Bước Đầu Thử Nghiệm Nuôi Cấy Dunaliella Salina Trên Giá Thể Bacterial Cellulose

28 Bảng 3.1 Tỷ lệ kết hợp giữa khối lượng BC và thể tích môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng của Dunaliella salina ..... Bên cạnh đó, các vấn đề môi trường như: ô nhiễm kh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

************

BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY

Dunaliella salina

TRÊN GIÁ THỂ BACTERIAL CELLULOSE

Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12/2009

LỜI CẢM ƠN

Trước hết con xin cảm ơn Ba, Mẹ và tất cả mọi người trong gia đình Mọi người luôn bên cạnh, yêu thương và che chở cho con, là nguồn động viên lớn lao nhất cho con vững bước trên đường đời Không có mọi người sẽ không có con như ngày hôm nay Con sẽ mãi ghi nhớ công ơn sinh thành và dưỡng dục này

Trong suốt thời gian học tập và thực hiện Luận văn tốt nghiệp, em đã nhận được rất nhiều sự yêu thương và giúp đỡ từ các Thầy cô, Anh chị, các bạn và từ gia đình

Đầu tiên em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Mỹ Lan, người đã trực tiếp hướng dẫn, khích lệ, định hướng và tạo điều kiện thuận lợi cho em để em có thể hoàn thành đề tài tốt nghiệp này

Em xin chân thành cảm ơn chị Phương, anhHoàng, anh Hùng trong phòng thí nghiệm Chuyển hóa sinh học đã giúp đỡ, cho em những lời khuyên bổ ích trong quá trình làm đề tài

Em xin gửi đến các Thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học – trường Đại học Tôn Đức Thắng đã hết lòng truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong những năm trên giảng đường Đại học Chính những kiến thức Thầy cô giảng dạy đã là nền tảng cho em trong quá trình thực hiện đề tài

Tp Hồ Chí Minh 12/2009

Võ Thị Thanh Hương

MỤC LỤC

Trang LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục bảng v

Dang mục hình vi

Danh mục đồ thị vii

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 2

1.2 Mục đích và phạm vi đề tài 3

1.3 Yêu cầu 4

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về Dunaliella salina 6

2.1.1 Phân loại 6

2.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố 6

2.1.3 Đặc điểm về hình thái-cấu tạo-sinh sản 6

2.1.3.1 Cấu trúc tế bào 7

2.1.3.2 Sinh sản 9

2.1.4 Thành phần hóa học 10

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của Dunaliella salina 12

2.1.6 Nhu cầu dinh dưỡng của Dunaliella salina 13

2.1.7 Ứng dụng Dunaliella salina 16

2.1.7.1 Sử dụng vi tảo trong dinh dưỡng và thực phẩm 16

2.1.7.2 Khai thác các hoạt chất từ tảo 16

2.1.7.3 Sắc tố 16

2.1.7.4 Carbohydrate 17

2.1.7.5 Sản xuất các nguyên liệu giàu năng lượng 17

2.2 Tổng quan về Bacterial Cellulose (BC): 18

2.3 Tổng quan về Acetobacter xylinum 18

2.3.1 Phân loại 18

2.3.2 Đặc điểm hình thái 19

2.3.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 19

2.3.4 Quá trình tổng hợp Cellulose 20

2.4 Quá trình lên men 22

2.4.1 Nguyên liệu lên men 22

2.4.2 Phương pháp lên men 23

2.4.2.1 Nhân giống 23

2.4.2.2 Lên men (lên men tĩnh) 23

2.5 Sản phẩm Bacterial Cellulose 24

2.5.1 Cấu trúc Bacterial Cellulose 24

2.5.2 Tính chất 25

2.5.2.1 Độ tinh khiết 25

2.5.2.2 Độ bền 26

2.5.2.3 Khả năng hút nước 26

2.5.2.4 Lắp ráp màng trực tiếp trong suốt quá trình sinh tổng hợp 26

2.5.2.5 Biến đổi cellulose trực tiếp trong suốt quá trình hình thành 26

2.5.2.6 Biến đổi gen tạo thành Cellulose 26

2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến cấu trúc và tính chất của BC 26

2.5.3.1 Điều kiện lên men 26

2.5.3.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng 27

2.5.3.3 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng độ muối 27

2.6 Ứng dụng của Bacterial Cellulose 27

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm 30

3.1.1 Địa điểm 30

3.1.2 Thời gian 30

3.2 Nội dung nghiên cứu 30

3.3 Vật liệu và hóa chất 30

3.3.1 Thu mẫu 30

3.3.2 Trang thiết bị thí nghiệm 30

3.3.3 Hóa chất 31

3.4 Phương pháp thí nghiệm 33

3.4.1 Khảo sát sự tăng trưởng của Dunaliella salina 33

3.4.1.1 Dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục huyền phù và mật độ tế bào tảo 33

3.4.1.2 Dựng đường cong tăng trưởng của Dunaliella salina 34

3.4.2 Lên men Acetobacter xylinum và thu nhận Bacterial Cellulose (BC) 34

3.4.2.1 Hoạt hóa giống 34

3.4.2.2 Nhân giống 34

3.4.2.3 Sản xuất BC 34

3.4.2.4 Xử lý BC 35

3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ phối hợp giữa khối lượng BC và thể tích môi trường lên sự tăng trưởng của Dunaliella salina 35

3.4.3.1 Xác định mật độ sinh khối tảo 36

3.4.3.2 Xác định độ đậm 36

3.4.4 Nhân sinh khối tảo trong môi trường lỏng và trên giá thể BC 37

3.4.4.1 Xác định trọng lượng khô của tảo trên hai môi trường nhân giống 37

3.4.4.2 Khảo sát độ đậm chlorophyll của bột 37

3.4.4.3 Xác định hàm lượng protein trong bột 38

3.4.5 Thử nghiệm khả năng tái sử dụng của BC trong nuôi cấy Dunaliella salina 40

3.4.6 Điều kiện thí nghiệm 40

3.4.7 Xử lý kết quả thu được 40

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 Khảo sát sự tăng trưởng của Dunaliella salina 42

4.1.1 Dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục huyền phù và mật độ tảo 42

4.1.1.1 Nồng độ sinh khối 42

4.1.1.2 Dựng đường tương quan giữa độ đục huyền phù và nồng độ sinh khối 42

4.1.2 Dựng đường cong tăng trưởng của Dunaliella salina 43

4.2 Lên men Acetobacter xylinum và thu nhận Bacterial Cellulose (BC) 44

4.3 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ phối hợp giữa khối lượng BC và thể tích môi trường lên sự tăng trưởng của Dunaliella salina 45

4.3.1 Xác định mật độ sinh khối D.salina 45

4.3.2 Xác định OD sắc tố chlorophyll 47

4.3.2.1 Phổ hấp thu ánh sáng của chlorophyll trong D.salina 47

4.3.2.2 Xác định OD sắc tố của sinh khối ở độ ẩm khác nhau 48

4.4 Nhân sinh khối tảo trong môi trường lỏng và trên giá thể BC 52

4.5 Thử nghiệm khả năng tái sử dụng của BC trong nuôi cấy Dunaliella salina 56

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 58

5.2 Đề nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 59

Tài liệu tiếng Anh 60

Tài liệu Internet 64 PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 So sánh thành phần dinh dưỡng 11

Bảng 2.2 So sánh khoáng chất trong các loại thực phẩm xanh 12

Bảng 2.3 Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn 18

Bảng 2.4 Thành phần của nước dừa 22

Bảng 2.5 Một số ứng dụng của BC 28

Bảng 3.1 Tỷ lệ kết hợp giữa khối lượng BC và thể tích môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng của Dunaliella salina 36

