Bộ Y TẾ f ty / VIEN VE SINH DICH TE HOC
CHƯƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÁP NHÀ NƯỚC KY 01
ĐỀ TÀI KY.01.03
UNG DUNG TIẾN Bộ KHOA HOC KY THUAT DE HOA
THIEN CONG NGHE SAN XUAT VAcXIN UONG PHONG _
ỨUI MƠ BẤN CƠNG NGHIỆP
Chủ nhiệm: GS.TS, Đặng Đức Trạch
Phĩ chủ nhiệm : PGS PTS Đặng Đức Phú
Viện Vệ Sinh Dịch Tã Học
Viện Vắcxin và Chế phẩm Sinh học Trung tâm Quốc gia Kiểm định Vắcxin
- Sở Y Tế Thừa Thiên - Huế
Viện Vi Sinh và Miễn Dịch học, trường Đại học Gotebor Viện Sức Khỏe Guốc Gia (N.I.H.), Bethesda, Md
Trang 2CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI KY - 01 - 03 GS TS ĐẶNG ĐỨC TRẠCH PHĨ CHỦ NHIỆM PGS PTS ĐẶNG ĐỨC PHÚ Chủ nhiệm đề mục: KI - 01 - 03 -01 PTS Hoang thu Thuy KI - 01 - 03 -02 TS Phùng Đắc Cam” KI- 01 - 03 -03 BS Nguyén Pht Quy KI- 01 - 03- 04 KI - 01 - 03 - 05 KS Phan Vii Diém Hang™ BS Đỗ Gia Cảnh) KI- 01 - 03 - 06 KI- 01 - 03 - Ơ7 PGS Nguyễn thị Ke2 BS Chế quang Tuân?) KI - 01 - 03 - 08 D§ Hồ thị Ánh? KI- 01-03- 09 BS Lé van Bé KI - 01-03-10 BS Dỗn thị Tam? KI - O1- 03-11 BS Nguyễn đình Sơnt® KI - 01-03-12 GS Jan Holmgren KI - 01-03-13 TS John Clemens Cộng tác viên chính:
Vũ thanh Bình”, Vũ thị Nương, Nguyễn văn Cam, Nguyén thu Thuy, Đặng Đức Phút”, Nguyễn Lan Phương), Nguyễn đình Bồng?, Phan thị Tuyết, Ha Hồng
Nhung), Hồng thị Hồng”, Nguyễn quế Anh?” Nguyễn Son, Hoang thi Phiém™, Nguyễn thai Hoa, Ann-Marie Svennerholm®, M.R Rao® Thư ký đề tài : PGS.PTS Đặng Đức Phú
_( Viện Vệ sinh Dịch tế học
(2) Viện vacxin và chế phẩm sinh học Nha trang- Đà lạt (3) Trung tâm Quốc gia kiểm định vacxin
(4) Sở Y tế thờa Thiên - Huế
Trang 3I ĐẶT VẤN ĐỀ I, TONG QUAN
Phần thứ nhất: Bổ xung các kháng nguyên cần thiết
Phần thứ hai: Sản xuất vắc xin tả ở qui mơ bán cơng nghiệp
Phần thứ ba: Thí nghiệm thực địa
IV BÀN LUẬN CHUNG V KET LUAN CHUNG
MUC LUC
Trang 4I BAT VAN DE
Đề tài “Nghiên cứu sản xuất vắc xin uống phịng bệnh tả" 64 B - 07 - 03 - 01 (1990) đã cĩ những kết quả như sau (3, 11, 12):
1 Một vắcxin chết, tồn tế bao, gdm Vibrio cholerae typ sinh hoe cé dién
va typ sinh hoc EI Tor, bất hoạt bởi nhiệt và formalin, đã được chế tạo
Sản phẩm đạt những yêu cầu của Trung Tâm Quốc Gia: Kiểm Định
Vắcxin ~
Vắcxin đã được thí nghiệm trên người tình nguyện và tơ ra an tồn, với
liêu uống 100 tỉ vi khuẩn x 3 lần Theo dõi đáp ứng miễn dịch ở người
tình nguyện, thấy cĩ hiệu giá các lg đặc hiệu cao, đặc biệt các sIgA
Vắcxin đã được sản xuất ở qui mơ phịng thí nghiệm, sản phẩm sản xuất
thử đạt 200.000 liều Giá thành ước tính của mỗi liều bằng 0,5 kg gạo
Nếu sản xuất và kiểm định ở qui mơ lớn hơn, giá thành cĩ thể sẽ thấp
hơn `
Những vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu:
e_ Quy trình hợp lý cần để sản xuất vắcxin này ở quy mơ lớn hơn
« Cải tiến để cĩ thể tăng hiệu lực gây miễn dịch của vắcxin này - Đề tài KY 01.03 (1992 - 1995) “Ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật để hồn thiện cơng nghệ sản xuất vắcxin uống phịng tả ở qui mơ bán cơng nghiệp” nhằm các mục dich:
1 2
Bổ xung một số kháng nguyên cần thiết để tăng hiệu lực của vắcxin
Nâng mức sản xuất từ qui mơ phịng thí nghiệm lên qui mơ bán ơng nghiệp, với thiết bị hiện cĩ
Trang 5II TONG QUAN
Bénh tả hiện nay vẫn xảy ra tại nhiều nơi trên thế giới Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới, khoảng 35 nước vẫn cịn cĩ bệnh tả Bệnh tả, nếu
khơng được điều trị kịp thời và đúng cách, thường cĩ tỷ lệ mắc/chết rất cao, khoảng 40% Mỗi năm ước tính cĩ trung bình 1 triệu trường hợp mắc bệnh tả, số tử vong là khoảng 200.000 ở Châu Phi và khoảng 100.000 ở Châu Á
Một phần ba số tử vong đĩ là trẻ em dưới 5 tuổi, một phần tư là trẻ em từ 5 tới 14 tuổi, và số cịn lại là người lớn Hiện nay bệnh tả chủ yếu vẫn do
Vibrio cholera 01 nhưng mới đây thấy xuất hiện một tác nhân mới, Vibrio cholerae 0139, gây nhiêu vụ dịch lớn trên thế giới, đặc biệt ở những nước trong khu vực Á Châu (2) Việt nam là vùng dịch tả lưu hành, bệnh tả vẫn là gánh nặng cho ngành y tế và xã hội Cũng khơng loại trừ khả năng cĩ
thể xẩy ra dịch lớn do V.cholerae 0139 ở nước ta
Từ lâu nay việc nghiên cứu để cĩ được một vắcxin hiệu nghiệm phịng
bệnh tả vẫn là mối quan tâm của y học thế giới Vắcxin tả đầu tiên cĩ từ một thế kỷ nay, sau khi Koch phát hiện được Vibrio cholerae 01 là bệnh
nguyên của tả Vắcxin này (cịn được gọi là vắcxin "cổ điển") đã được tiêm cho hàng nhiều triệu người trên thế giới, nhưng thật ra mãi rất lâu về sau,
