CÔNG NHỆ sản XUẤT INSUALIN

đề tài sx insualin dfg ght gfh đggvsb ergh hg hgyt yhr bnh gbnh nh bb vv vb bvf ghf gfb bvg vbg gv vbb b fgd fgd gf bvv gfh fgh hfh fgg grggggggggggggggggg ge g bb b bvv vvc vfg v bnhhg ht hf b hth hrth hrth hyu iulk kng b bbt tbhg uniu y6uj eryru uutjhe ytiuhhh iyioo; yut tikj il jhyu ujyui k jui ngj

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BẮC GIANG KHOA NÔNG HỌC ĐỀ TÀI SẢN XUẤT INSUALIN CÔNG NGHỆ dna tái tổ hợp Nhóm: Giảng viên hướng dẫn: Th.s Trần thị Hiền Sinh viên thực : Tráng Văn Trường Vần Đình Thanh Chảo Trung Sơn Bùi Quốc Hùng Thào Seo Lử Nguyễn Thị Lan Anh BẮC GIANG: 20/3/2016 NỘI DUNG CHÍNH I KHÁI QUÁT CHUNG VỀ INSUALIN VÀ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG 1.1 bệnh tiểu đường 1.2 Insulin II Cơ sở khoa học công nghệ sản xuất nsulin 2.1 cấu trúc phân tử insualin 2.2 Tổng hợp insulin thể III Công nghệ sản xuất insulin 3.1.Sản xuất insulin tách chiết từ động vật 3.2 sản xuất insualin từ thực vật 3.3 sản xuất insulin vi sinh vật 3.3.1 Khái quát công nghệ DNA tái tổ hợp Best Banting- người chiết suất insulin năm 1921 Collip MacLeod- người dùng insulin chiết suất để điều trị bệnh tiểu đường type cho Leonard Thomson Vậy bạn biết bệnh tiểu đường ? I KHÁI QUÁT CHUNG VỀ INSUALIN VÀ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG 1.1 bệnh tiểu đường + Bệnh đái tháo đường, gọi Bệnh tiểu đường, bệnh rối loạn chuyển hóa cacbohydrat hoóc môn insulin tụy bị thiếu hay giảm tác động thể, biểu mức đường máu cao + Bệnh tiểu đường nguyên nhân nhiều bệnh hiểm nghèo, điển hình bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy thận, liệt dương, hoại thư, v.v Bệnh tiểu đường bệnh chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố Tiểu đường gây tác động phức tạp gene yếu tố môi trường, từ dẫn đến bất bình thường trình điều hoà lượng Glucose thể liên quan tới vấn đề hormon Insulin Tiểu đường có loại: loại 1: tiểu đường phụ thuộc insulin hay tiểu đường người trẻ loại 2: đường không phụ thuộc insulin hay tiểu đường người trưởng thành Xuất phát từ vai trò to lớn insulin, nhu cầu sử dụng insulin điều trị bệnh tiểu đường cao Tính năm 2012, nhu cầu insulin dùng trị bệnh tiểu đường ước tính khoảng 4.000 – 5.000 kg dự kiến đến năm 2018 16.000 kg Nhu cầu insulin giới vượt qua số vài tấn/năm Do đó, nguồn cung cấp insulin cho điều trị bệnh tiểu đường thiếu + Số người tử vong giới bệnh tiểu đường liên tục gia tăng năm gần Điều đòi hỏi phải tìm hướng tiếp cận cho việc ngăn ngừa điều trị bệnh 1.2 Insulin Insulin hormon tạo tế bào beta đảo Langerhans tuyến tuỵ Đây hormon quan trọng cho trình lưu trữ, sử dụng đường, acid amin acid béo trì lượng đường máu Cấu trúc không gian cuả phân tử insualin Sự đời insulin Năm 1922, Fred Banting Charles Best thuộc Đại học Tổng hợp Toronto (Canada) thông báo họ tìm Insulin ứng dụng thành công chất điều trị bệnh tiểu đường người Vào thời điểm đó, người bệnh tiểu đường chưa có biện pháp điều trị hiệu Bệnh nhân nhanh chóng trở thành xương di động thường chết sớm bị sút cân nghiêm trọng Banting Best cắt bỏ tuyến tuỵ chó hậu chúng bị tiểu đường Họ cố gắng tinh chế loại hormon hoá học từ tuỵ chiết xuất nhiều thành phần từ đảo Langerhan Sau đó, chất tiêm vào chó bị bệnh tiểu đường để thử nghiệm Và nhận