Bảng 3.2 Các thành phần bổ sung trong ống nghiệm 39

Bảng 4.1 Khối lượng và nồng độ sinh khối của các chủng khảo sát 42

Bảng 4.2 Mật độ sinh khối (mg/ml) của tảo ở các độ ẩm khác nhau trong 10 ngày khảo sát 45

Bảng 4.3 Kết quả OD của dịch chiết sắc tố ở các bước sóng khác nhau 47

Bảng 4.4 OD sắc tố của sinh khối ở các độ ẩm khác nhau trong 10 ngày khảo sát 49

Bảng 4.5 Số liệu đường chuẩn albumin 54

Bảng 4.6 Tổng kết các chỉ tiêu của bột D.salina thu được trên giá thể BC và môi trường lỏng 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Vi tảo Dunaliella salina 6

Hình 2.2 Vi khuẩn Acetobacter xylinum 19

Hình 2.3 Con đường tổng hợp Cellulose của Acetobacter xylinum 21

Hình 2.4 Quá trình lên men thu BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum 23

Hình 2.5 So sánh cấu trúc của cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật 24

Hình 2.6 Mô phỏng cấu trúc của cellulose I (a) và cellulose II (b) 25

Hình 4.1 Các sản phẩm của quá trình nhân giống và tạo sản phẩm BC 44

Hình 4.2 Dịch chiết sắc tố của D.salina 48

Hình 4.3 Sinh khối tảo trên các nghiệm thức sau 10 ngày nuôi cấy 51

Hình 4.4 D.salina trên giá thể BC và môi trường lỏng sau 3 ngày nuôi cấy 52

Hình 4.5 D salina trên giá thể BC và môi trưởng lỏng sau 10 ngày nuôi cấy 52

Hình 4.6 D.salina trước và sau khi sấy 52

Hình 4.7 D.salina trên giá thể BC sử dụng lần 1 và lần 2 56

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1 Đường tương quan tuyến tính giữa OD660 và nồng độ sinh khối tảo 43

Đồ thị 4.2 Đường cong tăng trưởng của D.salina 43

Đồ thị 4.3 So sánh mật độ sinh khối tảo (mg/l) trung bình theo thời gian 46

Đồ thị 4.4 Phổ hấp thu ánh sáng của chlorophyll trong D.salina 48

Đồ thị 4.5 OD sắc tố chlorophyll của D.salina trong các nghiệm thức 50

Đồ thị 4.6 Khối lượng bột D.salina của môi trường có giá thể BC và môi trường lỏng 53

Đồ thị 4.7 OD của dịch chiết chlorophyll trong bột D.salina trên hai loại môi trường BC và lỏng 53

Đồ thị 4.8 Đường chuẩn albumin 54

Đồ thị 4.9 Hàm lượng protein của D.salina ở hai loại môi trường BC và lỏng 55

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ:

Hơn 80% năng lượng sử dụng hiện nay trên thế giới là từ nhiên liệu hóa thạch (dầu mỏ, than đá, khí thiên nhiên,…) Đây là những nguồn năng lượng không tái sinh được và có giới hạn Theo Bộ Năng lượng Mỹ và Ủy ban năng lượng thế giới dự báo nguồn năng lượng hóa thạch không còn nhiều: dầu mỏ còn 39 năm, khí thiên nhiên 60 năm, than đá 111 năm Trong khi đó nhu cầu năng lượng của cả thể giới ngày càng gia tăng Chính vì thế, các nhà khoa học đã lên tiếng cảnh báo cộng đồng quốc tế rằng thời điểm khủng hoảng năng lượng thế giới đang đến gần khi mà các nguồn cung cấp dầu

mỏ và khí đốt trên thế giới đang cạn kiệt nhanh với tốc độ 4-5% hàng năm Bên cạnh

đó, các vấn đề môi trường như: ô nhiễm không khí, sự gia tăng hàm lượng CO2 trong không khí rất đáng báo động dẫn đến hiệu ứng nhà kính,…Do đó, yêu cầu cần thiết được đặt ra là tìm những nguồn nhiên liệu mới để thay thế nguồn nhiên liệu hóa thạch đang ngày càng cạn kiệt Cả thế giới đang đổ xô vào cuộc chạy đua tìm nguồn nhiên liệu thay thế này Những nguồn năng lượng tái sinh như năng lượng mặt trời, năng lượng gió, năng lượng nước, năng lượng hạt nhân,… nhận được sự quan tâm đặc biệt trở lại của con người và được tăng cường khai thác Nhưng những nguồn năng lượng này có một số ưu và nhược điểm nhất định và vẫn chưa thể đáp ứng nổi như cầu về năng lượng của con người

Từ những yêu cầu như vậy, người ta hướng sự chú ý đến một nguồn nhiên liệu mới mà có khả năng thay thế vai trò cua nhiên liệu hóa thạch và phải có một ưu thế nổi bật là có khả năng tái tạo lại được, đồng thời là nguồn năng lượng “sạch”, không độc

và dễ phân giải trong tự nhiên Không nguồn nhiên liệu nào thích hợp hơn nhiên liệu

từ sinh vật Từ đó, thuật ngữ nhiên liệu sinh học –biofuel- ra đời, cho đến nay đã có 3 thế hệ nhiên liệu sinh học ra đời:

 Nhiên liệu sinh học thế hệ I: cồn sinh học (ethanol sinh học) được sản xuất

từ sự lên men sinh khối

 Nhiên liệu sinh học thế hệ II: - Biodiesel: Diesel sinh học được sản xuất từ

các chất béo, dầu thực vật như dầu đậu nành, dầu mè, dầu dừa, cọ dừa, hạt cải dầu, hạt hướng dương, hạt lanh , hạt Jatropha…, mỡ cá, mỡ động vật…

 Nhiên liệu sinh học thế hệ III:-Biodiesel từ tảo (tảo dầu)- là một sự thay thế

hòan hảo cho các nhiên liệu hóa thạch không tái tạo do có một số ưu điểm nội trội như:

 Hiệu suất dầu từ tảo thì cao hơn nhiều (10 – 100lần) so với những cây trồng năng lượng cạnh tranh

 Tốc độ tăng trưởng nhanh

 Không cạnh tranh đất trong với cây lương thực

 Hấp thu CO2.

 Phần sinh khôi sau khi chiết lấy dầu là nguồn lợi kinh thế rất lớn

Dunaliella salina là loài tảo chịu mặn tốt nhất, phổ biến ở các ruộng muối Nó

có thể chịu được nồng độ muối từ 3-31% (nồng độ bão hòa) Dunaliella salina còn

được biết đến đầu tiên như là một nguồn lipid tự nhiên bởi Ben-Amotz và cộng sự

(1982) Trong một số điều kiện Stress, lượng lipid tích trữ trong tế bào Dunaliella salina có thể lên đến 47% trọng lượng khô

Ngòai ra, Dunaliella salina được đề nghị là một nguồn -carotene thương mại

bởi Massyuk (1996), và sau này được xem như là một nguồn -carotene tự nhiên giàu

có nhất Hàm lượng -carotene tích trữ trong tế bào Dunaliella salina có thể lên đến

14% trọng lượng khô và có hoạt tính cao gấp nhiều lần so với -carotene từ thực vật

Hiện nay -carotene từ Dunaliella salina đang được sản xuất thương mại ở Australia,

Mỹ và Isarel, và cũng đang sản xuất quy mô pilot ở Trung Quốc, Nhật Bản…

Chi phí cho sản xuất tảo Dunaliella salina hiện nay khá tốn kém, vì vậy giá sản phẩm Dunaliella salina trên thị trường vẫn còn cao Chính vì thế mà nhiều cơ sở sản

xuất vẫn đang nỗ lực tìm các phương pháp giảm bớt các khâu sản xuất để hạ giá thành sản phẩm mà giữ nguyên chất lượng sản phẩm

Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành thí nghiệm “ Bước đầu thử nghiệm

nuôi cấy Dunaliella salina trên giá thể Bacterial Cellulose”

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ PHẠM VI ĐỀ TÀI:

 Nhân sinh khối Dunaliella salina

 Lên men Acetobacter xylinum và thu nhận Bacterial Cellulose (BC)

 Bước đầu thử nghiệm nuôi cấy Dunaliella salina trên giá thể BC

1.3 YÊU CẦU:

 Khảo sát sự tăng trưởng của Dunaliella salina

 Tìm tỷ lệ phối hợp giữa khối lượng BC và thể tích môi trường thích hợp

cho sự tăng trưởng của Dunaliella salina

 So sánh hiệu suất thu nhận sinh khối Dunaliella salina thu được từ môi

trường BC và môi trường lỏng

CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN

TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ Dunaliella salina:

2.1.1 Phân loại

Lĩnh giới (Domain) Eukaryota Woese, 1980 – Sinh vật nhân thật

Giới (Kingdom) Phantae Haecket, 1866 – Thực vật

Giới phụ (Subkingdom) Viridaeplantae Cavalier – Smith, 1981- Thực vật lục Ngành (Phylum hay Division) Chlorophyta A Pascher, 1914 - Tảo lục

Lớp (Class) Chlorophyceae Wille, 1884 – Tảo lục

Bộ (Order)Volcocales Oltmanns, 1904

Họ (Family) Dunaliellaceae T.Christensen, 1967

Chi (Genus) Dunaliella E.C Teodoresco, 1904

Loài (Species) Dunaliella salina Teodoresco, 1905

2.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố :

Dunaliella salina lần đầu tiên được công nhận bởi Teodoresco (1905)[35] Tảo

này thường được tìm thấy trong các hồ muối ở tất cả các nơi trên thế giới từ nhiệt đới đến ôn đới, thậm chí vùng cực Nó còn có thể được phân lập từ nước biển, mặc dù chúng không phải rất dồi dào trong tự nhiên (Borowitzka 1988b)[15]

2.1.3 Đặc điểm về hình thái-cấu tạo-sinh sản:

Hình 2.1 Vi tảo Dunaliella salina

Dunaliella salina là một loài vi tảo đơn bào có hình dạng tế bào thay đổi từ elip,

hình trứng, hình trụ, hình quả lê, và hình thoi đến gần như hình cầu Có kích thước 5,0-29,0µm dài x rộng 2,5 – 21,0 µm Các tế bào của một loài nhất định có thể thay đổi hình dạng khi điều kiện thay đổi, thường trở thành hình cầu trong các điều kiện bất

lợi Kích thước tế bào cũng có thể khác nhau tùy theo điều kiện tăng trưởng và cường

độ ánh sáng[3]

2.1.3.1 Cấu trúc tế bào:

Các tế bào Dunaliella salina có các loại bào quan điển hình của tảo lục:

màng-liên kết nhân, ti thể, không bào, bộ máy Golgi và một điểm mắt (Ben-Amotz and Avron 1989a)[10] Tế bào được bao quanh chỉ bởi một màng sinh chất đàn hồi bao phủ bởi lớp áo bề mặt nhầy

 Lớp áo tế bào :

Không có thành tế bào cứng, nhưng có lớp áo nhầy tế bào đặc biệt Nó được xem là lớp điện tử - dày hữu hình bất thường bao phủ bên ngoài màng sinh chất Nó bao gồm các sợi dài 25-200nm và xuất hiện lượng lớn glycoprotein trong tự nhiên[29]

Co lại hoặc giãn ra khi tiếp xúc điều kiện ưu trương và nhược trương (Ben-Amotz and Avron 1990; Ben-Amotz 1993)[11],[12]

 Lông roi ( flagella ):

Tế bào của tảo vận động được là nhờ lông roi

Hai lông roi được gắn trên đầu, dài bằng nhau, và thường biểu hiện cùng nhịp Cấu trúc của lông roi rất phức tạp Lông roi có thể gốc Hai thể gốc gần nhau ở hướng 1/7 h và mang vi ống gốc lông roi Các góc được hình thành giữa hai sợ lông roi thường từ 90-130o và dường như không đổi chiều Chúng được kết nối với nhau bởi một ngoại biên và 2 sợi tơ ở gần tâm Cũng có thể có thêm 2 thể gốc không kết nối với lông roi Hệ thống vi ống gốc lông roi chéo chữ thập và ở dạng X-2-X-2 Hai gốc bao gồm hai vi ống nằm dưới bởi sự nổi lên của hệ thống sợi I, hai cái khác bao gồm 4 vi ống và cũng được kết hợp với hệ thống sợi I Các vi ống của các phần đối diện liên kết đoạn cuối vỏ Hệ thống sợi rễ I kết thúc khoảng nữa chặng xuôi tế bào Chúng là những vân ngang với hệ vân mẫu theo sự sắp xếp từ 25-32 nm Khi các sợi được tách

ra từ rễ những vi ống, ví dụ như trong sự biệt lập của cơ cấu lông roi, những hệ vân mẫu của chúng thay đổi Hệ sợi rễ II (sợi rễ) có thể xuất hiện, kéo dài từ những thể gốc đến nhân)[29]

 Lục lạp (chloroplast):

Lục lạp đơn chiếm hầu hết thể bào Nó có dạng chén, đĩa, hoặc dạng chuông và

có vùng đậm đặc có chứa nhân tinh bột hay nhân protein (pyrenoid) Trong lục lạp có các thể đặc biệt gọi là hạt tạo bột (pyrenoid), là những thể protein hình cầu hay có góc, xung quanh tập trung các hạt tinh bột hay hydrat cacbon là chất dự trữ chính của

Dunaliella salina Lục lạp đôi khi được rạch thành nhiều thùy Trong tế bào sống, nó

có một cấu trúc nhăn nheo, đặc biệt trong các tế bào già Đôi khi những thylakoid của lục lạp được xếp chồng dày đặc đến hơn 10 đơn vị Đặc biệt trong những tế bào đã phát triển ở cường độ ánh sáng cao và nồng độ muối cao Những cặp thylakoid có thể nhập với nhân tinh bột một khoảng cách ngắn, nhưng không bao giờ đi ngang qua chất nền của nhân tinh bột Các hạt tinh bột thường xuyên bao quanh nhân tinh bột, nhưng

có thể ở những nơi khác của lục lạp (đặc biệt nhiều trong các môi trường cũ)

Dunaliella salina cũng có thể tích lũy số lượng lớn của β-carotene trong phạm vi một

giọt dầu nằm giữa các thylakoid, cho nên các tế bào có màu đỏ cam hơn là xanh lá cây

Những giọt β-carotene của D.salina được tìm thấy thực tế chỉ bao gồm các chất béo trung tính, hơn một nửa trong số đó là β-carotene Hầu hết các dạng đo đỏ có thể mất

màu đỏ của chúng khi phát triển trong cường độ ánh sáng thấp yếu[29]

 Điểm mắt (stigma hoặc eyespot):

Nằm ở vị trí trước ngoại biên trong các lục lạp.Điểm mắt có thể khó tìm thấy dưới ánh sáng kính hiển vi Nó bao gồm một hay hai hàng giọt lipid, có nhiều ở tế bào già Có thể các giọt có hình lục giác, nhưng sự đóng gói thường không theo quy luật và

các đơn vị khá đồng nhất về kích thước Ở Dunaliella salina chúng liên kết chặt chẽ

với các thylakoid[29]