vào quãng những năm 60, mới bắt đầu cĩ những nghiên cứu đánh giá hiệu lực của vắcxin này trên thực địa Những: nghiên cứu tại Bangledesh, Ấn Độ
và Philippin cho phép nhận định rằng vắcxin "cổ điển" này chỉ cĩ hiệu lực rất hạn chế, chỉ cĩ thể bảo vệ được trong thời gian ngắn (3-6 tháng), khả
năng gây miễn dịch cho trẻ em rất thấp, và đặc biệt là tiêm vắcxin cũng khơng hạn chế được việc đào thải Vibrio cholerae qua phân Vì thế
vắcxin"cổ điển" khơng được coi là phương tiện hiệu nghiệm để dự phịng
bệnh tả, và hiện nay khơng cịn được dùng nữa
Trong những năn 70, Ấn Độ và Inđơnésïa cĩ thí nghiệm liêm vắcxin hấp ˆ
phụ aluminium Vắcxin này cĩ hiệu lực bảo vệ cao hơn và dài hơn vắcxin
"cổ điển" Cũng trong khoảng thời gian này Bangladesh và Philippin cũng thử tiệm giải độc tố (toxoid): loại vắcxin này, tuy cĩ gây đáp ứng kháng thể
kháng độc tố, nhưng trên thực địa khơng cĩ hiệu lực bảo vệ đáng kể
Lúc này Tổ chức Y tế Thế giới bắt đầu khuyến cáo khơng nên tiêm vắcxin
Trang 6những khu vực lưu hành bệnh tả, khơng cĩ tác dụng chống các vụ dịch tả, và khơng cĩ khả năng ngăn chặn bệnh tả lan truyền giữa các khu vực trên thế giới Ngồi ra, một lý do nữa cũng khiến cho mọi người khơng cịn
quan tâm tới thức vắcxin"cổ điển" này: Việc điều trị bệnh tả đã cĩ nhiều
tiến bộ và đơn giản hơn trước Phương pháp bủ nước trên thực tế đã làm
giảm tỷ lệ mắc/chết xuống tối thiểu (dưới 1%), và như vậy điều trị rõ ràng là
cĩ tác dụng cứu được nhiều người hơn là tiêm phịng vắcxin tồi
Sau tai họa lớn ở Rwanda, từ năm 1995, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã thay
đổi quan niệm và đã nhận thấy sự cần thiết phải dùng vắc xin tả kiểu mới để dự phịng dịch tả (13)
Xuất phát từ quan niệm rằng phịng vệ tự nhiên chống bệnh tả chủ yếu dựa vào các kháng thể hình thành tại đường ruột, cĩ khả năng chống vi
khuẩn tả và độc tố tả, từ những năm 80 nhiều phịng thí nghiệm đã tập
trung nghiên cứu vắcxin tả uống, với hy vọng là vắcxin uống cĩ thể kích thích đáp ứng miễn dịch tại đường ruột chống lại một noặc nhiều kháng
nguyên chủ yếu của Vibrio cholerae 01
I.1 NHỮNG KHÁNG NGUYÊN CHỦ YẾU CỦA VIBRIO CHOLERAE 01 Qua các nghiên cứu trên súc vật và trên người cĩ thể thấy rằng các kháng
nguyên lipopolysaccharid của thành tế bào vi khuẩn (LPS) và độc tố (CT) cĩ khả năng tạo được miễn dịch bảo vệ -chống tả Những kháng thể đặc
hiệu chống các kháng nguyên này được hình thành tại đường ruột, và cĩ tác dụng cộng lực Miễn dịch kháng vi khuẩn chủ yếu do LPS, nhưng các kháng thể kháng các protein khác của tế bào vi khuẩn tả cũng cĩ thể cĩ vai trị quan trọng Miễn dịch kháng độc tố cĩ tác dụng chống lại tiểu đơn vị
B của độc tố tả
Vibrio cholerae 01, muốn gây được ia chảy, trước tiên cần phải: định cư- được tại đường ruột Quá trình này rất phức tạp, địi hỏi cĩ sự biểu hiện nhịp nhàng giữa các chức năng hĩa ứng động và sau cùng là sự hình thành
độc tố (CT) Như vậy, nếu ngăn cản khơng cho V.cholerae 01 bám dính
Trang 7được tại ruột TCP (viết tắt của toxin coregulated pilus = pilus đồng điều hịa độc tố) là một "lơng" của vi khuẩn tả TCP biểu hiện được nhiều hay ít tùy theo ngoại cảnh, và điều kiện ngoại cảnh thích hợp cho TCP biểu hiện
được nhiều cũng đồng thời thích hợp cho độc tố tả hình thành được nhiều
(6)
Gen cấu trúc chính của TCP, TepA, và các gen mã hĩa sự tổng hợp độc tố,
là một phần của yếu tố điều hịa độc lực (toxR) Các kháng nguyên, do các
gen nĩi trên mã hĩa, đều cĩ khả năng riêng kích thích đáp ứng miễn dịch
chống lại bệnh tả thực nghiệm Các kháng nguyên này, nếu cộng lực, sẽ
ngăn các gen biểu hiện Do vai trị quan trọng của protêin tiết do toxR điều hịa, đặc biệt là TCP và tiểu đơn vị B của CT, được coi như là những kháng
nguyên miễn dịch mạnh, cĩ thể dùng phối hợp với LPS trong vắcxin `
Trong thực nghiệm, kháng huyết thanh thỏ đa-clơn kháng TCP cĩ hiệu lực
bảovệ thụ động cho chuột nhắt mới đẻ, sau khi thử thách gây bệnh bằng V.cholerae 01 (chủng Inaba và chủng Ogawa) Nếu hấp phụ kháng huyết
thanh khang TCP với một chủng V.cholerae 01 hoang dại, thì khả năng bảo
- vệ mất Nhưng nếu hấp phụ với một chủng V.cholerae 01 pilus-âm, thì khả năng bảo vệ cịn nguyên vẹn Như vậy cĩ thể nghĩ rằng khả năng báo vệ
cĩ liên quan chặt chẽ với kháng thể kháng -TCP Các gen TcpA của các chủng V.cholerae 01, sinh týp cổ điển, Inaba và Ogawa, giống nhau hồn tồn Các gen TcpA này khơng giống hẳn các gen TcpA của V.cholerae sinh - typ El Tor, nhung cĩ lẽ cĩ chung những quyết định kháng nguyên
