Bài DNA POLYMERASE, SAO CHÉP DNA VÀ SỰ NHÂN ĐÔI CỦA TẾ BÀO Mục tiêu - Sinh viên hiểu vai trò enzyme DNA polymerase trình nhân đôi tế bào thông qua việc ức chế hoạt động enzyme chất ức chế đặc hiệu - Sinh viên biết cách nuôi cấy vi khuẩn E.coli, đếm số lượng tế bào phương pháp đo quang phổ xác định tế bào sống cách đếm khuẩn lạc Cơ sở khoa học Để nhân đôi tế bào (nguyên phân) tế bào phải nhân đôi DNA pha S (hình 1) Enzyme DNA polymerase thực trình chép DNA Nếu DNA không chép tế bào phân chia Trong tự nhiên nhiều hợp chất có khả ức chế hoạt động enzyme DNA polymerase chúng ức chế phân chia tế bào Hình Chu kỳ tế bào Một số hợp chất thuộc loại glycolipid thực vật bậc cao (hình 2) có tác dụng ức chế hoạt động enzyme DNA polymerase như: monogalactosyl diacylglycerol (MGDG), digalactosyl diacylglycerol (DGDG) sulfoquinovosyl diacylglycerol (SQDG) Hình Các hợp chất có khả ức chế DNA polymerase spinach Gần MGDG sử dụng làm chất kháng viêm ứng chế phát triển khối u ung thư dày thông qua tác dụng ức chế hoạt động enzyme DNA polymerase Khi tế bào tiến hành nhân đôi, MGDG ức chế làm cho tế bào dừng phân chia kỳ G1, dẫn đến kích hoạt chế tự chế tế bào (apoptosis) (hình 3) Hình Cơ chế ức chế trình tái DNA MGDG Trong thực hành, sinh viên thực thí nghiệm kiểm tra ảnh hưởng MGDG lên hoạt động enzyme DNA polymerase thông qua đánh giá nhân lên tế bào vi khuẩn E.coli tăng lên theo thời gian nuôi môi trường dinh dưỡng có bổ xung MGDG 3 Vật liệu, hóa chất thiết bị Dụng cụ: o Bình nuôi cấy vi khuẩn 50 mL sạch, khử trùng: 10 bình o Máy lắc ấm 37ºC: máy có nhiều vị trí đặt bình nuôi o Kính hiển vi + buồng đếm: + o Máy đo quang phổ: o Cuvette Hóa chất: o Môi trường nuôi cấy E.coli (Môi trường LB lỏng đặc pha sẵn) o Monogalactosyl diacylglycerol (MGDG) (C45H74O10) [MM29186, Carbosynth] o NaCl 0.9% Trước buổi học ngày, sinh viên tiến hành nuôi cấy vi khuẩn bình có bổ sung 5µg/mL MGDG bình không bổ sung MGDG Tiến hành thí nghiệm Chia nhóm: Sinh viên chia thành 4-5 nhóm, nhóm người Chuẩn bị bình nuôi cấy: nhóm bình ghi rõ ký hiệu Đổ mL môi trường nuôi vào ống nghiệm Dùng pipet hút 0,25 ml dịch vi khuẩn E.coli cho vào bình Bổ sung µl MGDG nồng độ µg/mL vào bình (đánh dấu) Nuôi cấy 37ºC, tốc độ lắc 200 vòng/ phút 24 Đánh giá phát triển (nhân lên) vi khuẩn: Dừng máy lắc, hút 100 µl dịch nuôi cấy vi khuẩn vào ống eppendorf Pha loãng với nước cất theo tỉ lệ: 1/10, 1/100, 1/1000 Đếm số lượng tế bào vi khuẩn buồng đếm máy đo quang phổ bước sóng 600 nm tính theo công thức OD620 = 108 tế bào/mL So sánh số lượng tế bào E.coli bình để đánh giá hiệu ức chế enzyme DNA polymerase chất MGDG Chú ý - Sinh viên hiểu rõ mục đích thực hành nắm cách tiến hành thí nghiệm - Sinh viên nuôi cấy vi khuẩn E.coli xác định số lượng tế bào vi khuẩn dịch nuôi cấy Câu hỏi Vai trò enzyme DNA polymerase nguyên phân vi khuẩn? Nêu tác dụng chất ức chế monogalactosyl diacylglycerol (MGDG) lên DNA polymerase ứng dụng? KỸ THUẬT HỖ TRỢ: Phương pháp định lượng tế bào vi khuẩn dung dịch Sự diện vi sinh vật định lượng nhiều phương pháp khác đếm số lượng tế bào trực tiếp kính hiển vi, định lượng gián tiếp thông qua mức độ cản ánh sáng (độ đục) máy đo quang phổ -spectrophotometer UVvis, đếm số khuẩn lạc mọc môi trường xác định Trong 4, tiến hành định lượng trực tiếp buồng đếm hồng cầu Quy trình có ưu điểm nhanh chóng mật độ vi sinh vật mẫu có nhược điểm không phân biệt tế bào sống tế bào chết Buồng đếm hồng cầu thường phiến kính dày - mm có vùng đĩa đếm nằm phiến kính bao quanh rãnh Đĩa đếm thấp bề mặt phiến kính khoảng 1/10 mm, có hình tròn phủ lên kính độ sâu đĩa đếm đồng Vùng đĩa đếm có diện tích 1mm2 chia thành 25 ô vuông lớn có diện tích ô 1/25 mm2 400 ô vuông nhỏ hơn, ô có diện tích 1/400 mm2 Tiến hành Chuẩn bị mẫu - Pha loãng huyền phù tế bào với nước muối sinh lý 0.9% - Pha loãng mẫu cần đếm cho ô nhỏ buồng đếm có khoảng - 10 tế bào vi sinh vật Để đạt độ pha loãng cần phải ước lượng số lượng vi sinh vật mẫu, đồng thời phải thử vài lần trình pha loãng Đếm kính hiển vi Chỉnh thị trường cho thị trường chứa trọn ô lớn (4 x = 16 ô nhỏ) Đếm số tế bào diện ô lớn Sau đó, chỉnh thị trường tìm ô lớn khác Đếm số tế bào ô lớn Công thức tính mật độ tế bào: ... bào vi khuẩn dịch nuôi cấy Câu hỏi Vai trò enzyme DNA polymerase nguyên phân vi khuẩn? Nêu tác dụng chất ức chế monogalactosyl diacylglycerol (MGDG) lên DNA polymerase ứng dụng? KỸ THUẬT HỖ TRỢ:... hợp chất có khả ức chế DNA polymerase spinach Gần MGDG sử dụng làm chất kháng viêm ứng chế phát triển khối u ung thư dày thông qua tác dụng ức chế hoạt động enzyme DNA polymerase Khi tế bào tiến... (apoptosis) (hình 3) Hình Cơ chế ức chế trình tái DNA MGDG Trong thực hành, sinh viên thực thí nghiệm kiểm tra ảnh hưởng MGDG lên hoạt động enzyme DNA polymerase thông qua đánh giá nhân lên tế bào