 Nhân (Nucleus):

Nhân thường bị che khuất trong thời gian tồn tại bởi một lượng hạt nhỏ Nó chiếm phần lớn phần trước của tế bào và thường được bao quanh bởi các thùy trước của lục lạp Nghiên cứu kết cấu siêu vi cho thấy rằng nó có một lớp màng xốp và một hạch nhân đơn nổi lên, được bao quanh bởi cụm dị nhiễm sắc thể[29]

 Ty thể (mitochondria):

Ty thể thường tìm thấy ở gần thể gốc và tại nhiều vị trí ngoại vi giữa các lục lạp

và màng sinh chất hoặc xung quanh nhân Klut và các cộng sự cho thấy rằng số lượng

và kích thước của ti thể có thể khác nhau giữa những tế bào ở các giai đoạn khác nhau của sự tăng trưởng [21]

 Thể Golgi (Golgi bodies):

Gồm nhiều túi dịch nhỏ dẹp giới hạn bởi một màng xếp như chồng dĩa (Dictyosomes) Thường gồm có 2-4 chồng đĩa, mỗi cái gồm 10-15 túi dịch Chúng ở giữa trước cực của nhân và thể gốc, bề mặt tạo thành nằm hướng về phía màng sinh chất, được liên kết với mạng lưới nội chất[29]

 Lưới nội chất (Endoplasmic reticulum)

Lưới nội chất thường làm nền tảng màng sinh chất trên hầu hết các phần của tế bào Ngoài ra, một chuỗi của màng sinh chất liên kết màng nhân với phần gốc của bộ lông roi Trong giai đoạn tạo stress nồng độ thẩm thấu cao, có thể tăng rõ rệt ở lưới nội chất Lưới nội chất như nguồn dự trữ tạm thời của màng vật chất trong giai đoạn gây stress vượt mức khi những gian tế bào chính co lại[29]

 Không bào (Vacuole)

Ở Dunaliella salina không có không bào co bóp Những giọt lipid lớn và những

không bào chứa những giọt lipid nhỏ tương tự lục lạp có thể xuất hiện ở những nơi khác nhau của tế bào (đặc biệt là những tế bào trong pha ổn định) Lượng mật độ điện

tử của không bào của D.salina đã được phân tích bởi laser microprobe (1 que thăm dò

siêu nhỏ dùng để xác định các thành phần hóa học của bề mặt rắn), phân tích X-quang cho thấy chứa một lượng cao silicon, phospho, lưu huỳnh và clorua[29]

2.1.3.2 Sinh sản [3]:

 Sinh sản sinh dưỡng:

Sinh sản sinh dưỡng phân chia theo chiều dọc ở trạng thái di động Sự gián phân và sự phân bào biểu lộ các đặc tính của Chlorophyceae – lớp tảo lục (trụy kỳ cuối thoi và sự xuất hiện của phycoplast – 1 loại vi sợi tìm thấy trong quá trình phân bào)

Tại kỳ đầu sớm, hạt nhân chuyển về hướng thể gốc tại phần trước của tế bào

Sự sao chép của thể gốc xảy ra tại cuối kỳ đầu sớm Thoi trong nhân phát triển trong suốt kỳ trước trong khi màng nhân thì bền Tại pha giữa, thoi kéo dài giữa 2 lỗ đối nhau xuất hiện ở màng nhân Những thể gốc không nằm ở những cực của bộ thoi, nhưng nằm gần màng nhân ở khu vực trung gian giữa mặt phẳng kỳ giữa và các cực của thoi Mối liên hệ chặt chẽ giữa nhân và thể gốc bị mất ở kỳ cuối Tại cuối kỳ cuối,

vỏ ngoài nhân được đóng xung quanh 2 nhân con và sự suy yếu của thoi Sự phân bào được thực hiện bởi các rãnh phân cắt của màng tế bào ở phycoplast (nghĩa là một đĩa của những vi ống ở các mặt phân chia) Sự phân chia của lạp lục bắt đầu tại kỳ đầu sớm bằng sự phân chia của nhân tinh bột, nhưng phân hạch hoàn toàn của lục lạp chỉ diễn ra trong giai đoạn phân bào

Những nang vô tính (những giao tử bất động) có thể được hình thành dưới điều kiện khắc nghiệt như môi trường loãng nhiều hoặc môi trường khô hạn Có những giai đoạn không di động, tựa hình cầu, vách dày, và có thể có bề mặt mấp mô Giai đoạn quần keo, trong đó các tế bào bất động được bọc trong dịch nhầy như chất keo, cũng

có thể được hình thành trong điều kiện nhất định

 Sinh sản hữu tính:

Sinh sản hữu tính là bởi sự đẳng giao, với sự dung hợp giao tử bắt đầu tương tự trong Chlamydomonas ( bởi sự dính kết lông roi và kích hoạt cấu trúc sinh sản đặc biệt) Các giao tử có cùng kích thước và tính năng cấu trúc giống như các tế bào phát

triển của cùng một loài Một vài loài của Dunaliella xảy ra đồng tản, trong khi D.salina dị tản Các hợp tử màu xanh hoặc đỏ và được bao quanh bởi vách dày và mịn

Sau giai đoạn nghỉ, các hạt nhân hợp tử phân chia tạo thành 32 tế bào, được giải phóng thông qua sự vỡ thành tế bào mẹ Sự phân bào giảm nhiễm diễn ra trong giai đoạn nảy mầm bào tử

Dunaliella salina đặc biệt giàu chất dinh dưỡng và khoáng chất chống oxi hóa,

đặc biệt là Selenium (Se) và Magie Se là một chất chống oxy hoá mạnh mẽ nhằm hỗ trợ trong cai nghiện và sức khỏe miễn dịch Magie là rất quan trọng trong chuyển hóa

tế bào, sản xuất năng lượng và chức năng các cơ bắp và dây thần kinh[31]

 Vitamin

Dunaliella salina chứa một loạt các chất dinh dưỡng bao gồm cả vitamin E,

cobalamin (vitamin B12) và provitamin A Vitamin A đóng vai trò thiết yếu cho thị lực, sự tăng trưởng, sinh sản và sự điều khiển hệ thống miễn dịch Nó cũng giúp duy trì các sức khỏe,da và niêm mạc Cobalamin là cần thiết cho sự chuyển hóa năng lượng thích hợp, chức năng miễn dịch và chức năng thần kinh[31]

 Chlorophyll

Dunaliella salina giàu chất diệp lục, có khả năng loại trừ chất độc hại của cơ thể[31]

 Các axit béo thiết yếu (EFAs)

Dunaliella salina chứa EFAs, nồng độ cao chất béo không no giúp làm giảm

mức cholesterol và chất béo trong máu, ngăn ngừa bệnh tim, giảm viêm trong viêm khớp, cải thiện chức năng miễn dịch và não, và hỗ trợ sức khỏe sinh sản và kinh nguyệt

Những chất béo, bao gồm cả Omega 3, Omega 6, axit linoleic và alpha linoleic axít là rất cần thiết cho việc hấp thu carotenoids, vitamin E và chất béo-chất dinh dưỡng khác hòa tan[31]

 Amino axit

Dunaliella salina có chứa hàm lượng acid amin cao Amino axit là những vật

liệu xây dựng cơ bản của cuộc sống, cần thiết cho sự tổng hợp của cơ bắp, da và liên kết mô, hormon, các enzyme và chất dẫn truyền thần kinh (neurotransmitter)[31]

Bảng 2.2 So sánh khoáng chất trong các loại thực phẩm xanh [31]

