HỆ THỐNG PROTEIN DUNG HỢP VỚI GST (HỌ VECTOR pGEX)

HỆ THỐNG PROTEIN DUNG HỢP VỚI GST (HỌ VECTOR pGEX)

HỆ THỐNG PROTEIN DUNG HỢP VỚI GST (HỌ VECTOR pGEX) I • • • • • • • Đặc điểm họ vector pGEX: Có chứa promoter tac điều khiển biểu vượt mức gen nằm hạ lưu cảm ứng IPTG chất có cấu trúc tương tự Vùng gen lacIq dạng đột biến gen lacI tạo lượng lớn repressor lac operon (lacO) tế bào chủ E.coli Điểm khởi đầu chép Ori: vị trí DNA polymerase tế bào vi khuẩn gắn vào bắt đầu trình chép plasmid Gen kháng Ampicillin làm nhân tố sàng lọc tế bào khơng có plasmid q trình biến nạp trải lên mơi trường chọn lọc có ampicillin Việc tách rửa cho phép thu nhận protein dung hợp khỏi cột lực điều kiện ơn hồ để đảm bảo tính kháng ngun hoạt tính chức protein Có vị trí nhận biết cho enzyme protease PreScission™, thrombin, or factor Xa để cắt protein mục tiêu khỏi sản phẩm protein dung hợp Có vị trí kết thúc phiên mã nằm sau vùng MCS Hệ thống pGEX có tất 13 vectors Trong có vectors có vùng MCS mở rộng giúp dễ dàng việc dịng hố, chứa vị trí nhận biết cho enzyme cắt giới hạn: • pGEX-6P-1, pGEX-6P-2, and pGEX-6P- mã hố cho trình tự nhận biết vị trí cắt đặc hiệu protease PreScission™ domain GST MCS • pGEX-4T-1, pGEX-4T-2, and pGEX-4T-3 bắt nguồn từ pGEX-2T chứa vị trí nhận biết cho thrombin • pGEX-5X-1, pGEX-5X-2, and pGEX5X-3 dẫn xuất pGEX-3X có vị trí nhận biết cho factor Xa II Đặc tính vector pGEX: Cảm ứng: promoter tac cảm ứng IPTG (1-5 mM) Biểu hiện: protein biểu protein dung hợp với protein GST (26 kDa) Gen GST chứa codon khởi đầu ATG vị trí kết hợp với ribosome, chịu kiểm sốt promoter tac Mỗi ORF có codon kết thúc trình dịch mã Protein dung hợp tinh kit tinh protein dung hợp với GST • Vị trí cắt protease PreScission™: pGEX-6P-1, -2, -3 cho phép loại bỏ protein GST khỏi protein dung hợp enzyme cắt PreScission™ Bởi PreScission™ xử lý với tag GST Tag GST loại bỏ đồng thời với protein GST khỏi protein dung hợp • Vị trí cắt enzyme thrombin: pGEX-1λT, pGEX-2T, pGEX-2TK, pGEX4T-1, -2, -3 cho phép loại bỏ protein GST khỏi protein dung hợp thrombin • • • Vị trí cắt cho fator Xa: pGEX-3X, pGEX-5X-1, -2, -3 cho phép loại bỏ protein GST khỏi protein dung hợp factor Xa • Đánh dấu trực tiếp điều kiện in vitro: pGEX-2TK cho phép đánh dấu P32 protein dung hợp điều kiện in vitro tiểu phần xúc tác protein kinase phụ thuộc cAMP • Tế bào chủ: E.coli plasmid mang gen ức chế lacIq • Marker chọn lọc: plasmid chứa gen kháng ampicillin 100 àg/ml II.1 pGEX-2T: ã Vựng gen GST: promoter tac:-10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn kết ribosome: 244; codon khởi đầu ATG: 258; vùng mã hoá cho vị trí cắt thrombin: 918-935 • MCS:930-945 • Vùng gen cho beta-lactamase: Promoter: -10: 1309-1314; -35: 12861291; codon khởi đầu (ATG): 1356; codon kết thúc (TAA): 2214 • Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3297; codon kết thúc (TGA): 4377 • Vùng chép plasmid: vị trí khởi đầu chép: 2974; vùng cấn thiết cho chép: 2281-2977 • Trình tự primer: 5’ pGEX trình tự primer kết hợp nucleotide 869891; 3’ pGEX trình tự primer kết hợpơơ3 nucleotides 1020-998 II.2 pGEX-2TK: • Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn ribosome cho GST:244; codon khởi đầu (ATG) cho GST: 258; vùng mã hố cho vị trí cắt thrombin: 918-935; • Vùng mã hố cho vị trí cắt kinase: 936-950 • Vùng MCS: 951-966 • Vùng gen beta-lactamase: promoter: -10: 1330-1335; -35: 1307-1312; codon khởi đầu (ATG): 1377; codon kết thúc (TAA): 2235 • Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3318; codon Stop (TGA): 4398 • Vùng chép plasmid: vị trí khởi đầu chép: 2995; vùng cần thiết cho chép: 2302-2998 • Trình tự primers: trình tự primer 5' pGEX bắt cặp vị trí 869891; trình tự primer 3' pGEX bắt cặp vị trí 1041-1019 II.3 pGEX-3X: • Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn kết với ribosome cho GST: 244; codon • • • • • khởi đầu (ATG) cho GST: 258; vùng mã hố cho vị trí cắt Factor Xa: 921-932 Vùng MCS: 934-949 Vùng gen Beta-lactamase: Promoter: -10: 1313-1318; -35: 1290-1295; codon khởi đầu (ATG): 1360; codon kết thúc (TAA): 2218 Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3301; codon kết thúc (TGA): 4381 Vùng chép plasmid: vị trí khởi đầu chép: 2978; vùng cần thiết cho chép: 2285-2981 Trình tự primers: trình tự Primer 5' pGEX bắt cặp vị trí 869-891; trình tự Primer 3' pGEX bắt cặp vị trí 1024-1002 II.4 pGEX-1λT: • Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn với ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hố cho vị trí cắt thrombin: 918-935 • Vùng MCS: 930-944 • Vùng gen beta-lactamase: promoter: -10: 1308-1313; -35: 1285-1290; codon khởi đầu (ATG): 1355; codon kết thúc (TAA): 2213 • Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3296; codon kết thúc (TGA): 4376 • Vùng chép plasmid: vị trí khởi đầu chép: 2973; vùng cần thiết cho chép: 2280-2976 • Trình tự primers: trình tự primers 5' pGEX bắt cặp vị trí 869-891; trình tự primer 3' pGEX bắt cặp vị trí 1019-997 II.5 pGEX-4T-1: • Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; Vị trí gắn với ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hố cho vị trí cắt thrombin: 918-935 • Vùng MCS: 930-966 • Vùng gen beta-lactamase: promoter: -10: 1330-1335; -35: 1307-1312; codon khởi đầu (ATG): 1377; codon kết thúc (TAA): 2235 • Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3318; codon kết thúc (TGA): 4398 • Vùng chép plasmid: vị trí khởi đầu chép: 2995; vùng cần thiết cho chép: 2302-2998 • Trình tự primers: trình tự primer 5' pGEX bắt cặp vị trí 869891; trình tự primer 3' pGEX bắt cặp vị trí 1041-1019 II.6 pGEX-4T-2: • Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn kết với ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hố cho vị trí cắt thrombin: 918-935 • Vùng MCS: 930-967 • Vùng gen Beta-lactamase: promoter: -10: 1331-1336; -35: 1308-1313; codon khởi đầu (ATG): 1378; codon kết thúc (TAA): 2236 • Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3319; codon kết thúc (TGA): 4399 • Vùng chép: vị trí khởi đầu chép 2996; vùng cần thiết cho chép: 2303-2999 • Trình tự primers: 5' pGEX bắt cặp bổ sung vị trí 869-891; 3' pGEX bắt cặp bổ sung vị trí 1042-1020 II.7 pGEX-4T-3: • Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn với ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hố cho vị trí cắt thrombin: 918-935 • Vùng MCS: 930-965 • Vùng gen Beta-lactamase: Promoter: -10: 1329-1334; -35: 1306-1311; codon khởi đầu (ATG): 1376; codon kết thúc (TAA): 2234 • Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3317; codon kết thúc (TGA): 4397 • Vùng chép: vị trí khởi đầu chép: 2994; vùng cần thiết cho chép:2301-2997 • Trình tự primers: 5' pGEX bắt cặp vị trí 869-891; 3' pGEX bắt cặp vị trí 1040-1018 II.8 pGEX-5X-1: • Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hố cho vịt rí cắt factor Xa: 921-932 • Vùng MCS: 934-969 • Vùng gen beta-lactamase: promoter: -10: 1333-1338; -35: 1310-1315; codon khởi đầu (ATG): 1380; codon kết thúc (TAA): 2238 • Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3321; codon kết thúc (TGA): 4401 • Vùng chép: vị trí khởi đầu chép: 2998; vùng cần thiết chép: 2305-3001 • Trình tự primers: 5’ pGEX bắt cặp vị trí 869-891; 3’ pGEX bắt cặp vị trí 1044-1022 II.9 pGEX-5X-2: • Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hố cho vị trí cắt factor Xa: 921-932 • Vùng MCS: 934-970 • Vùng gen beta-lactamase: promoter: -10: 1334-1339; -35: 1311-1316; codon khởi đầu (ATG): 1381; codon kết thúc (TAA): 2239 • Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3322; codon kết thúc (TGA): 4402 • Vùng chép: vị trí khởi đầu chép: 2999; vùng cần thiết cho chép: 2306-3002 • Trình tự primers: 5' pGEX bắt vị trí 869-891; 3' pGEX bắt cặp vị trí 1045-1023 II.10 pGEX-5X-3: • Vùng gen GST: tac promoter: -10: 205-211; -35: 183-188; lac operator: 217-237; vị trí gắn ribosome: 244; codon khởi đầu (ATG): 258; vùng mã hố cho vị trí cắt factor Xa: 921-932 • Vùng MCS: 934-971 • Vùng gen beta-lactamase: Promoter: -10: 1335-1340; -35: 1312-1317; codon khởi đầu (ATG): 1382; codon kết thúc (TAA): 2240 • Vùng gen lacIq: codon khởi đầu (GTG): 3323; codon kết thúc (TGA): 4403 • Vùng chép: vị trí khởi đầu chép: 3000; vùng cần thiết cho chép: 2307-3003 • Trình tự primers: 5' pGEX bắt cặp vị trí 869-891; 3' pGEX bắt cặp vị trí 1046-1024 Hình 1: Sơ đồ vectors dung hợp GST cho thấy ORFs đặc điểm codon stop tất ORFs không mô tả đồ tất 13 vectors có codon stop tất ORFs phía thượng nguồn vị trí MCS III Phương pháp phát protein dung hợp với GST: III.1 Phát protein dung hợp với GST nhờ hoạt tính enzyme: Sản phẩm protein dung hợp với GST từ vector pGEX phát dựa vào hoạt tính GST chất khơng màu CDNB (1-chloro-2,4-dinitrobenzen) tạo sản phẩm có màu, có phổ hấp thu cực đại bước sóng 340 nm (1) Hình 2: Phương pháp phát protein dung hợp với GST hoạt tính enzyme (1) III.2 Phương pháp lai miễn dịch: Protein dung hợp phát kháng thể đặc hiệu kháng nguyên đánh dấu Sau protein dung hợp phân đoạn điện di gel polyacrylamid, vạch protein chuyển thẩm lên màng lai Sau màng lai đựơc ủ với kháng thể thứ (kháng thể kháng GST-anti GST IgG), bắt đặc hiệu với protein dung hợp Kháng thể kháng GST kháng thể đa dòng tinh từ huyết dê mà gây miễn dịch với GST Schistosoma japonicum Sau màng lai ủ với kháng thể thứ hai đánh dấu (kháng thể thứ hai gắn đặc hiệu với đoạn Fc kháng thể thứ nhất) Nếu kháng thể thứ hai đánh dấu horse-radish peroxidase phát dựa vào phản ứng xúc enzyme peroxidase chất H2O2 luminol làm phát ánh sáng, có phổ hấp thu bước sóng 428 nm đựơc ghi nhận lại phim (1) Hình 3: Phương pháp lai miễn dịch (1) IV Tinh chế protein dung hợp với GST: Protein dung hợp với GST từ dịch ly giải tế bào vi khuẩn dể dàng tinh chế nhờ lực cao glutathione với GST Sử dụng glutathione gắn kết với giá thể Sepharose cột săc ký, cho hổn hợp protein qua cột, protein dung hợp với GST gắn với glutathione giữ lại cột Các protein khác không gắn rửa trôi qua cột Protein dung hợp sau dung ly khỏi cột điều kiện trung tính khơng biến tính chất khử glutathione (1) Protein mục tiêu cắt khỏi GST protein dung hợp nhờ hoạt tính protease (PreScission, thrombin factor Xa) có khả nhận biết vị trí cắt đặc hiệu protein dung hợp Phản ứng cắt thực protein dung hợp giữ lại cột Protein mục tiêu tách khỏi GST dung ly dung dịch rửa cột Tuy nhiên, trường hợp ứng dụng cần có chức GST protein dung hợp sản phẩm protein dung hợp cần tinh chế dạng protein dung hợp với GST Hình 4: Phương pháp tách chiết protein dung hợp với GST Tài liệu tham khảo: Stan Metzenberg, Fusion proteins and display libraries (Biology 470 – Biotechnology) California State University Northridge GE healthcare pGEX Vectors (GST Gene Fusion System) GE healthcare Protein (http://www.amersham.com) Handling and Detection Techniques  ... cột Protein mục tiêu tách khỏi GST dung ly dung dịch rửa cột Tuy nhiên, trường hợp ứng dụng cần có chức GST protein dung hợp sản phẩm protein dung hợp cần tinh chế dạng protein dung hợp với GST. .. Sepharose cột săc ký, cho hổn hợp protein qua cột, protein dung hợp với GST gắn với glutathione giữ lại cột Các protein khác không gắn rửa trôi qua cột Protein dung hợp sau dung ly khỏi cột điều kiện... (1) IV Tinh chế protein dung hợp với GST: Protein dung hợp với GST từ dịch ly giải tế bào vi khuẩn dể dàng tinh chế nhờ lực cao glutathione với GST Sử dụng glutathione gắn kết với giá thể Sepharose