BÁO cáo MIỄN DỊCH học

BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học BÁO cáo MIỄN DỊCH học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

BÁO CÁO MIỄN DỊCH HỌC PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HỌC

(NGUYÊN LÝ- GIỚI THIỆU MỘT VÀI PHẢN ỨNG

MIỄN DỊCH HỌC)

MÃ SỐ HỌC PHẦN: NN112

Cần Thơ, Tháng 04/2015

SINH VIÊN THỰC HIỆN:

1 Lê Thị Mỹ Phượng B1303709

2 Phan Ngọc Thảo B1303850

3 Bùi Thị Yến Nhi B1303823

4 Nguyễn Thị Ngọc Mai B1303807

5 Nguyễn Ngọc Thanh Vy B1303759

7 Huỳnh Thị Kim Tuyền B1308946

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

PGs Ts TRẦN NGỌC BÍCH

LỜI MỞ ĐẦU

Phương pháp huyết thanh học giúp ta phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể trên

cơ sở phát hiện sự hình thành tổ hợp kháng nguyên - kháng thể khi trộn một thành phần

đã biết (kháng nguyên hoặc kháng thể) với một dịch nghi có chứa yếu tố kia (kháng thể hoặc kháng nguyên) Phát hiện kháng nguyên trong bệnh phẩm chứng tỏ con vật bị cảm nhiễm mầm bệnh có kháng nguyên tương ứng Tuy nhiên, phản ứng phát hiện kháng nguyên thường có độ nhạy thấp và khó có được bệnh phẩm thích hợp đặc biệt khi động vật còn sống Vì vậy, người ta thường vận dụng phản ứng phát hiện kháng thể Phản ứng này có nhược điểm là khó giải thích kết quả phản ứng Kết quả dương tính thường nói rằng trong quá khứ cơ thể động vật đã tiếp xúc với kháng nguyên tương ứng vừa có thể

do cảm nhiễm tự nhiên, vừa có thể do đã được tiêm phòng Như vậy, ngay cả khi đã loại trừ trường hợp đáp ứng miễn dịch do vacxin thì nếu giết hủy hay loại thải những con vật kháng thể dương tính thì vẫn có thể là lạm sát Tuy nhiên, trong trường hợp bệnh tiến triển nếu lấy máu kiểm tra kháng thể hai lần mà thấy có sự gia tăng lượng kháng thể chứng tỏ bệnh do mầm bệnh tương ứng đang tiến triển Về mặt kỹ thuật mặc dù nguyên tắc của phản ứng kháng nguyên - kháng thể là đơn giản, nhưng tổ hợp kháng nguyên - kháng thể được hình thành thường khó phát hiện nếu không có những thủ thuật thích hợp Chính vì vậy, xuất hiện những phương pháp phân tích khác nhau Có thể nói, mỗi phương pháp là một thủ thuật phát hiện tổ hợp kháng nguyên - kháng thể Ngoài ra, các phản ứng định lượng (thường bán định lượng) như xác định hiệu giá kháng thể có ý nghĩa quan trọng trong đánh giá đáp ứng miễn dịch tập đoàn Do đó, những ứng dụng của phản ứng miễn dịch học hiện nay đang được sử dụng phổ biến

Mục lục

PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HỌC

1 Quy luật chung của phản ứng

1.1 Khái niệm

Phản ứng miễn dịch hay còn gọi là phản ứng kháng nguyên- kháng thể Phản ứng kháng nguyên- kháng thể là phản ứng cơ bản nhất của miễn dịch học Phản ứng nói lên sự kết hợp kháng nguyên- kháng thể là một trường hợp cụ thể của sự tác động tương hỗ- tương ứng của kháng nguyên- kháng thể Khả năng chính xác của phản ứng này rất cao,

nó có thể phân biệt được các dạng protein gần nhau về chủng loại, cũng như các hóa chất giống nhau về hình dạng, về phân tử lượng hoặc phát hiện được ở tỉ lệ kháng thể vô cùng nhỏ (ở tỉ lệ pha loãng 10-4)

Ở in vivo, nó là nguyên nhân của mọi hiện tượng bảo vệ cũng như phản vệ

Ở in vitro, nó là cơ sở của rất nhiều thử nghiệm dùng để phát hiện kháng nguyên, kháng thể hoặc cả kháng nguyên - kháng thể, là cơ sở để phân loại sinh học hoặc vi sinh học trong y học, nông học