Khoáng

chất

(mg/100g)

Dunaliella salina

Spirulina Chlorella Cỏ mạch

(Wheat grass)

barley (Green barley)

2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của Dunaliella salina:

D salina có lợi thế là có khả năng phát triển mạnh trong môi trường nồng độ

muối cao nên có thể nuôi cấy trong những ao mở cũng như hệ thống nuôi cấy khép

kín Tuy nhiên, phải thêm một số dinh dưỡng và yếu tố hạn chế sinh lý cho sự phát

triển tối ưu

 Ánh sáng:

Vì D.salina là một vi tảo quang tự dưỡng bắt buộc, ánh sáng là nguồn năng

lượng duy nhất cho sự chuyển hóa của nó (Borowitzka và Borowitzka 1989)[17] Trong hệ thống những ao mở, nguồn ánh sáng duy nhất là ánh sáng mặt trời, trong khi trong các lò phản ứng sinh quang hóa (photobioreactor) thì ánh sáng có thể cung cấp bằng cách sử dụng ánh sáng trắng đèn huỳnh quang hoặc ánh sáng mặt trời

 Nhiệt độ:

D salina có khả năng phát triển mạnh khoảng nhiệt độ từ 0-45oC Trong phòng

thí nghiệm các mẻ cấy, nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng D.salina từ 25-35oC Amotz 1995)[13] Do hạn chế kỹ thuật, nhiệt độ trong các ao mở là không thể điều khiển Ngoài ra nhiệt độ cao hơn 40oC gây lò rỉ glycerin trong môi trường (Wegmann và các cộng sự, 1980)[37], mà nó có thể cung cấp nguồn cacbon hữu cơ chủ đạo cho vi khuẩn và nấm sợ nhỏ (Ben-Amotz 1995)[13] Nhiệt độ lớn hơn 40oC thường gây chết

(Ben-Đây có thể là vấn đề chính trong việc nuôi D.salina ngoài trời, đặc biệt là ở những vùng

nắng nóng So với các khu vực ẩm ướt, tốc độ bốc hơi cao hơn ở các vùng khô cằn có thể dẫn đến giảm nhiệt độ đáng kể trong các ao và do vậy các khu vực này là thích hợp

nhất cho nuôi cấy ngoài trời của D.salina và các vi tảo khác Không giống như các ao

mở, nhiệt độ trong các lò phản ứng sinh quang hóa được điều khiển chính xác

 Độ pH:

Độ pH tối ưu cho D.salina là 9-11 Trong nuôi cấy tảo tự dưỡng, độ pH tăng vì

sự kìm hãm quang hợp của CO2 và NO־3 hấp thu góp phần tăng sự giải phóng OH- (Ben-Amotz và Avron 1989a)[10] Trong nhiều nguồn nước thiên nhiên, nguy cơ của một số lượng mưa muối can xi và keo tụ của sinh khối tảo lúc độ pH cao hơn, đặc biệt

là khi nồng độ của Ca2+ cao Điều này có thể dẫn đến giảm tăng trưởng tảo và vì thế để tránh tăng pH trên 8 trong nuôi cấy (Ben-Amotz và Avron 1989a)[10] Trong chế độ hoạt động chuyên sâu của ao mở, pH thường được duy trì ở 7,5 ± 0,2 bởi kiểm soát gấp đôi 2 khí CO2 và HCl nơi đầu tiên thường là chảy đến các mẻ cấy và thứ hai là thỉnh thoảng được thêm vào khi trên ngưỡng kiểm soát (Ben-Amotz 1995)[10] Trong một số ao mở và lò phản ứng sinh quang hóa nơi mà các nguồn chính của cacbon vô

cơ là bicarbonate ion (HCO־3), pH được điều khiển bằng cách cho thêm HCl

2.1.6 Nhu cầu dinh dưỡng của Dunaliella salina:

 Nguồn cacbon:

Vì D.salina là một sinh vật quang tự dưỡng, nó có thể chỉ sử dụng carbon

dioxid (CO2) và bicarbonate (HCO3) là nguồn cacbon vô cơ Việc thiếu một nguồn cacbon vô cơ thích hợp là nhân tố hạn chế phát triển phổ biến nhất dưới những điều

kiện có trong nuôi cấy D.salina như độ mặn cao, giảm pH và nhiệt độ cao (Borowitzka

và Borowitzka 1989)[17] Các thiết bị bơm các bọt CO2 nhỏ vào mẻ cấy Khí đưa qua ống nhựa xốp cố định ở phía dưới các ao hồ và thiết bị kỹ thuật số đo lưu lượng khối được dùng chỉnh tốc độ lưu lượng khí ở 0,4 l ml-1 ( Garcia-Gonzlez và các cộng sự 2003)[23] Ngoài ra, 10 mmol l-1 NaHCO3 có thể được sử dụng như nguồn cacbon cho

sự tăng trưởng tốt giữa pH 7,5 và 9,5 Tuy nhiên, tảo sẽ phát triển tốt khi lên đến pH

11 khi cao hơn nồng độ bicarbonate ban đầu được cung cấp, vì ở độ pH cao hơn, việc cung cấp carbon dioxide hòa tan sẽ bị giới hạn (Ben-Amotz và Avron 1989a)[10] Ngoài ra, 5mmol l-1 NaHCO3 được bổ sung hằng ngày cho vào nồi phản ứng sinh học (bioreactor) sau khi khử trùng bằng sodium bicarbonate (NaHCO3) đặc ở 1200C trong một lò dưới bóng tối và sau đó được trộn với nước khử trùng (Hejazi và các cộng sự 2003)[25]

Việc cung cấp cacbon vô cơ đặc biệt quan trọng đối với nuôi cấy D.salina, ở độ

mặn rất cao mà tảo này phát triển, sự hòa tan các chất vô cơ cacbon là rất thấp; tức là ở 25% NaCl sự hòa tan của cacbon vô cơ là <50% tại độ mặn nước biển (3% NaCl) Hơn nữa, trong nước biển tự nhiên với nhiệt độ cao và độ pH, phần lớn các cacbon vô

cơ (>99%) là ở dạng CO3 2- và vì thế không có sẵn để tảo hấp thu Sự hiện diện của enzyme ngoại bào anhydrase carbonic mà xúc tác chuyển đổi HCO-3từ CO2 có nghĩa

là tảo có thể sử dụng HCO -3 dưới những điều kiện này[35]

 Nguồn nitơ:

Nguồn nitơ tốt nhất cho D.salina là nitrat Trong thực nghiệm, 5mmol l-1

NaNO3 hoặc KNO3 được thêm vào môi trường cho sự phát triển tối ưu của tảo Mặt khác, hạn chế nitrat là một trong những cách phổ biến nhất để giảm tốc độ tăng trưởng dẫn đến cảm ứng sản xuất chất carotene Tuy nhiên, kéo dài thời gian hạn chế nitơ trong mẻ nuôi cấy cuối cùng có thể dẫn đến tỷ lệ tử vong cao của các tế bào cũng như giảm nghiêm trọng lượng carotene trên một đơn vị thể tích nuôi cấy Những nguồn

nitơ khác như muối ammonium và ure không thích hợp Ví dụ, thực nghiệm cho thấy

ammonium nitrate ức chế sự hình thành β-carotene, và tích cực phát triển hấp thu

ammonium của mẻ nuôi cấy dẫn đến một quá trình acid hóa môi trường và kết quả cuối cùng là gây chết cho tảo (Borowitzka, MA &Borowitzka, 1988b)[15] Ure có thể

sử dụng như là nguồn nito, đặc biệt là trong các môi trường đệm Tuy nhiên trong mẻ nuôi cấy quy mô lớn ngoài trời ure có thể dẫn đến tử vong do có nồng độ cao của amoni được giải phóng trong sự chuyển hóa của ure (Massyuk, 1966)[26] Nó cũng cho thấy rằng sử dụng NH4NO3 hay (NH4)2 CO3 như nguồn nitơ có ảnh hưởng độc hại

