CÔNG NGHỆ tế bào ĐỘNG VẬT

Chiến lược WGS tránh được các công việc chuẩn bị ban đầu, nhưng cũng có nhiều bất lợi như có nguy cơ cao việc kết hợp nhầm  Ứng dụng và triển vọng của chiến lược  Thuốc phân tử Molecul

Trả lời

1 Khái niệm

Công nghệ sinh học trên người và động vật (CNSHTN&ĐV) là những kỹ thuật

CNSH tiến hành hoặc ứng dụng trên người và động vật Ở nước ta, CNSH trên người

chưa thực sự phát triển thành một lĩnh vực độc lập, nên thường được gọi chung là Công nghệ Sinh học Động vật (CNSH ĐV)

2 Nền tảng khoa học và kỹ thuật

 Genomic và bộ gen người

 Kỹ thuật tế bào động vật in vitro

 Công nghệ Nano và micro

 Cytomics

 Proteomics

3 Genomic và bộ gen người

Genomics là lĩnh vực nghiên cứu về thành phần, tổ chức, chức năng và tiến hóa của thông tin di truyền chứa trong bộ gen

Ba lĩnh vực chính của genomics: hệ gen cấu trúc (structure genomics), hệ gen chức năng (functional genomics), hệ gen so sánh (comparative genomics)

3.1 Hệ gen cấu trúc (structure genomics)

 Là khái niệm để chỉ thành phần và cấu trúc một bộ gen Để tìm hiểu, xác định cấu trúc gen trong bộ gen, cần lập bản đồ di truyền, bản đồ vật lí của chúng

 Bản đồ di truyền (genetic map), hay bản đồ liên kết (linking map) là sự biểu thị vị trí

tương đối của các gen có quan hệ với nhau Trong đó, ít nhất có vài gen đã biết trước chính xác vị trí của chúng trên nhiễm sắc thể (NST) Bản đồ di truyền được thiết lập dựa trên chức năng di truyền thông qua các thí nghiệm tái tổ hợp

 Bản đồ vật lí (physical map) được thiết lập dựa trên sự phân tích trực tiếp DNA và

khoảng cách giữa các gen được đo theo thông số cặp base, Kilobase hay Megabase (bp, Kb, Mb) Bản đồ vật lý sẽ cung cấp thông tin về vị trí các gen, các DNA marker

và sự phân mảnh của NST Thông tin này giúp định vị và lắp đặt các mảnh DNA sau khi được giải trình tự vào trong bộ gen, sao cho đúng vị trí của chúng

 Để lập bản đồ vật lý, bộ gen của sinh vật được cắt thành những mảnh nhỏ

 Bản đồ vật lý có độ phân giải cao hơn bản đồ di truyền, độ chính xác cao hơn

 Nhiều kỹ thuật hiện đại giúp bản đồ vật lý:

 Bản đồ dựa trên các vị trí cắt giới hạn

 Bản đồ dựa trên các điểm đánh dấu trình tự (Sequence tagged site – STS)

 Bản đồ dựa trên các phương pháp lai tại chỗ, có gắn chất huỳnh quang

 (Flourescent in situ hydridization – FISH)

 Giải trình tự DNA

3.2 Hệ gen chức năng (Functional genomics)

 Chỉ định các gen, nhận diện và tổ chức các gen này và quan trọng nhất là chỉ ra được chức năng của chúng

 Mục đích chính của hệ gen chức năng bao gồm cả việc chỉ định tất cả các phân tử RNA phiên mã từ genome và tất cả các protein được mã hóa từ trong bộ gen

 Có thể sử dụng các công cụ tin sinh học như:

 Dự đoán chức năng gen từ trình tự gen

 Phương pháp dò tìm chức năng theo hướng đồng dạng

 Phương pháp dò tìm chức năng dựa trên sự so sánh vùng chủ đạo

 Phương pháp dò tìm chức năng gen dựa trên chất biểu hiện phát sinh chủng loài (phylogenetic profile method)

 Phương pháp Rossetta Stone

 Phương pháp hàng xóm gen (gene neighbor method)

 Kĩ thuật microarray

 Xét nghiệm đột biến

3.3 Hệ gen so sánh (comperative genomics)

 Cung cấp thông tin về thành phần và tổ chức của hệ gen, không chỉ của các loài khác nhau mà có thể của những thành viên của cùng một loài => suy luận về chức năng của gen và sự tiến hóa của genome

 Ở mức độ DNA, người và các sinh vật khác có rất ít khác biệt Đến nay, người ta đã hoàn thành việc lập bản đồ bộ gen của các sinh vật mô hình bao gồm tinh tinh, chuột, ruồi giấm, giun tròn, nấm men, E.coli… và gần đây là chuột túi (2/2005) Các sinh vật này được sử dụng để so sánh, tìm hiểu bộ gen người

 Chiến lược giải trình tự bộ gen người

 Kĩ thuật “shotgun” là kỹ thuật xác định trình tự gen bằng cách chia nhỏ đoạn gen, xác định trình tự sau đó sẽ được lắp ghép lại

 Shotgun theo cấp bậc (HS – Hierarchical shotgun): Trong chiến lược này, bộ gen

được làm vỡ thành một nhóm các clone trung bình như các NST nhân tạo vi khuẩn Trình tự của mỗi BAC được xác định bằng giải trình tự shotgun, và trình tự của bộ gen được tạo ra bằng cách nối các trình tự BAC Chiến lược HS cung cấp một con đường chắc chắn cho sản xuất trình tự chính xác

 Shotgun cả bộ gen (WGS – Whole genome shotgun): Trong chiến lược này, bộ gen được làm vỡ thành những trình tự read ngẫu nhiên riêng lẻ, sau đó chúng được kết hợp lại thành bộ gen hoàn chỉnh Chiến lược WGS tránh được các công việc chuẩn bị ban đầu, nhưng cũng có nhiều bất lợi như có nguy cơ cao việc kết hợp nhầm

 Ứng dụng và triển vọng của chiến lược

 Thuốc phân tử (Molecular medicine)

 Các nguồn năng lượng và các ứng dụng môi trường

 Đánh giá rủi ro

 Sinh khảo cổ, nhân loại học, tiến hóa và sự di cư người

 DNA pháp y (DNA forensic)

 Nông nghiệp, sinh sản vật nuôi và chế biến sinh học

Câu 2: Trình bày những hiểu biết của bạn về PROTEOMICS, CYTOMICS, CÔNG NGHỆ NANO VÀ MICRO?

kích thước của proteome thường lớn hơn so với số lượng gen

2 Các công cụ của proteomics:

 Công cụ đầu tiên của proteomics là dữ liệu: Các dữ liệu protein, EST (expressed sequence tag) và trình tự bộ gen được thu thập tạo ra mục lục các protein được biểu hiện trong sinh vật

 Công cụ thứ hai là khối phổ (Mass spectrometry – MS):

 Cung cấp sự đo lường chính xác khối lượng phân tử của một protein nguyên vẹn như 100 kDa hay hơn

 Cung cấp sự đo khối lượng chính xác các peptide từ quá trình protolytic

 Cung cấp các trình tự của peptide từ quá trình thủy giải

 Công cụ thứ ba là các phần thu gom: Kết hợp các dữ liệu MS với các trình tự protein đặc biệt có sẵn trong cơ sở dữ liệu Các phần mềm này sẽ lấy các dữ liệu MS không được giải thích rõ ràng và kết hợp nó với những trình tự ở cơ sở dữ liệu protein, hay EST và trình tự bộ gen với các thuật toán đặc biệt

 Công cụ cần thiết thứ tư là kỹ thuật phân tách protein: Sự phân tách các protein làm đơn giản các hỗn hợp protein thành các protein đơn lẻ hay các nhóm nhỏ và chúng cho phép phát hiện các khác biệt trong các mức độ protein so sánh giữa hai mẫu

3 Các ứng dụng của proteomics

 Khai thác: Là một áp dụng đơn giản của việc xác định tất cả (hay một lượng lớn) các protein trong một mẫu Mấu chốt của mining là sắp xếp proteome trực tiếp hơn là suy luận thành phần của proteome từ các cơ sở dữ liệu biểu hiện gen

 Ghi nhận sự biểu hiện đặc biệt: Là sự xác định các protein trong một mẫu đặc biệt, cũng như chức năng của một trạng thái đặc biệt của tế bào hay cơ thể hay chức năng của sự tiếp xúc với thuốc, các kích thích hóa lí Sự ghi nhận biểu hiện là một dạng đặc biệt của khai thác được áp dụng phổ biến

 Lập các sơ đồ mạng lưới protein: Là một chiến lược proteomics để xác định, làm thế nào các protein tương tác với nhau trong các hệ thống sống Hầu hết các protein biểu hiện những chức năng của nó trong sự kết hợp gần gũi với các protein khác

 Lập bản đồ các biến đổi protein: Là vấn đề xác định làm thế nào và ở đâu các protein

bị biến đổi Nhiều biến đổi sau dịch mã điều khiển mục tiêu, cấu trúc, chức năng và sự lưu thông đổi mới của các protein

 Công nghệ nano liên quan đến khả năng sắp xếp các phân tử và các nguyên tử thành các cấu trúc phân tử Nó có tác động chính lên máy tính, các vật liệu và sự sản xuất các công cụ, thiết bị, khả năng can thiệp vào các cấp độ điều trị bệnh.

 Các kỹ thuật thiết kế máy micro đang phát triển nhanh chóng và có nhiều ứng dụng trong các vi dòng (microfluidic), trong các sensor, sợi quang học…

 Ứng dụng microrobot và các nanorobot trong cơ thể người là điều cần thiết, nhằm phát triển các hoạt động có mục tiêu của thiết bị, như tách bỏ vật chướng ngại (cục máu đông), tạo các cấu trúc giàn (scaffold), đo các chỉ tiêu tế bào…

 Sự ra đời của biochip là một tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học nano, chúng chứa đựng một phạm vi rộng các vấn đề nghiên cứu như genomics, proteomics, sinh học máy tính và dược học, cũng như một số hoạt động khác

 Kỹ thuật tế bào động vật IN VITRO

 Nuôi cấy các tế bào động vật lượng lớn là nền tảng của sản xuất vaccine virus và nhiều sản phẩm công nghệ sinh học khác Các chất sinh học được sản xuất bằng

kỹ thuật DNA tái tổ hợp trong nuôi cấy tế bào động vật như enzyme, hormone, các kháng thể đơn dòng, interleukin… hay nhân tố kháng ung thư

 Tuy mới phát triển, nhưng các tế bào gốc (stem cell) đã hứa hẹn nhiều ứng dụng to lớn trong y sinh học

Câu 3: Cho biết các thành tựu điển hình của công nghệ tế bào động vật? Nêu các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản?