1.2 Cơ chế của phản ứng miễn dịch học

Phản ứng kháng nguyên- kháng thể là sự kết tương ứng của 2 thành phần cơ bản là kháng nguyên và kháng thể Phản ứng xảy ra trong các điều kiện nhất định như: nhiệt độ, các muối của môi trường, cơ thể, các chất bổ trợ, sự chuyển động của các phân tử Kết quả là kháng nguyên- kháng thể lên kết chặt chẽ với nhau nhờ các lực lý- hóa của phân tử kháng nguyên và kháng thể Song phản ứng này có thể xảy ra ở trạng thái hoàn nguyên

KN + KT KN -KT

Phản ứng kết hợp KN-KT có thể xảy ra theo 2 giai đoạn khác nhau:

- Sự liên kết đặc hiệu của kháng nguyên-kháng thể

- Hình thành phức hợp KN-KT có thể trực tiếp hoặc gián tiếp nhìn thấy được

Sự liên kết giữa kháng nguyên với kháng thể luôn mang tính đặc hiệu cao Tính đặc hiệu này tương tự như giữa enzyme với cơ chất, nghĩa là khớp với nhau như khóa với chìa

Kháng thể không thể liên kết toàn bộ với kháng nguyên mà chỉ một phần nhất định của kháng nguyên gọi là quyết định kháng nguyên hay epitope Kích thước của epitope khoảng 7x12x35 Ao gồm 5-7 acid amin Phần tương ứng của nó trên mỗi kháng thể gọi là

vị trí kết hợp kháng nguyên hay là paratope Mỗi epitope chỉ gắn đặt hiệu với mỗi

paratope của kháng thể và chỉ sinh ra một dòng kháng thể đặc hiệu Một kháng nguyên có nhiều epitope khác nhau sẽ tạo thành nhiều dòng kháng thể khác nhau tương ứng với từng epitope

Hình 1 Phức hợp kháng nguyên- kháng thể

Về mặt kỹ thuật mặc dù nguyên tắc của phản ứng kháng nguyên - kháng thể là đơn giản, nhưng tổ hợp kháng nguyên- kháng thể được hình thành thường khó phát hiện nếu không có những thủ thuật thích hợp Chính vì vậy, xuất hiện những phương pháp phân tích khác nhau Có thể nói, mỗi phương pháp là một thủ thuật phát hiện tổ hợp kháng nguyên- kháng thể

1.3 Phân loại phản ứng miễn dịch học

Người ta chia phản ứng huyết thanh học làm 2 nhóm:

- Nhóm thứ nhất: phát hiện kháng thể nhờ kháng nguyên đã biết

- Nhóm thứ hai: phát hiện kháng nguyên nhờ kháng thể đã biết

Trong từng nhóm người ta lại chia thành loại đơn giản (có 2-3 thành phần tham gia)

và loại phức tạp (có trên 3 thành phần tham gia)

Hình 3 Kháng thể với các epitope khác nhau Hình 2 Kháng nguyên với một epitope

1.3.1 Nhóm phản ứng loại đơn giản

a Loại 2 thành phần

KN + KT KN -KT

Phản ứng nhìn thấy được, đánh giá được gọi là phản ứng đơn giản trực tiếp, ví

dụ như phản ứng HA (Haemagglutination) Trường hợp một thành phần phải gắn trên chất khối (hồng cầu) mới cho phép ta quan sát, được gọi là phản ứng đơn giản gián tiếp,

ví dụ như phản ứng HA gián tiếp

Trong phản ứng 2 thành phần chỉ có kháng thể hoàn toàn (hóa trị 2) và kháng nguyên hoàn toàn (đa hóa trị) thì kết quả của phản ứng mới có khả năng tạo ‘lưới’- nhìn thấy được Còn nếu 1 trong 2 thành phần không có hóa trị hoàn toàn thì phản ứng sẽ không tạo lưới- không quan sát trực tiếp được

b Loại 3 thành phần

Chia làm 2 nhóm

- Nhóm 1 :

