Tinh sạch và nghiên cứu tính chất của enzyme

Tinh sạch và nghiên cứu tính chất của enzyme

TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE Mục lục I, Tóm tắt II, mở đầu 1, giới thiệu 2, phương pháp, III, kết quả.và thảo luận IV, Tài liệu tham khảo I, TÓM TẮT Enzyme amylase loại enzyme có khả chuyển hóa nguồn chất có liên kết 1-4 Glucozo thành glucozo, dextrin, enzyme amylase có trongnước bọt, dịch tiêu hóa người động vật, hạt nảy mầm nấm sợi xạ khuẩn nấm men vi khuẩn Trên giới Việt Nam có nhiều đề tài nghiên cứu việc sản xuất amylase từ chủng nấm Aspergillus oryzae Tuy nhiên nghiên tính chất động học yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính amylase lại chưa thật cụ thể Trong báo ta sử dụng enzyme amylase tách chiết từ chủng nấm mốc aspergillus oryzae Việt Nam +cách thu enzyme từ chủng nấm aspergillus oryzae +các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ xúc tác enzyme +các biện pháp tinh sơ enzyme amylase II, MỞ ĐẦU 1, GIỚI THIỆU Tinh bột với protein chất béo thành phần quan trọng bậc thành phần dinh dưỡng loài người loài động vật khác Trong trình tiêu hóa chúng bị thủy phân thành đường glucose chất tạo nên nguồn lượng thực phẩm Tinh bột sản phẩm tự nhiên quan trọng có nhiều ứng dụng kỹ thuật đời sống người Nhiều nước giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây , lúa mì , ngô nước ta sử dụng chủ yếu lúa khoai mì nguồn tinh bột chủ yếu Page TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE Trong chế biến tinh bột đường công đoạn quan trọng thủy phân tinh bột đường đơn giản Sau , chủ yếu sở đường đơn nhờ lên men người ta thu nhiều sản phẩm quan trọng rượu cồn, rượu vang, bia loại acid hữu , amino acid Trước người ta hay dung acid H2SO4 để thủy phân tinh bột kết cho thấy thủy phân acid khó kiểm soát thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn Nên để thủy phân tinh bột người ta sử dụng enzyme amylase thu nhận từ thực vật vi sinh vật Enzyme amylase tìm góp phần quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm Ezyme amylase tìm thấy nhiều nguồn khác amylase từ thực vật, động vật, vi sinh vật Amylase ngày thay acid quy mô công nghiệp Nguồn amylase lấy từ mầm thóc mầm đại mạch (matl), hạt bắp nảy mầm hay từ nấm mốc Nguyên liệu cho sản xuất enzyme amylase thường gạo, bắp khoai mì, nguồn nguyên liệu rẻ tiền dễ tìm nước ta lợi hướng phát triển mạnh làm sở cho nhiều ngành khác phát triển Ví dụ sản xuất rượu , bia , nước giải khát 2,PHƯƠNG PHÁP : Chủng giống môi trường nuôi cấy, môi trường thu enzyme: Chủng nấm Asgersillus oryze phân lập từ nguồn mốc cơm (meo sử dụng làm tương) môi trường PDA: 20% khoai tây, 2% glucozo, 2% agar Đặc điểm chủng Aspergillus oryzae loại nấm vi thể thuộc Plectascales lớp ascomycetes thể sinh trưởng hệ sợi bao gồm sợi mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh nhiều có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào ) Chủng Asp.oryzae: giàu enzyme thủy phân nội bào ngoại bào (amylase, protease, pectinasa,…), ta hay gặp chúng kho nguyên liệu, thùng chứa