đến D.salina (Borowitzka và Borowitzka 1987)[14]

 Sulfate:

D.salina cũng cần nồng độ cao sulphate cho sự phát triển tối đa, nhưng điều này

hiếm khi cần thiết thêm vào các ao môi trường thương mại vì nguồn nước tự nhiên như nước biển hoặc nước máy có lượng sulfate cao, khoảng 30 mmol l-1 (Ben-Amotz và Avron 1989a)[10]

Nồng độ sắt thấp trong một dạng có thể được đồng hóa là rất cần thiết cho sự

tăng trưởng D.salina Nồng độ tối ưu cho sắt trong D.salina là 1,25-3,75mg.1-1

(Mil’ko, 1962)[28] và cần được cung cấp dạng như sắt citrate hoặc Fe-EDTA (Borowitzka, MA & Borowitzka, 1988b)[16] Nồng độ sắt cao ức chế tăng trưởng

 Các nguyên tố và Vitamin:

Những nguyên tố như Zn, Co, Cu, Mo và Mn thường được thêm vào môi

trường D.salina, tuy nhiên rất biết rất ít đến các yêu cầu thực tế của tảo này D.salina

không yêu cầu bất kỳ các vitamin ngoại sinh cho sự tăng trưởng[35]

2.1.7 Ứng dụng Dunaliella salina:

2.1.7.1 Sử dụng vi tảo trong dinh dưỡng và thực phẩm:

Trong gần ba thập kỉ qua, sử dụng vi tảo và các vi sinh vật khác làm nguồn protein đơn bào (SCP) đã thu hút sự chú ý của các nhà khoa học và sản xuất Một số

đặc điểm nổi bật của D.salina là sinh khối có hàm lượng protein cao, trung bình

40-60% trọng lượng khô

Dùng vi tảo làm thức ăn và trao đổi khí hô hấp trong các chuyến bay vũ trụ cũng kích thích các nhà nghiên cứu sử dụng vi tảo cho dinh dưỡng của người [7]

2.1.7.2 Khai thác các hoạt chất từ tảo

D.salina chứa nhiều chất béo và lượng dầu tương tự thành phần dầu thực vật

Trong một số điều kiện nhất định, tảo có thể chứa lipid tới 85% trọng lượng khô Nhưng nhìn chung, hàm lượng của lipid trong sinh khối tảo dao động từ 20-40% chất khô

Ở vi tảo, lipid là ester cua glycerol và các acid béo mạch dài C14, C12 Triglycerid là nguồn lipid dự trữ quan trọng và có thể chiếm tới 80% tổng lượng lipid Những acid béo mạch dài chưa bão hòa được coi là rất quan trọng trong khẩu phần ăn của người và động vật Cũng nhờ có hàm lượng protein và các acid éo mạch dài chưa

no cao mà D.salina đã trở thành thức ăn tươi sống không thể thiếu cho ấu trùng một số

thủy đặc sản[7]

2.1.7.3 Sắc tố:

Ngoài Chlorophyll (a, b), D.salina còn chứa sắc tố bổ trợ như carotenoid

Các carotenoid có gam màu từ vàng đến đỏ và có bản chất izoprenoid polyene dẫn xuất từ lycopen Các loại carotenoid thông thường chiếm tới 14% trọng lượng khô Carotenoid đượic sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau Ví dụ, chúng được coi là chất màu thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên, là tác nhân làm tăng màu sắc cho thịt cá hồi và lòng đỏ trứng gà cũng như tăng thể trạng và khả năng sinh sản ở gia súc nuôi

nhốt β-carotene còn được coi là chất kích thích sinh trưởng, ngăn ngừa ung thư và làm

sáng mắt Hiện nay chúng ta biết khoảng 400 loại carotenoid, nhưng trong số này chỉ

có một ít loại được thương mại hóa dưới dạng chất màu thực phẩm như β-carotene,

lycopene, cryptoxanthin, zeaxanthin và lutein

Trong cơ thể vi tảo, carotenoid đóng vai trò như sắc tố bổ trợ quang hợp và là tác nhân bảo vệ tế bào khỏi tác hại của cường độ ánh sáng quá cao [7]

2.1.7.4 Carbohydrate:

D.salina chứ khối lượng lớn carbohydrate dưới dạng sản phẩm dự trữ (tinh bột,

glycogen) hoặc các chất điều hòa thẩm thấu (glycerol, trehalose, mannitol, sorbitol…) Lượng glycerol có thể đạt tới 50% trọng lượng khô trong điều kiện bão hòa muối

2.1.7.5 Sản xuất các nguyên liệu giàu năng lượng:

D.salina được coi là nguồn cung cấp nguyên liệu sinh học tiềm năng trong tương lai Một số ưu điểm nổi bật khi sử dụng D.salina để sản xuất nguyên liệu sinh

Ví dụ, glycerol thu được trong quá trình làm biodiesel từ D.salina có thể dùng làm xà

phòng, lượng sinh khối tảo sau khi chiết tách dầu có thể dùng làm chất đất và làm phân bón hữu cơ rất tốt [39],[40],[41]

2.2 TỔNG QUAN VỀ BACTERIAL CELLULOSE (BC):

BC được tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn (bảng 2.3) Con đường tổng hợp và

cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở các loài có lẽ giống nhau, nhưng cấu trúc BC ở mỗi loài thì khác nhau (Ross và cộng sự, 1991, Jonas và Farah, 1998) Có các đặc điểm khác biệt đáng kể về thuộc tính vật lý của các sản phẩm cellulose, chủ yếu là chiều dài của chuỗi glucan (được đặc trưng bởi mức độ polymer hóa), tính kết dính và trạng thái kết tinh của nó Tùy thuộc vào mỗi loài mà trạng thái kết tinh của cellulose khác nhau,

từ đó xác định các tính chất vật lý của sản phẩm như là độ bền, độ hòa tan trong các dung môi, tính chịu ảnh hưởng của các tác nhân biến tính

Bảng 2.3 Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn [5]:

Acetobacter Lớp màng ngoại bào tạo thành các dải

Zoogloea Chưa xác định rõ cấu trúc

2.3 TỔNG QUAN VỀ Acetobacter xylinum:

2.3.2 Đặc điểm hình thái

Acetobacter xylinum có dạng hình que, kích thước khoảng 2µm thay đổi tùy

chủng, khi trưởng thành có dạng cầu có vỏ nhày bao quanh, có thể di động hay không di

động, không sinh bào tử Tế bào Acetobacter xylinum có dạng sắp xếp đặc trưng là riêng

lẽ hay xếp thành chuỗi, chúng có khả năng tạo váng dày trên môi trường nuôi cấy

Hình 2.2 Vi khuẩn Acetobacter xylinum

Acetobacter xylinum thuộc loại Gram âm, nhưng dạng gram của chúng có thể

bị biến đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi trường [36]

Khi Acetobacter xylinum phát triển trên môi trường thiếu thức ăn hay môi

trường nuôi cấy lâu, chúng biến đổi thành những dạng có hình thái đặc biệt như tế bào phình to, kéo dài, phân nhánh hay không phân nhánh và dần dần bị thoái hóa, tổng hợp cellulose giảm, sản phẩm cellulose tạo ra có độ kết hợp không chặc chẽ, nhũn và mềm [2],[9]