2.1 Kĩ thuật IVF (in vitro fertilization):

 Thụ tinh trong ống nghiệm trên người được tiến hành từ năm 1961 nhưng mãi đến năm 1978 mới có em bé đầu tiên ra đời (bé Louise Brown) Năm 1982, Brackett và

cộng sự (cs), đã nuôi và sử dụng tế bào trứng chín in vitro (của bò) Từ đó, công nghệ

này phát triển vượt bậc

 Thụ tinh trong ống nghiệm thường kết hợp với kỹ thuật chuyển phôi vào tử cung hay

cấy truyền hợp tử Để tăng hiệu quả, người ta còn thử nghiệm kỹ thuật chuyển giao tử vào vòi trứng hay cấy chuyển phôi vào vòi trứng của động vật mang

2.2 Kĩ thuật ICSI (Intracytoplasmic sperm injection)

 Là kỹ thuật bơm tinh trùng vào trứng với sự hỗ trợ của những thiết bị hiện đại Tuy

mới ra đời (1993) nhưng ICSI đã cho thấy hiệu quả trong việc điều trị vô sinh, đặc biệt là vô sinh do khả năng sống và hoạt động của tinh trùng kém kỹ thuật này đã thành công ở thỏ, bò, ngựa, chó, heo, ngựa vằn… ICSI điều trị vô sinh trên người cũng đã thu được những kết quả tốt

 Tuy nhiên, kỹ thuật ICSI cũng có thể ẩn chứa nhiều nguy cơ:

 Sự lan truyền những bệnh di truyền tiềm ẩn, bởi vô sinh nam thường do sự bất thường về NST hay những bất thường khác về mặt di truyền

 Sự không nhất quán chất lượng, thiếu chuẩn hóa tự nhiên của tinh trùng

 Tiến trình sinh học của sự thụ tinh không hoàn chỉnh

 Có khả năng sai lệch trong sự biểu hiện gen Trường hợp này thường xảy ra khi sử dụng tinh trùng chưa trưởng thành

2.3 Kĩ thuật ROSI (Round spermatid injection – tiêm những tinh trùng hình tròn)

 Đang mở ra hy vọng mới cho những trường hợp nam không thể sản xuất tinh trùng Đây là những tế bào hình thành trong quá trình sinh tinh, mang bộ NST đơn bội, nhưng không có khả năng kích hoạt trứng ở giai đoạn giảm phân II

 Chuyển phôi (hay cấy chuyền) là quá trình đưa phôi vào cá thể cái nhận

 Chuyển phôi thường kết hợp với một số kỹ thuật hỗ trợ khác như thụ tinh trong ống nghiệm, cắt phôi, đông lạnh… được ứng dụng để nhân nhanh các động vật nuôi, đặc biệt là bò

 Điều khiển giới tính phôi là xác định giới tính thông qua phôi có thể được thực hiện qua việc chọn lọc giới tính tinh trùng, hoặc xác định trực tiếp giới tính của phôi Xác định giới tính tinh trùng dựa vào tính tích điện hay khối lượng riêng của tinh trùng mang NST X hay Y, hoặc dựa vào kiểu hình khác biệt giữa tinh trùng mang NST X

và Y Máy flow cytometer cho hiệu quả chọn lọc giới tính rất cao Phương pháp miễn dịch cũng được ứng dụng thông qua việc xác định

 Thể Barr hay phân tích NST tế bào phôi Các phương pháp di truyền có thể xác định giới tính phôi ở giai đoạn sớm 12-14 ngày tuổi

2.4 Tạo dòng (cloning)

 Là tạo ra một bản copy của một cá thể nào đó

 Cừu Dolly là động vật có vú đầu tiên được nhân dòng từ tế bào 2n trưởng thành

 Năm 2004, một con chuột được tạo dòng bằng cách sử dụng bằng cách dùng nhân của

tế bào thần kinh khứu giác

 Có thể tạo dòng các động vật bằng hai phương pháp: cắt phôi hay chuyển nhân Tuy nhiên, khi đề cập đến tạo dòng vô tính, người ta thường nghĩ đến việc nhân bản (cloning), đó là việc chuyển nhân (2n) của tế bào sinh dưỡng

 Ngày nay, với sự hoàn thiện của kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật, dựa trên nguyên lý của tạo dòng bằng cắt phôi, kỹ thuật tạo dòng phôi (embryo cloning) được ra đời Trong những phương pháp này, phôi ở giai đoạn sớm (morula chẳng hạn, hay sớm hơn) được tách ra thành từng tế bào và nuôi cấy riêng lẻ, sau một thời gian chúng sẽ

có khả năng tạo ra một phôi mới hoàn chỉn

 Trong chuyển nhân các tế bào phôi, tế bào cho nhân được thu nhận từ giai đoạn blastocyst Từ tế bào phôi ở giai đoạn này đã thể hiện một số gen nền (paternal gene) vốn không có ở nhân của tế bào trứng trưởng thành Trong chuyển nhân tế bào sinh dưỡng, người ta cũng đã tiến hành thu nhận nhân tế bào của bất kì cơ quan nào để chuyển sang tế bào trứng đã loại nhân trước đó

 Những rủi ro có thể xảy ra ở những động vật tạo dòng vô tính bằng nhân tế bào trưởng thành bao gồm:

1 Sai sót xảy ra trong quá trình thao tác khi mà gen và tế bào tái thiết lập chương trình (reprogramming)

2 Lỗi trong quá trình sao chép

3 Sự không phù hợp trong điều hòa hoạt động giữa DNA ti thể của tế bào nhận và DNA nhân của tế bào cho

2.5 Kĩ thuật IVM (in vitro maturation – nuôi chín trong ống nghiệm):

 Nhằm thu nhận và làm chín các tế bào sinh dục Việc này có ý nghĩa lớn đối với các bệnh nhi được điều trị bằng những tác nhân có khả năng gây đột biến di truyền

 Nguồn tế bào sinh dục thu từ mẫu mô thường được sử dụng để tiến hành ICSI, nhờ

đó, những người này khi trưởng thành vẫn có thể có con bình thường

Câu 4: Hãy cho biết quy trình tạo động vật chuyển gen?

Trả lời

1 Quy trình

(1) Gen có chức năng nào đó được lựa chọn và phân lập trong phòng thí nghiệm

(2) Một con vật cho được gây siêu bài noãn và thu hoạch phôi từ ống dẫn trứng

(3) Gen được đưa vào trứng được thụ tinh bằng kỹ thuật vi tiêm

(4) Phôi chuyển gen được đưa vào con vật nhận mà có thể cho ra đời con non có gen

đã chuyển

(5) Kiểm tra con non đối với gen mới chuyển, lai tạo để tạo con non có tính ổn định di truyền về tính trạng mới

2 Một số đặc điểm về ứng dụng động vật chuyển gen

 Tuy nhiên những ứng dụng này tiềm ẩn nhiều rủi ro, đáng lo ngại cho người sử dụng

 Nguy cơ lớn nhất là việc xuất hiện nhiều virus gây bệnh do sự tái tổ hợp giữa trình tự của vector chuyển gen với các virus nội sinh

 Những ứng dụng của dị ghép có thể sẽ cứu sống được nhiều bệnh nhân

 Hiện tại động vật duy nhất được dùng để thu nhận mô cấy ghép là heo

 Việc cấy ghép bao gồm nhiều kỹ thuật phức tạp: Cấy nhưng tế bào đơn, ghép mô

hay cấy ghép cả cơ quan trọn vẹn…

 Dị ghép có thể đưa đến những rủi ro lớn cho người nhận mô ghép:

 Các tác nhân gây ngoại nhiễm và retrovirus nội sinh, về nguyên tắc, chúng có thể truyền nhiễm từ cơ thể này sang cơ thể khác, hay qua sinh sản

 Các tác nhân trên đều có thể vô hiệu bằng biện pháp ngăn chặn thích hợp (tiêm chủng, chọn lọc loại bỏ…) mặc dù rất khó khăn, vì chúng tồn tại số lượng lớn, đa dạng, trong khi chuẩn đoán hiệu quả chưa đủ cơ sở

 Nảy sinh nhiều tranh cãi về tính an toàn của người tiêu dùng và môi trường: Liệu có thể loại bỏ hết toàn bộ hoạt tính của của các sản phẩm chuyển gen bằng những hình thức chế biến thông thường như nấu chín?… Nguy cơ gây di ứng đối với người tiêu dùng, độc tố của sản phẩm đối với sức khỏe người tiêu dùng, rủi ro về môi trường của thủy sinh vật chuyển gen…

Câu 5: Tế bào gốc là gì? Những mặt thuận lợi và khó khăn của việc ứng dụng tế bào gốc?

Trả lời

1 Khái nhiệm

Tế bào gốc (stem cell) là những tế bào có khả năng trẻ hóa lâu dài và có thể hoạt hóa thành các loại tế bào chức năng khác…

2 Ứng dụng của tế bào gốc có thể theo các hướng

1 Thay thế mô hoặc cơ quan

2 Sửa chữa những tế bào đã bị hỏng

3 Phương tiện (vector) cho những liệu pháp di truyền

4 Phương tiện (vector) cho những tác nhân liệu pháp hóa học

 Chỉ 25% trứng được nhân dòng trở thành phôi

 Khoảng 5% trong số đó phát triển thành dòng tế bào

 Chi phí điều trị bằng liệu pháp này cao

 Những câu hỏi đặt ra khi hướng đến liệu pháp tế bào gốc

 Có chắc chắn rằng những tế bào gốc phôi nuôi cấy in vitro sẽ cho ra tất cả các loại

tế bào của một cơ thể trưởng thành hay không?

 Có chắc chắn rằng những tế bào gốc phôi khi nuôi cấy in vitro sẽ có chức năng

giống như chúng phát triển bình thường trong phôi hay không?

 Có chắc là khi đem nuôi cấy in vitro những tế bào gốc phôi, chúng sẽ không bị đột

biến? Khó khăn vẫn là vấn đề đạo lý và pháp luật

Câu 6: Trình bày ứng dụng của công nghệ tế bào động vật trong chẩn đoán bệnh? Trả lời

 Chẩn đoán bệnh là những kỹ thuật tiên lượng khả năng mắc bệnh, hay nguyên nhân mắc bệnh do nhưng tác nhân khác nhau gây ra

 Chẩn đoán bệnh được chia thành ba phương pháp: chẩn đoán trực tiếp, chẩn đoán gián tiếp và phương pháp huyết thanh

 Chẩn đoán trực tiếp dựa vào đặc điểm khác biệt, đặc trưng của từng tác nhân gây bệnh để nhận diện chúng

 Chẩn đoán gián tiếp thường sử dụng là nuôi cấy tác nhân gây bệnh (vi khuẩn, virus, nấm, kí sinh trùng)

 Phương pháp huyết thanh???

 Sự tiến bộ của y sinh học đã giúp việc chẩn đoán phân tử thể hiện được nhiều lợi thế (độ nhảy cao, nhanh, chẩn đoán được những bệnh mà trước kia không thể tiến hành như các bệnh di truyền ung thư…).