đựng bột, gạo… hết không rửa sạch, cặn bã bia, bã rượu, lỏi ngô, bã sắn… Chúng mọc phát triển có thành lớp mốc, có màu sắc đen ,vàng… Màu bào tử Page TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE già có màu sắc Các bào tử này, dễ bị gió bay xa phát tán khắp nơi, gặp điều kiện thuận lợi mọc thành mốc -Hình ảnh chủng nấm aspergillus oryzae Hóa chất: Page TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE Dùng hóa chất có phòng thí nghiêm khoa Khoa học Sự Sống đươc cung cấp từ nhiều hang khác nhau: K2HPO4, MgSO4.7H2O, NaNO3, KCl, FeSO4.7H2O, peptone, cao nấm men, NaOH, DNS… Sinh tổng hợp amylase Chủng Asgersillus oryze nuôi cấy môi trường khoáng Czapek có bổ sung 1% tinh bột, 0.4% peptone, 0,2% cao nấm men, pH=6.0, sau ngày nuôi máy lắc thu dịch nhận enzyme để xác định hoạt tính amylase Xác đinh hoạt tính amylase Hoạt tính amylase xác đinh phương pháp quang phổ theo Miler(1959), với chất tinh bột 1% đệm acetate pH 5,6 Thuốc thử dung dịch DNS 1% pha NaOH muối kép Phản ứng tiến hành theo Miler 1959 đo bước sóng 540nm Độ hấp phụ đối chiếu với đường chuẩn glucozo để tính lượng đường giải phóng tương đương Một đơn vị hoạt độ amylase xác định lượng enzyme xúc tác thủy phân giải phóng mol tinh bột vòng phút điều kiên thí nghiệm Xác định hoạt độ enzyme amylase theo phương pháp phân tích lượng đường khử tạo thành: 1, Dựng đường chuẩn 2, Tiến hành xác định hoạt độ - Chuẩn bị chất CMC 1% (ư/v) pha đệm acetate 100mM, pH 5,0 Ống thí nghiệm Ống kiểm tra 0,25 ml enzyme 0,25 ml enzyme 0,5 ml tinh bột 1% 0,75 ml DNS 1% Page TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE - Đảo - Ủ 50oC 10 phút 0,75 ml DNS 1% - 0,5 ml tinh bột 1% Đảo Đun sôi cách thủy 5- 10 phút Làm nguội đến nhiệt độ phòng Đo độ hấp phụ bước sóng 540 nm ΔOD1 0.707 ΔOD2 0.720 Từ giá trị OD ta tính theo đường chuẩn lượng đường ống thí nghiệm ống kiểm tra Vậy hoạt độ enzyme tính là: Áp dụng công thức tính hoạt độ :HĐ (U/ml) = (a – b)* HSPL/(V*t) (a1 –b1) = (0,707 – 0,0048)/0,6475 = 1.084 HD1 = (1,084*8)/(0,25*10) = 3.4688 (a2 –b2) = (0,720 – 0,0048)/0,6475 =1.104 HD2 = (1.104*8)/(0,25*10) =3.528 Tinh sơ protein: Enzyme trích ly chứa nhiều protein tạp, để loại bớt tiến hành tủa dịch enzyme dung môi hữu cơ: acetone, ethanol, methanol Các dung môi hữu hòa vào dung dịch làm thay đổi số điện môi dẫn đến protein có xu hướng liên kết với (kết tủa) Ta tủa dịch enzyme với dung môi nồng độ khác từ 40%-90%, lưu ý tủa phải tiến hành nhiệt độ thấp thời gian tủa thích hợp không dài, nghiên cứu 30 phút Sau đó, tiến hành ly tâm thu tủa, bổ sung dung dịch đệm kiểm tra hoạt tính Page TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE Tinh protein phương pháp sắc ký lọc Gel Phương pháp sắc ký lọc gel phương pháp tinh enzyme dựa vào kích thước enzyme Để thực phương pháp ta cần làm bước sau: Chuẩn bị cột sắc ký * Ngâm gel - Cân 2g sephadex G-100 cho vào cốc đong 500 ml, bổ sung nước cất khử trùng nước khử ion khuấy - Ngâm 48h, khuấy nhẹ * Nhồi cột - Kẹp cột sắc ký vào giá treo phương thẳng đứng, lắp khóa vào cột