Sự kết hợp giữa kháng nguyên- kháng thể là kết quả của phản ứng không nhìn thấy được, buộc chúng ta phải đọc kết quả gián tiếp theo sự tác động của kháng nguyên với hệ thống chỉ thị (động vật thí nghiệm, phôi gia cầm, môi trường thay đổi pH) Điển hình của nhóm phản ứng này là phản ứng trung hòa để xác định đặc tính của mầm bệnh (vi khuẩn, virus) hoặc sản phẩm của chúng (độc tố)

- Nhóm 2:

Kháng nguyên và kháng thể kết hợp với nhau cũng không nhìn thấy được, kết quả phản ứng được đánh giá theo thành phần thứ 3 Thành phần khi kết hợp trước với kháng nguyên hoặc kháng thể sẽ làm mất đi sự biến đổi nhìn thấy được Điển hình của nhóm phản ứng này là các phản ứng loại ức chế ngưng kết hồng cầu HI

(Haemagglutination Inhibition)

1.3.2 Nhóm phản ứng loại phức tạp

Thường được dùng để phát hiện kháng nguyên hoặc kháng thể không hoàn toàn Khi tiến hành phản ứng chúng ta phải dùng nhiều thành phần, nhiều hệ thống phản ứng mới phát hiện được kháng nguyên hoặc kháng thể Điển hình là phản ứng kết hợp bổ thể, phản ứng miễn dịch huỳnh quang

Sự kết hợp kháng nguyên, kháng thể nhờ các lực sau:

- Lực hút phân tử (Vander Waals)

- Lực Coulomb (lực hút tỉnh điện giữa 2 nhóm ion trái dấu)

- Lực hút giữa các phân tử đồng hóa trị (S-S)

- Lực liên kết cầu nồi hydro của nhóm OH

Trong phản ứng huyết thanh học thì những chất có cấu tạo bề mặt tương đối giống nhau thường cho các liên kết giống nhau (trong các phản ứng chéo)

1.4 Tác động sinh học

Là phản ứng bảo vệ cơ thể

Mặt có lợi: loại bỏ các mầm bệnh, độc tố, các yếu tố lạ xâm nhập vào cơ thể hoặc các chất của chính cơ thể bị biến đổi đi

Mặt có hại: phản ứng gây nên các bệnh lý miễn dịch Đôi khi do phản ứng miễn dịch

mà cơ thể từ chối cả những yếu tố có lợi cho bản thân

2 Các phản ứng miễn dịch học thường dùng trong chẩn đoán bệnh

2.1 Phản ứng ngưng kết

2.1.1 Khái niệm

Là phản ứng liên kết các tiểu thể có kích thước nhỏ (tính bằng Micromet) thành một cấu trúc lớn quan sát được bằng mắt thường

Ở đây, kháng nguyên là một cấu phần nằm trên bề mặt tiểu thể

2.1.2 Các loại phản ứng ngưng kết

a Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính

Đây là phản ứng có tính chất định tính, cho kết quả sơ bộ Thường sử dụng kháng nguyên đã biết được nhuộm màu để phát hiện kháng thể tương ứng trong huyết thanh Thường dùng để chẩn đoán bệnh truyền nhiễm

Ví dụ: Bệnh thương hàn gà Typhus avium

CRD (Chromic Respiratory Disease)

Hình 4 Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính

Cách làm:

+ Dùng một phiến kính, một bên thí nghiệm, một bên đối chứng

+ Bên thí nghiệm nhỏ 1 giọt huyết thanh cần chẩn đoán, sau đó nhỏ 1 giọt kháng nguyên đã biết  trộn đều, sau 1- 2 phút đọc kết quả

+ Nếu trong huyết thanh có kháng thể tương ứng  kháng nguyên + kháng thể tạo thành đám ngưng kết

b Phản ứng ngưng kết chậm trong ống nghiệm

Phản ứng vừa có tính chất định tính, vừa có thể định lượng kháng thể, cho kết quả tương đối chính xác

Cách làm:

Dùng một loạt ống nghiệm, cho vào ống thứ nhất một lượng huyết thanh, rồi pha loãng huyết thanh theo cơ số 2 (1/2; 1/4; 1/8 ) hoặc theo cơ số 10 Sau đó cho vào mỗi ống nghiệm một lượng kháng nguyên (lượng kháng nguyên tương đương với lượng kháng thể) Trộn đều để ở nhiệt độ thích hợp (tủ ấm 37oC) sau 30 phút hoặc vài giờ, đọc kết quả và tính được hiệu giá ngưng kết