chính :
Ngồi những gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp TCP, cịn cĩ những gen mã hĩa các protêin màng ngồi tế bào vi khuẩn, và các gen mã hĩa tổng hợp một yếu tố phụ định cư (ACF - accessory colonization factor) Tat
cả các gen này cũng đều do toxR điều hịa Như vậy, TepA cĩ thể dùng
-như là "chỉ điểm" của các kháng nguyên mạnh khác cùng bị điều hịa bởi
toxR, trong quá trình sản xuất loại vắcxin tồn tế bào (WC - whole cell)
1.2 CÁC VẮCXIN UỐNG DỰ TUYỂN Các vắcxin chết
Các vắcxin WC đơn hoặc phối hợp với tiểu đơn vị B của CT mới đây đã
Trang 8Vắcxin phối hợp WC/BS gồm cĩ tiểu đơn vị B tỉnh chế từ độc tố tả, và các ‘vi khuẩn tả thuộc sinh-týp cổ điển và sinh- -typ El Tor (Inaba va Ogawa) Tiểu đơn vị B hồn tồn khơng độc, nhưng cĩ khả năng sinh kháng thể trung hịa như độc tố tồn vẹn
Tiểu đơn vị B cĩ khả năng gắn vào màng tế bào ruột, do đĩ cĩ tính sinh
miễn dịch Tế bào vi khuẩn bất hoạt bởi nhiệt cung cấp được các kháng nguyên LPS Inaba và Ogawa, tế bào vi khuẩn bất hoạt bởi formalin cung cấp các kháng nguyên khơng kháng nhiệt Tiểu đơn vị B là một pentamer dễ bị hủy bởi axít, vì vậy khi cho uống vắcxin cần phải dùng dung dịch đệm gồm cĩ natri bicarbonat va axit citric
Qua những thí nghiệm thực địa đầu tiên ở quy mơ nhỏ (Bangladesh, Thụy Điển, Mỹ) thấy rằng vắcxin WC/BS an tồn Tại Bangladesh cĩ thí nghiệm đánh giá để xem vắcxin này cĩ khả năng kích thích các đáp ứng kháng thể niêm mạc kháng vi khuẩn và kháng độc tố Kết quả thấy rằng : uống hai liều (hoặc nhiều liều hơn) thì gây được sự hình thành khang thé IgA kháng - LPS va khang độc tố trong nước rửa ruột, với hiệu giá cao như ở bệnh nhân tả Các đáp ứng kháng thể này cao hơn rất nhiều và tồn tại lâu hơn nhiều, nếu so sánh các đáp ứng sau khi tiêm bắp thịt 2 liều cùng thứ vắcxin này Đáp ứng kháng thể ở người Thụy Điển thấp hơn so với đáp ứng ở người Bangladesh ở cùng lứa tuổi Theo dõi lâu dài , thấy rằng ký ức miễn dịch (lgA niêm mạo) cĩ thể tồn tại f nhất 15 tháng ở người tình nguyện Bangladesh, và ít nhất 5 năm ở người tình nguyện Thụy Điển
Tại Hoa Kỳ, những người tình nguyện đã uống 3 liều vắcxin WC/BS cĩ được tỷ lệ bảo vệ là 63%, nếu dùng WC thì tỷ lệ bảo vệ 56%, sau khi thử thách gây bệnh tả với V.cholerae 01 EI Tor Trong số những người tình nguyện Hoa Kỳ này, nếu uống WC/BS thì khơng cĩ ai bị ïa chảy nặng
(nặng = bài tiết ít nhất 2 líVngày), và nếu uống WC thi 44% bi ia chảy nặng Do thấy cĩ những kết quả đáng khích lệ nĩi trên, Trung Tâm Quốc tế
Nghiên cứu Bệnh fa chay (ICDDR/B) tai Bangiadesh phối hợp với chính phủ Bangladesh và Tổ chức Y tế Thế giới, tiến hành một thực địa nghiên cứu hiệu lực của vắcxin tả uống tại Matlab từ năm 1985 Tất cả cĩ 63.000
người (gơm trẻ em 2-15 tuổi và phụ nữ trên 15 tuổi) đã uống 3 liều, mỗi liều
cách nhau 6 tuân, theo các nhĩm như sau: (a) vacxin WC/BS, (b) vắcxin
Trang 9(Cairo 48), Ogawa cổ điển bất hoạt nhiệt (Cairo 50), lượng đều nhau
'Vắcxin WC cũng cĩ cơng thức như trên, nhưng khơng cĩ tiểu đơn vị B
Cả 2 vắcxin đều làm tăng hiệu giá kháng thể huyết thanh diệt Vibrio (tăng khoảng 2 bậc); riêng vắcxin WC/BS làm tăng hiệu giá kháng thể huyết thanh lgG kháng độc tố tả (tăng 4-6 bậc) Theo dõi các người uống vắcxin, khơng thấy cĩ phản ứng gì xảy ra
Theo dõi hiệu lực bảo vệ của vắcxin qua 3 năm giám sát trong khu vực Matlab: Những số liệu chính được ghi lại trong bảng kèm theo Sau 3 năm theo dõi những người đã uống 3 liều vắcxin, thấy rằng WC cĩ tỷ lệ bảo vệ 52%, vắcxin WC/BS cĩ tỷ lệ bảo vệ 50% Tỷ lệ báo vệ ở đây cĩ nghĩa là dự phịng được ia chảy do vi khuẩn tả gây ra (chứng minh bằng nuơi cấy vi
khuẩn}
Cả hai loại vắcxin đều cĩ hiệu lực bảo vệ thấp đối với trẻ em 2-5 tuổi: 31%
và 24% với WC, và 38% và 47% với WC/BS, trong năm thứ nhất và năm
thứ hai Tới năm thứ 3 coi như khơng cịn thấy hiệu lực bảo vệ nữa ở lứa
tuổi này Trái lại, ở lứa từ 6 tuổi trở lên, hiệu lực bảo vệ trong cả thời gian 3
năm là khá cao: 68% với WC, và 63% với WC/BS Trong nhĩm placebo,
65% những người mắc bệnh tả là thuộc lứa tuổi từ 6 tuổi trở lên
Qua mỗi năm theo rõi, thấy rằng các trường hợp bệnh tả cĩ cả V.cholerae 01 typ sinh học cổ điển hoặc typ sinh học El Tor, và phần lớn các chủng đã
phân lập được là Ogawa Hiệu lực bảo vệ của cả hai thứ vắcxin đối với
V.cholerae cổ điển cao hơn đối với V.cholerae EI Tor