thấy bệnh tiểu Đường bị đẩy lùi F.S.Banting C.L.Best thử nghệm insualin chó (1922) + Một đội ngũ nhà khoa học phối hợp nghiên cứu tạo tinh chất chiết xuất từ tiểu đảo Langerhan, đảm bảo độ tinh khiết để thử nghiệm người bệnh + Vào tháng năm 1922, Leonard Thompson, 14 tuổi, điều trị thành công bệnh viện Toronto tinh chất gọi Insulin Năm 1928, Oskar Wintersteiner chứng minh insulin protein • • • Hỗn hợp tinh có insulin • B8 B7 B6 B5 B1 Sàng lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp B2 Nuôi cấy tế bào tái tổ hợp để thu sản phẩm B3 Tiền tinh B4 Hoạt hoá • • Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn với dung dịch ion Ca+ tạo lỗ xung điện proinsulin người, sau phân cắt để tạo thành insulin hoàn chỉnh • Tách thiết kế plasmit tái tổ hợp Phương pháp 1: Tạo chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học tạo tiền chất chuỗi đơn Bước 1: Chuẩn bị gen cần tách dòng Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng sinh học phân tử tách gen mã hoá proinsulin người nhiễm sắc thể số 11 + Tách mRNA gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ người Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen, loại bỏ protein Do hầu hết mRNA người có đuôi polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với đuôi polyA + Sử dụng sắc kí lực với polyT giữ lại mRNA cần thiết cho trình dịch mã; lại loại bỏ DNA RNA khác +Cắt bỏ cầu nối A - T thu mRNA Tách mRNA gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ người Bước 2: Tách thiết kế plasmit tái tổ hợp + Cắt gen mã hoá proinsulin plasmit loại enzym giới hạn Nối DNA ligase phageT4 Trong thành phần vector biểu phải có promoter mạnh giúp gen biểu vi khuẩn + Thiết kế trình tự mã hoá cho protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin tế bào chất Nếu sử dụng mRNA tách từ tiến hành sau: - Sao mRNA tinh khiết thành DNA (cDNA) nhờ enzym phiên mã ngược nhờ dNTP (trong phản ứng RT - PCR) - Cài đoạn cDNA mã hoá insulin hoàn chỉnh vào plasmit đứng sau promoter mạnh Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli Bước 3: Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn với dung dịch ion Ca+ tạo lỗ xung điện cô lập DNA plasmid DNA người cắt hai mẫu DNA với enzyme hạn chế tương tự trộn DNA: chúng tham gia cách ghép nối sở sản phẩm plasmid tái tổ hợp nhiều plasmid không tái tổ hợp Đưa DNA vào tế bào vi khuẩn có đột biến gen lacZ Tách biến nạp Plasmic tái tổ hợp vào E.Coli Bước 4: Sàng lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp • Sau trình biến nạp, cần chọn lọc dòng vi khuẩn mang gen mong muốn Qúa trình chọn lọc phụ thuộc vào quy trình gen đánh dấu vector sử dụng • Thông thường sử dụng kháng sinh Ampixilin Tetraxilin để chọn lọc Sau kiểm tra dòng chọn lọc theo nhiều cách khác cách giải đoạn trình tự nucleotic đoạn gen cài vào vector tái tổ hợp so sánh với trình tự gốc Bước 5: Nuôi cấy tế bào tái tổ hợp để thu sản phẩm Các vi khuẩn chuyển gen sau đưa vào nồi lên men Nuôi chúng nồi lên men với điều kiện tối ưu Sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục, theo chất dinh dưỡng liên tục bổ sung để đảm bảo tăng trưởng vi khuẩn theo hàm mũ Cứ 20 phút lại có hàng triệu vi khuẩ nhân lên qua nguyên phân Như vậy, sau thời gian ngắn, sinh khối tăng Nồi lên men Bước 6: Tiền tinh + Sau lên men cần tách tế bào khử trùng nhiệt + Dùng enzym lizozyme phá vỡ màng tế bào, sau dùng hỗn hợp chất tẩy rửa để tách lớp màng lipit + Proinsulin tách khỏi mảnh vỡ tế bào phương pháp li tâm lọc Bước 7: Hoạt hoá + Do hệ thống E.coli có khả biểu gen insulin khả hoạt hoá insulin + Hoạt hoá proinsulin invitro cách xử lý dung dịch đệm, giúp đạt cấu trúc bậc 4, sau dùng enzym đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin Khi sản phẩm thu có hoạt tính cần thiết Bước 8: Hỗn hợp tinh có insulin + Bằng phương pháp sắc ký, tách phương pháp miễn dịch gắn enzym + Độ tinh insulin đánh giá qua mỗi giai đoạn trung gian trình sản xuất nhờ phòng thí nghiệm chuyên hoá Cuối insulin tinh thể hoá Các tinh thể insulin Phương pháp 2: Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A B + Phương pháp tránh việc sản xuất enzim đặc hiệu cần thiết để biến proinsulin thành insulin + Nhà sản xuất cần hai gen nhỏ đẻ sản xuất hai chuỗi A B Xác định trình tự DNA để qua tổng hợp tách hai dòng gen + Mỗi DNA chèn vào plasmit Sau sản xuất tương tự sản xuất proinsulin + Cuối hai chuỗi A B trộn với hình thành cầu nối đisulfua qua phản ứng tái oxi hoá khử nhờ chất oxi hoá định Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A chuỗi B riêng biệt Tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A B Tạo số lượng lớn Insulin tạo gần hoàn chỉnh với cấu trúc Insulin thời gian ngắn Insulin người Năng suất cao Qt tách chiết: dễ thao tác kĩ thuật vàchuẩn hóa Ưu phương phòng tno pháp Nguồn nguyên liệu dễ tìm ,không nguy hại đến môi trường Ít tốn chi phí Giá thành rẻ Các phương pháp sản xuất khác [...]... nghĩa của sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để sản xuất insulin Sản xuất Insulin bằng công nghệ tái tổ hợp là một bước nhảy vọt trong việc chữa trị bệnh tiểu đường Ngoài ra một ý nghĩa khá quan trong khi sử dụng công nghệ này để sản xuất Insulin đó là: + hiệu quả kinh tế + khi sử dụng công nghệ này, giá thành sản phẩm hạ khá nhiều mà chất lượng sản phẩm vẫn bảo đảm chính là nhờ ý nghĩa sản xuất sinh khối... lớn với quy mô công nghiệp 3.3 SẢN XUẤT INSSULIN BẰNG VI SINH VẬT * QUY TRÌNH SỬ DỤNG CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP ĐỂ SẢN XUẤT INSULIN: 3.3.1 Khái quát về công nghệ DNA tái tổ hợp: Kỹ thuật DNA tái tổ hợp là tập hợp nhiều kỹ thuật để tạo ra một gen hoặc cả hệ gen; cải biến cấu trúc của gen, nhằm tạo ra các gen mới rồi chuyển chúng vào trong tế bào, cơ thể chủ nhằm mục đích sản xuất các sản phẩm (protein,... chuyển thành Glucose ở gan Gia tăng tuần hoàn Glucagon Sơ đồ biểu hiện sự điều hòa hàm lượng glucose máu III Công nghệ sản xuất insulin Từ thực vật Sản xuất Insulin Từ động vật Từ vi sinh vật 3.1 sản xuất insualin từ thực vật Giáo sư Henry Daniell (ĐH Central Florida – Hoa Kì) Hoa Rum  Sản xuất Insulin trị bệnh tiểu đường từ hoa Rum: Các nhà khoa học ĐH Calgary đã cấy một gen Insulin nhân tạo vào... Trường Đại học Central Florida, và các cộng sự (hoa kỳ) Sản xuất insulin từ tế bào gốc để trị bệnh tiểu đường • Những tế bào gốc từ dây rốn có khả năng sản xuất một hợp chất có tên là C-peptide (một chất protein tiền thân của insulin và chỉ hiện diện khi tế bào sản xuất ra insulin) • Sự hiện diện C-pep  đã có một lượng insulin nhất định được