 Sự ra đời của AND chip, Cellchip, Tissuechip, Biosensor… cho thấy lợi ích to lớn của chẩn đoán phân tử Tuy nhiên chúng còn những giới hạn nhất định, đặc biệt là những vấn đề đạo lý, khi chẩn đoán bệnh di truyền ở thai nhi hay chẩn đoán tiền thai

Câu 7 : Trình bày ứng dụng của công nghệ tế bào động vật trong liệu pháp gen? Trả lời

 Một đột biến gen sẽ làm thay đổi hoạt động của enzyme, tạo ra hoặc tích trữ một chất độc nào đó, hoặc thiếu thành phần thiết yếu cho hoạt động của tế bào

 Chẳng hạn, có một đột biến xảy ra trong gen sẽ mã hóa cho enzyme phenylalanine dehydroxylase, khiếm khuyết này đã làm amino acid phenyalalanine không thể biến đổi thành tirosine Hậu quả là ảnh hưởng lên mô thần kinh

 Bởi sự phức tạp trong biểu hiện sinh lí của những gen đột biến, cho nên việc điều trị bệnh luôn phải được thực hiện với nhiều phương pháp khác nhau

 Loại bệnh mà hậu quả gây nên các khiếm khuyết trong cơ chế chuyển hóa, thì việc

ăn kiêng với cơ chất của enzyme là cần thiết

 Liệu pháp thay thế thường được sử dụng các bệnh suy giảm miễn dịch trầm trọng hemophilia, bệnh Gaucher Cấy nghép tủy xương, hay cơ quan thường được ứng dụng hoặc thay thế cho các mô đã bị tổn thương

 Chữa trị thông qua việc thay thế những gen hỏng bằng gen lành

 Khó khăn của liệu pháp gen:

 Gen liệu pháp tồn tại trong thời gian ngắn

 Sự đáp ứng miễn dịch cơ thể nhận gen

 Rủi ro từ các vector virus

 Khiếm khuyết đa gen (gây việc khó khăn điều trị bằng liệu pháp gen)

 Liệu pháp gen còn được sử dụng điều trị một số bệnh nan y khác

Câu 8 : Trình bày ứng dụng của công nghệ tế bào động vật trong vật liệu y sinh?

Trả lời

 Vật liệu sinh học (Bio-material) có thể có nguồn gốc tổng hợp nhân tạo, hay tự nhiên, chúng có khả năng thay thế bộ phận cơ thể sống về cấu trúc, đồng thời đảm nhiệm

chức năng (hay một phần chức năng) của bộ phận ấy và nhất thiết phải tương thích sinh học với cơ thể.

 Những tiến bộ trong y học và điều trị bệnh bằng kháng sinh đã làm giảm thiểu nguy

cơ truyền nhiễm, điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc chế tạo vật liệu thay thế Nhiều khớp nối và bộ phận thiết yếu của cơ thể có thể bị bào mòn và phải được thay thế giúp con người duy trì một cuộc sống tốt hơn

 Vật liệu sinh học ngày càng đóng vai trò thiết yếu trong việc thay thế và cải thiện chức năng của mọi hệ thống chính trong cơ thể (hệ xương, hệ tuần hoàn …)

 Những hoạt chất sinh học nhân tạo đã được dùng trong phẫu thuật tim mạch vào năm

1952 Sau đó là những bước cải tiến để tái cấu trúc mảnh ghép, tăng tính tương hợp sinh học cho mảnh mô được cấy

 Để tái cấu trúc những động mạch lớn như động mạch chủ, động mạch chậu, người ta

sử dụng nhưng mạch ghép tổng hợp từ ePTFE hoặc Dacron

 Trong suốt những thập niên 90, những vật liệu và các bộ phận nhân tạo đã phát triển đến mức có thể thay thế nhiều bộ phận con người Mảnh ghép thành công đầu tiên là đĩa xương, dùng ổn định vị trí xương gẫy, đẩy nhanh quá trình lành hóa

 Sau đó là những thử nghiệm về kỹ thuật vật liệu và công nghệ phẫu thuật thay thế mạch máu Van tim và khớp háng được phát triển vào thập niên 60 của thế kỉ trước Ngay khi có mảnh ghép đĩa xương, người ta phát hiện chúng bị mất chức năng nhanh chóng do sự ăn mòn hóa học và sự thiếu tính tương hợp sinh học Thiết kế, thu nhận vật liệu và sự tương hợp sinh học

 Ngoài các vật liệu có chức năng vật lý, thời gian gần đây, CNSH cũng đã phát triển hàng loạt vật liệu có tính chất sinh hóa, đó là các màng sống có cố định thuốc và tế bào, nhằm ứng dụng trị liệu hoặc phát triển công nghệ tế bào động vật…

CHƯƠNG 2: TỔ CHỨC PHÒNG THÍ NGHIỆM Câu 1 Thiết kế PTN

Trả lời

 Phòng thí nghiệm nên được thiết kế với các nguyên liệu chất lượng tốt, phù hợp, đảm bảo an toàn và hoạt động hiệu quả

 Khi thiết kế phòng thí nghiệm, các khu thao tác khác nhau phải được tách rời, đặc biệt

là khu nhận mẫu Nếu các thao tác không thể hiết kế cách biệt nhau thì tất cả các thao tác ở khu vực này phải tuyệt đối vô trùng

 Các bề mặt làm việc và nền nhà, bề mặt cần nhẵn bóng, dễ dàng lau chùi giữa các lần thao tác Phải có kế hoạch và kĩ thuật tốt để giảm thiểu rủi ro nhiễm xảy ra

 Các bề mặt tiếp xúc nên được thiết kế bằng vật liệu không hoặc ít thấm nước, chịu được hóa chất như kiềm, acid, chất tẩy tại khu vực sử dụng cho việc bảo quản các mẫu trong nito lỏng, nền nhà phải chịu được sự gây nứt vỡ nếu nito chảy ra

 Phòng thí nghiệm phải được bảo trì, kiểm tra chất lượng định kì bởi các nhà bảo hành hay các chuyên gia Phòng được vô trùng định kì bằng UV hay tác nhân khác

Câu 2 Một số thiết bị trong PTN

Trả lời

1 Thiết bị thiết yếu:

1.1 Buồng thao tác an toàn vsv

 Buồng thao tác an toàn vi sinh vật là loại thiết bị phổ biến và quan trọng nhất trong các thiết bị sử dụng, nhằm tạo không gian vô trùng Sản phẩm được bảo vệ thông qua

hệ thống màng lọc HEPA

 Các buồng thaotác có thể thông ra bên ngoài không khí, hay tuần hoàn qua màng lọc HEPA thứ hai trước khi chuyển vào không khí

 Mức độ nhiễm phụ thuộc vào các lớp buồng khác nhau và chất lượng màng lọc

 Buồn thao tác nên được kiểm tra định kì 6 tháng một lần, kiểm tra lại dòng khí và phin lọc HEPA

 Kiểm tra mức độ vô trùng bên trong không gian buồng cấy bằng cách đặt môi trường agar TSB trong ít nhất 4h Buồng thao tác tốt sẽ không xuất hiện nhiễm vi khuẩn trên đĩa chứa môi trường/

1.2 Tủ ấm

 Là thiết bị tạo ra yếu tố lí hóa cần thiết để kết hợp một cách hữu cơ với thành phần của môi trường nuôi tế bào và cần được kiểm soát nghiêm ngặt tủ nuôi thường được cài đặt nhiệt độ 28-370C, 5-10%CO2

 CO2 và O2 nên được kiểm tra định kì để đảm bảo duy trì nồng độ khí mong muốn trong tủ nuôi Nhiệt độ tủ ấm nên được kiểm tra với NAMAS hay nhiệt kế thích hợp

 Sự khác biệt giữa nuôi cấy in vitro và in vivo đó chính là giá thể để tế bào phát triển.

 Tế bào có thể bám và biệt hóa chức năng nhờ ECM (chất nền ngoại bào)

 ECM là các thành phần cơ bản trong liên kết mô có ở các cơ quan sống (collagen, lamimin và fibronectin )

 EMC được sử dụng trên bề mặt các dụng cụ nuôi cấy để tăng cường khả năng bám dính cúa tế bào

 Một số tế bào cần bám dính vào giá thể để phát triển

CHƯƠNG 3: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Câu hỏi

Câu 1: Nêu đặc điểm của tế bào động vật? Phân tích những ảnh hưởng của các đặc điểm đó tới quá trình nuôi cấy tế bào động vật?

Câu 2: Nêu các cấp độ nuôi cấy mô và tế bào động vật?

Câu 3: Phân tích mối quan hệ giữa tế bào và giá thể nuôi? (TRÙNG CÂU 3 CHƯƠNG 2)Câu 4: Phân tích điều kiện lí-hóa trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào?

Câu 5: Trình bày các thành phần môi trường cơ bản và vai trò trong nuôi cấy tế bào động vật?

Câu 6: Phân tích vai trò của huyết thanh trong môi trường nuôi cấy tế bào động vật?

Câu 7: Nuôi cấy sơ cấp là gì? Nêu tóm tắt quy trình nuôi cấy sơ cấp?

Câu 8: Nêu một số enzym và cơ chế cắt của chúng trong tách tế bào sử dụng cho nuôi cấy tế bào động vật?

(cả nhà đọc pp tách cơ học và 1 số pp khác nhé)

Câu 9: Tóm tắt quy trình trypsin ấm là trypsin lạnh được sử dụng để tách tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật?

Câu 10: Nêu quy trình nuôi cấy tế bào sơ cấp? Nên lưu ý những vấn đề gì?

Câu 11: Tại sao phải tiến hành cấy chuyền? Nêu các thao tác cấy chuyền?

Câu 12: Dòng tế bào là gì? Nêu các kỹ thuật chọn tạo dòng tế bào?

Câu 13: Trình bày vai trò và quy trình xây dựng đường cong tăng trưởng?

Câu 14: Trình bày và phân tích các hình thức nuôi cấy?

Câu 15: Nêu các ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật?

Bổ sung

Câu 16: Nêu quá trình nuôi cấy không huyết thanh

Câu 17: Nêu hiệu quả trải (Plating efficiency)

Câu 18: Nêu phương pháp cơ học để tách tế bào

Trả lời Câu 1: Nêu đặc điểm của tế bào động vật? Phân tích những ảnh hưởng của các đặc điểm đó tới quá trình nuôi cấy tế bào động vật?