sắc ký, nhồi mội thủy tinh vào đáy cột - Gạn bớt nước cốc ngâm gel, khuấy đều, cho gel chạy từ từ theo thành cột sắc ký đũa thủy tinh - Mở khóa cho nước chảy để gel nhồi nén vào cột Tiếp tục trình lên cột toàn lượng gel - Rửa cột 150 – 200 ml nước cất khử trùng *Cân cột - Cho 150 -200 ml đệm acetate 0,05 M, pH 5,6 chảy từ từ qua cột Tiến hành sắc ký - Cho mẫu lên cột: dùng pipet nhỏ từ từ theo thành cột từ – 10 ml mẫu protein - Mở khóa điều chỉnh tốc độ dòng chảy khoảng 30 ml/h - Khi lượng mẫu thấm hết vào gel: bổ sung từ từ đệm acetate 0,05 M, pH 5,6 lên cột tiến hành thu 20 phân đoạn vào ống nghiệm nhỏ (mỗi phân đoạn ml) Đánh giá độ phương pháp điện di protein Đánh giá độ phương pháp điện di protein ( SDS – PAGE) Page TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE Đổ gel Seperating gel (Gel tách) Sol A: 2,5 ml Sol C: 3,3 ml Sol D: 0,1 ml ASP 10%: 50 µl TEMED: µl H2O cất khử ion: 4,045 ml Stacking gel (Gel cô) Sol B: ml Sol C: 0.67 ml Sol D: 0,04 ml ASP 10%: 30 µl TEMED: µl H2O cất khử ion: 2,33 ml Đổ gel tách trước khoảng 30 phút sau tiếp tục đổ gel cô, để đông 30 phút - Lắp gel vào bể điện di - Đổ đầy đệm chạy vào bể điện di ngập gel - Làm giếng Chuẩn bị mẫu - 25 µl dịch enzyme + µl Loading 5x - Biến tính 95oC 10 phút, làm lạnh - Tra từ từ mẫu vào giếng gel Chạy điện di - Chạy cường độ dòng điện 80V với gel cô 100-120V với gel tách - Sau chạy xong, tách gel khỏi kính Nhuộm gel Để gel ngập dung dịch nhuộm khoảng 1-2 qua đêm điều kiện lắc nhẹ Tẩy gel phân tích - Ngâm dung dịch tẩy điều kiện lắc nhẹ đến có màu trắng - Bảo quản gel nước cất Phân tích kết Page TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE III, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phương trình đường chuẩn glucozo theo miler 1959 HĐ (U/ml)= (a-b)*HSPL/(V*t *Các yếu tố ảnh hưởng đến họa độ xúc tác enzyme -Ảnh hưởng chất đến hoạt tính amylase - ảnh hưởng nồng độ chất đến hoạt tính enzyme amylase Cơ chất thành phản ứng enzyme chất Tốc độ phản ứng amylase giới hạn có phụ thuộc vào nồng độ chất tinh bột môi trường Chừng enzyme chưa bị bão hòa chất tốc độ phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ chất Và nồng độ chất khác hoạt tính hay vận tốc phản ứng amylase khác Page TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE Hình đồ biểu diễn biến đổi vận tốc phụ thuộc vào vận tôc phản ứng Từ mối quan hệ nồng độ chất với vận tốc phản ứng enzyme ta tìm đước thông số động học amylase: Vmax Km Các thông số động học enzyme amylase tính toán dựa vào phương trình Lineweaver-Burk Kết thu nhận sau: Bảng kết thủy phân tinh bột amylase [S] (%) 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 1.4 1.6 [ V ] (%/phút) 0.209 0.308 0.564 0.567 0.575 0.601 0.694 0.72 0.723 1/[S] 10 2.5 1.667 1.25 0.833 0.714 0.625 1/[V] 4.785 3.247 1.773 1.764 1.739 1.664 1.441 1.389 1.383 Page TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE Đồ thị biểu điển phụ thuộc 1/V 1/S amylase Bảng thông số động học amylase từ chủng Aspersillus oryze Vmax Km amylase 0.856 0.342 -ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme amylase Để xác định nhiệt độ thích hợp (opt), nhiệt độ mà enzyme có khả thủy phân chất mạnh Ta tiến hành cho enzyme amylase thủy phân chất tinh bột 1% nhiệt độ khác nhau: 30; 40; 50;60; 70 Nhiệt độ ΔOD Hoạt tính 30oC 1.118 2.7507 40oC 1.271 3.1362 50oC 1.385 3.4106 60oC 1.380 3.3982 70oC 0.632 1.5498 Hoạt tính enzyme amylase tăng dần từ nhiệt độ 30 oC đến 60oC, ổn định khoảng nhiệt độ 50oC – 60oC, sau hoạt tính enzyme giảm xuống nhanh chóng Theo số tài liệu công bố Enzyme amylase có khả xúc tác mạnh khoảng nhiêt độ 50-600C nhiệt độ tăng lên tiếp hoạt tính enzyme giảm Trong nghiên cứu này, có chung kết luận với nghiên cứu công bố, khoảng nhiệt độ thích hợp enzyme amylase thủy phân chất tinh bột 50-60 0C cao 600C Page 10 TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE Hình: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả xúc tác enzyme amylase - ảnh hưởng PH đến hoạt tính enzyme amylas Mỗi enzyme có khoảng pH thích hợp (opt), khoảng pH mà enzyme thể hoạt tính mạnh Để xác đinh khoảng pH opt amylase, ta cho enzyme thủy phân chất tinh bột 1% đệm acetate từ pH= (3; 4; 5) đệm photphat từ (6; 7; 8) pH ΔOD Hoạt tính acetate phosphat e 0.374 0.8056 0.582 1.4262 1.425 3.5094 1.305 3.2128 0.872 2.1428 0.756 1.8562 Page 11 TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE hoạt tính enzyme cao nằm khoảng PH từ 5-6 Theo số nghiên cứu amylase cho hoạt tính mạnh khoảng pH 5-6 Như đề xuất pHopt amylase Ảnh hưởng pH tới hoạt tính amylase -ảnh hưởng dung môi hữu đến hoạt độ enzyme amylase Dung môi hữu àm thay đổi cấu trúc enzyme từ ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Để kiểm tra ảnh hưởng ta cho enzyme ủ với loại dung môi hữu khác nhau: acetone, ethanol,methanol Với lượng enzyme với 10% dung môi 30 phút, tiến hành thí nghiệm Dung môi hưu ΔOD Hoạt tính Ethanol 1.102 2.7112 Methanol 1.257 3.0941 Page 12 TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE Acetone 1.415 3.4846 Nước 1.124 2.7656 Dung môi hưu acetone ảnh hưởng hoạt tính enzyme amylase cao nhất, làm tăng hoạt tính enzyme Dung môi nồng độ thích hợp để tủa enzyme Tủa dung môi hữu phương pháp tinh sơ amylase Phương pháp tốn thời gian dễ làm Khi tủa amylase dung môi nồng khác thu enzyme amylase có hoạt tính khác dẫn đến hiệu suất tủa khác Nồng độ 50% 60% 70% 80% 90% E thô ∆OD 0.797 1.089 1.521 1.578 0.545 0.7 Hspl 6 8 Hoạttính 2.936 4.018 7.493 7.774 2.66922 1.718 Hiệusuấ t 58.5 42.76 22.9 22.1 64.36 Bảng ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hoạt tính enzyme Từ số liệu ta thấy tủa enzyme acetone khoảng nồng độ 70-80% cho hiệu tốt nhất, tối đa 80% đó, hoạt tính enzyme 7.774 U/ml Xác định phân đoạn có enzyme từ phương pháp sắc ký lọc gel: Sắc ký lọc gel phương pháp tinh enzyme dựa vào kích thước phân tử enzyme Đây phương pháp cho hiêu cao Chúng tiến hành sắc ký enzyme amylase thu 20 phân đoạn, sau kiểm tra hoạt tính cho kết sau: Page 13 TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE Phân đoạn 10 11 12 13 14 15 16 17 ∆OD x x x x 0,872 1,131 1,205 1,624 1,649 0,98 0,67 0,48 x x x Hoạt độ 0 0 2,143 2,873 2,965 4,001 4,063 2,41 1,644 1,174 x x x Kết cho thấy enzyme amylase xuất hiên phân đoạn từ (512) Sau lấy mẫu phân đoạn từ 5-13 điện di cho hình ảnh sau: Page 14 TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE Hình ảnh kết điện di *Kết luận Từ kết thu qua thí nghiệm báo, rút kết luận trình tinh nghiên cứu tính chất enzyme amylase từ chủng nấm aspergillus oryzae sau : - Chủng Aspergillus oryzae nuôi cấy môi trường khoáng Czapek có bổ sung 1% tinh bột, 0.4% peptone, 0,2% cao nấm men, pH=6.0, sau ngày nuôi máy lắc thu dịch nhận enzyme để xác định hoạt tính amylase - Hoạt tính amylase xác đinh phương pháp quang phổ theo Miler(1959), với chất tinh bột 1% đệm acetate pH 5,6 Thuốc thử dung dịch DNS 1% pha NaOH muối kép - Từ khoảng pH 5-6 enzyme amylase có hoạt tính mạnh - Nồng độ acetone 80% nồng độ tủa enzyme tối đa với hoạt tính 7.774U/ml Page 15 TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE - Khoảng nhiệt độ thích hợp để amylase thủy phân tinh bột cao 60oC IV TÀI LIỆU THAM KHẢO Bài giảng thực hành công nghệ protein –Ths Trịnh Đình Khá Bài giảng thực hành công nghệ enzyme-Ths Trịnh Đình Khá Giáo trình công nghệ sinh hoc tập enzyme ứng dụng Phạm Thị Trân Châu-Phan Tuấn Nghĩa Các từ khóa enzyme amylase; aspergillus oryzae http://www.ebook.edu.vn http://.Tailieu.vn Page 16 [...].. .TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE Hình: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng xúc tác của enzyme amylase - ảnh hưởng của PH đến hoạt tính enzyme amylas Mỗi enzyme có 1 khoảng pH thích hợp (opt), đó chính là khoảng pH mà enzyme thể hiện hoạt tính mạnh nhất Để xác đinh khoảng pH opt của amylase, ta cho enzyme thủy phân cơ chất tinh bột 1% trong... ΔOD Hoạt tính Ethanol 1.102 2.7112 Methanol 1.257 3.0941 Page 12 TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE Acetone 1.415 3.4846 Nước 1.124 2.7656 Dung môi hưu cơ acetone ảnh hưởng hoạt tính của enzyme amylase cao nhất, làm tăng hoạt tính của enzyme Dung môi và nồng độ thích hợp để tủa enzyme Tủa bằng dung môi hữu cơ là trong những phương pháp tinh sạch sơ bộ... mẫu ở các phân đoạn từ 5-13 đi điện di thì cho hình ảnh như sau: Page 14 TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE Hình ảnh kết quả điện di *Kết luận Từ những kết quả thu được qua các thí nghiệm của bài báo, chúng tôi rút ra những kết luận về quá trình tinh sạch và nghiên cứu tính chất của enzyme amylase từ chủng nấm aspergillus oryzae như sau : - Chủng Aspergillus... acetate từ pH= (3; 4; 5) và trong đệm photphat từ (6; 7; 8) pH ΔOD Hoạt tính acetate phosphat e 3 0.374 0.8056 4 0.582 1.4262 5 1.425 3.5094 6 1.305 3.2128 7 0.872 2.1428 8 0.756 1.8562 Page 11 TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE hoạt tính của enzyme cao nhất nằm trong khoảng PH từ 5-6 Theo 1 số nghiên cứu thì amylase cho hoạt tính mạnh ở khoảng pH 5-6... 