sản xuất bởi tế bào gốc được dùng thay thế cho tế bào tụy...Một số insualin trên thị trường n ả s ệ h g n g n ô c a ủ c c ọ h a o h k ở s II Cơ n i l u s n I t ấ xu 2.1 cấu trúc phân tử insualin o Insulin người là Bao Chuỗi Chuỗi một polypeptide gồm: A 21 B acid 30 amin acid amin Có một cầu nối disulfur trong chuỗi A và 2 cầu nối disufur nối giữa hai chuỗi A và B Công thức C257H383N65O77S6 Trọng lượng phân tử: 5808 Cấu trúc phân tử insualin hóa học:... vào tế bào nhận với gia tốc lớn BƯỚC 4: Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện của gen + Việc chọn lọc đúng dòng tế bào như ý không đơn giản và tốn nhiều công sức Khi xác nhận DNA tái tổ hợp đã xâm nhập vào tế bào và mang đúng gen cần thiết thì chúng được sinh sản để tạo dòng và tạo điều kiện cho gen biểu hiện +Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmit tái tổ hợp: sau khi biến nạp DNA vào tế bào nhận, tạo nhiều... bào tụy tạng đã hư hại hoặc bị phá hủy Các nhà khoa học Anh và Mỹ cho biết họ đã SX được insulin từ tế bào gốc lấy từ dây rốn trẻ sơ sinh để điều trị bệnh tiểu đường (nguồn Ảnh: www.neonet.ch) 3.2 Sản xuất insulin tách chiết từ động vật • Từ những thập niên 1920 cho đến những năm đầu của thập niên 1980, insulin được tạo ra bằng cách cô lập từ tuyến tụy của động vật như heo và bò và được tinh sạch... tác nối các đoạn DNA do các enzym cắt đầu bằng từ đó tạo nên đầu sol Các adaptor đặc trưng riêng cho mỗi loại enzym Dùng enzym cắt hạn chế từ hai nguồn DNA khác nhau, qua khâu nối trộn lẫn sẽ tạo ra sản phẩm DNA tái tổ hợp BƯỚC 3: Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng gen + Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ theo kỹ thuật biến nạp (chuyển trực tiếp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ) – tế... khuẩn, tế bào động vật, tế bào thực vật; nhờ bộ máy di truyền của tế bào chủ nhân bản DNA tái tổ hợp, tạo sinh khối lớn * Những tế bào chủ chính thường dùng: +Vi khuẩn E.Coli: dễ thao tác, ít tốn kém, sinh sản nhanh, tạo dòng DNA tái tổ hợp nhanh +Tế bào nấm men, tế bào động vật, thực vật nuôi cấy Invitro, loại tế bào này thường dùng vào mục đích cụ thể như nghiên cứu điều hòa hoạt động của gen, đột biến... lông, tóc, thịt, máu, nước bọt, mô thân, rễ, lá… Tách chiết RNA: quy trình tương tự tách chiết DNA, dịch chiết sau khi làm sạch protein, sử dụng enzim phân hủy RNA, kết tủa thu RNA + Định lượng DNA, RNA: sản phẩm sau khi tách chiết cần có độ tinh sạch và hàm lượng đủ cho nghiên cứu, dùng phương pháp đo quang phổ để xác định chỉ số hấp phụ, tù đó đánh giá độ tinh sạch và hàm lượng cần thiết Hoặc dùng phương ... III Công nghệ sản xuất insulin Từ thực vật Sản xuất Insulin Từ động vật Từ vi sinh vật 3.1 sản xuất insualin từ thực vật Giáo sư Henry Daniell (ĐH Central Florida – Hoa Kì) Hoa Rum  Sản xuất. .. nghĩa sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để sản xuất insulin Sản xuất Insulin công nghệ tái tổ hợp bước nhảy vọt việc chữa trị bệnh tiểu đường Ngoài ý nghĩa quan sử dụng công nghệ để sản xuất Insulin... CHUNG VỀ INSUALIN VÀ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG 1.1 bệnh tiểu đường 1.2 Insulin II Cơ sở khoa học công nghệ sản xuất nsulin 2.1 cấu trúc phân tử insualin 2.2 Tổng hợp insulin thể III Công nghệ sản xuất insulin