Trả lời:

1 Tính cơ học yếu

 Tế bào động vật không có vách, kích thước lớn (khoảng 10 μm) => tính bền cơ học yếu

 Tế bào động vật invitro rất dễ vỡ do khuấy trộn, thao tác, ly tâm không quá 100rmp

=> Thời gian thao tác cần ngắn, bảo quản di chuyển nhẹ nhàng

2 Tăng trưởng và phân chia chậm

 Chu kỳ tế bào trong điệu kiện sinh lý 20-40 giờ

 Hiệu suất sản sinh các chất có hoạt tính sinh học của tế bào thấp và chậm

=> Cần thời gian dài và khối lượng tế bào lớn để sản xuất các chất có hoạt tính từ tế bào động vật

3 Cơ chế kìm hãm ngược (negative feeb-back)

 Cơ chế ức chế sự tổng hợp và tiết ra ngoài môi trường của một chất nào đó là sự gia tăng nồng độ của chất này trong môi trường

 Thay môi trường là cần thiết

 Trong ptn, cơ chế ức chế ngược còn gây tổn thương thế bào, thậm chí làm chết hàng loạt

4 Tính chất cần giá đỡ

 Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia

 Tế bào ngừng phân chia khi đã hình thành lớp đơn liên tục trên bề mặt giá thể

 Tuy nhiên, một số dòng ung thư, dòng tế bào liên tục từ mô bình thường sau khi được thuần hóa, có thể sinh trưởng và phân chia trong trạng thái lơ lửng

5 Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

 Do quá trình dung hợp hai tế bào có nhân khác nhau-> tế bào lai

 Hoặc quá trình biến nạp: ví dụ: tế bào bình thường mang đặc tính của tế bào ung thư thông qua quá trình biến nạp bởi một virus cảm ứng hoặc hóa chất

6 Có thể bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu

 Các dòng tế bào có thể được bảo quản đông lạnh sâu trong nito lỏng (-196oC) trong nhiều năm

 Khi được giải đông và hoạt hóa, tế bào khôi phục khả năng tăng trưởng và phân chia như ban đầu

7 Các đặc tính khác

 Kém thích nghi với môi trường

 Nhạy cảm với ion kim loại

 Cần hormone, huyết thanh, để tăng trưởng và phân chia

Câu 2: Nêu các cấp độ nuôi cấy mô và tế bào động vật?

Trả lời

1 Nuôi cấy cơ quan

 KT nuôi cấy cơ quan được phát triển từ các phương pháp nuôi cấy mô nhằm phục vụ nghiên cứu

 Những mảnh của một cơ quan hay cả cơ quan được nuôi cấy in vitro, vấn đề chính là

duy trì cấu trúc của mô và hướng nó phát triển bình thường

 Môi trường nuôi cấy cơ quan được chế tạo cùng cách với môi trường nuôi mô, gồm môi trường rắn và lỏng

 Nuôi cấy cơ quan thu nhận từ phôi thai dễ dàng hơn các cơ quan từ cơ thể trưởng thành Do đó để nuôi được cơ quan từ cơ thể trưởng thành phải sử dụng môi trưởng với các thiết bị đặc biệt

2 Nuôi cấy mô

 Nuôi cấy mô phát triển sơ cấp được tiến hành bằng cách đặt các mảnh mô lên trên bề mặt rắn bằng nhựa, thủy tinh bao phủ các chất dinh dưỡng dạng lỏng

 Trong điều kiện thích hợp, các mảnh mô sẽ bám vào bề mặt rắn, các tế bào ở phần rìa của mảnh mô tăng sinh làm nới rộng mảnh mô

 Thuận lợi của nuôi cấy mô

 Có thể kiểm soát môi trường: yếu tố lí hóa như nhiệt độ, pH, CO2, O2, áp suất thẩm thấu có thể được kiểm soát tốt hầu hết các loại môi trường cần bổ sung huyết thanh có giá thành cao và chứa các yếu tố không xác định như hoarmone và các thành phần điều hòa khác Tuy nhiên dần dần chức năng của protein này đã được hiểu và thay thế bởi những thành phần xác định

 Tính đồng nhất của mẫu: sau vài thế hệ nuôi cấy in vitro, các dòng tế bào trở nên

đồng nhất ở mỗi lần cấy truyền, mỗi lần nhân lên, mẫu sẽ nhân lên, đặc tính của dòng được duy trì qua nhiều thế hệ

 Kinh tế: những tế bào nuôi cấy có thể tiếp xúc trực tiếp với một chất ở nồng độ thấp và xác định, chất này có thể xâm nhập trực tiếp vào tế bào

 Khó khăn của nuôi cấy mô

 Sự thành thạo của người thao tác: KT nuôi cấy mô TB dv cần được thực hiện trong điều kiện vô trùng tuyệt đối Hơn nữa TBDV đa bào không thể tồn tại ở dạng cô lập, không sống được nếu không được cung cấp một môi trường hợp Do

đó cần một mức độ kĩ năng và hiểu biết của người thực hiện để đánh giá đúng những yêu cầu của hệ thống và phán đoán những khó khăn nảy sinh

 Số lượng: tiêu hao nhiều công sức + tiền bạc nhưng thu được lượng nhỏ Giá thành nuôi cấy cao nên chỉ sử dụng khi thật cần thiết

 Sự không ổn định: do sau một time phân chia liên tục tạo thành các TB với bộ NST đa bội không hoàn chỉnh Ngay cả với nuôi cấy trong time ngắn, mặc dù các

TB có thể ổn định vê mặt di truyền, nhưng sự không đồng nhất về tốc độ tăng trưởng của từng tế bào có thể tạo ra sự thay đổi từ thế hệ này snag thế hệ khác

3 Nuôi cấy tế bào

 Nuôi cấy sơ cấp: phương pháp sử dụng các tế bào sau khi được tách từ các mảnh mô

và trước lần cấy chuyền đầu tiên Quy trình: thu nhận các mảnh sinh phẩm, các mảnh

mô sống xử lí sơ bộ để loại vi khuẩn, nấm, các thành phần không mong muốn tách để tạo huyền phù tế bào đơn trước khi nuôi cấy

 Nuôi cấy thứ cấp: tiến hành sau khi tế bào được tạo dòng từ nuôi sơ cấp

 Nuôi cấy huyền phù: thường được tiến hành với các tế bào thu nhận từ máu Đây là phương pháp nuôi cấy trong không gian 3 chiều với kĩ thuật nhân sinh khối bằng fermenter, thông qua hệ thống bioreacter nhằm thu nhận một lượng lớn tế bào mong muốn

 Nuôi cấy lớp đơn: ứng dụng với những dòng tế bào khác thu nhận từ các mô rắn( phổi, thận, cơ, xương, mỡ) cần nuôi phát triển thành lớp đone Các dòng tế bào bám dính có thể được phân loại như tế bào nội mô, tế bào biểu mô, mô thần kinh

Câu 3: Phân tích mối quan hệ giữa tế bào và giá thể nuôi?

Trả lời

 Sự khác biệt rõ ràng giữa môi trường in vitro và in vivo là bề mặt để tế bào sống bám

vào, và hình dạng mà tế bào đó thể hiện trên bề mặt của giá thể

 Tế bào sống có thể bám, phát triển và biệt hóa chức năng trong nuôi cấy, nhờ những phát hiện cho biết các thành phần làm nên chất nền ngoại bào (extra cellualr matrix-ECM)

 ECM là hành phần màng cơ bản trong liên kết mô, có ở tất cả các cơ quan sống ( thường là collagen, lamimin, fibronectin, ) => làm tăng sự bám dính của tế bào nuôi cấy

 Huyết thanh cũng chứa các nhân tố bám dính ở dạng hòa tan như fibronectin => HT góp phần làm tế bào nhanh chóng bám vào bề mặt nuôi.

 Đặc điểm bám dính của tế bào trong nuôi cấy

 Hầu hết các tế bào động vật đều bám vào một cấu trúc trong mô liên kết, màng cơ bản hay chất nền khoáng (như xương)

 Một số tế bào phát triển in vivo nhưng không thể phát triển in vitro, nếu không có thể

bám vào đĩa nuôi (hay các tế bào khác) chúng sẽ chết

 Các tế bào khối u hoặc bị biến đổi in vitro thường mất nhu cầu bám dính, có thể phát

triển trong môi trường huyền phù Ngoài ra một số loại tế bào lymphocyte không bám dính và giá thể

 Nếu tế bào bám dính vào bề mặt nuôi cấy, chúng sẽ có hình dài, trải rộng trên bề mặt đáy hộp nuôi, ngược lại, nếu không bám dính, tế bào sẽ có hình khối cầu đều

Câu 4: Phân tích điều kiện lí - hóa trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào?

Trả lời

1 Nhiệt độ

 Hầu hết các tế bào của Homo sapiens được nuôi cấy ở 37oC Đây cũng là nhiệt độ tối

ưu cho sự phát triển của đa số các dòng thế bào thu nhật từ người và động vật có vú

 Tế bào động vật không chịu được nhiệt độ cao hơn 2oC so với nhiệt độ tối ưu Ở nhiệt

độ > 40oC tế bào chết rất nhanh

 Tuy nhiên tế bào có thể chịu được nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ phát triển tối ưu: Tế bào sống được vài ngày ở 4oC, bảo quan lạnh sâu ở -196oC trong thời gian dài

 Một số tế bào có thể phát triển ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu: Tế bào biểu mô,

da, tinh trùng

 Nhìn chung dựa vào nhiệt độ của cơ thể để điều chỉnh nhiệt độ nuôi cấy phù hợp với mẫu mô của từ cơ quan và loài động vật khác nhau

 Để duy trì nhiệt độ nuôi cấy, sử dụng tủ ấm

2 pH

 pH có vai trò quan trọng: Duy trì sự cân bằng ion thích hợp, duy trì chức năng tối ưu của các enzyme nội bào, duy trì sự gắn kết của các hormone và nhân tố tăng trưởng lên các receptor bề mặt

 Môi trường nuôi cấy quá acid hoặc base sẽ làm giảm sự phát triển của các tế bào Sự thay đổi pH làm thay đổi chuyển hóa tế bào dẫn đến sự cảm ứng sản xuất protein shock nhiệt, một quá trình dẫn đến sự chết tế bào (apoptosis)

 Kiểm soát pH là cần thiết, pH ít thay đổi giúp tế bào sống tốt hơn

 pH tối ưu cho sự phát triển của các tế bào nuôi cấy phụ thuộc vào loài Thông thường, môi trường nuôi cấy tế bào động vật được điểu chỉnh pH 7.0 -7.4 (trung bình 7.2) bởi hầu hết các tế bào sống trong môi trường có ngưỡng pH 6.5 – 7.8 pH tối ưu cho tế bào côn trùng là 6,2 ± 0,1 Một số tế bào khác có pH tối ưu ngoài các giới hạn kể trên

3 Áp suất thẩm thấu

 ASTT của môi trường được xác định bởi công thức môi trường Muối và glucose là hai tác nhân chính

 Thay đổi ASTT của tế bào luôn tác động lên sự tăng trưởng và chức năng tế bào Tế bào phát triển trong khoảng 290-310mOsm

 Sự chênh lệch ASTT bên trong và ngoài tế bào có thể gây nên hiện tương ưu trương và nhược trương gây biến dạng tế bào

 Có thể điều chỉnh ASTT bằng cách thêm NaCl ( 1ml NaCl 5m/lít MT làm tăng ASTT lên 10 mM)