Hiệu giá ngưng kết: Là độ pha loãng cao nhất của huyết thanh mà ở đó vẫn còn khả năng gây hiện tượng ngưng kết

Phản ứng này thường được sử dụng để chẩn đoán bệnh xảy thai truyền nhiễm

c Phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động

Trong phản ứng ngưng kết, khi dùng kháng nguyên hoà tan để phát hiện một kháng thể tương ứng phải cần đến tế bào mang làm giá đỡ, mang các phân tử kháng nguyên hoà tan

Thường dùng hồng cầu làm tế bào mang

Nguyên lý:

- Kháng nguyên hoà tan trở thành kháng nguyên hữu hình bằng cách gắn kháng nguyên hoà tan vào hồng cầu, như vậy hồng cầu làm giá đỡ cho kháng nguyên Phản ứng ngưng kết dễ dàng xảy ra

- Có nhiều phương pháp gắn kháng nguyên hoà tan lên bề mặt hồng cầu: Dùng một số hoá chất như axit tanic, benzidin, muối crom, glutaldehyt để xử lý hồng cầu Các chất này có một nhóm chức gắn với hồng cầu, một nhóm gắn với kháng nguyên

- Khi kháng nguyên gặp kháng thể tương ứng, phản ứng ngưng kết xảy ra, ta quan sát rõ

Ngoài sử dụng hồng cầu làm giá đỡ, còn sử dụng các hạt chất dẻo như: hạt latex, bentonít Các hạt này có tác dụng hấp phụ kháng nguyên hoà tan vào trong đó

2.1.3 Ưu, nhược điểm của phản ứng ngưng kết

Ưu điểm: Phản ứng đơn giản, dễ làm, độ nhạy cao, ít tốn kém, được sử dụng rộng rãi

Hình 5 Phản ứng ngưng kết nhanh trong ống nghiệm

Nhược điểm: Hay cho phản ứng dương tính giả, khó đạt trình độ chính xác cao

2.2 Phản ứng trung hòa

Dựa theo nguyên lý:

“ Phản ứng trung hòa là phản ứng huyết thanh học gián tiếp dựa trên tác động trung hòa kháng nguyên bằng huyết thanh miễn dịch đặc hiệu Phản ứng được sử dụng chủ yếu

để xác định các mầm bệnh phân lập được (đặc biệt là virus) hoặc định lượng hàm

lượng huyết thanh miễn dịch trong cơ thể sinh vật cần được chẩn đoán”

Phản ứng trung hòa : xảy ra khi kháng thể bao vây, trung hòa ngoại độc tố vi khuẩn

hoặc bao vây virus Kháng thể đặc hiệu có khả năng trung hòa độc tố, độc lực của vi sinh vật, hoặc làm mất đi một tính chất nào đó của vi sinh vật hoặc sản phẩm của nó

a Phản ứng trung hòa độc tố

Độc tố của vi khuẩn khi được vô độc bằng formol thì trở thành giải độc tố, không còn tính độc nhưng vẫn còn tính kháng nguyên cao, nên người ta thường dùng giải độc tố làm vắc xin, và khi tiêm cho cơ thể, chúng kích thích cơ thể sinh kháng thể rất tốt Khi kháng thể đặc hiệu này gặp độc tố tương ứng chúng sẽ kết hợp và làm cho độc tố đó không còn hoạt tính nữa hay còn gọi là độc tố đã bị trung hòa

Huyết thanh chứa kháng thể kháng độc tố được gọi là huyết thanh kháng độc tố và được sử dụng vào mục đích chữa bệnh Khi tiêm huyết thanh kháng độc tố vào cơ thể, nếu gặp độc tố, chúng sẽ kết hợp và trung hòa độc tố đó, đây là phản ứng trung hòa trên

cơ thể

Nếu cho kháng độc tố (kháng thể đặc hiệu chống độc tố) kết hợp với độc tố tương đương, thì phản ứng trung hòa sẽ xảy ra, nếu thực hiện in vitro trong ống nghiệm, sẽ thấy phức hợp miễn dịch này biểu hiện như những cụm bông lơ lửng, vì vậy người ta gọi là phản ứng lên bông

b Phản ứng trung hòa virus

Khi virus bị kháng thể đặc hiệu kết hợp sẽ không còn khả năng gây bệnh nên phản ứng kết hợp giữa virus với kháng thể được gọi là phản ứng trung hòa virus