Trang 10Hiệu lực của vắcxin WC và WC/BS tại thực địa Bangladesh Các nhĩm tuổi và Hiệu lực của vắcxin (%) thời gian theo dõi WC WC/BS Tính từng năm: Năm thứ nhất 33 62 Năm thứ hai 37 57 Năm thứ ba - 43 17 Tinh chung 3 nam Lứa tuổi 2-5 năm 23 26 Lứa tuổi6năm - 68 63 Chung các lứa tuổi 52 50 Căn nguyên Vi khuẩn tả cổ điển 60 58 Vi khuẩn tả EI Tor 40 39
Trang 11Các vắcxin V.cholerae 01 sống, giảm sức độc
Trong khoảng mười năm qua cĩ khá nhiều nghiên cứu nhằm tạo được các
chủng đột biến V.cholerae 01 để làm vắcxin sống uống Phần lớn các
nhĩm nghiên cứu đều theo đuổi mục đích tạo được các chửng đột biến
khơng sinh độc tố (kiểu hình độc tố A-B-) , hoặc chỉ sinh tiểu đơn vị B của
độc tố (kiểu hình A-B+)
Một số chủng dự tuyển (như Texas Star-R) đã được thí nghiệm trên người tình nguyện, và tỏ ra cĩ khả năng sinh miễn dịch bảo vệ Tuy nhiên những chủng này đều khơng sử dụng được làm vắcxin, vì khơng được an tồn Chủng dự tuyển đáng chú ý nhất hiện nay là C.cholerae 01 CVD 103
Chúng này là một đột biến A-B+, tái tổ hợp từ chủng độc cổ điển Inaba 569B đã loại gen mã hổa tiểu don vi A Nhu vay chủng CVD 103 chỉ sinh tiểu đơn vi B Ching này cũng khơng cĩ độc tố "giống Shiga" (thường cĩ thể thấy ở nhiều chủng Vibrio cholerae, cĩ khả năng tham gia vào quá trình
sinh bệnh ïa chảy)
Tại Hoa Kỳ cĩ thí nghiệm CVD 103 trên người tình nguyện: 46 người lớn
khỏe, đã uống một liều 10 vi khuẩn sống, khơng cĩ phản ứng gì nghiêm
trọng Tuy vậy, 5 người (11%) đã cĩ ïa chảy nhưng khơng cĩ những dấu
hiệu kèm theo như buồn nơn , khĩ chịu, đau quặn, biếng ăn Thử huyết
thanh thấy 45/46 người tinh nguyện (98%) cĩ tăng hiệu kháng thể diệt Vibrio một cách đáng kể , và 93% cĩ tăng hiệu giá kháng độc tố rõ rệt Sau đĩ cũng tại Mỹ, cĩ 3 thí nghiệm thử thách trên tổng số 26 người tình
nguyện Mỗi người uống một liều 2x10Ê vi khuẩn CVD 103, và sau 1 tháng
được thử thách gây bệnh với V cholerae 01 độc ( liều thử thách này gây ïa
chảy cho 24/25 người tình nguyện đối chứng khơng uống vắcxin) Kết quả
thấy rằng một liều CVD 103 duy nhất đã bảo vệ được 80% trường hợp khơng cĩ xảy ra Ïa chảy,-và 94% khơng cĩ ỉa chảy trầm trọng: - ~ Về sau, chủng CVD 103 đã được sửa đổi lại: gài thêm một gen mã hĩa tính kháng thủy ngân vào vị trí hlyA của nhiễm sắc, do đĩ tên chủng này cũng được sửa là CVD 103-HgR Dấu ấn kháng thủy ngân này giúp để phân biệt với những chúng vi khuẩn tả hoang dại CVD 103-HgR đơng khơ được thử
trên 90 người tình nguyện ở Mỹ, với liều 5x10Ê và 5x10” vi khuẩn sống
Trang 12Hiệu giá kháng thể huyết thanh diệt khuẩn tăng trong 91% các trường hợp, hiệu giá này tăng 3-4 bậc cao hơn hiệu giá của những người uống 3 liều WC/BS Điều đáng chú ý là chỉ thấy 30% trỨờng hop dao thai CVD 103
HgR qua phân (trong khi đĩ tỷ lệ đào thải CVD là 91%) Qua thí nghiệm
trên người tình nguyện uống 1 liều CVD-HgR, 65% cĩ miễn dịch bảo vệ
chống thử thách gây bệnh với V cholerae 01 EI Tor Inaba (khac typ sinh học)
Sau đĩ, tại Thái Lan cũng cĩ thí nghiệm CVD-HgR trên người tình nguyện:
12 người uống một liều 5x 108 khơng thấy cĩ phản ứng, và 11/12 người cĩ
tăng hiệu kháng thể huyết thanh diệt Vibrio, và 9/12 người cĩ tăng hiệu giá
kháng thể huyết thanh kháng độc tố Tuy nhiên, trong những thí nghiệm
tương tự tiếp theo với một số lớn tân binh, kết quả huyết thanh học kém
hơn thế nhiều Cĩ lẽ do quá trình đơng khơ vắcxin đã làm chết nhiều vi khuẩn Một thực địa để đánh giá hiệu lực bảo vệ của vắc xin này đang được tiến hành tại Jakarta, và tới cuối năm 1996 sẽ cĩ tổng kết
Những vắcxin lai tạo
Đĩ là trường hợp vắcxin tả lai (của Trưởng Đại học Adelaide) : “cài” các gen mã hĩa sự tổng hợp các kháng nguyên LPS của V.cholerae trên bề mặt của chủng S Ty21a sống Chủng lai này đã được thử trên 500 người tình nguyện Nhận xét đầu tiên là chỉ cĩ xảy ra rất ít phản ứng phụ Cho
người tình nguyện uống 3 liều 2x 109 vị khuẩn sống, thấy 50% cĩ đáp ứng kháng thể với LPS của V cholerae 01 và 35% cĩ đáp ứng kháng thể diệt Vibrio Trong thí nghiệm cĩ thử thách, cho người tình nguyện uống 3 liều 10?! vi khuẩn đơng khơ, nhưng chỉ bảo vệ được cĩ 25% số người khơng
mắc bệnh tả, tuy nhiên những trường hợp mắc bệnh tả thì nhẹ hơn nhiều
so với đối chứng °
Những nghiên cứu kể trên đã mở ra một hướng tìm tịi các vắcxin lai, và
như vậy chỉ cần tuyển lựa được một vi khuẩn vận tải an tồn để cĩ khả năng chế tạo được nhiều vắcxin dự phịng các bệnh nhiễm khuẩn khác ở
Trang 134
tải cĩ thể được dùng nhiều lần để đưa vào một cơ thể các kháng nguyên
khác nhau được khơng?