2.3.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Vi khuẩn Acetobacter xylinum là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc và thường thấy

trong trái cây, rau giấm, nước trái cây và đồ uống có cồn, cho phản ứng catalase dương tính, có khả năng oxi hóa ethanol thành CH3COOH, CO2, và H2O Có thể chuyển hóa glucose thành acid, glycerol thành dihydroxyaceton, tổng hợp cellulose nhưng không

có khả năng tăng trưởng trên môi trường Hoyer và không có sắc tố nâu [8]

Trong môi trường lỏng, Acetobacter xylinum có khả năng hình thành màng

cenllulose khá dày Khi nhuộm màng bằng Iod và acid sulfuric sẽ cho màu xanh

Chúng có thể tích tụ được 4,5% acid acetic, đôi khi được dùng kết hợp với nấm men

để sản xuất đồ uống có độ rượu thấp[3]

Nguồn carbohydrate mà Acetobacter xylinum sử dụng tạo ra cellulose cao là:

glucose, fructose, manitol và sorbitol Hiệu suất thấp hơn nếu sử dụng glycerol,

galactose, lactose, sucrose và maltose Acetobacter xylinum không có khả năng sử

dụng sorbose, manose, cellobiose, erithritol và acetate [3],[36]

2.3.4 Quá trình tổng hợp Cellulose:

Cellulose được tổng hợp bởi Acetobacter xylinum là sản phẩm cuối cùng của

quá trình chuyển hóa carbon, phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của tế bào có liên quan đến chu trình pentose phosphate và chu trình Krebs gắn liền với con đường sinh

glucose Trong Acetobacter xylinum, sự sinh tổng hợp cellulose liên quan tới quá trình

dị hóa của quá trình oxi hóa và tiêu thụ hơn 10% năng lượng từ phản ứng dị hóa Sự sản xuất BC không gây trở ngại cho quá trình đồng hóa gồm sự tổng hợp protein

Acetobacter xylinum có thể chuyển hóa nhiều hợp chất carbon khác nhau như hexose,

glycerol, dihydroxyacetone, pyruvate, dicarboxylic acid thành cellulose với hiệu suất khoảng 50% [4]

Vi khuẩn Acetobacter xylinum sản xuất cellulose tinh sạch Một tế bào đơn có thể polymer hóa trên 200.000 gốc glucose thành chuỗi β-1,4-glucan trong một phút

Thuận lợi của việc sử dụng vi khuẩn sản xuất cellulose là vi khuẩn tăng trưởng nhanh trong điều kiện kiểm soát và sản xuất cellulose từ nhiều nguồn cacbon khác nhau gồm

có glucose, ethanol, sucrose và glycerol

Cellulose được tổng hợp từ bề mặt tế bào Acetobacter xylinum Vị trí tổng hợp

cellulose trên bề mặt tế bào được tạo thành những lỗ 3,5nm liên kết với nhau thành những dãy dài Mỗi lỗ bao phủ một tiểu phần 10 nm gồm có những enzyme tổng hợp cellulose liên quan đến phản ứng polymer hóa và những protein phụ liên quan tới những chức năng khác Mỗi tiểu phần 10 nm tạo ra một lượng lớn chuỗi glucan để hình thành sợi phụ cơ bản 1,5 nm Những sợi phụ cơ bản tập hợp lại thành vi sợi Tiếp theo là sự ghép chặt các vi sợi thành dải [19]

Con đường sinh tổng hợ cellulose từ cơ chất glucose thành cellulose gồm nhiều phản ứng trong đó đầu tiên glucose biến đổi thành glucose-6-phosphate bằng enzyme kinase Bước thứ hai, glucose-6-phosphate biến đổi thành glucose-1-phosphate bằng

enzyme phosphoglucomutase Bước tiếp theo, glucose-1-phosphate biến đổi thành UDP-glucose khi có sự hiện diện của UTP và enzyme UDPG pyrophosphorylase UDP-glucose sản xuất được dùng như cơ chất bởi enzyme cellulose synthase Trong

Acetobacter xylinum, enzyme này được hoạt hóa bằng chu trình nucleotide, c-di-GMP Chất hoạt hóa cellulose synthase c-di-GMP trong Acetobacter xylinum được tổng hợp

bằng enzyme diguanylate cyclase và nồng độ của chất hoạt hóa này được điều chỉnh bằng hoạt động của phosphodiesterase [19]

Hình 2.3 Con đường tổng hợp Cellulose của Acetobacter xylinum [22]

PGA: phosphogluconic acid

UDPGlc: uridine diphosphoglucose

FK: fructokinase

2.4 Quá trình lên men

2.4.1 Nguyên liệu lên men: nước dừa

Nước dừa là một môi trường thuận lợi để nuôi cấy vi khuẩn vì có nhiều chất dinh dưỡng Thành phần của nước dừa già bao gồm [5]

Bảng 2.4 Thành phần của nước dừa

Chất kích thích sinh trưởng 1,3 diphenyllurea Hexitol

Phyllocosine Cytokinin Myo-inositol Scycle-inositol Sorbitol

Dừa sau khi thu hoạch thường được bảo quản 3 ngày rồi đem sử dụng làm môi trường lên men Nếu để lâu lượng đường trong nước dừa giảm, chất lượng dinh dưỡng cũng không đảm bảo

2.4.2 Phương pháp lên men

2.4.2.1 Nhân giống:

Ống giống được giữ đem hoạt hóa bằng cách lấy một khuẩn lạc đơn đem huyền phù vào môi trường nhân giống, sau đó hoạt hóa giống bằng cách lắc ở nhiệt độ thích hợp

2.4.2.2 Lên men (lên men tĩnh)

Môi trường dinh dưỡng được cho vào khay, các khay nuôi cấy có bề mặt rộng, thoáng Trong quá trình lên men, các khay được đậy bằng giấy báo xốp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và môi trường bên ngoài để chủng phát triển và tránh khả năng nhiễm khuẩn [22] Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 28-30oC Sợi cellulose hình thành sẽ di chuyển lên bề mặt môi trường tạo thành một lớp màng cellulose ở mặt phân cách của môi trường lỏng và khí Đây là phương pháp cổ điển nhưng vẫn được

sử dụng rộng rãi trên thế giới do quy trình đơn giản

Sơ đồ quá trình lên men:

Hình 2.4 Quá trình lên men thu BC của vi khuẩn Acetobacter xylinum

2.5 Sản phẩm Bacterial Cellulose

2.5.1 Cấu trúc Bacterial Cellulose

Bacterial cellulose là chuỗi polymer không phân nhánh của các nhóm glucose liên kết với nhau qua nối β-1,4-glucan Chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau bằng liên kết Van de Waals Các chuỗi BC mới tạo thành liên kết với nhau hình thành nên các sợi sơ cấp (subfibril), các sợi sơ cấp kết lại thành vi sợi (microfibril) (Jonash

và Farash, 1989) Các vi sợi nằm trong các bó (bundle) và cuối cùng hình thành các dải (ribbon) (Yamanaka và cộng sự, 2000) Các dải có chiều dày 3- 4 nm x chiều rộng 70-80 nm (Zarr, 1997); 3,2 x 133 nm (Brown và cộng sự, 1976); 4,1 x 117 nm (Yumanaka và cộng sự, 2000) Trong khi chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra

từ gỗ thông là 30.000 – 75.000 nm hay gỗ Bulo (Betula) là 14.000 – 40.000 Những dải vi sợi cellulose vi khuẩn mịn có chiều dài thay đổi từ 1 – 9 µm làm thành nên cấu trúc lưới dày đặc, được ổn định bởi các nối hydrogen Các tế bào của vi khuẩn

Acetobacter xylinum phân bố khắp hệ thống dải cellulose [18],[33]