 Các thành phần MT: ion, amino acid, đóng gớp vào tạo ASTT

4 Các loại khí

 Ba loại khí quan tâm là: CO2, O2, N2 Tỉ lệ của chúng được phối trộn thích hợp theo chương trình thiết kế sẵn trong tủ nuôi

 O2:

 Vai trò quan trọng trong sinh trưởng, tăng sinh và biệt hóa tế bào

 Nhu cầu O2 của tế bào nuôi cấy thấp hơn nhiều so với mô sống

 Áp suất O2 trong tủ nuôi cấy tế bào thường thấp hơn áp suất O2 trong không khíTrong quá trình nuôi cấy tĩnh, các phân tử oxy trong không khí luôn có xu hướng khuếch tán vào môi trường nuôi Oxy khuếch tán tự do qua lớp môi trường dày chừng vài milimet sử dụng quá nhiều môi trường trong một thể tích hẹp kìm hãm sự khuếch tán oxy Nếu sự khuếch tán xảy ra thấp, các tế bào ở quá xa bên trong lòng chất lỏng, hay các tế bào sử dụng oxy quá nhanh, chúng sẽ phát triển kém và có thể chết

 Nồng độ O2 phổ biến dùng trong tủ nuôi tế bào thường từ 16 – 20%

cao và hàm lượng bicarbonate cao

5 Sự oxy hóa:

 Một số loại tế bào nhạy cảm với tác nhân oxy hóa sẽ không thể nuôi cấy in vitro, nếu

không thêm vào môi trường các chất chống oxy hóa (antioxidant)

 Một số loại tế bào có thể phát triển tốt trong môi trường khử tạo ra bằng cách thêm

β-mercaptoethanol hay các tác nhân khử khác, các tác nhân khử có thể sẽ bất hoạt một

số hormone (như insulin…) cần cho sự phát triển của tế bào

6 Độ sâu của đáy bình nuôi đến mặt thoáng của môi trường

 Ảnh hưởng đến nhu cầu O2 của tế bào

 Phương pháp nuôi cấy tĩnh, độ sâu của môi trường nuôi thích hợp vào khoảng 2 – 5

mm, tương đương với 0,2 – 0,5 ml môi trường nuôi cấy/cm2 đáy bình nuôi

Câu 5: Trình bày các thành phần môi trường cơ bản và vai trò trong nuôi cấy tế bào động vật?

Trả lời

Các thành phần chủ yếu: Muối vô cơ; các amino acid; carbohydrate; vitamin; acid béo; lipid; huyết thanh; yếu tố vi lượng; hệ đệm

1 Muối vô cơ:

 Một số muối chứa ion Na+, K+, Ca++, như KCl, NaCl,

 Vai trò:

 Cần bằng áp suất thẩm thấu tế bào

 Giúp điều hòa điện thế màng nhờ các ion

 Cần trong chất nền bào, bám gắn và hoạt động như các cofactor, duy trì cơ chế vận chuyển các chất qua màng

 Giúp tế bào bám vào giá thể tốt hơn

2 Hệ đệm

 Có vai trò điều hòa pH môi trường nuôi cấy

 Có 2 hệ đệm chính được sử dụng: Hệ đệm “tự nhiên” của khí CO2 với CO32- /HCO3-

trong môi trường và hệ đệm hóa học sử dụng HEPES

 Hệ đệm “tự nhiên”: Khi sử dụng bicarbonate làm hệ đệm thì sự tương tác của CO2 thu nhận từ các tế bào (hay từ không khí) với nước sẽ dẫn đến sự điều chỉnh pH môi trường theo cân bằng của phương trình:

CO2 Hầu hết các dòng tế bào kháng được đệm HEPES trong khoảng 10 – 50 mM, hay cả khi cao hơn Tuy nhiên, vì môi trường này đắt, chỉ nên dùng ở nồng độ 20 mM

 Hầu hết các môi trường thương mại chứa phenol red như là một chất chỉ thị pH Môi trường chuyển màu vàng cho biết pH giảm (acid) và màu hồng nếu pH tăng (kiềm)

5 Các protein và peptide

 Các peptide cần thiết như: albumin, transferring, fibronectin và fetuin thường là những chất có sẵn trong huyết thanh

 Là các yếu tố cần thiết khi môi trường không có huyết thanh

6 Acid béo và lipid

 Thường là cholesterol và steroid

 Cần thiết trong môi trường nuôi không có huyết thanh và cho một số tế bào đặc biệt

7 Yếu tố vi lượng

 Bao gồm: kẽm, đồng, selenium, và các tricarboxylic acid trung gian

 Là chất giúp tách các gốc oxy tự do

8 Huyết thanh

 Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như: amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, nguyên tố vi lượng,

 Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích tb tăng trưởng và phân chia

 Kích thích phục hồi và tránh các tổn thương của tế bào khi cấy chuyền, các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trysin

 Cải thiệt tính tan của các chất dinh dưỡng

 Chống oxy hóa: ht kháng oxy hóa mạnh và ức chế độc tính của oxy

 Làm tăng độ bám dính của tế bào

Câu 6: Phân tích vai trò của huyết thanh trong môi trường nuôi cấy tế bào động vật?

 Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích tb tăng trưởng và phân chia

 Kích thích phục hồi và tránh các tổn thương của tế bào khi cấy chuyền, các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trysin

 Cải thiệt tính tan của các chất dinh dưỡng

 Chống oxy hóa: ht kháng oxy hóa mạnh và ức chế độc tính của oxy

 Làm tăng độ bám dính của tế bào

 Huyết thanh chứa các chất có nguồn gốc từ các tiểu cầu bị vỡ xuất hiện tại các vị trí bị tổn thương trong cơ thể, nên vai trò của huyết thanh trong môi trường nuôi tương đương với vai trò phục hồi tổn thương của cơ thể Đặc biệt là nhân tố tăng trưởng từ tiểu cầu PDGF (platelet derived growth factor) có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào khi cơ thể bị tổn thương

 Trong huyết thanh không chỉ có các nhân tố kích thích phân bào mà còn có các chất ức chế sự phân bào và cảm ứng sự phân hóa Ví dụ: nhân tố biến đổi tăng trưởng TGF-β (transforming factor- β) có tác dụng ức chế sự phân chia của tế bào thượng bì khí quản, và làm tế bào biến thành hình có góc cạch, còn làm kìm hãm sự phân chia của dòng tế bào biều bì người và chuột

 Tuy nhiên, huyết thanh dễ bị nhiễm virus, mycoplasm và khó ổn định chất lượng

Câu 7: Nuôi cấy sơ cấp là gì? Nêu tóm tắt quy trình nuôi cấy sơ cấp?

 Tóm tắt quy trình

3 bước cơ bản:

 Bước 1: Thu nhận mô (tươi hay đông lạnh) có chứa tế bào sống

 Mẫu thu nhận: bất kỳ mô nào của cơ thể; phải làm sạch mô tại vị trí lấy ( rửa và sát trùng bằng cồn); đưa mô vào bảo quản trong dung dịch DPBS và nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm (tùy vào thời gian chuyển có thể để ở điệu kiện 37oC, đông lạnh tạm thời, )

 Bước 2: Phẫu tích/ tách rời tế bào, xác định nồng độ

 Xử lý mẫu sơ bộ: rửa nhiều lần bằng PBS có bổ sung kháng sinh (gentamicin, piniccilin, streptomicin), kháng nấm; cắt bỏ mô chết, phần thừa

 cắt thành mảnh nhỏ 2-3 mm2=>sử dụng để nuôi cấy hoặc tách rời tế bào

 Tách tế bào bằng cơ học (nghiền, ép)

 Tách bằng enzym: trypsin, collagenase, dispase, chymotrysin, papain,

 Bước 3: Nuôi cấy

 Mẫu mô được cắt thành mảnh nhỏ sẽ được nuôi cấy mô sơ cấp, sau khi thu nhận tế bào mới sẽ được cấy chuyển để tạo dòng tế bào hoặc nuôi mảnh mô thứ cấp

 Tế bào sau khi tách được nuôi cơ cấp => cấy chuyển => tạo dòng tế bào

Câu 8: Nêu một số enzym và cơ chế cắt của chúng trong tách tế bào sử dụng cho nuôi cấy tế bào động vật? (câu này nhà mình xem kỹ nhé, xem lại của a,c 54)

Trả lời

Cầu nối gian bào có bản chất là protein (các tế bào liên kết với nhau và với ECM), do vậy các protease sử dụng để tách tế bào là những enzyme thủy phân protein như: trypsin, collagenase, elastase, pronase, dispase, có thể riêng lẻ hay kết hợp tùy thuộc và mục đích

1 Trypsin

 Là enzyme kiềm tính, có bản chất là serin protease được tổng hợp ở tụy tạng và tiết dưới dạng tiền hoạt động là zymogen là trypsinogen

 Cấu trúc: Chuỗi polypeptide gồm 249 aa, khối lượng 22,6-23,4 Kda

 pH 6-9, tối ưu 8-9 Rất bền vững trong môi trường acid yếu

 Cơ chế: Trypsin cắt liên kết giữa nhóm carboxyl (−COOH) của lysin hoặc arginin và gốc amin (−NH2) của acid amin bất kì đứng liền kề với nó trong polypeptid, ngoại trừ liên kết giữa lysin và arginin Xử lý trypsin dẫn đến sự cuộn tròn tế bào  các liên kết

trở nên lỏng lẻo và tế bào dễ dàng được tách ra bởi tác động cơ học Canxi là chất bảo

vệ trypsin, hoạt tính xúc tác của trypsin bị giảm 50% khi vắng mặt Ca2+ vì trypsin trở nên trơ Một số kim loại như coban, mangan có khả năng hoạt hóa trypsin Hoạt tính của trypsin sẽ bị kìm hãm bởi huyết thanh bò có thai hoặc DFP

 Trypsin không tác động đặc hiệu cho loại protein, vì vậy có thể phân cắt các protein ở

màng và gây vỡ tế bào khi dùng nồng độ cao, hoặc cho tác động trong thời gian dài

 Nồng độ thường được dùng: 0.01-0.5%, sử dụng quy trình trypsin ấm (37oC) hay trypsin lạnh (4oC)

 Cần trung hòa trypsin bằng huyết thanh ngay sau khi thu được tế bào đơn

 Có 4 loại collagenase:

 Collagenase loại I: chứa một lượng trung bình những hoạt chất( collagenase, caseinase, clostripain, trypsin hoạt động) => tách tế bào da, gan, phổi, mỡ và những tế bào thượng thận

 Collagenase loại II: chứa hợp chất clostripain nhiều hơn => tách tế bào từ tim, xương, cơ và sụn

 Collagenase loại III: có hoạt tính phân giải protein thấp

 Collagenase loại IV: có hoạt tính trypsin thấp, thường dùng phân tách tế bào tụy

 Collagenase phân cắt không hoàn toàn các cầu nối nên ít làm hư hại tế bào Kết hợp với hyaluronidase => phân hủy các chất dịch nội bào, + Dnase =>thủy phân các DNA thoát ra từ các tế bào li giải

3 Chymotrypsin

 Là một protease gồm 246 aa

 Ở tụy tạng, tiết ở dạng zymogen là chymotrypsinogen

 Hoạt tính kiềm (pH 7-9), thích hợp pH 8-9

 Cơ chế: Hoạt động như một endopeptidase, phân giải các peptide tạo thành bởi nhóm carboxyl của acid amin thơm (như tirosin, phenylalanin, tryptophan, methyonin và leucin) với nhóm amin của một aa khác

4 Papain

 Là một endoprotease được cấu tạo từ 212 aa không chứ methyonin

 Trung tâm hoạt động: Nhóm (-SH) của cystein 25 và nitrogen hóa trị 3 của histidin

159, được liên kết với nhau bằng cầu nối hydro

 Thủy phân các protein thành các polypeptide và aa

 Chịu được nhiệt tương đối cao, dạng khô không biến tính ở 100oC-3h, dạng dung dịch bị mất hoạt tính ở 83,5oC-sau 30 phút

 pH 4,5-8,5, bị biến tính ở pH dưới 4,5 hoặc trên 12

 Bị kìm hãm bởi các chất oxy hóa như oxy, ozone, hydroperoxyte,

 Là enzym được chọn để tách tế bào từ phôi

Câu 9: Tóm tắt quy trình trypsin ấm là trypsin lạnh được sử dụng để tách tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật?

Trả lời

1 Quy trình trypsin ấm

 B1: chuyển mô và đĩa Petri có chứ PBS vô trùng và rửa

 B2: Chuyển sáng đĩa thứ 2, cắt bỏ những phần không cần như mô mỡ, hư, chết Sau đó dùng dao mổ cắt thành thành những khối nhỏ khoảng 3mm3

 B3: Dùng pince chuyển mô vào erlen loại 50ml đã chứa sẵn PBS

 B4: Rửa lại các mảnh trong PBS để mô được ổn định, sau đó loại bỏ phần dịch trong bên trên Lặp lại 2-3 lần

 B5: Sau khi rửa sạch mẫu, thêm trypsin 0,25% vào erlen

 B6: Khuấy từ gia nhiệt: 200 vòng/ phút, 30 phút, 36,5oC

 B7: Để các mảnh mô ổn định, thu phần dịch nổi đem li tâm với tốc độ khoảng 1000 vòng/phút-10 phút=> hút bỏ dịch trong=> hòa tế bào với 1ml môi trường => lưu trữ

4oC

 B8: Thêm 10ml trypsin 0.25% vào các mảnh mô còn lại trong erlen, khuấy trong 30 phút, lặp lại B3-B5 đến khi mảnh mô tách hết

 B9: Trộn chung huyền phù tế bào thu được=> đếm tế bào=> mật độ

 B10: Chuẩn bị đĩa môi trường khoảng 4ml MT

 B11: Chuyển tế bào vào đĩa MT nuôi, mật độ ban đầu là 106 tế bào/ml

2 Quy trình trypsin lạnh

 B1: Cắt mô thành các mẫu 3-4mm và rửa mẫu nhiều lần bằng PBS vô trùng

 B2: Sau khi rửa, loại bỏ phần PBS rửa mẫu lần cuối và thay thế bằng trypsin 0.25%

 B3: Đặt mẫu ở 4oC trong 6-18h

 B4: Cẩn thận loại bỏ trypsin sao cho lượng trypsin còn lại ít nhất

 B5: Ủ ống chứa mô ở 36,5oC trong 20-30 phút

 B6: Thêm vào môi trường đã được ủ ấm khoảng 1ml MT cho mỗi 100mg mô, dùng pipette nhẹ nhàng sục lên xuống => mô rời

 B7: Mô chưa rời nhau=> lọc vô trùng (kich thước 100-200μm)

 B8: Thu dịch chứa tế bào và xác định mật độ tế bào- 106 tb/ml

Câu 10: Nêu quy trình nuôi cấy tế bào sơ cấp? Nên lưu ý những vấn đề gì?

Trả lời

1 Quy trình:

 B1: dùng pipetman hút vào bốn eppendorf – 1ml dịch tách tế bào

 B2: Ly tâm 1000rrp/ phút-20 phút, loại bỏ dịch nổi

 B3: Cho vào mỗi eppendorf 1 ml môi trường nuôi, huyền phù tế bào bằng vortex

 B4: Hút dịch huyền phù tế bào ở bốn eppendorf cho vào một bình nuôi cấy (bình Roux) và bổ sung 1 ml môi trường

 B5: Ủ ở 37,5oC trong tủ nuôi, sau 24h thay môi trường mới và tiếp tục ủ

=> Sau lần nuôi cấy sơ cấp sẽ thu được các tế bào sơ cấp

2 Những chú ý:

 Thành phần tế bào nuôi cấy sơ cấp rất phức tạp, gồm nhiều tế bào khác nhau, để có dòng thuần nhất => chọn dòng

 Tùy theo thể tích của hộp nuôi => lượng môi trường thích hợp tương ứng với mật độ tế bào Từ 2-3 ngày, hầu hết tế bào bám vào tế mặt hộp nuôi và có dạng đặc trưng, các mảnh nổi là tế bào chết => thay môi trường

 Thông thường, đk 37oC, 5% CO2 được dùy trì ổn định trong các tủ nuôi

 Hồi phục tế bào bằng cách nuôi trong môi trường dinh dưỡng cao hay bổ xung huyết thanh nhiều với nồng độ cao

 Việc cố đinh mẫu mô bằng huyết tương/huyết thanh thường được sử dụng khi nuôi cấy các mảnh mô đông lạnh

Câu 11: Tại sao phải tiến hành cấy chuyền? Nêu các thao tác cấy chuyền?

Trả lời

1 Tại sao phải cấy chuyền

Cấy chuyền để cung cấp chất sinh dưỡng và không gian cho các dòng tế bào phát triển liên tục Tần số cấy chuyền và tỉ lệ pha loãng hay nồng độ tế bào phụ thuộc vào các đặc tính của mỗi dòng Nếu cấy chuyền quá thường xuyên hay nồng độ tế bào quá thấp => chúng có thể bị mất

2 Cấy chuyền bao gồm các thao tác sau:

 Tách bỏ môi trường nuôi cấy cũ

 Rửa bề mặt giá thế nuôi

 Tách các tế bào khỏi bề mặt dụng cụ nuôi

 Pha loãng các tế bào bằng môi trường mới

3 Cấy chuyền các tế bào bám dính:

3.1 Nguyên vật liệu:

Môi trường phát triển, DPBS (không Ca2+, Mg2+), trypsin (0.05% w/w với 0.53 mM EDTA), đĩa nuôi 100mm và buồng đếm hồng cầu

3.2 Tiến hành:

 B1: Tách bỏ môi trường khỏi hộp nuôi; sau đó làm lỏng sự bám dính các tế bào bằng dung dịch trypsin

 B2: Rửa dụng cụ nuôi với PBS (5ml/bình Roux 25cm2)

 B3: Bổ sung dung dịch trypsin (2-3 ml/bình Roux 25cm2)

 B4: Ủ trong tủ ấm 37oC Thời gian ủ phụ thuộc vào loại tế bào và kiểu nuôi (sơ cấp hay thiết lập dòng) khoảng 2-3 phút => quan sát dưới kình hiểm vi => nếu tế bào có hình tròn => đã tách khỏi giá thể nuôi

 B5:

Tái huyền phù với môi trường có bổ sung huyết thanh (5ml/bình Roux 25cm2)

Rửa tế bào = ly tâm ở 800 vòng/phút trong 5-10 phút

Tái huyền phù = môi trường nuôi (5ml/bình Roux 25cm2) Tỷ lệ pha loãng ¼

 Nếu sử dung môi trường không huyết thanh, trypsin nên được trung hòa bằng STI (1mg/ml) (5ml/bình Roux 25cm2), pha loãng thành 10ml môi trường và li tâm 3-4 phút ở 900 vòng/phút => rửa tế bào để tách enzyme thừa và loại bỏ STI (ngăn cản sự bám dính của tế bào)

4 Cấy chuyền tế bào huyền phù

Nuôi cấy các tế bào trong các flask hay spinner có thể duy trì bằng việc pha loãng một lượng tương đương của huyền phù tế bào bằng môi trường tươi

1 Giữ flask đứng thẳng Dùng pipette huyền phù vài lần => tách rời cụm tế bào

2 Hoặc lấy một lượng huyền phù để đếm, hoặc chuyển 200μl thành 1ml huyền phù vào bình nuôi mới chứa 10ml môi trường phát triển Nếu tỷ số pha loãng 1/10, thể thích hợp của huyền phù tế bào sẽ được được đặt vào ống li tâm 15ml, pha loãng

thành 10ml bằng môi trường, sau đó ly tâm ở 900 vòng/phút trong 3-4 phút Tái huyền phù => lấy một thể tích tương đương lượng tế bào mong muốn vào các bình=> tiếng hành nuôi

Câu 12: Dòng tế bào là gì? Nêu các kỹ thuật chọn tạo dòng tế bào?

 Dòng tế bào tạm thời (temporary cell line) là dòng tế bào chỉ có khả năng sống trong điệu kiện nuôi cấy ở một thời gian nhất đinh Là các dòng tế bào thường.

2 Kỹ thuật chọn dòng tế bào:

Là kỹ thuật dùng để tách riêng một colony tế bào trong một đĩa nuôi có nhiều dạng tế bào khác nhau Phương pháp này thực hiện như sau:

 Dùng dịch trypsin tách rời các tế bào từ đĩa nuôi cấy, tạo huyền phù

 Cấy tế bào vào đĩa nuôi có môi trường mới, với mật độ thấp ( khoảng 1000 tế bào/ml)

để tế bào cách xa nhau trong đĩa nuôi => ủ tế bào đến khi chúng phát triển các colony riêng rẽ

 Chọn một colony tế bào cần tạo dòng Cô lập colony này bằng một ống kim loại nặng

có kích thước phù hợp Hút bỏ môi trường trong ống và tách cáo tế bào từ colony này bằng trypsin, cấy sang đĩa môi trường mới Nếu cần thiết có thể thực hiện bước chọn dòng này vài lần nữa cho đến khi đảm bảo thu được dòng tế bào từ một tế bào đầu tiên

3 Cấy chuyền tế bào

1 Đổ bỏ môi trường cũ trong bình Roux có tế bào

2 Dùng pipette hút 2 2ml PBS(-) cho vào bình Roux, lắc nhẹ để rửa sạch tế bào chết

và huyết thanh, đổ bỏ PBS(_), lặp lại 2 lần

3 Dùng pipette hút 2ml trypsin-EDTA cho vào bình Roux

4 Để bình Roux trên lòng bàn tay, lắc nhẹ khoảng 50 lần

5 Đổ bỏ trypsin

6 Hút 2ml E’MEM cho vào bình Roux Tráng đều lên bề mặt bình Roux có tế bào

7 Hút vào mỗi bình Roux mới 5ml môi trường E’MEM

8 Dùng pipettr 1ml tạo huyền phù

9 Hút vào mỗi bình Roux mới 0.5 ml dịch huyền phù Lắc nhẹ, ủ 37,5oC trong tủ nuôi

10 24h sau, đổ bỏ môi trường cũ, cho vào bình Roux 6ml môi trường mới để loại bỏ trypsin và những tế bào chết

Câu 13: Trình bày vai trò và quy trình xây dựng đường cong tăng trưởng?

