryogenic callus) - Nuôi và nhân cụm tế bào dịch lỏng (Suspension - huyền phù tế bào) trong bình tam giác hoặc bioreactor - Lọc lấy các cụm tế bào phôi hoá nhỏ hay cụm tế bào tiền phôi, có kích thƣớc đồng nhất bằng lƣới lọc (Lọc bỏ các cụm quá lớn hoặc quá nhỏ bằng các mắt lƣới khác nhau) - Đƣa các cụm tế bào vào môi trƣờng chín của phôi (Phôi phát triển, tích luỹ các chất