Vắcxin tả thích hợp cho Việt Nam
Đối với Việt Nam vắcxin tả nào thích hợp? Vắcxin lý tưởng, để cĩ thể dùng
ở quy mơ lớn, phải là một vắc xin an tồn và cĩ mức độ hiệu lực cĩ thể
chấp nhận được ngồi ra nhất thiết phải khơng cĩ giá thành cao, cĩ thể
sản xuất được ở quy mơ lớn với cơng nghệ khơng quá phức tạp, cĩ tính bền
Trang 14ill CÁC NỘI DỤNG NGHIÊN CỨU Phần thứ nhất
BỔ SUNG CÁC KHÁNG NGUYÊN CẦN THIẾT
I CO SG CUA VAN DE:
_ Các kháng nguyên đồng điều hịa độc tố ( TCP : toxin coregulated pilus) và ngưng kết hồng cầu nhay cam D-mannose ( MSHA: D-mannose-
sensitive haemagglutinin) la cần thiết để vắc xin đạt được khả năng sinh miễn dịch đặc hiệu cao phịng chống bệnh tả Ngồi ra, hàm lượng kháng nguyên LPS (lipopolysaccharide) cũng cần cĩ trong vác xin ở mức độ đầy đủ, để hiệu lực bảo vệ được chắc chắn (6, 9, 10)
Vắcxin chết, tồn tế bào , đã được thí nghiệm tại thực địa Bangladesh, và
đã được sản xuất tại nước ta, cần được bổ xung những kháng nguyên cần
thiết nĩi trên
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP: 2.1 Các chủng vi khuẩn thí nghiệm :
- V cholerae 01 569 B, typ sinh học cổ điển, typ huyết thanh Inaba ~ V cholerae 01 Cairo 50,typ sinh học cổ điển, typ huyết thanh Ogawa,
- an = — +
- V cholerae 01 Phil 6973, typ sinh học EI Tor, typ huyét hanh Inaba, Các chúng nĩi trên nhận từ Trường Đại Học Goteborg, Thụy Điển
Trang 15Mơi trường IVAC va AKI ( 7, 14) nuơi cấy trên nồi lên men CHEMAP 75 lít
và 300 lít, ở các nhiệt độ từ 27 đến 30°C trong 16-20 giờ Gặt bằng li tâm, điều cHỉnh để cĩ đậm độ 100 tỉ vi khuẩn/mI Nuơi cấy 12 loạt liên tiếp 2.3 Phương pháp kiểm tra :
Kiểm tra các kháng nguyên LPS và TCP bằng phương pháp ELISA cạnh tranh, kiểm tra kháng nguyên MSHA bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu thụ động, theo thường qui của trương Đại Học Goteborg (8)
2.3.1 Phương pháp định lượng LPS cĩ trong vắc xin bằng kỹ thuật ELISA
cạnh tranh: ,
Gắn 100 ni LPS của V cholerae Inaba 569B vào các giếng của bản nhựa
polystyren số 1 với nồng độ 25 ug/ml pha trong PBS Để ở nhiệt độ phịng
qua đêm
Trên bản nhựa số 2, sau khi Ủ 30 phút với BSA 1% ở 37°C, cho 60 uÌ BSA
1% pha trong PBS, sau đĩ cho 30 ni mẫu vắc xin thử vào giếng đầu tiên trong hàng Trộn đều và hút chuyển 30 ul sang giếng thứ hai, tiếp tục hút
chuyển pha lỗng bậc 3 cho tới hàng G của bản nhựa Riêng hàng H chỉ cho đệm BSA-PBS 1% Sau đĩ, cho 60 ul vào mỗi giếng kháng thể đơn clén tu chuột khang LPS (Mab 8:4 880950) pha lỗng 1/160 trong BSA- PBS 1% theo thứ tự đi từ hàng H trở lên Đập nắp kín vừa lắc vừa ủ 1 giờ ở nhiệt độ phịng Rửa bản số 1 ba lần với PBS Sau đĩ ủ bản này 200
ul/giéng BSA-PBS 1% 37°C trong 30 phút Rửa 1 lần: với PBS-Tween
0,05%
Chuyển 100 „i từ mỗi giếng của bản nhựa số 2 sang bản nhựa số 1, bắt đầu từ hàng H Ủ ở nhiệt độ phịng 90 phút, khơng lắc Rửa 3 lần với PBS- Tween Sau đĩ, cho 100 kị cộng hợp enzym lg peroxydaza kháng chuột (Jackson No 115 035068, lot 10538) pha lỗng1/2000 trong BSA-PBS 1% Ủ 90 phút ở nhiệt độ phịng Rửa 3 lần với PBS - Tween
Cho 100 ul orthophenylen diamin pha trong dém citrat natri 0,1M, pH 4,5 cĩ
thêm 4 ul HeO2 30% DE G nhiét dé phéng 20 phút, đọc kết quả trên máy Titertex Muitiskan budc sĩng 450 nm Kết quả dựa theo 50 % nồng độ bị ức chế của kháng thể kháng LPS kháng lại LPS chuẩn Theo tiêu chuẩn quốc
tế, một vắc xin cĩ chất lượng tốt cần cĩ nồng độ từ 500 - 1300 đơn vị (EU)
Trang 162.3.2 Phương pháp định lượng Tcp trong vắc xin bằng kỹ thuật ELISA cạnh
tranh: :
Gan vào bản nhya 50 wl/giéng vi khudn ta co Top [chủng JS 1569 (pJS
752-3) moc ở mơi trường AKi, 30°C] với nồng độ 10! vị khuẩn/mi đã xử lý glutaraldehyd Sau đĩ, mỗi giếng được ủ BSA 1% pha trong PBS 30 phút, 37°C Sau khi rửa 3 lần với PBS - Tween, cho 25 ul mau vắc xin thử vào giếng đầu của hàng A, trộn đều và hút chuyển 25 mi sang hàng thứ hai và tiếp tục cho đến hàng G, riêng hàng H-cho đệm Trộn đều và ủ ở nhiệt độ phịng 90 phút Rửa 3 lần với PBS - Tween Cho kháng thé don clon tu
chuột (Mab Tc 20:2) pha lỗng 1/400 trong BSA-PBS 0,1% Ủ nhiệt độ