Nguyên lý cơ bản của phương pháp này: trên đối tượng nuôi cấy (phôi gà, động vật cảm thụ, môi trường tế bào) virus sẽ nhân lên và gây bệnh tích cho các đối tượng trên, còn khi hỗn hợp virus với kháng thể đặc hiệu tương ứng, chúng sẽ bị trung hòa, không nhân lên được và không gây bệnh tích

Nếu pha loãng virus (theo cơ số 10) rồi hỗn hợp với một lượng tương đương huyết thanh miễn dịch ở mỗi nồng độ, rồi thực hiện phản ứng trung hòa trên các đối tượng trên, người ta gọi đó là phản ứng trung hòa theo phương pháp virus pha loãng, huyết thanh cố định Bằng phản ứng này người ta chuẩn độ được virus

2.3 Phản ứng kết tủa

2.3.1 Nguyên lí chung

Kết tủa chỉ có thể sử dung được khi kháng nguyên hòa tan phản ứng với kháng thể cũng hòa tan Hiện tượng kết tủa miễn dịch xảy ra in vitro Người ta không thể nói có miễn dịch in vitro với cái nghĩa mà nó được mô tả ở đây Hiện tượng tủa những phức hợp phân tử do liên kết KN-KT là do hình thành một mạng lưới ba chiều các kháng nguyên nối lại với nhau bởi các kháng thể (Marrack 1934)

Việc hình thành mạng lưới kết tủa phải cần nhiều điều kiện như sau:

- Kháng thể phải có ít nhất hai hóa trị (các mãnh Fab của kháng thể còn một hóa trị nên không có khả năng này)

- Kháng nguyên phải đa hóa trị (các hapten không kết tủa được)

- Tính chất của kháng nguyên (chủ yếu là tính hòa tan) và thành phần của môi trường (lực ion và pH) có vai trò nhất định trong việc xảy ra hiện tượng kết tủa

- Các kháng thể IgG chỉ có chứa 3% glucid, là những chất gây kết tủa tốt nhất còn kháng thể IgM chứa tới 10% nên dễ hòa tan hơn và ít gây kết tủa

- Các kháng nguyên-kháng thể càng to thì càng dễ tủa

2.3.2 Kết tủa trong môi trường lỏng

Phương pháp Heidelberger và Kendall

Lần đầu tiên phương pháp này cho phép định lượng một phản ứng miễn dịch, đến nay vẫn còn được dùng để giải thích hiện tượng tủa tại sao khi xuất hiện khi không,

đó là do thay đổi tỉ lệ nồng độ tương đối giữa kháng nguyên và kháng thể Trong một loạt ống thí nghiệm

2.4 Phản ứng kết hợp bổ thể

Phản ứng kết hợp bổ thể thực hiện được nhờ hai hệ thống: hệ thống dung khuẩn và

hệ thống dung huyết với sự tham gia của bổ thể, bởi vì hiện tương dung khuẩn không thể quan sát được bằng mắt thường,do đó phải dùng hệ thống dung huyết để đánh giá kết quả Các bước tiến hành thí nghiệm:

- Cho hệ thống dung khuẩn (hệ thống 1) và ống nghiệm trước, gồm có kháng

nguyên đã biết và huyết thanh con vật cần chẩn đoán đã đun cách thủy lên 56o C trong 30 phút để diệt bổ thể, sau đó cho tiếp tục vào ống nghiệm một lượng bổ thể đã được chuẩn

độ vừa đủ lượng cần thiết (thường dùng huyết thanh tươi chuột lang) ủ ở 37o C trong vòng 20-30 phút

- Sau đó cho tiếp tục vào ống nghiệm hệ thống hai (hệ thống dung huyết) gồm có hồng cầu và huyết thanh miễn dịch chống hồng cầu cừu đã được đun 56o C trong 30 phút

để diệt bổ thể, ủ tiếp cả hai hệ thống ở 37o C trong 20-30 phút rồi đọc kết quả

- Đọc kết quả:

+ Nếu ở hệ thống 1 (hệ thống dung khuẩn), kháng nguyên và kháng thể tương ứng, thì sự kết hợp kháng nguyên kháng thể sẽ chiếm lấy bổ thể, không còn bổ thể cho hệ