BC và cellulose thực vật (PC) có cùng cấu trúc hóa học nhưng khác nhau về tính chất vật lý và hóa học Mức độ polymer hóa khác nhau ở thực vật khoảng 13.000-14.000, ở BC là 2.000-6.000 BC được sản xuất bằng vi khuẩn sinh acid acetic và đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật [42]

Cellulose thực vật (x 200) Cellulose vi khuẩn (x 20.000)

Hình 2.5 So sánh cấu trúc của cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật [42]

Cấu trúc BC tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy Trong nuôi cấy tĩnh sản phẩm

BC thu được ở dạng màng, trong nuôi cấy lắc BC dạng hạt nhỏ có thớ phân tán trong môi trường

Có hai dạng cellulose kết tinh phổ biến là cellulose I và cellulose II được phân biệt bằng tia X, cộng hưởng từ hạt nhân, kính phổ Raman, và phân tích tia hồng ngoại

Cả hai đều được tổng hợp trong tự nhiên, nhưng cellulose I phổ biến hơn, không tế bào

nhân thực nào được biết có thể tổng hợp in vitro cellulose II Cellulose I có thể chuyển

hóa trực tiếp thành cellulose II những cellulose II thì không thể chuyển hóa thành cellulose I [33],[ 32]

Cellulose I là dạng chuyển hóa nhiệt học của cellulose, được tổng hợp chủ yếu

bởi thực vật và cũng được tổng hợp bởi Acetobacter xylinum trong điều kiện nuôi cấy

tĩnh Các chuỗi β-1,4-glucan của cellulose I song song với nhau và xếp dọc một trục

Có hai dạng đơn vị điển hình của cellulose I và Iα và Iβ, trong đó Iβ là dạng nhiệt động lực học ổn định hơn

Cellulose II được tạo thành từ Acetobacter xylinum trong điều kiện nuôi cấy lắc

Các chuỗi β-1,4-glucan của cellulose II sắp xếp ngẫu nhiên hay đối song song với nhau bằng một lượng lớn liên kết hydro làm cho cellulose II là dạng cellulose ổn định nhất về nhiệt động lực

2.5.2.2 Độ bền:

BC có trọng lượng nhẹ, ổn định về kích thước, sức căng cao, độ bền cao Đặc biệt là cellulose I có độ bền cao

2.5.2.3 Khả năng hút nước:

Khả năng giữa nước đặc biệt, điều chỉnh độ xốp, độ ẩm cao và chứa dung tích

bề mặt cao Tính chất này đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy in vitro thực vật vì có thể

bổ sung môi trường khi cạn kiệt

2.5.2.4 Lắp ráp màng trực tiếp trong suốt quá trình sinh tổng hợp:

Không cần bước trung gian trong quá trình làm giấy từ bột giấy cũng như trong quá trình dệt từ sợi Tổng hợp được các màng rất mỏng, sạch và cực nhỏ

2.5.2.5 Biến đổi cellulose trực tiếp trong suốt quá trình hình thành:

Làm chậm quá trình kết tinh bằng cách cho thuốc nhuộm vào môi trường Kiểm soát tính chất vật lý của cellulose về trọng lượng phân tử và kết tinh trong suốt quá trình hình thành

2.5.2.6 Biến đổi gen tạo thành cellulose:

Tổng hộp trực tiếp dẫn xuất cellulose như: acetate cellulose, carboxymethylcellulose, methyl cellulose Kiểm soát được trọng lượng phân tử cellulose, cellulose kết tinh dị hình (cellulose I và II)[30]

2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến cấu trúc và tính chất của BC

2.5.3.1 Điều kiện lên men:

Sự hình thành cấu trúc BC phụ thuộc hoàn toàn vào điều kiện nuôi cấy

Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn tích lũy cellulose ở bề mặt canh trường dinh dưỡng Các tiền sợi cellulose được đẩy ra từ các lỗ trên bề mặt tế bào vi khuẩn, kết tinh thành vi sợi bị đẩy xuống sâu hơn trong môi trường Do đó hình thành lớp màng có sự chồng và xoắn của dải cellulose và có tế bào vi khuẩn[8]

Trong điều kiện nuôi cấy lắc, BC hình thành dạng hột nhỏ không đều, các sợi

có thớ hình sao, phân tán trong môi trường theo hướng song song hay vuông góc Sợi cellulose nuôi cấy lắc uốn cong và có chiều rộng lớn hơn sợi cellulose nuôi cấy tĩnh[42]

2.5.3.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng:

Quá trình lên men bề mặt BC tạo lớp màng là mạng cellulose xen lẫn với tế bào

vi khuẩn Acetobacter xylinum Yếu tố dinh dưỡng khác nhau ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của Acetobacter xylinum và khả năng sản sinh ra cellulose khác nhau Do đó, yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng đến cấu trúc của lớp màng BC [22]

2.5.3.3 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng độ muối

BC có hàm lượng ẩm cao (96,5-99%) và khả năng giữ nước cao

Hàm lượng ẩm của BC giảm khi thêm NaCl (05%) và tăng khi pH từ 2 10.Việc tăng nồng độ NaCl và nhiệt độ làm giảm khả năng giữ nước

-Tác động của nhiệt độ không ảnh hưởng đáng kể đến độ ẩm của BC, khi đun sôi hay ở -200C thì độ ẩm của BC không thay đổi Nhiệt độ cao không thay đổi đáng kể cấu trúc sợi BC, còn nhiệt độ lạnh làm tăng tính đàn hồi của sợi BC[38]

2.6 Ứng dụng của Bacterial Cellulose

Với những ưu điểm nổi trội, BC ngày càng được nghiên cứu nhiều và được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm (sản phẩm chính hoặc chất phụ gia), dược phẩm và mỹ phẩm, chăm sóc sức khỏe, môi trường, dầu mỏ, quần áo và giày dép, thể thao và các sản phẩm khác [6]

Bảng 2.5: Một số ứng dụng của BC

Thực phẩm  Món ăn tráng miệng (thạch dừa, snack…)

 Món ăn kiêng (kem ít calo và salad)

 Quần áo và giầy dép có thể tự phân hủy

Dệt  Sản xuất sợi nhân tạo

 Y phục quân đội

Thể thao  Lều lắp ráp

Công nghiệp gỗ  Gỗ nhân tạo

 Giấy đặc biệt để lưu trữ hồ sơ

 Container có độ bền cao Các lĩnh vực khác  Làm màng lọc

 Tả lót có thể tái chế

 Màng rung động âm thanh

 Môi trường nuôi cấy mô thực vật

CHƯƠNG 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm

Đề tài được thự hiện từ tháng 09/2009 đến tháng 12/2009

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Nhân sinh khối Dunaliella salina

- Lên men Acetobacter xylinum và thu nhận Bacterial Cellulose (BC)

- Bước đầu thử nghiệm nuôi cấy Dunaliella salina trên giá thể BC

3.3 Vật liệu và hóa chất

3.3.1 Thu mẫu

Giống Dunaliella salina được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Chuyển

Hóa Sinh Học Bộ môn Công nghệ Sinh học

Giống Acetobacter xylinum do phòng thí nghiệm Chuyển Hóa Sinh Học

Bộ môn Công nghệ Sinh học cung cấp

3.3.2 Trang thiết bị thí nghiệm

Máy đo pH, máy đo OD, cân điện tử, tủ cấy vô trùng, nồi hấp, máy lạnh,

tủ lạnh, máy cất nước, kẹp cấy, dao cấy, chai lọ, ống nghiệm, đĩa petri…

3.3.4 Hóa chất:

 Môi trường nhân giống Dunaliella salina:[MT1]