phịng qua đêm Cho 100 kí cộng hợp enym phosphataza kiềm lgG+lgM (Jackson, West Grave, Pennsyivania), pha lỗng 1/3000 trong BSA-PBS- Tween Ủ 90 phút ở nhiệt độ phịng Sau khi rửa 3 lần như trên, cho cơ chất nitrophenyl phosphat (Sigma, St Louis, Missouri) Đọc kết quả trên máy
Titertex Multiskan, bước sĩng 405 nm Kết quả dựa vào độ ức chế 50% của kháng thể kháng TCP với kháng nguyên chuẩn
Theo tiêu chuẩn quốc tế, một vắc xin cĩ chất lượng tốt phải cĩ hàm lượng TCP tối thiểu là 1:150
2.3.3 Phương pháp định lượng kháng nguyên MSHA trong vắc xin:
Vắc xin thử được pha lỗng bậc hai, 25 HÍ vắc xin vào mỗi giếng của bản
nhựa sau khi pha lỗng (từ 1/2 đến 1/1624 hoặc hơn) Sau đĩ, cho vào mỗi giếng 25 ui hồng cầu 1% (chú ý: thử hồng cầu gà với chủng EI Tọ, hồng cầu người với chủng tả cổ điển) Mỗi bản cĩ một giếng chỉ cĩ hồng cầu và đệm để làm chứng Sau đĩ, ủ bản ở nhiệt độ phịng từ 30 - 60 phút Kết quả dương tính khi hồng cầu bị tan đều trong giếng, âm tính khi hồng cầu lắng thành một điểm ở đáy giếng
Theo tiêu chuẩn quốc tế vắc xin tốt cĩ hàm lượng kháng nguyên MSHA từ
1/8 trở lên
Các loại kháng nguyên được kiểm tra chất lượng song song tại Viện Vệ 8ing Dịch Tễ Học, Hà nội, và Viện Vi Sinh Y Học và Miễn Dịch Học ,
Trang 173 KẾT QUẢ : 3.1 Hàm lượng "kháng nguyên LPS: Hàm lượng trung bình kháng nguyên LPS qua 12 loạt nuơi cấy đạt 640 đơn vị quốc tế 3.2 Hàm lượng trung bình kháng nguyên TCP qua 12 loạt nuơi cấy đạt hiệu giá †:2560 3.3 Hàm lượng trung bình kháng nguyên MSHA qua 12 loạt nuơi cấy đạt hiệu giá 1:4 4 BÀN LUẬN : e Ham lugng LPS trong vaexin nay cao hơn một chút so với tiêu chuẩn quốc tế ( 500 đơn vị) e Hàm lượng TCP trong văcxin này cao hơn nhiều lần so vơi tiêu chuẩn _ quốc tế (1:150) » Hàm lượng MSHA trong vắcxin này thấp hơn tiêu chuẩn quốc tế (1:8) 5 KẾT LUẬN :
Đã bổ xung được các kháng nguyên TCP và nâng cao được hàm lượng khang nguyén LPS Riêng MSHA cần phải tiêp tục nghiên cứu để đạt tiêu
Trang 18Phần thứ hai
SAN XUAT VẮCXIN TẢ Ở QUI MO BAN CƠNG NGHIỆP
I CƠ SỞ CỦA VẤN ĐỀ
Vắcxin tả đã được sản xuất ở qui mơ phịng thí nghiệm từ,vài năm nay, với
sản lượng khơng quá 150.000 liều/năm Số lượng~ này quá nhỏ, khơng đáp
ứng được nhu cầu sử dụng vắcxin dự phịng trong y tế cơng cộng, khơng
đủ ngay cả để tiến hành một thực địa lớn
Phương pháp nuơi cấy tĩnh ở phịng thí nghiệm khơng đạt một số yêu cầu
kỹ thuật của vắcxin này, nhất là việc sản xuất các kháng nguyên TCP và
MSHA cũng như việc tăng cường hàm lượng kháng nguyên LPS
Vĩ vậy, xây dựng một cơng nghệ sản xuất vắcxin này ở qui mơ bán cơng nghiệp, với thiết bị hiện cĩ, là cần thiết Cơng tác này được thực hiện tại Viện Vắcxin và các chế phẩm sinh học, Nha Trang-Đà lạt (11, 14)
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP:
2.1 các chủng ví khuẩn: -
« V.cholerae 01 589B cổ điển, Inaba
* V.cholerae 01 Cairo 50, cé điển, Ogawa
* V.cholerae 01 Phil 6973 EI Tor, Inaba
Các chủng nĩi trên nhận được từ Trường Đại hoc Goteborg, Thụy Điển
* « œ
2.2 Nuơi cấy:
Mơi trường IVAC và AKI (7, 14), nuơi cấy trên các mơi trường lên men CHEMAP dung tích 75 lít và 300 lít, ở các nhiệt độ khác nhau, trong các
Trang 19Sinh khối được bất hoạt bằng nhiệt (60°C/1 giờ) hoặc formalin 0,025 Múit 2.4 Kiểm tra:
« Kiểm tra nồng độ vi khuẩn bằng quang kế Spectronic - 20
« Kiểm tra kết quả bất hoạt trên các mơi trường Thạch máu, Pepton kiềm
và TCBS
«Kiểm tra tính an tồn bằng thí nghiệm tăng trọng chuột nhắt, theo thường
quy của TCYTTG `
» Kiểm tra các kháng nguyên LPS, TCP và MSHA, theo thường quy của Trường Đại Học Goteborg (8)
2.3.1 Phương pháp định lượng LPS cĩ trong vắc xin bằng kỹ thuật ELISA
cạnh tranh:
Gắn 100 ul LPS của V cholerae Inaba 569B vào các giếng của bản nhựa
polystyren số 1 với nồng độ 25 ug/ml pha trong PBS Để ở nhiệt độ phịng
qua đêm `
Trên bản nhựa số 2, sau khi ủ 30 phút với BSA 1% & 37°C, cho 60 ul BSA
1% pha trong PBS, sau đĩ cho 30 ul mau vắc xin thử vào giếng đầu tiên trong hàng Trộn đều và hút chuyển 30 ul sang giếng thứ hai, tiếp tục hút
chuyển pha lỗng bậc 3 cho tới hàng G của bản nhựa Riêng hàng H chỉ
cho đệm BSA-PBS 1% Sau đĩ, cho 60 ui vào mỗi giếng kháng thể đơn
ciơn từ chuột kháng LPS (Mab 8:4 880950) pha lỗng 1/160 trong BSA-
PBS 1% theo thứ tự đi từ hàng H trở lên Đập nắp kín vừa lắc vừa ủ 1 giờ ở
- nhiệt độ phịng Rửa bản số 1 ba lần với PBS Sau đĩ ủ bản này 200
Hl/giếng BSA-PBS 1% 37°C trong 30 phút Rửa 1 tần với PBS-Tween
0,05%
Ae ro
Chuyển 100 pl tu méi giéng của bản nhựa số 2 sang bản nhựa số 1, bắt đầu từ hàng H Ủ ở nhiệt độ phịng: 90 phút, khơng lắc Rửa 3 lần với PBS-
Tween Sau đĩ, cho 100 ul cộng hợp enzym lg peroxydaza kháng chuột (Jackson No 115 035068, lot 10538) pha lỗng1/2000 trong BSA-PBS 1%
Ủ 90 phút ở nhiệt độ phịng Rửa 3 lần vdi PBS - Tween
Cho 100 kì orthophenylen điamin pha trong đệm citrat natri 0,1M, pH 3,5 cĩ
Trang 20Titertex Multiskan bước sĩng 450 nm Kết quả dựa theo 50 % nồng độ bị ức
chế của kháng thể kháng LPS kháng lại LPS chuẩn Theo tiêu chuẩn quốc tế, một vắc xin cĩ chất lượng tốt cần cĩ nồng độ từ 500 - 1300 đơn vị (EU)
trong một liều
2.3.2 Phương pháp định lượng Tcp trong vắc xin bằng kỹ thuật ELISA cạnh
tranh:
Gắn vào bản nhựa 50 nl/giếng vi khuẩn tả cĩ Tcp [chủng JS 1569 (pJS 752-3) moc 6 mai trường AKI, 30°C] với nồng độ 10'° vi khuẩn/ml đã xử lý glutaraldehyd Sau đĩ, mỗi giếng được ủ BSA 1% pha trong PBS 30 phút, 37°C Sau khi rửa 3 lan vdi PBS - Tween, cho 25 ul mau vắc xin thử vào giếng đầu của hàng A, trộn đều và hút chuyển 25 ml sang hang thi hai và tiếp tục cho đến hàng G, riêng hàng H cho đệm Trộn đều và ủ ở nhiệt độ
phịng 90 phút Rửa 3 lần với PBS - Tween Cho kháng thể đơn clơn từ chuột (Mab Tc 20:2) pha lỗng 1/400 trong BSA-PBS 0,1% Ủ nhiệt độ phịng qua đêm Cho 100 uÍ cộng hợp enym phosphataza kiềm lgG+lgM (Jackson, West Grove, Pennsylvania), pha lỗng 1/3000 trong BSA-PBS-
_`_Tween Ủ 90 phút ở nhiệt độ phịng Sau khi rửa 3 lần như trên, cho cơ chất
nitrophenyl phosphat (Sigma, St Louis, Missouri) Doc két qua tran may
Titertex Multiskan, bước-sĩng 405 nm Kết quả dựa vào độ ức chế 50% của kháng thể kháng TCP với kháng nguyên chuẩn
Theo tiêu chuẩn quốc tế, một vắc xin cĩ chất lượng tốt phải cớ hàm lượng
TCP tối thiểu là 1:150
2.3.3 Phương pháp định lượng kháng nguyên MSHA trong vắc xin:
Vắc xin thử được pha lỗng bậc hai, 25 uÌ vắc xin vào mỗi giếng của bản
nhựa sau khi pha lỗng (từ 1/2 đến 1/1624 hoặc hơn) Sau đĩ, cho vào mỗi
giếng 25 uÍ hồng cầu 1% (chú ý: thử hồng cầu gà với chủng EI Tor, hồng cầu người với chủng tả cổ điển) Mỗi bản cĩ một giếng chỉ cĩ hồng cầu và đệm để làm chứng Sau đĩ, ủ bản ở nhiệt độ phịng từ 30 - 60 phút Kết quả dương tính khi hồng cầu bị tan đều trong giếng, âm tính khi hồng cầu lắng thành một điểm ở đáy giếng
Theo tiêu chuẩn quốc tế vắc xin tốt cĩ hàm lượng kháng nguyên MSHA từ
Trang 21Các loại kháng nguyên được kiểm tra chất lượng song song tại Viện Vệ
Sing Dịch Tễ Học, Hà nội, và Viện Vi Sinh Y Học và Miễn Dịch Học
Trương Đại học Goteborg, Thụy Điển 2
3 KET QUA
Dựa trên kết quả sản xuất của 7 loạt cĩ kết quả tốt nhất, cơng nghệ sản
Trang 243.2 Các thơng số thích hợp: - Tốc độ khuấy:600-700 vịng/phút - Thơng khí: 120-140 lít/phút - Nhiệt độ:35°C cho các chủng sinh LPS và MSHA 30°C cho các chủng sinh TCP
- Bất hoạt: nhiệt độ 60°C/1 giờ đối với chủng Cairo 50; formalin 0,025 MMit
đối với các chủng Phii 8973 và 5698 l
3.3 Kiểm tra nồng độ vi khuẩn:
Sau thời gian nuơi cấy theo số đo nĩi trên, các chủng V cholerae đạt trung bình 25-30 ti/ml
Kiém tra két qua bat hoat:
Các phương pháp bất hoạt bằng nhiệt độ và formalin đều đạt yêu cau Kiểm tra tính an tồn:
Các nhĩm chuột nhắt thí nghiệm đều đạt tỉ lệ tăng trọng 85-90% (tiêư
chuẩn tối thiểu của TCYTTG là 60%) Kiểm tra các kháng nguyên:
e Hiệu giá kháng nguyên LPS đạt trung bình 640 đơn vị quốc tế (tiêu chuẩn quốc tế là 500 đơn vị)
« Hiệu giá kháng nguyên TGQP đạt trung bình 1:570 đơn vị quốc tế (tiêu
chuẩn quốc tế là 1:150 đơn vị)
° Hiéu gia kháng nguyên MSHA đạt trung bình 1:4 đơn vi quốc tế (tiêu