5-6 Như vậy có thế đề xuất pHopt của amylase là 5 Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính của amylase -ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt độ của enzyme amylase Dung môi hữu cơ có thể àm thay đổi cấu trúc của enzyme từ đó ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme Để kiểm tra sự ảnh hưởng này ta cho enzyme ủ với các loại dung môi hữu cơ khác nhau: acetone, ethanol,methanol Với lượng enzyme ử với 10% dung môi trong... tủa enzyme tối đa nhất với hoạt tính là 7.774U/ml Page 15 TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE - Khoảng nhiệt độ thích hợp để amylase thủy phân tinh bột cao nhất là 60oC IV TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Bài giảng thực hành công nghệ protein –Ths Trịnh Đình Khá 2 Bài giảng thực hành công nghệ enzyme- Ths Trịnh Đình Khá 3 Giáo trình công nghệ sinh hoc tập 3 enzyme và. .. tủa enzyme bằng acetone ở khoảng nồng độ 70-80% sẽ cho hiệu quả tốt nhất, và tối đa là ở 80% khi đó, hoạt tính enzyme là 7.774 U/ml Xác định các phân đoạn có enzyme từ phương pháp sắc ký lọc gel: Sắc ký lọc gel là phương pháp tinh sạch enzyme dựa vào kích thước phân tử của enzyme Đây là phương pháp cho hiêu quả rất cao Chúng tôi tiến hành sắc ký enzyme amylase thu 20 phân đoạn, sau khi kiểm tra hoạt tính. .. Czapek có bổ sung 1% tinh bột, 0.4% peptone, 0,2% cao nấm men, pH=6.0, sau 5 ngày nuôi trong máy lắc thì thu dịch nhận enzyme để xác định hoạt tính của amylase - Hoạt tính của amylase được xác đinh bằng phương pháp quang phổ theo Miler(1959), với cơ chất tinh bột 1% trong đệm acetate pH 5,6 Thuốc thử là dung dịch DNS 1% pha trong NaOH và muối kép - Từ khoảng pH 5-6 enzyme amylase có hoạt tính mạnh nhất -... đoạn, sau khi kiểm tra hoạt tính cho kết quả như sau: Page 13 TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE Phân đoạn 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 ∆OD x x x x 0,872 1,131 1,205 1,624 1,649 0,98 0,67 0,48 x x x Hoạt độ 0 0 0 0 2,143 2,873 2,965 4,001 4,063 2,41 1,644 1,174 x x x Kết quả này cho thấy enzyme amylase xuất hiên ở các phân đoạn từ (512) Sau đó chúng... ít thời gian và rất dễ làm Khi tủa amylase bằng dung môi ở các nồng khác nhau thì sẽ thu được enzyme amylase có hoạt tính khác nhau dẫn đến hiệu suất tủa cũng khác nhau Nồng độ 50% 60% 70% 80% 90% E thô ∆OD 0.797 1.089 1.521 1.578 0.545 0.7 Hspl 6 6 8 8 8 4 Hoạttính 2.936 4.018 7.493 7.774 2.66922 1.718 Hiệusuấ t 58.5 42.76 22.9 22.1 64.36 Bảng ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hoạt tính enzyme Từ số ... hoạt tính Page TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE Tinh protein phương pháp sắc ký lọc Gel Phương pháp sắc ký lọc gel phương pháp tinh enzyme dựa vào... Chuẩn bị chất CMC 1% (ư/v) pha đệm acetate 100mM, pH 5,0 Ống thí nghiệm Ống kiểm tra 0,25 ml enzyme 0,25 ml enzyme 0,5 ml tinh bột 1% 0,75 ml DNS 1% Page TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME. .. chung kết luận với nghiên cứu công bố, khoảng nhiệt độ thích hợp enzyme amylase thủy phân chất tinh bột 50-60 0C cao 600C Page 10 TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM