Hoàn chỉnh hệ thống pcr đa mồi để chẩn đoán và theo dõi vi khuẩn th ơng hàn đa kháng thuốc

bộ Y tế _ Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Bộ hoàn chỉnh hệ thống pcr đa mồi để Chẩn đoán theo dõi vi khuẩn thơng hàn đa kháng thuốc Chủ nhiệm đề tài PGS TS Lê Văn Phủng Cơ quan chủ trì Trờng đại học Y Hà Nội Cơ quan chủ quản Bộ Y tế 6057 01/9/2006 Năm 2006 Lời cảm ơn Thay mặt nhóm nghiên cứu, xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp sở sau đây, giúp đỡ nhiệt tình vô t để công trình hoàn thành: Bệnh viện đa khoa Đồng Tháp, bệnh viện Trung ơng Huế (Thừa Thiên Huế) bệnh viện Thanh Nhàn (Hà Nội); Labo trung tâm Y sinh học, Bộ môn Vi sinh Y học, Phòng NCKH, Phòng Tài vụ (ĐHY Hà Nội); Vụ Khoa học-Đào tạo (Bộ Y tế) Chủ nhiệm đề tài PGS TS Lê Văn Phủng Những chữ viết tắt PCR Polymerase Chain Reaction RIA Radioimmunoassay (Thử nghiệm miễn dịch phóng xạ) IHA Indirect Haemaglutination (Ngng kết hồng cầu gián tiếp) CHL Chloramphenicol MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) NAL Nalidixic Acid CAT Chloramphenicol Acetyltransferase Cat Gen cat dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphate ATP Adenosine triphosphate CTP Cytosine triphosphate GTP Guanosine triphosphate TTP Thymidine triphosphate Taq Thermus aquaticus TAE Tris-Acetate-EDTA (Đệm TAE) EMBL European Molecular Biology Laboratory (Phòng thí nghiệm sinh học phân tử châu Âu) DDBJ DNA Data Bank of Japan (Ngân hàng liệu ADN Nhật Bản) NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông tin sinh học Quốc gia, Mỹ) Những ngời thực TT Họ tên Học hàm, học vị chuyên môn Cơ quan Lê Văn Phủng PGS TS, Vi sinh vật Đại học Y Hà Nội Nguyễn Trọng Tuệ ThS, Sinh học Đại học Y Hà Nội (Th ký) Phạm Thanh Tân BS, Đa khoa Đại học Y Hà Nội (Th ký tài chính) Bùi Khắc Hậu PGS TS, Vi sinh vật Đại học Y Hà Nội Trần Hồng Vân BS, Đa khoa Đại học Y Hà Nội Cao Văn Viên PGS TS, Truyền nhiễm Viện bệnh truyền nhiễm Nhiệt đới Quốc gia Nguyễn Liên Phan Văn Bé Bảy BS, Vi sinh vật Bệnh viện đa khoa Đồng Tháp Lê Thị Phợng BS, Truyền nhiễm Bệnh viện đa khoa Đồng Tháp Thị Nam ThS, Vi sinh vật Bệnh viện trung ơng Huế Mục lục Nội dung Trang Phần A: Tóm tắt kết nghiên cứu bật Đóng góp đề tài áp dụng vào thực tiễn Đánh giá thực đề tài đối chiếu với đề cơng đợc phê duyệt ý kiến đề xuất Phần B: báo cáo chi tiết kết nghiên cứu Đặt vấn đề Chơng 1: Tổng quan 1.1 Tình hình bệnh thơng hàn giới nớc .9 1.1.1 Bệnh thơng hàn giới 1.1.2 Bệnh thơng hàn nớc .10 1.2 Salmonella 11 1.2.1 Phân loại danh pháp 11 1.2.2 Cấu trúc kháng nguyên 12 1.2.3 Vật liệu di truyền 12 1.3 Các phơng pháp chẩn đoán bệnh thơng hàn .12 1.3.1 Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn 12 1.3.2 Huyết học 14 1.3.3 Kỹ thuật sinh học phân tử 14 1.4 Tình hình kháng thuốc vi khuẩn thơng hàn 15 Chơng 2: Đối tợng, vật liệu phơng pháp nghiên cứu 18 2.1 Đối tợng nghiên cứu 18 2.2 Vật liệu, trang thiết bị phục vụ nghiên cứu 18 2.3 Phơng pháp nghiên cứu 19 Chơng 3: Kết nghiên cứu 22 3.1 Thiết kế mồi .22 3.2 Kết PCR đa mồi với chủng Salmonella mẫu 25 3.3 Kết tối u phản ứng PCR đa mồi 27 3.4 Độ nhạy độ đặc hiệu PCR đa mồi 31 3.5 Theo dõi diện vi khuẩn thơng hàn máu .32 3.6 Phản ứng chéo 33 3.7 Kháng kháng sinh Salmonella gen cat 34 Chơng 4: Bàn luận 36 4.1 Bộ mồi cho PCR đa mồi chẩn đoán bệnh thơng hàn 36 4.2 Tối u điều kiện phản ứng PCR đa mồi 37 4.3 Độ nhạy phản ứng PCR 38 4.4 Độ đặc hiệu phản ứng chéo phản ứng PCR .39 4.5 Về khả phát đa đề kháng thông qua gen cat 40 4.6 Về khả theo dõi bệnh thơng hàn PCR đa mồi .41 Kết luận 42 Kiến nghị 42 Tài liệu tham khảo 43 Phụ lục Phần A: Tóm tắt kết nghiên cứu bật Đóng góp đề tài - áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn đoán nguyên gây bệnh thơng hàn Kỹ thuật có u điểm độ nhạy đặc hiệu cao, thời gian xét nghiệm ngắn so với kỹ thuật khác, có khả phát đợc loài vi khuẩn thơng hàn lần xét nghiệm; lợng bệnh phẩm cần (chỉ 1/10 so với cấy máu) Vì vậy, bệnh đợc chẩn đoán sớm trớc - Phát khả đa kháng thuốc vi khuẩn thơng hàn lúc với chẩn đoán nguyên Điều phục vụ cho điều trị sớm hơn, không cần thời gian chờ đợi làm kháng sinh đồ - Tiên lợng bệnh tốt biết sớm đợc đa đề kháng hay không theo dõi đợc diện vi khuẩn máu điều chỉnh đợc kháng sinh sử dụng - Đa kỹ thuật giải trình tự gen, áp dụng lần đầu tiên, vào trờng ĐHY Hà Nội; góp phần nâng cao chất lợng đào tạo nghiên cứu khoa học Trờng - Góp phần đào tạo sinh viên với việc đa sinh viên tiếp cận kỹ thuật cao, giới áp dụng vào thực tiễn - Chẩn đoán sớm bệnh thơng hàn phát vi khuẩn thơng hàn môi trờng (nớc, thực phẩm) - Phát sớm khả đa đề kháng vi khuẩn thơng hàn Đánh giá thực đề tài đối chiếu với đề cơng đợc phê duyệt - Đề tài hoàn thành tốt tất nội dung đợc phê duyệt đề cơng: đa đợc quy trình thực phản ứng PCR đa mồi, có tính tốt: 1) phát đợc loài vi khuẩn thơng hàn thờng gặp nớc ta 2) phát đợc khả đa đề kháng nguyên gây bệnh - Đã đào tạo sinh viên đại học cao học ý kiến đề xuất - Phổ biến rộng rãi kết nghiên cứu để áp dụng cho ngời bệnh, kiểm soát vệ sinh an toàn thực phẩm, giám sát chất lợng nớc môi trờng; giám sát đa kháng thuốc kháng sinh Phần B: báo cáo chi tiết kết nghiên cứu Đặt vấn đề Theo thông báo Tổ chức Y tế giới, bệnh thơng hàn (typhoid fever) phó thơng hàn (paratyphoid fever) vấn đề sức khoẻ quan trọng nhiều nớc giới, đặc biệt nớc phát triển Khu vực đông-nam châu châu Phi vùng có dịch thơng hàn lu hành vấn đề y tế nan giải Vấn đề thơng hàn trở nên trầm trọng xuất lan tràn nhanh chủng vi khuẩn thơng hàn đa đề kháng, làm cho điều trị khó khăn nhiều biến chứng trầm trọng (thủng ruột) xuất chẩn đoán chậm điều trị đặc hiệu không kịp thời Các phơng pháp thông thờng chẩn đoán bệnh thơng hàn đòi hỏi 4-6 ngày trờng hợp dơng tính ngày trờng hợp xác định âm tính Vì vậy, không đáp ứng đợc yêu cầu cấp bách điều trị thơng hàn Hiện nay, có số công trình nghiên cứu dùng kỹ thuật PCR bổ sung cho kỹ thuật chẩn đoán kinh điển Kỹ thuật cho kết nhanh độ nhạy cao nhiều Tuy vậy, công trình tập trung vào phát S typhi S paratyphi A phản ứng riêng lẻ không phát đợc khả đa đề kháng chúng Điều gây tốn không đáp ứng đợc nhu cầu điều trị Việc tăng phổ phát PCR Salmonella khác (S paratyphi B S paratyphi C chẳng hạn) phát sơ khả đa đề kháng chúng cần thiết cho việc điều trị có hiệu cao Chính vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài Hoàn chỉnh hệ thống PCR đa mồi để chẩn đoán theo dõi vi khuẩn thơng hàn đa kháng thuốc nhằm 02 mục tiêu: Phát triển hệ thống PCR mới, đa mồi để phát Salmonella gây bệnh thơng hàn thờng gặp nớc ta Bớc đầu đánh giá độ nhạy, đặc hiệu phản ứng chéo PCR nói chẩn đoán bệnh thơng hàn theo dõi diện vi khuẩn thơng hàn đa kháng thuốc máu Chơng 1: Tổng quan 1.1 Tình hình bệnh thơng hàn giới nớc 1.1.1 Bệnh thơng hàn giới Bệnh thơng hàn tập trung chủ yếu nớc phát triển; vậy, nớc phát triển có trờng hợp bệnh lẻ tẻ ngời nhập c, du lịch ngời có công việc phải lại với nớc lu hành bệnh Vì vậy, bệnh thơng hàn vấn đề y tế quan trọng nớc phát triển mà vấn đề phải đợc quan tâm tất nớc giới Theo Edelman cộng [1], năm 1984 số bệnh nhân mắc bệnh thơng hàn 12,5 triệu ngời Đến năm 1997, Hội nghị quốc tế bệnh thơng hàn Indonesia năm 1999 Đài loan thông báo, hàng năm có khoảng 33 triệu ngời mắc, khoảng 1,5 triệu ca tử vong [2] Nh vậy, thời gian gần đây, tình hình mắc bệnh thơng hàn giới tăng lên Tại Cộng hoà dân chủ Congo, vụ dịch thơng hàn lớn dã xảy từ ngày 27/9/2004 đến 1/2005 với 42.564 trờng hợp mắc bệnh, 214 ca chết tổng số 696 trờng hợp viêm phúc mạc thủng ruột (WHO, 2006) (WWW who.int/vaccine_rearch/diseases/diarrhoeal/en/) Theo thông báo Tổ chức Y tế giới [3], tình hình mắc bệnh thơng hàn số khu vực giới nh sau: Bảng Tình hình mắc tử vong bệnh thơng hàn giới Khu vực Tỷ lệ mắc (/100.000 dân) Số mắc Châu Phi 500 2.655.000 130.000 Châu 500 13.310.000 440.000 Nam Mỹ 150 595.000 10.000 Châu Đại dơng 150 7.500 124 22.620 74 16.590.120 580.198 Các nớc phát triển Tổng Số chết Nh vậy, châu khu vực có bệnh thơng hàn trầm trọng Một thống kê dới cho thấy rõ tình hình quốc gia cụ thể: Bảng Tình hình bệnh thơng hàn khu vực Đông Nam châu Tỷ lệ mắc/105 dân Tỷ lệ chết/mắc (%) Toàn khu vực 15,44 0,34 Thái Lan 22,25 0,17 Indonesia 11,04 0,56 Myanma 37,72 0,71 Singapore 5,9 0,8 Nớc Có thể thấy, lần qua số liệu nêu trên, bệnh thơng hàn đồng hành điều kiện vệ sinh môi trờng trình độ phát triển chung xã hội nớc phát triển khác, bệnh thơng hàn gia tăng: ấn độ, Pakistan, Bangladesh, Trung Quốc, Nepal; Trung Nam Phi nh Chi Lê, Peru, Mehico; châu Phi nh Nigeria, Madagasca tỷ lệ mắc lên tới 810/100.000 dân [4] Thơng hàn đợc ghi nhận với mức độ gia tăng nớc phát triển nh Mỹ, Pháp, Anh, Thuỵ Sỹ; gần đây, Nga, CH Séc, Tajikistan đặc biệt có vụ dịch thơng hàn xảy chiến tranh sắc tộc kéo dài Bosnia Hersegovia [5] Tóm lại, bệnh thơng hàn vấn đề y tế lớn nớc phát triển mối quan tâm tất nớc giới khả giao lu thuận tiện 1.1.2 Bệnh thơng hàn nớc Bệnh thơng hàn nớc ta đợc ghi nhận trầm trọng kể từ đầu thập kỷ 90 Năm 1992, vụ dịch thơng hàn xảy Bỉm Sơn (Thanh Hoá) với 31 trờng hợp đợc ghi nhận [6] Năm 1995, vụ dịch thơng hàn lớn xảy Kim Sơn (Ninh Bình), sau lan tỉnh thành khác [7-9] Năm 1998, dịch lớn xảy Lai Châu với tỷ lệ mắc 284,54/100.000 dân [10] miền Trung, từ năm 1990 - 1994 có 1.453 trờng hợp mắc (Nguyễn Đình Sơn CS); năm 1996 xảy dịch lớn Thừa thiên - Huế, sau Quảng Nam, Ninh Thuận số tỉnh khác [11-14] miền Nam, từ năm 1990-1994 ghi nhận 55.397 trờng hợp mắc thơng hàn, tỷ lệ mắc chết tăng dần, đỉnh cao năm 1995 với xuất chủng Salmonella typhi đa kháng [15-17] Trong vòng 18 năm (19811998), 19 tỉnh thành phía Nam, có 123.651 trờng hợp mắc bệnh, có 70 trờng hợp tử vong (Phạm Kim Sắc CS) [18] Theo thống kê Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ơng [10], tỷ lệ mắc bệnh thơng hàn 100.000 dân nh sau: 10 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Hayani A., Mahoney D.H., and Ferbach D.J Role of bone marrow examination in the child with prolonged fever J Pediatr, 1990 116(6):919-923 Hoffman S.L., Punijabi N.H., Rockhil R.C Duodenal string-capsule culture compared with bone marrow, blood and rectal swab cultures for diagnosing typhoid and paratyphoid fever J Infect Dis, 1984 149:157-161 Abraham G., Teklu B., Selassie G H Diagnostic value of the Widal test Trop Geog Med., 1981 33:329-333 Rao R.S., Sundarraraj T., Paramasivan C.N Widal test - as a diagnostic aid Indian J Microbiol, 1980 20:1-2 Sack, B.R Serologic tests for the diagnosis of enterobacterial infections Manual Clin Microbiol 3rd, 1986:359-361 Reynold D.W., Carpenter L., and Simon W.H Diagnostic specificity of Widal's reaction for typhoid fever J Am Med Assoc, 1970 214:2192-2193 Schroeder, S.A Interpretation of serologic tests for typhoid fever J Am Med Assos, 1968 206:839-840 Beasley W.J., Joseph S.W., and Weiss E Improved serodiagnosis of Salmonella enteric fevers by an enzyme-linked immunosorbent assay J Clin Microbiol, 1981 13:106-114 Chau P.Y., Tsang R.S., Lam S K., Antibody responses to the lipopolysaccharide and protein antigens of Salmonella typhi during typhoid infection Clin Exp Immunol, 1981 46:512-520 Gupta A.K., and Rao K.M Simultaneous detection of Salmonella typhi antigen and antibody in serum by counter immunoelectrophoresis for an early and rapid diagnosis of typhoid fever J Immunol Methods, 1979 30:349-353 Hein, I., G Flekna, M Krassnig, and M Wagner Real-time PCR for the detection of Salmonella spp in food: An alternative approach to a conventional PCR system suggested by the FOOD-PCR project J Microbiol Methods, 2006 Hashimoto, Y., Y Itho, Y Fujinaga, A Q Khan, F Sultana, M Miyake, K Hirose, H Yamamoto, and T Ezaki Development of nested PCR based on the ViaB sequence to detect Salmonella typhi J Clin Microbiol, 1995 33(11):3082 Bansal, N S., V Gray, and F McDonell Validated PCR assay for the routine detection of Salmonella in food J Food Prot, 2006 69(2):282-7 Amavisit, P., G F Browning, D Lightfoot, S Church, G A Anderson, K G Whithear, and P F Markham Rapid PCR detection of Salmonella in horse faecal samples Vet Microbiol, 2001 79(1):63-74 Gibson, D M Rapid and definitive detection of Salmonella in foods by PCR Lett Appl Microbiol, 1998 27(6):384-5 Wan, J., K King, H Craven, C McAuley, S E Tan, and M J Coventry Probeliatrade mark PCR system for rapid detection of Salmonella in milk powder and ricotta cheese Lett Appl Microbiol, 2000 30(4):267-71 Whyte, P., K Mc Gill, J D Collins, and E Gormley The prevalence and PCR detection of Salmonella contamination in raw poultry Vet Microbiol, 2002 89(1):53-60 Dupray, E., M P Caprais, A Derrien, and P Fach Salmonella DNA persistence in natural seawaters using PCR analysis J Appl Microbiol, 1997 82(4):507-10 Chiu, C H and J T Ou Rapid identification of Salmonella serovars in feces by specific detection of virulence genes, invA and spvC, by an enrichment broth culture-multiplex PCR combination assay J Clin Microbiol, 1996 34(10):2619-22 43 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 Lofstrom, C., R Knutsson, C E Axelsson, and P Radstrom Rapid and specific detection of Salmonella spp in animal feed samples by PCR after culture enrichment Appl Environ Microbiol, 2004 70(1):69-75 Hirose, K., K Itoh, H Nakajima, T Kurazono, M Yamaguchi, K Moriya, T Ezaki, Y Kawamura, K Tamura, and H Watanabe Selective amplification of tyv (rfbE), prt (rfbS), viaB, and fliC genes by multiplex PCR for identification of Salmonella enterica serovars Typhi and Paratyphi A J Clin Microbiol, 2002 40(2):633-6 Hirose, K., K Tamura, and H Watanabe Screening method for Salmonella enterica serovar Typhi and serovar Paratyphi A with reduced susceptibility to fluoroquinolones by PCR-restriction fragment length polymorphism Microbiol Immunol, 2003 47(2):161-5 Massi, M N., T Shirakawa, A Gotoh, A Bishnu, M Hatta, and M Kawabata Quantitative detection of Salmonella enterica serovar Typhi from blood of suspected typhoid fever patients by real-time PCR Int J Med Microbiol, 2005 295(2):117-20 Desai, A R., D H Shah, S Shringi, M J Lee, Y H Li, M R Cho, J H Park, S K Eo, J H Lee, and J S Chae An allele-specific PCR assay for the rapid and serotype-specific detection of Salmonella pullorum Avian Dis, 2005 49(4):558-61 Kawasaki, S., N Horikoshi, Y Okada, K Takeshita, T Sameshima, and S Kawamoto Multiplex PCR for simultaneous detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes, and Escherichia coli O157:H7 in meat samples J Food Prot, 2005 68(3):551-6 Herrera-Leon, S., J R McQuiston, M A Usera, P I Fields, J Garaizar, and M A Echeita Multiplex PCR for distinguishing the most common phase-1 flagellar antigens of Salmonella spp J Clin Microbiol, 2004 42(6):2581-6 Tavechio, A T., A C Ghilardi, and S A Fernandes "Multiplex PCR" identification of the atypical and monophasic Salmonella enterica subsp enterica serotype 1,4,[5],12:i:- in Sao Paulo State, Brazil: frequency and antibiotic resistance patterns Rev Inst Med Trop Sao Paulo, 2004 46(2):115-7 Botteldoorn, N., E Van Coillie, K Grijspeerdt, H Werbrouck, F Haesebrouck, E Donne, E D'Haese, M Heyndrickx, F Pasmans, and L Herman Real-time reverse transcription PCR for the quantification of the mntH expression of Salmonella enterica as a function of growth phase and phagosomelike conditions J Microbiol Methods, 2005 Daum, L T., W J Barnes, J C McAvin, M S Neidert, L A Cooper, W B Huff, L Gaul, W S Riggins, S Morris, A Salmen, and K L Lohman Realtime PCR detection of salmonella in suspect foods from a gastroenteritis outbreak in kerr county, Texas J Clin Microbiol, 2002 40(8):3050-2 Jothikumar, N., X Wang, and M W Griffiths Real-time multiplex SYBR green I-based PCR assay for simultaneous detection of Salmonella serovars and Listeria monocytogenes J Food Prot, 2003 66(11):2141-5 Quang, Nguyễn Ngọc Xác định kháng nguyên Salmonella typhi nớc tiểu thay đổi TNFa, IL1b, IL6 huyết bệnh nhân thơng hàn để chẩn đoán tiên lợng bệnh Luận án tiến sĩ Y học, 2002 Học viện quân y:62-64 Trung, Nguyễn Đắc ỳimhiểu R-plasmid số chủng Salmonella typhi gây bệnh thơng hàn Việt Nam Luận văn thạc sĩ Y học, 1999 Đại học Y Hà Nội:4058 Tuệ, Nguyễn Trọng Giải trình tự gen FliC Salmonella typhi, S paratyphi A, S paratyphi B, S paratyphi C, S tyơhimurium ứng dụng PCR đa mồi chẩn 44 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 đoán bệnh thơng hàn Luận văn thạc sĩ khoa học, 2004 ĐHQG Hà Nội, Trờng đại học KHTN:35-55 Yến, Hoàng Thị Hải Hoàn chỉnh kỹ thuật PCR đa mồi để chẩn đoán Salmonella typhi, S paratyphi A, S paratyphi B S paratyphi C Luận văn thạc sĩ Y học, 2005 Trờng Đại học Y Hà Nội:43-57 Weill, F X., F Guesnier, V Guibert, M Timinouni, M Demartin, L Polomack, and P A Grimont Multidrug Resistance in Salmonella enterica Serotype Typhimurium from Humans in France (1993 to 2003) J Clin Microbiol, 2006 44(3):700-8 Rahman, M., A K Siddique, S Shoma, H Rashid, M A Salam, Q S Ahmed, G B Nair, and R F Breiman Emergence of multidrug-resistant Salmonella enterica serotype Typhi with decreased ciprofloxacin susceptibility in Bangladesh Epidemiol Infect, 2006 134(2):433-8 McLaughlin, J B., L J Castrodale, M J Gardner, R Ahmed, and B D Gessner Outbreak of multidrug-resistant Salmonella typhimurium associated with ground beef served at a school potluck J Food Prot, 2006 69(3):666-70 Lauderdale, T L., F M Aarestrup, P C Chen, J F Lai, H Y Wang, Y R Shiau, I W Huang, and C L Hung Multidrug resistance among different serotypes of clinical Salmonella isolates in Taiwan Diagn Microbiol Infect Dis, 2006 Reddy, K R., P K Rajesh, M Krishnan, and U Sekar Antibiotic susceptibility pattern and plasmid profile of multidrug resistant Salmonella typhi Indian J Med Microbiol, 2005 23(3):208 Wain, J and C Kidgell The emergence of multidrug resistance to antimicrobial agents for the treatment of typhoid fever Trans R Soc Trop Med Hyg, 2004 98(7):423-30 Lee, K., D Yong, J H Yum, Y S Lim, H S Kim, B K Lee, and Y Chong Emergence of multidrug-resistant Salmonella enterica serovar typhi in Korea Antimicrob Agents Chemother, 2004 48(11):4130-5 Kariuki, S., G Revathi, J Muyodi, J Mwituria, A Munyalo, S Mirza, and C A Hart Characterization of multidrug-resistant typhoid outbreaks in Kenya J Clin Microbiol, 2004 42(4):1477-82 Mills-Robertson, F., M E Addy, P Mensah, and S S Crupper Molecular characterization of antibiotic resistance in clinical Salmonella typhi isolated in Ghana FEMS Microbiol Lett, 2002 215(2):249-53 Connerton, P., J Wain, T T Hien, T Ali, C Parry, N T Chinh, H Vinh, V A Ho, T S Diep, N P Day, N J White, G Dougan, and J J Farrar Epidemic typhoid in vietnam: molecular typing of multiple-antibiotic-resistant Salmonella enterica serotype typhi from four outbreaks J Clin Microbiol, 2000 38(2):895-7 Rodrigues, C., A Mehta, S Mehtar, P H Blackmore, A Hakimiyan, N Fazalbhoy, C Kallat, and V R Joshi Chloramphenicol resistance in Salmonella typhi Report from Bombay J Assoc Physicians India, 1992 40(11):729-32 Gebre-Yohannes, A., B Tekle, and Y Limenih Chloramphenicol-resistant Salmonella typhi from a patient in Addis Abeba Ethiop Med J, 1992 30(2):119-22 Phipps, M., T Pang, C L Koh, and S Puthucheary Plasmid incidence rate and conjugative chloramphenicol and tetracycline resistance plasmids in Malaysian isolates of Salmonella typhi Microbiol Immunol, 1991 35(2):157-61 Rowe, B., E J Threlfall, and L R Ward Does chloramphenicol remain the drug of choice for typhoid? Epidemiol Infect, 1987 98(3):379-83 45 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 Huq, M I and A R Samadi Chloramphenicol-resistant Salmonella typhi Vi phage type A isolated from patient in Bangladesh Lancet, 1982 1(8281):1125 Agarwal, K C., B R Panhotra, J Mahanta, V K Arya, and R K Garg Typhoid fever due to chloramphenicol resistant Salmonella typhi associated with Rplasmid Indian J Med Res, 1981 73:484-8 Pato, M V., G Gerbaud, and M David ["Salmonella typhi" resistant to chloramphenicol isolated north of Lisbon (author's transl)] Ann Microbiol (Paris), 1980 131(1):31-7 Akache, W and K Rahal [Characterization of R plasmids in "Salmonella typhi" and "S paratyphi B" from Algeria (author's transl)] Ann Microbiol (Paris), 1980 131(3):265-70 Walia, M., R Gaind, R Mehta, P Paul, P Aggarwal, and M Kalaivani Current perspectives of enteric fever: a hospital-based study from India Ann Trop Paediatr, 2005 25(3):161-74 Akinyemi, K O., S I Smith, A O Oyefolu, and A O Coker Multidrug resistance in Salmonella enterica serovar typhi isolated from patients with typhoid fever complications in Lagos, Nigeria Public Health, 2005 119(4):321-7 Yoo, S., H Pai, J H Byeon, Y H Kang, S Kim, and B K Lee Epidemiology of Salmonella enterica serotype typhi infections in Korea for recent years: trends of antimicrobial resistance J Korean Med Sci, 2004 19(1):15-20 Safdar, A., H Kaur, L Elting, and K V Rolston Antimicrobial susceptibility of 128 Salmonella enterica serovar typhi and paratyphi A isolates from northern India Chemotherapy, 2004 50(2):88-91 Phủng Lê, V., H Ryo, and T Nomura Specific gyrA mutation at codon 83 in nalidixic acid-resistant Salmonella enterica serovar Typhi strains isolated from Vietnamese patients Antimicrob Agents Chemother, 2002 46(6):2052-3 Senthilkumar, B and G Prabakaran Multidrug resistant Salmonella typhi in asymptomatic typhoid carriers among food handlers in Namakkal district, Tamil Nadu Indian J Med Microbiol, 2005 23(2):92-4 Panigrahi, D., A H al-Aneziz, and P W West Plasmid-mediated multidrug resistance in Salmonella typhi in Kuwait Trop Med Int Health, 1996 1(4):439-42 Hasan, Z., K M Rahman, M N Alam, A Afroza, Z H Asna, P K Ghosh, and N Alam Role of a large plasmid in mediation of multiple drug resistance in Salmonella typhi and paratyphi A in Bangladesh Bangladesh Med Res Counc Bull, 1995 21(1):50-4 Ben Hassen, A., M Meddeb, T Ben Chaabane, M Zribi, and S Ben Redjeb Characteristics of the antibiotic resistance plasmid in Salmonella typhi isolated in Tunis in 1990 Ann Biol Clin (Paris), 1994 52(2):133-6 Mirza, S H and C A Hart Plasmid encoded multi-drug resistance in Salmonella typhi from Pakistan Ann Trop Med Parasitol, 1993 87(4):373-7 Rattan, A., V Dogra, R A Bhujwala, and M A Jabber Multi-drug resistant Salmonella Natl Med J India, 1992 5(2):95-6 Jesudason, M V and T J John Plasmid mediated multidrug resistance in Salmonella typhi Indian J Med Res, 1992 95:66-7 Karmaker, S., D Biswas, N M Shaikh, S K Chatterjee, V K Kataria, and R Kumar Role of a large plasmid of Salmonella typhi encoding multiple drug resistance J Med Microbiol, 1991 34(3):149-51 Georges-Courbot, M C., I K Wachsmuth, J C Bouquety, M R Siopathis, D N Cameron, and A J Georges Cluster of antibiotic-resistant Salmonella 46 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 enteritidis infections in the Central African Republic J Clin Microbiol, 1990 28(4):771-3 Goldstein, F W., J C Chumpitaz, J M Guevara, B Papadopoulou, J F Acar, and J F Vieu Plasmid-mediated resistance to multiple antibiotics in Salmonella typhi J Infect Dis, 1986 153(2):261-6 Marranzano, M., M D'Angelo, A Agodi, and C Santangelo Plasmid resistance to ampicillin in Salmonella typhi Boll Ist Sieroter Milan, 1990 69(1):305-7 Tassios, P T., A C Vatopoulos, E Mainas, D Gennimata, J Papadakis, A Tsiftsoglou, V Kalapothaki, and N J Legakis Molecular analysis of ampicillinresistant sporadic Salmonella typhi and Salmonella paratyphi B clinical isolates Clin Microbiol Infect, 1997 3(3):317-323 Brandis, H and L Andries [A fi- tetracyclin resistance plasmid with specific restriction of phages on salmonella typhi, S paratyphi B and S typhi-murium (author's transl)] Zentralbl Bakteriol [Orig A], 1979 243(2-3):207-15 Threlfall, E J., J A Frost, H C King, and B Rowe Plasmid-encoded trimethoprim resistance in salmonellas isolated in Britain between 1970 and 1981 J Hyg (Lond), 1983 90(1):55-60 Ling, J M., Y W Hui, A F Cheng, and G L French Development of trimethoprim-resistance in Salmonella typhi during therapy Pathology, 1992 24(3):190-3 Rahman, M., H Islam, D Ahmed, and R B Sack Emergence of multidrugresistant Salmonella Gloucester and Salmonella typhimurium in Bangladesh J Health Popul Nutr, 2001 19(3):191-8 Le, T A., M Lejay-Collin, P A Grimont, T L Hoang, T V Nguyen, F Grimont, and M R Scavizzi Endemic, epidemic clone of Salmonella enterica serovar typhi harboring a single multidrug-resistant plasmid in Vietnam between 1995 and 2002 J Clin Microbiol, 2004 42(7):3094-9 Sudarsana, J., L Nair, and K I Devi Multidrug resistant Salmonella typhi in Calicut, south India Indian J Med Res, 1992 95:68-70 Coovadia, Y M., V Gathiram, A Bhamjee, R M Garratt, K Mlisana, N Pillay, T Madlalose, and M Short An outbreak of multiresistant Salmonella typhi in South Africa Q J Med, 1992 82(298):91-100 Kapil, A., A Ayyagari, R K Garg, and K C Agarwal S typhi with transferable chloramphenicol resistance isolated in Chandigarh during 1983-87 Indian J Pathol Microbiol, 1994 37(2):179-83 Potrykus, J and G Wegrzyn The acrAB locus is involved in modulating intracellular acetyl coenzyme A levels in a strain of Escherichia coli CM2555 expressing the chloramphenicol acetyltransferase (cat) gene Arch Microbiol, 2003 180(5):362-6 Lin, C F., Z F Fung, C L Wu, and T C Chung Molecular characterization of a plasmid-borne (pTC82) chloramphenicol resistance determinant (cat-TC) from Lactobacillus reuteri G4 Plasmid, 1996 36(2):116-24 Odjakova, M., A Golshani, G Ivanov, M Abou Haidar, and I Ivanov The low level expression of chloramphenicol acetyltransferase (CAT) mRNA in Escherichia coli is not dependent on either Shine-Dalgarno or the downstream boxes in the CAT gene Microbiol Res, 1998 153(2):173-8 Samprook J., E.F Frtsch and T Maniatis DNA Sequencing Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989 2(Second edition):13 Chamberlain J.S., R.A Gibbs, J.E Ranier and C.T Caskey Mutiplex PCR for the diagnosis of Duchenne muscular dystrophy In: M.A Innis, D.H Gelfand, J.J 47 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 Sninsky and T.J White (Eds) PCR Protocol A guide to Methods and Applications Aca demic Press, San Diego., 1990:272-281 A., Anonymous Diagnois of Duchenne and Becker muscular dystrophies by polymerase chain reaction A multicenter study JAMA, 1992 267:2609-2615 Henegariu O., P Hirschmann, K Killian, S Kirsch, C Lengauer, R Maiwald, K Mielke and P Vogt Rapid screening of the Y chromosome in diagnosis sterile men, diagnistic for the deletions in AZF, a genetic Y factor expressed during spermatogenesis Androgia, 1994 26:97-106 Shuber A.P., J Skoletsky, R Stern and B.L Handelin Efficient 12-mutation testing in the CFTR gene: a general model for complex mutation analysis Hum Mol Genet., 1993 2:153-158 Mutirangura A., F Greenberg, M.G Butler, S Malcolm, R.D Nicholls, A Chakravarti and D.H Ledbetter Multiplex PCR of three dinucleotide repeats in the Prader-Willi/Angelman critical region (15q11-q130): A molecular diagnosis and mechanism of uniparental disomy Hum Mol Genet, 1993 2:143-151 Crisan, D Molecular diagnostic testing for determination of meyeloid lineage in acte leukemias Ann Clin Lab Sci, 1994 24:355-363 Soumet, C., G Ermel, V Rose, N Rose, P Drouin, G Salvat, and P Colin Identification by a multiplex PCR-based assay of Salmonella typhimurium and Salmonella enteritidis strains from environmental swabs of poultry houses Lett Appl Microbiol, 1999 29(1):1-6 Uzzazu S., M hovi, and B.A.D Stocker Application of ribotyping and IS200 fingerprinting to distinguish the five Salmonella serotype O6,7:c:1,5 groups: Choleraesuis var Decatur, Paratyphi C, and Typhsuis Epidemiol Infect, 1999 123:27-46 Courtney, S., M E Mossoba, T S Hammack, C Keys, and S F Al-Khaldi Using PCR amplification to increase the confidence level of Salmonella typhimurium DNA microarray chip hybridization Mol Cell Probes, 2006 Seo, K H., I E Valentin-Bon, and R E Brackett Detection and enumeration of Salmonella enteritidis in homemade ice cream associated with an outbreak: comparison of conventional and real-time PCR methods J Food Prot, 2006 69(3):639-43 Suh, D K and J C Song Analysis of Salmonella enterica serotype Enteritidis isolated from human and chickens by repetitive sequence-PCR fingerprinting, antibiotic resistance and plasmid profiles J Vet Sci, 2006 7(1):37-41 Henegariu O., N.A Heerema, S.R Dlouhy, G.H Vance and P.H Vogt Multiplex PCR: Critical Parameters and Step-by-Step Protocol BioTechniques, 1997 23(3):504-511 Song, J H., H Cho, M Y Park, D S Na, H B Moon, and C H Pai Detection of Salmonella typhi in the blood of patients with typhoid fever by polymerase chain reaction J Clin Microbiol, 1993 31(6):1439-43 Alvarez, J., M Sota, A B Vivanco, I Perales, R Cisterna, A Rementeria, and J Garaizar Development of a multiplex PCR technique for detection and epidemiological typing of salmonella in human clinical samples J Clin Microbiol, 2004 42(4):1734-8 Huơng, Nguyễn Thu So sánh phơng pháp tách chiất ADN Salmonella typhi từ máu Luận văn tốt nghiệp cử nhân KTYH, 2005 Đại học Y Hà Nội Bennett, A R., D Greenwood, C Tennant, J G Banks, and R P Betts Rapid and definitive detection of Salmonella in foods by PCR Lett Appl Microbiol, 1998 26(6):437-41 48 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 Bej, A K., M H Mahbubani, M J Boyce, and R M Atlas Detection of Salmonella spp in oysters by PCR Appl Environ Microbiol, 1994 60(1):368-73 Agarwal, A., A Makker, and S K Goel Application of the PCR technique for a rapid, specific and sensitive detection of Salmonella spp in foods Mol Cell Probes, 2002 16(4):243-50 Johnston, L M., D Elhanafi, M Drake, and L A Jaykus A simple method for the direct detection of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from raw alfalfa sprouts and spent irrigation water using PCR J Food Prot, 2005 68(11):2256-63 Carlson, S A and M T Wu Avoidance of false PCR results with the integronretron junction in multiple antibiotic resistant Salmonella enterica serotype Typhimurium Mol Cell Probes, 2003 17(4):183-6 Shanahan, P M., M V Jesudason, C J Thomson, and S G Amyes Molecular analysis of and identification of antibiotic resistance genes in clinical isolates of Salmonella typhi from India J Clin Microbiol, 1998 36(6):1595-600 Bahrmand, A R and A A Velayati Antimicrobial resistance pattern and plasmid profile of Salmonella typhi isolated from an outbreak in Tehran province Scand J Infect Dis, 1997 29(3):265-9 Hermans, P W., S K Saha, W J van Leeuwen, H A Verbrugh, A van Belkum, and W H Goessens Molecular typing of Salmonella typhi strains from Dhaka (Bangladesh) and development of DNA probes identifying plasmid-encoded multidrug-resistant isolates J Clin Microbiol, 1996 34(6):1373-9 Ogawa, W., M Koterasawa, T Kuroda, and T Tsuchiya KmrA multidrug efflux pump from Klebsiella pneumoniae Biol Pharm Bull, 2006 29(3):550-3 Villa, L and A Carattoli Integrons and transposons on the Salmonella enterica serovar typhimurium virulence plasmid Antimicrob Agents Chemother, 2005 49(3):1194-7 Parry, C Điều trị thơng hàn đa kháng thuốc Kỷ yếu công trình NCKH thơng hàn, Bệnh viện đa khoa Đồng Tháp, 1999 1:22-25 Bảy, Phan Văn Bé Định lợng vi khuẩn tuỷ xơng bệnh nhân thơng hàn: Mối liên hệ số lợng vi khuẩn với bệnh cảnh lâm sàng Kỷ yếu công trình NCKH thơng hàn Bệnh viện đa khoa Đồng Tháp, 1999 1:36-46 49 Phụ lục A Sản phẩm đề tài Quy trình kỹ thuật phản ứng PCR đa mồi chẩn đoán bệnh thơng hàn Vi khuẩn - Mồi: Tên kháng nguyên H1:d Trình tự (5-3) AAT CAA CAA CAA CCT GCA GCG Sản phẩm PCR (bp) 750 S typhi GCA TAG CCA CCA TCA ATA ACC Vi GTT ATT TCA GCA TAA GGA G 439 CTT CCA TAC CAC TTT CCG O:2 CTT GCT ATG GAA GAC ATA ACG AAC C 258 CGT CTC CAT CAA AAG CTC CAT AGA O:9 GAG GAA GGG AAA TGA AGC TTT T 615 S paratyphi C S paratyphi B S paratyphi A TAG CAA ACT GTC TCC CAC CAT AC H1:a AAT CAA CAA CAA CCT GCA GCG 329 TAG TGC TTA ATG TAG CCG AAG G O:2 CTT GCT ATG GAA GAC ATA ACG AAC C 258 CGT CTC CAT CAA AAG CTC CAT AGA O:4 CCA GCA CCA GTT CCA ACT TGA TAC 663 GGC TTC CGG CTT TAT TGG TAA GCA H1:b TGT TAC ACC GAC GCC AGT TG 151 AAC TTT AAG CGC GTA ACC CG O:6 GCA ACG CGA AGA ACC TTA CC 650 GGT TAC CTT GTT ACG ACT T H1:c AAA GAC GAT GCG GCA GGT C 151 CAC GCT GCA GGT TGT TGT TG Vi GTT ATT TCA GCA TAA GGA G 439 Kháng thuốc CTT CCA TAC CAC TTT CCG CAT GCG TGT TAC GGT GAA AAC CT 219 ATC ACA AAC GGC ATG ATG AA - Tách chiết ADN từ máu: Kit Qiagen (QIAmp DNA Blood Mini Kits 51304) - Thành phần điều kiện phản ứng: 50 Nớc cất Đệm x10 dNTPs mM Mồi (10 cặp) 10 àM (mỗi mồi) ADN mẫu MgCl2 25 mM Taq ADN polymerase UI/àl 14,0 àl 2,5 2,5 2,0 1,0 1,0 2,0 - Tổng thể tích 25 àl - Chu trình nhiệt: 95 C/3 phút; 35 chu kỳ, chu kỳ gồm: 94 C/1phút, 56 C/30 giây 72 C/1 phút; chu kỳ: 72/7 phút - Điện di: agarose 2% - Nhuộm gel: Ethidium bromide 1%, 15 phút; rửa 15 phút - Soi gel: Máy đọc gel thông thờng - Kết luận vi khuẩn: theo xuất băng đặc hiệu loài Đào tạo Nguyễn Trọng Tuệ Giải trình tự gen FliC Salmonella typhi, S paratyphi A, S paratyphi B, S paratyphi C, S typhimurium ứng dụng PCR đa mồi chẩn đoán bệnh thơng hàn Luận văn thạc sĩ khoa học, 2004 ĐHQG Hà Nội, Đại học KHTN:35-55 Nguyễn Thu Huơng So sánh phơng pháp tách chiất ADN Salmonella typhi từ máu Luận văn tốt nghiệp cử nhân KTYH, 2005 Đại học Y Hà Nội Hoàng Thị Hải Yến Hoàn chỉnh kỹ thuật PCR đa mồi để chẩn đoán Salmonella typhi, S paratyphi A, S paratyphi B S paratyphi C Luận văn thạc sĩ Y học, 2005 Đại học Y Hà Nội:43-57 Bài báo, công bố Phung, L.V and Tue, N.T 2004 Salmonella enterica isolate VCMM 3420 flagellar antigen H1:c (fliC) gene, partial cds Accession No AY657000 Phung, L.V and Tue, N.T 2004 Salmonella enterica isolate VCMM 4477 flagellar antigen H1:b (fliC) gene, complete cds Accession No AY657001 Nguyễn Trọng Tuệ Lê Văn Phủng Giải trình tự gen FliC Salmonella typhi, S paratyphi A, S paratyphi B, S paratyphi C S 51 typhimurium ứng dụng PCR để phân biệt loài 2005 Tạp chí Y học dự phòng 15(5): 36-41 52 B Kết định danh vi khuẩn máy Vitex Salmonella typhi Kháng huyết S typhi: (+) Salmonella paratyphi A Kháng huyết S paratyphi A: (+) 53 Salmonella paratyphi B Kháng huyết S paratyphi B: (+) Salmonella paratyphi C Kháng huyết S paratyphi C: (+) 54 Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae 55 Citrobacter freundii 56 Các tính chất sử dụng máy định danh Vitek cho trực khuẩn Gram (-) Số TT Ký hiệu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 DP3 OFG GC ACE ESC PLI URE CIT MAL TDA PXB LAC/TLA MLT MAN XYL RAF SOR SUC INO ADO COU H2S ONPG RHA ARA GLU ARG LYS NC ORN OXI TLA Tên thuốc thử DP-300 OF glucose Canh thang tryptophan Acetamide Esculin -D glucoside Urea Citrate Malonate Indole Polymyxin B Lactose Maltose Mannitol Xylose Raffinose Sorbitol Sucrose Innositol Adonitol p-Coumaric H2S ONPG Rhamnose L-Arabinose Glucose Arginine Lysine Peptone Ornithin Oxidase Lactose 10% 57 Tính chất Glucose F* Glucose O Chứng vi khuẩn, Indole Acetamide Thuỷ phân Esculin Indoxyl--D glucoside Urease Citrate Malonate Tryptophan deaminase Polymyxin B Lactose O Maltose O Mannitol O Xylose O Sử dụng Raffinose Sử dụng Sorbitol Sử dụng Sucrose Sử dụng Innositol Sử dụng Adonitol Glucose F* H2S ONPG Sử dụng Rhamnose Sử dụng L-Arabinose Glucose O Arginine dihydrrolase Lysine decarboxylase Chứng decarboxylase Ornithin decarboxylase Phản ứng Oxidase Leen men lactose 10% [...]... (ngoài th ng hàn) (%) 2.3.6 Địa điểm lấy mẫu và th c hiện các kỹ thuật Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi: Bộ môn Vi sinh Y học và Labo trung tâm Y sinh học, Trờng đại học Y Hà Nội Đánh giá kỹ thuật PCR: Bệnh vi n đa khoa Đồng Th p và bệnh vi n trung ơng Huế có bệnh nhân th ng hàn đã xác chẩn bằng cấy máu dơng tính với Salmonella 21 Chơng 3: Kết quả nghiên cứu 3.1 Thiết kế mồi Bộ mồi dùng để chẩn đoán. .. PCR + Tổng Tổng + 36 0 0 60 36 60 36 60 96 Nh vậy, độ nhạy của PCR là 36/36 (%) = 100%; độ đặc hiệu là 60/60 (%) = 100% 3.5 Theo dõi sự hiện diện của vi khuẩn th ng hàn trong máu Bảng 10 Theo dõi vi khuẩn th ng hàn trong máu Lần lấy máu Th i điểm lấy máu Số bệnh nhân 1 2 3 4 Ngày vào vi n Ngày th 2 Ngày th 3 Ngày th 4 36 36 36 36 PCR (+) N % 36 100 30 83 10 28 0 0 144 76 Tổng số máu 32 53 Theo dõi. .. paratyphi A, B và C cũng kháng nhiều kháng sinh, trong đó có cả ciprofloxacin (MIC > 4 àg/ml) và nalidixic acid (NAL) [73] Tình hình kháng fluoroquinolone ngày càng trầm trọng và gây quan ngại lớn cho điều trị th ng hàn trong tơng lai, vì cho đến nay, nhóm kháng sinh 15 này vẫn là nhóm chủ đạo trong điều trị các vi khuẩn th ng hàn đa kháng thuốc [74-76] ở nớc ta, các chủng vi khuẩn th ng hàn đa đề kháng đã... nhằm theo dõi và đánh giá nhanh chóng hiệu quả của điều trị? Đó là những vấn đề cần thiết hiện nay và cũng chính là mục tiêu cần giải quyết của nghiên cứu này 1.4 Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn th ng hàn Salmonella typhi đa kháng thuốc không còn là câu chuyện hiếm trên th giới [55-58] Kháng 6 kháng sinh (amoxicillin, chloramphenicol, streptomycin, spectinomycin, sulfonamides và tetracycline (đa. .. nhiều loại PCR đã đợc áp dụng: PCR đơn mồi [44], đa mồi [45-47] hoặc định lợng [31, 48-50] Mỗi loại PCR có những u, nhợc điểm của nó; tuỳ theo từng trờng hợp cụ th mà áp dụng cho phù hợp Trong chẩn đoán bệnh th ng hàn, xu th hiện nay là dùng PCR đa mồi với kỹ thuật Real-Time [31, 49, 50] 14 Tuy vậy, ở nớc ta, vi c ứng dụng những tiến bộ nh trên còn chậm Đã có nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR cho mục... kháng nguyên th ng gặp ở nhiều loài Salmonella khác nhau (Bergey Manual, 1984) 12 1.3 Tình hình nghiên cứu các phơng pháp chẩn đoán bệnh th ng hàn 1.3.1 Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Phân lập vi khuẩn có giá trị khẳng định bệnh Tuy vậy, tỷ lệ phân lập đợc vi khuẩn không cao, nhất là các trờng hợp bệnh nhân đến muộn - Cấy máu: trong các bệnh phẩm dùng để phân lập vi khuẩn th ng hàn, máu là bệnh phẩm th ng... multocida, C freundii Các vi khuẩn này đợc Dự án bảo tồn gen vi sinh vật gây bệnh cho ngời (ĐHY Hà Nội) cung cấp - Máu bệnh nhân th ng hàn (đã đợc xác định bằng cấy máu +): 36 mẫu, do bệnh vi n đa khoa Đồng Th p và Trung ơng Huế cung cấp - Máu bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết (cấy máu +) do các vi khuẩn không phải Salmonella: 115 mẫu, do các bệnh vi n đa khoa Đồng Th p, Trung ơng Huế và Thanh Nhàn (Hà Nội) cung... loài Các cặp mồi đề xuất cho PCR đa mồi chẩn đoán các vi khuẩn th ng hàn (Bảng 5) đặc hiệu cho 4 loài Salmonella đã đợc thiết kế dựa vào sự lựa chọn các yếu tố kháng nguyên đặc trng của từng loài Salmonella, rồi tìm đến vùng ADN mã hoá cho chúng: cặp mồi fliCcom và fliCd-as dùng để xác định gen fliC-d, đây là gen mã hóa kháng nguyên lông pha 1 của S typhi [41] Cặp mồi fliCcom và fliCa-as đợc thiết kế xác... (H1:a và O:2), B: S paratyphi B (O:4; H1:b và cat) C: S paratyphi C (O:6; Vi; H1:c; và cat); T: S typhi (H1:d; O:9; Vi; O:2 và cat) (th tự các băng cho mỗi vi khuẩn đợc liệt kê từ trên xuống) M: ADN mẫu (Marker), thang 100 bp Hình 8: Hình ảnh điện di trên gel agarose 2%, 100V/80mA sản phẩm PCR đa mồi với ADN tách chiết từ máu các bệnh nhân th ng hàn Bảng 9 Độ nhạy và độ đặc hiệu của PCR đa mồi so... loại Salmonella khác và đặc biệt là không có khả năng phát hiện đa đề kháng Trong tầm hiểu biết của chúng tôi, ở nớc ta, cha th y có báo cáo về vi c áp dụng th nh công kỹ thuật PCR đa mồi nào trong chẩn đoán bệnh th ng hàn Hơn nữa, mặc dù S typhi có tỷ trọng lớn nhất trong tất cả các căn nguyên gây bệnh th ng hàn, nhng ở nớc ta vẫn gặp các loài Salmonella khác nh S paratyphi A, B và C [6-12, 14, 15, ... Chính vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài Hoàn chỉnh hệ thống PCR đa mồi để chẩn đoán theo dõi vi khuẩn thơng hàn đa kháng thuốc nhằm 02 mục tiêu: Phát triển hệ thống PCR mới, đa mồi để phát Salmonella... sinh vi n với vi c đa sinh vi n tiếp cận kỹ thuật cao, giới áp dụng vào thực tiễn - Chẩn đoán sớm bệnh thơng hàn phát vi khuẩn thơng hàn môi trờng (nớc, thực phẩm) - Phát sớm khả đa đề kháng vi khuẩn. .. 53 Theo dõi liên tục PCR, sau ngày, vi khuẩn thơng hàn không máu Đây kết điều trị kháng sinh đặc hiệu 3.6 Phản ứng chéo Bảng 11 Kết PCR đa mồi với vi khuẩn thờng gây nhiễm khuẩn huyết STT 10 Vi