tính tan của protein

Ti liu chia s tan ti: wWw.SinhHoc.edu.vn Tính protein Tính tan protein chịu ảnh hưởng mạnh pH nồng độ muối dung dịch Protein tan pI tương tác tĩnh điện phân tử với dung môi thấp Solubility ảnh hưởng pH pI pH ảnh hưởng nồng độ muối Solubility Salting in tượng tăng độ Salting in Salting out hoà tan tăng nồng độ muối; Salting out tượng giảm độ hoà tan tăng nồng độ muối; Salt Kết tủa muối ammon phương pháp concentration thông dụng Ti dựa liu salting out chiatượng s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn Tinh chế Protein Những phương pháp thường dùng tinh chế protein: Sắc ký lọc gel; Sắc ký trao đổi ion; Sắc ký lực; Sắc ký tương tác kỵ nước; Xác định độ kích thước protein điện di biến tính gel polyacrylamide (SDS- PAGE) Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn Sắc ký lọc gel (Rây phân tử) Sự phân tách protein dựa kích thước phân tử: Các hạt gel cấu tạo từ polymer dextran (sephadex), agarose (Sepharose), polyacrylamide (Sephacryl BioGel P) Mỗi hạt gel có mắt lưới to hay nhỏ phụ thuộc vào loạị gel Trong trình sắc ký, chất phân tử lớn di chuyển pha lỏng phía hạt gel, nhanh chóng rút khỏi cột Trong đó, chất có kích thước nhỏ chui qua mắt lay vào bên hạt gel với mức độ khác tuỳ theo khối lượng hình dạng chúng, khỏi cột gel chậm Phân tử nhỏ phải len lách nhiều hạt gel, chậm Do coi việc tách chất gel Sephadex trình sàng lọc (rây) phân tử Các phân tử đươc phân bố thụ động thể tích kẽ (thể tích bên hạt gel- V0) thể tích bên hạt gel (Vi), phụ thuộc vào khả chui vào bên hạt gel chúng Nếu tổng thể tích cột Vt, thì: Vt = Vo + Vi Độ hấp thụ UV Protein lớn Protein nhỏ V0 Vi Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn Vt Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn Sắc ký trao đổi ion Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography) sử dụng tính chất tĩnh điện protein cần tách Trong trính sắc ký, chất phân tử lớn tích điện cố định qua liên kết cộng hóa trị lên chất giá không tan cellulose polyacrylamide Protein với điện tích trái dấu gắn với giá thể protein khác bị rửa trôi khỏi cột Sau rửa hết tạp chất, protein gắn với giá thể chiết rút lực ion cao (muối nồng độ cao), tác nhân khác thay đổi pH protein B protein B Protein A Na+ SOCM3+ ProteinA Protein B Độ hấp thụ UV Protein B Nồng độ muối tăng Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn sắc ký trao đổi ion Các đặc tính tĩnh điện protein xác định loại nhựa trao đổi ion có tác dụng phù hợp Về nguyên tắc là: Protein tích điện dương dung dịch có pH < pI, gắn với nhựa tích điện âm, hay gọi cationit (cation exchanger); Protein tích điện âm dung dịch có pH > pI, gắn với nhựa tích điện dương, hay gọi anionit (anion exchanger) Lưu ý thực tế bề mặt protein có vùng có điện tích khác với tổng điện tích toàn phân tử không phân cực Bề mặt ++ - protein + không phân cực Ví dụ cationit gồm: carboxymethyl (CM) sulfopropyl (SP) Ví dụ anionit gồm: diethylaminoethyl (DEAE), quaternary amine (QAE) Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn Sắc ký áI lực Sắc ký lực (affinity chromatography) sử dụng lực cấu tử gắn (ligand) protein cần tách Cấu tử gắn thường cố định qua liên kết cộng hoá trị giá thể không tan cellulose polyacrylamide Khi tiến hành sắc ký, protein cần tách gắn với giá thể protein khác rửa trôi khỏi cột Sau rửa tạp chất, protein cần tách phản hấp phụ chất cạnh tranh cấu tử tự do, hay chất có khả phá vỡ tương tác Trong số ví dụ tương tác protein- cấu tử kể đến tương tác kháng nguyên- kháng thể, hay tương tác Ni+ nhãn poly-histidine protein ligand Độ hấp thụ UV Nồng độ cấu tử tự Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn Tương tác kỵ nước Sắc ký tương tác kỵ nước (hydrophobic interaction chromatography) dựa mảng kỵ nước protein tương tác chúng với nhựa kỵ nước Ví dụ, phenyl sepharose loại nhựa kỵ nước mạnh thu gắn cộng hoá trị nhóm phenyl với giá thể agarose Trong trình sắc ký, phân tử protein gắn với nhân phenyl nhờ tương tác kỵ nước Những tương tác mạnh dung dịch muối nồng độ cao Do quy trình thông thường phương pháp trước tiên gắn protein điều kiện nồng độ muối cao, sau chiết rút protein gắn gradient muối ngược từ nồng cao xuống thấp không phân cực Bề mặt +- protein ++ -không phân cực Độ hấp thụ UV Nồng độ muối giảm Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn Sắc ký giấy Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn ... wWw.SinhHoc.edu.vn Tinh chế Protein Những phương pháp thường dùng tinh chế protein: Sắc ký lọc gel; Sắc ký trao đổi ion; Sắc ký lực; Sắc ký tương tác kỵ nước; Xác định độ kích thước protein điện... với giá thể protein khác bị rửa trôi khỏi cột Sau rửa hết tạp chất, protein gắn với giá thể chiết rút lực ion cao (muối nồng độ cao), tác nhân khác thay đổi pH protein B protein B Protein A Na+... SOCM3+ ProteinA Protein B Độ hấp thụ UV Protein B Nồng độ muối tăng Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn Ti liu chia s ti: wWw.SinhHoc.edu.vn sắc ký trao đổi ion Các đặc tính tĩnh điện protein