Trả lời

1 Vai trò:

 Đường cong tăng trường được thiết lập để phân tích các đặc điểm phát triển của kiểu

tế bào hay dòng tế bào

 Đường cong tăng trưởng cung cấp nhiều thông tin: sự gia tăng trong số lượng tế bào

=> đánh giá ảnh hưởng của hormone chất dinh dưỡng và những yếu tố khác lên một kiểu tế bào; sự tăng trưởng, tăng số lượng=>thước đo cho sự đáp ứng sinh học

2 Quy trình xây dựng đường cong tăng trưởng

 Đường cong tăng trưởng nhìn chung sẽ có:

 Phase lag: của quần thể tế bào khôi phục cấy chuyền, bám dính và trải rộng

 Phase log: số lượng tế bào tăng theo số mũ

5 Pha loãng lượng tế bào thích hợp vào 55ml môi trường tăng trưởng để có tổng cộng tế bào là 5,5x105

6 Tai huyền phù các giếng và thêm 5ml môi trường vào mỗi giếng=> nồng độ đạt 5x105 tế bào/ đĩa

7 Đếm số lượng tế bào còn trogn 5ml huyền phù để xác định nồng độ thật

8 Đặt các đĩa vào tủ ấm 37oC

9 Đếm các tế bào cứ sau 24h

10 Sau lần đếm cuối, vẽ đồ thị các kết quả thành các đường thẳng Xác định thời gian quần thể tăng gấp đôi bằng các xác định số tế bào dọc theo phase log của đường cong, di chuyển dọc theo các phần thẳng của đường cong đến khi số lượng tế bào gấp đôi, sau đó thích số giờ giữa hai sự kiện

Câu 14: Trình bày và phân tích các hình thức nuôi cấy?

Trả lời

Các hình thức sản xuất kháng thể đơn dòng (MAbs) trong những hệ thống nuôi

cấy in vitro lớn bao gồm: batch (theo mẻ), fed batch (theo mẻ có cung cấp thêm tế bào),

chemostat (nuôi cấy liên tục) và perfusion thì đòi hỏi thao tác, hóa chất nhiều hơn vì nó cho phép tạo MAbs liên tục

Sau đây là đặc điểm của hệ thống đồng nhất :

1 Hình thức batch và fed batch:

 Tế bào được cấy, phát triển đến mật độ hay sản phẩm cần thiết thì thu hoạch

 Thời gian nuôi cấy mẻ tùy thuộc vào mật độ tế bào cấy ban đầu, dòng tế bào và các đặc tính như tốc độ phát triển, động học sản xuất kháng thể của dòng tế bào

 Bioreactor phải được làm sạch, hấp khử trùng cho lần sản xuất tiếp theo

 Ở hình thức fed batch, tế bào được cung cấp liên tục hay gián đoạn và dịch huyền phù

tế bào được rút ra định kì

 Mật độ của tế bào thấp hơn so với perfusion hay hệ thống không đồng nhất (cuối quá trình, có ít hơn 5×106 tế bào/ml) Có sự tích tụ các cơ chất biến đổi và chất thải

 Mật độ sản phẩm thường thấp hơn 100 mg/l, nhưng cũng có thể lên đến 200 mg/l theo kiểu batch, và 500 mg/l theo kiểu fed batch Yêu cầu kiểm soát quá trình thấp

 Tỉ lệ thời gian sản xuất và thời gian tái sản xuất thấp ở kiểu fed batch

2 Hình thức chemostat :

 Tế bào được cấy và phát triển đến một mật độ nào đó Sau đó, môi trường được bơm liên tục vào bioreactor với tốc độ không đổi và huyển phù tế bào chứa kháng thể được rút ra với tốc độ tương đương

 Tốc độ pha loãng có thể thay đổi từ 0 (batch) và cao nhất là bằng tốc độ tăng trưởng của tế bào

 Hình thức chemostat làm kéo dài thời gian đạt trạng thái cân bằng ổn định của tế bào, khi một hay vài cơ chất (như glucose, nitrogen), hay chất thải (ammonia) tăng lên (thường thấy ở hình thức batch)

 Đặc điểm chung của hình thức nuôi cấy này:

 Tế bào đạt được đến mật độ cuối cùng trong hình thức batch

 Hàm lượng sản phẩm cao hơn 300 mg/l Điều kiện nuôi cấy không đổi

 Tối ưu cho việc tạo sản phẩm kháng thể, nhưng không tối ưu cho tạo ra sinh khối

 Tối ưu cho các thông số ở điều kiện ổn định, độ chính xác cao Năng suất cao hơn

 Tốc độ chảy của môi trường và mực chất lỏng trong bioreactor được kiểm soát

3 Hình thức perfusion

Đặc điểm chung của hình thức này:

 Mật độ tế bào cao (>107 tế bào/ml) Năng suất cao

 Hàm lượng sản phẩm lớn hơn 1000 mg/l Tái sử dụng môi trường tốt hơn

 Bồn lên men có thể tích nhỏ hơn nhưng vẫn cho cùng một lượng kháng thể

 Cần nhiều thiết bị phức tạp để kiểm tra quá trình Màng lọc có thể bị bít kín

Câu 15: Nêu các ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật?

Trả lời

1 Mô hình thử nghiệm và chẩn đoán bệnh

 Mô hình tế bào được sử dụng để khảo sát sự chuyển hóa các chất có nguồn gốc ngoại lai Tế bào gan thường được sử dụng – quan trọng trong sự chuyển hóa, nhất là chất đọc

 Các dòng tế bào ung thư thử nghiệm các chất khác phân bào => tìm kiếm thuốc trị, sản xuất kháng thể, protein khác

 Phân tích NST của tế bào có nguồn gốc từ tử cung qua chọc hút có thể phát hiện những rối loại về di truyền ở trẻ tiềm sinh, sự xâm nhiễm virus

2 Sản xuất các hợp chất sinh học

 Vaccine virus: Vaccine phòng chống HBV sản xuất bằng dòng tế bào ung thư gan ở người được chuyển plasmid mang gen mã hóa kháng nguyên bề mặt HBs của HBV

3 Sản xuất các hoạt chất sinh học

 Đưa các gen ngoại lại vào tế bào động vật và sau đó nuôi cấy, thu nhận các sản phẩm protein (các chất chống dông máu, hoạt hóa plasminogene, ) hay enzyme Rtase

 Sử dụng tế bào động vật: ghéo tế bào tụy tạng tạo ra insulin của heo vào người, ghép

tế bào thần kinh từ thai,

 Ghép tế bào tự thân, nguyên tắc: thu nhận tế bào từ bệnh nhân => cho tăng trưởng invitro => biệt hóa => thu => ghép lại chính bệnh nhân

5 Tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy

 Sản xuất thành công mạch máu tự nhiên = nuôi cấy tế bào động mạnh chủ bò, gồm các tế bào cơ + tế bào nội mô trên một giá thể polymer

 Triển vọng là sử dụng các tế bào gốc phôi thai

6 Sản xuất các virus diệt côn trùng

 Nuôi cấy tế bào côn trùng và cho nhiễm virus => thu chế phẩm

Câu 16: Nêu quá trình nuôi cấy không huyết thanh

Trả lời

 Bên cạnh những tác động tốt như đã nêu huyết thanh cũng có những điểm không tố Nuôi cấy tế bào với môi trường bổ sung huyết thanh chi phí cao, nhất là huyết thanh

bò (FBS) Trong thực tế,có thể tạo ra môi trường tối ưu cho sự phát triển tế bào mà

không cần bổ sung huyết thanh Một số tế bào nuôi cấy in vivo không (hoặc kém) phát

triển trong huyết thanh, chúng thích ứng với các môi trường cục bộ chuyên biệt, có tính chất khác biệt rõ rệt với huyết thanh

 Nhiều chất trong huyết thanh (vitamin C, cá lipoprotein …) thường không ổn định khi đông lạnh hay bảo quản lâu Môi trường bổ sung huyết thanh sẽ có nồng độ hoocmone hay các nhân tố tăng trưởng không thích hợp với sự phát triển của một số

tế bào

 Các tế bào nội mô thanh mạch phát triển trong môi trường tương tự như huyết thanh,nhưng không hoàn toàn giống huyết thanh Do vậy ,chúng có khả năng chịu đựng nồng độ huyết thanh cao hơn tế bào khác Tuy nhiên, đối với nhiều loại tế bào, huyết thanh không pha loãng sẽ độc, do đó nên pha loãng 5-10 lần để giảm độc tính

 Khi mất nồng độ hoocmone thích hợp, huyết thanh cũng có thể chứa cơ chất ức chế

sự phát triển, biệt hóa hay chức năng Huyết thanh cũng kích thích sự biệt hóa của các

tế bào vào trạng thái không nguyên phân, làm chúng không thể duy trì dòng tế bào bất

tử (Levi và cs ,1997) Để phát triển tế bào trong môi trường không huyết thanh, có nhiều cách tiếp cận, tất cả các chiến lược nạy đều nhằm kết hợp sự thay đổi liên tục với nhiều việc làm giàu các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi

 Tạo sự thích nghi của các tế bào với môi trường không huyết thanh và không bổ sung hoocmone nào (Evans và cs, 1956)

 Sử dụng huyết thanh đã được làm giảm ( hay loại bỏ hoàn toàn) các lớp hoocmone không cần thiết (Nishkawwa và cs, 1975)

 Bổ sung thường xuyên và môi trương không huyết các nhân tố tăng trưởng, bám dính và các nhân tố phù hợp khác (Barnes và Sato, 1980)

Câu 17: Nêu hiệu quả trải (Plating efficiency)

Trả lời

 Hiệu quả trải sẽ xác định các tế bào đơn có thể sống sót và hình thành nên các tập đoạn

 Vì tỉ số của thể tích môi trường trên thể tích các tế bào rất lớn ,cho nên ảnh hưởng của

tế bào lên môi trường nuôi không đáng kể Do đó, cớ ít cơ hội để các tế bào chuyển hóa và chuyển đồi các amino acid Ngay cả việc tế bào gắn vào thành phần độc tính hay tiết các yếu tố tăng trưởng (nhằm tự điều hòa cần cho phát triển) cũng khó xảy ra

 Phương pháp này còn nhằm đo đọ nhạy các đáp ứng tế bào với môi trường

 Nó còn xác định các nhu cầu dinh dưỡng của tế bào ,kiểm tra và so sành huyết thanh hoặc thử nghiệm độc tố

 Gần dây, phương pháp này được sử dụng nhiều để đánh giá hiệu quả ức chế hay kích thích sự tăng trưởng của một nhân tố nào đó lên dòng tế bào xác định

 Hiệu quả trải được bằng công thức

(Số tập đoàn hình thành/số tế bào đem trải) x 100 = Hiệu quả trải

 Nguồn vật liệu

Tế bào nuôi cấy, đĩa 100mm, ống li tấm 15ml, 60ml môi trường phát triển, dung dịch trypsin, ức chế STI, buồng đếm hồng cầu, 10% formalin, trystal violet (0,1% trong nước )

 Tiến hành

1 Dùng trypsin tách tế bào,kiểm tra chắc chắn rằng tất cả đều là tế bào đơn

2 Trung hòa enzyme bằng cách tái huyền phù 10ml môi trương có huyết thanh trong ống nghiêm 15ml, hoặc thêm vào 1ml STI và tái huyền phug trong 10ml môi trường phát triển không huyết thanh

3 Rửa bằng cách li tâm ở 900 vòng/phút trong 3-4 phút Tái huyền phù trong 10ml môi trường phát triển không huyết thanh

4 Đếm tế bào với một lượng mẫu thích hợp

5 Xác định thể tích cần thiết để có được 100,500 và 1000 tế bào,cho vào đĩa 100mm.Bởi vì thể tích này có thể quá nhỏ,để tiện lợi hơn,pha loãng lượng tế bào thích hợp thành 1ml,và thêm vào thể tích này 9ml môi trường nuôi cấy

6 Tái huyền phù các tế bào trong 10ml môi trường bằng cách sử dụng pipette hút nhả liên tục vài lần để chắc chắn rằng,các tế bào đều đã được tách riêng rẽ Trải các tế bào này vào đĩa nuôi 100mm

7 Ử các đĩa vào trong tủ ấm đến khi các tập đoàn đủ lớn để có thể quan sát bàng mắt thường ( 0,2-1mm đường kính ) nhưng không phát triển chồng lên nhau.Thời gian cần thiết để ủ khoảng 10 ngày

8 Rủa các đĩa bằng PBS và thêm formalin 10% sao cho bao phủ cả bề mặt đĩa.Cố định trong 10 phút

9 Tách lấy formalin và thêm dung dịch crystal violet (2-3ml)để bao phủ đĩa.Để 10 phút ,tách các crystal violet và rủa dưới dòng nước chảy đến khi mất màu

10 Đếm số lượng colony bằng bút mực hay sử dụng máy đếm colony

Câu 18: Nêu phương pháp tách tế bào bằng cơ học?

Trả lời

Tách bằng cơ học

 Cắt nhuyễn mô : Dùng lực cơ học bẻ gãy các cầu nối liên bào Dùng kéo cắt nhuyễn

mảnh môhuyền phù trong dung dịch PBS thu hỗn hợp chứa tế bào đơn và những cụm tế bàoĐể lắng, thu dịch trong (là huyền phù thu nhận các tế bào đơn) Hiệu quả tách không cao, số lượng tế bào đơn thu nhận ít áp dụng cho mẫu mô có kích thước lớn và không khan hiếm, dùng để làm tăng khả năng tiếp xúc của mô với enzyme trong kĩ thuật tách bằng enzyme được tiến hành sau đó Ưu điểm là tế bào có khả năng sống cao

 Ép nhuyễn mô : Dùng 2 hai phiến lame hoặc pitton của syringe để ép mô trong đĩa

petri để tách rời các tế bào Áp dụng để tách tế bào ở những mô có liên kết yếu ,mô mà các tế bào liên kết với nhau chặt chẽ cho hiệu quả không cao

 Tách bằng màng lọc tế bào : Màng lọc tế bào động vật thường có đường kính lỗ từ 70

- 100 µm chỉ cho một tế bào lọt qua, sử dụng chúng để làm công cụ tách rời các tế bào rất hiệu quả Đặt mẫu mô lên trên màng lọc sử dụng pitton của syringe để chà sát mạnh mảnh mô, tế bào sẽ va chạm vào lưới lọc và tách rời tế bào đơn có đường kính nhỏ hơn lỗ lọc sẽ lọt qua

CHƯƠNG 4: KĨ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT TRÊN GIÁ THỂ 3

CHIỀU VÀ HỆ THỐNG NUÔI CẤY KHÁC

HỆ THỐNG CÂU HỎI

Câu 2: Các đặc tính lý tưởng của Scaffold và các vật liệu Scaffold 39 Câu 3: Các phương pháp chế tạo scaffold truyền thống 40 Câu 4: Các hạn chế của Scaffold kỹ nghệ mô 42 Câu 6: Ứng dụng SFF để tạo scaffold kĩ nghệ mô 45 Câu 7: Các ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào ba chiều 47

1 Kỹ nghệ tế bào- mô xương 47

mạng lưới phức tạp các vi sợi khuôn ngoại bào với các vi lỗ Vì thế nuôi cấy 2D sẽ có một số hạn chế như sau:

(1) Sự chuyển động của các tế bào trong môi trường 3D của cơ thể theo sau một tín hiệu hóa học hay gradient phân tử Gradient phân tử đóng vai trò quan trọng trong sự biệt hóa sinh học, quyết định số phận của tế bào, sự phát triển cơ quan, truyền tín hiệu, truyền thông tin thần kinh và vô số các quá trình sinh học khác.Tuy nhiên, không thể thiết lập một gradient 3D “đúng” trong nuôi cấy 2D

(2) Tế bào được phân lập trực tiếp từ cơ thể thường xuyên thay đổi sự chuyển hóa và các kiểu biểu hiện gen khi được nuôi cấy 2D Cấu trúc tế bào có vai trò chính trong việc xác định hoạt động, mặc dù các tương tác protein ECM và receptor tế bào vẫn tồn tại trong các mô và cơ quan Cấu trúc màng tế bào và ECM ảnh hưởng đáng kể đến chuyển hóa tế bào thông qua các tương tác protein-protein Sự thích ứng của các

tế bào với đĩa Petri 2D đòi hỏi sự điều chỉnh đáng kể của quần thể tế bào đang sống không chỉ để thay đổi oxy, dưỡng chất và các tương tác ECM mà còn để loại bỏ chất thải

(3) Các tế bào tăng trưởng trong môi trường 2D có thể thay đổi đáng kể khả năng sản xuất các protein ECM của riêng chúng và thường xuyên chịu những biến đổi về hình thái (ví dụ như gia tăng sự trải rộng) Các receptor trên bề mặt tế bào có thể tạo các cụm trên những phần tiếp xúc trực tiếp với môi trường nuôi giàu dưỡng chất, nhân

tố tăng trưởng và các ligand ngoại bào khác Trong khi đó, các receptor trên tế bào bám trực tiếp với bề mặt nuôi cấy sẽ ít có cơ hội tạo cụm hơn Vì vậy, các receptor không xuất hiện đúng hướng và tạo cụm, điều này cũng ảnh hưởng đến thông tin giữa các tế bào

(4) Hơn nữa, các tế bào nuôi cấy in vitro thiếu các tác nhân tín hiệu và hormone chủ

yếu (như bình thường, chúng được cung cấp đầy đủ trong cơ thể từ hệ tuần hoàn)

Câu 2: Các đặc tính lý tưởng của Scaffold và các vật liệu Scaffold

Trả lời

Trong hai thập kỷ vừa qua, các polymer sinh học như PLA, PLGA, copolymer PLGA và hàng loạt các vật liệu y sinh học khác đã ra đời (như alginate, agarose, gel collagen, polyglycosaminoglican…) đã được phát triển để nuôi cấy tế bào 3D

PLA-Kỹ thuật nuôi tế bào 3D được ứng dụng nhằm phát triển các mô và cơ quan thay thế Các kỹ thuật này liên quan đến việc đưa các tế bào và các nhân tố tăng trưởng vào trong các scaffold tổng hợp (hoạt động như ECM tạm thời) để giúp các tế bào tổ chức thành mô khác nhau (da, sụn, gan, thần kinh, mạch…), hay thậm chí là cả cơ quan

Scaffold là một khuôn ngoại bào nhân tạo có cấu trúc lỗ xốp, giúp điều tiết tế bào, hướng dẫn tăng trưởng và tái tạo mô 3 chiều Sau khi được đưa vào scaffold, các tế bào

bám, sau đó sao chép, biệt hóa và tổ chức thành mô khỏe mạnh bình thường, cùng với việc tạo ra các thành phần nền ngoại bào để tạo mô Dùng scaffold để tạo các mô và cơ quan có hình dạng và kích thước mong muốn Oxy và dưỡng chất được đưa vào từ môi trường lỏng nuôi cấy tế bào.

1 Các đặc tính lý tưởng của Scaffold

(1) Có cấu trúc lỗ xốp bên trong (đường kính lỗ ít nhất 60 – 100 µm) cung cấp dưỡng chất giúp tăng trưởng mô, phân bố mạch…

(2) Được chế tạo từ vật liệu có khả năng tự phân hủy sinh học, hoặc khả năng hấp thu sinh học được kiểm soát, để sau đó mô sẽ thay thế scaffold

(3) Có hóa học bề mặt thích hợp để giúp các tế bào bám, biệt hóa và tăng sinh

(4) Có các đặc tính cơ học thích hợp để tương xứng với vùng ghép

(5) Không kích thích bất kỳ loại phản ứng có hại nào

(6) Dễ tạo hình dáng và kích thước mong muốn

2 Các vật liệu Scaffold

2.1 Các polymer tổng hợp

Các polyester như polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), các copolymer (như PLGA) và polycaprolactone (PCL), thường được sử dụng để thiết kế các scaffold Sản phẩm phân hủy của các polymer này (glycolic acid và lactic acid) hiện diện trong cơ thể người và được thải loại thông qua con đường trao đổi chất tự nhiên

2.2 Các polymer tự nhiên

Các polymer là protein hoặc carbohydrate có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng làm scaffold cho sự tăng trưởng của vài loại mô Polymer tự nhiên phổ biến nhất được sử dụng tạo scaffold kỹ nghệ mô là collagen

Câu 3: Các phương pháp chế tạo scaffold truyền thống

Trả lời

1 Lọc gián đoạn qua khuôn dung môi (Solvent casting particulate leaching)

Kỹ thuật này tạo một dung dịch PLA trong chloroform và thêm các hạt muối có đường kính đặc biệt, để hình thành một dịch huyền phù thống nhất Cho dung môi bay hơi để còn lại khuôn nền polymer với các hạt muối ở khắp bên trong Sau đó, ngâm composite trong nước để loại muối, chỉ còn lại cấu trúc lỗ xốp

2 Bọt khí (Gas foaming)