Trang 254 BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN
Trên cơ sở.thiết bị sắn cĩ, đã xây dựng qui trình sản xuất vắcxin tả ở qui
Trang 26Phần thứ ba
NHẬN XÉT HIỆU LỰC BẢO VE CUA VĂCXIN TẢ ˆ TẠI THỰC ĐỊA HUẾ
_1 CƠ SỞ CỦA VẤN ĐỀ
Vắcxin chết tồn tế bào gồm Vibrio cholerae 01 týp sinh học cổ điển và EI Tor, gây miễn dịch bằng lối uống đã được thí nghiệm trên thực địa Bangladesh Kết quả sau 3 năm theo dõi thấy tỷ lệ bảo vệ là 52% (1) Vắcxin chế tạo tại nước ta cĩ bổ sung thêm kháng nguyên TCP, và tăng
Cường hàm lượng kháng nguyên LPS đã được thí nghiệm tại thực địa Huế Nhận xét sơ bộ về hiệu lực bảo vệ của văcxin này được ghi lại sau 1 năm theo dõi
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thực địa:
Thành phố Huế thuộc tỉnh Thừa Thiên - Huế ở miền Trung Việt Nam cĩ số
dân 266.000 người sống tại 23 xã phường Điều kiện khí hậu của Huế khá khắc nghiệt, mùa khơ trời nắng nĩng, nhiệt độ 38°C-39°C gây khơ hạn kéo dài, mùa mưa lụt bão liên miên, nhiều sơng ngịi, hồ ao làm cho tình trạng
ngập lụt nặng nê Chỉ cĩ khoảng 40% dân được dùng nudc-may do nhà
máy nước Huế cung cấp với số iượng khoảng 40lit/ngudi/ngay Dan co tap quán ăn hải sản nấu khơng chín và uống nước lã, nước đá, nước giải khát
Trang 27Năm Mắc/1 0.000 dan | Chét/mac (%) 1980 31,24 1,36 1983 27,14 1,30 1986 16,80 1,24 1990 8,04 0,00 1992 25,94 0,30 1993 31,08 0,23 Trung binh 6 vu dich " 23,37 0,57
Dịch thường kéo dài, tốc độ lây lan ra các huyện trong tồn tỉnh nhanh gây
nhiều thiệt hại và lo lắng trong nhân dân
Thanh phé Huế là vùng lưu hành dịch tả, cĩ số trường hợp mắc tâ trung bình qua các vụ dịch là 23,37/10.000 dan, thường chiếm gần 50% số trường hợp mắc tả trong tồn tỉnh Thừa thiên - Huế Hệ thống y tế xã,
phường cĩ bác sĩ làm việc, nhiều bệnh viện cĩ labo thuận tiện cho việc giám sát bệnh tả Dân cư sống khá tập trurig thuận tiện cho việc theo dõi và dễ dàng lựa chọn các hộ gia đình cho thử nghiệm Nhân dân và chính quyền địa phương sẵn sàng cộng tác thực hiện
Chọn mẫu:
Xác định cỡ mẫu: , “
Dựa vào tỷ lệ mắc trung bình của bệnh tả :trên 10.000 dân là 23%00, căn cứ hiệu lực vắcxin WC của kết quả nghiên cứu tại Bangladesh là trên 50% Cỡ mẫu được chọn giữa 2 nhĩm uống và khơng uống để tính hiệu lực
Trang 28Pc = 23/10.000 = 0,0028 (tý lệ mắc bệnh trong nhĩm khơng uống)
Pv = 12/10.000 = 0,0012 (ty lệ mắc bệnh trong nhĩm uống)
N [E.v2Pc (1- Pe) + 2B y Pv(1= Pv)+ Pe( - Pc) Ì ~ (Pv ~ Pcy [1,96y 2x0,0023(1 - 0,0023) + 1,645, 0,0012(1 — 0,0012) + 0,0023(1 - 0,0023) | N= — + (0.0012 - 0,0023)? N = 44.085 người cho mỗi nhĩm
Dựa vào phân độ mất nước của bệnh nhân tả năm 1992 ở tỉnh Thừa Thiên
- Huế (A=35%; B=40%; C=285%) để chọn: mẫu sư sánh độ trầm trọng của 2
Trang 29Vật liệu:
Vắcxin tồn tế bào bất hoạt do Viện Văcxin Nha Trang - Đà Lạt sản xuất, liều cho uống là 100 tỷ vi khuẩn V cholerae trong 1ml cho tất cả những người trên 1 tuổi trong nhĩm uống vắcxin, uống 2 liều cách nhau 14 ngày
Phương pháp nghiên cứu:
Một thực địa được lựa chọn để cho uống văcxin trong 19/23 phường, xã của thành phố Huế Các hộ gia đình được điều tra, lập danh sánh và vào sổ
theo dõi uống văcxin theo số thứ tự Hộ chấn được cho uống vắcxin, hộ lẻ khơng uống vắcxin (đối chứng)
18 xã phường của thành phố Huế được chọn để thử nghiệm hiệu lực của
vắcxin là: Vĩ Dạ, Hương Long, Phú Bình, Phú Hịa, Thuận Lộc, Phường Đức, Thủy Biều, Thủy Xuân, Xuân Phú, Trường An, Phước Vinh, Tây Lộc, Phú Thuận, Hương Sơ, Phù Cát, An Cựu, Thuận Thành, Thủy An, Vĩnh Ninh
Các nhĩm nghiên cứu:
« Nhĩm uống văcxin:67.395 người
Nhĩm khơng uống văcxin:67.058 người Tuổi uống vắcxin: từ 12 tháng trở lên
Liều gây miễn dịch: 100 tỷ vi khuẩn trong 1mi x 2 lần, cách nhau 14 ngày Cách cho uống vắcxin và giám sát:
* Số người trên 1 tuổi trong hộ chẵn được chọn uống 2 liều văcxin
cách nhau 14 ngày
Trang 30thành phố Huế, Bệnh viện Trung ương Huế để xét nghiệm tả, phân
lập týp huyết thanh
Số theo dõi uống vắcxin tả và các mẫu báo cáo về việc cho uống
vắcxin và giám sát bệnh nhân tiêu chảy tại xã, phường
Sổ khám bệnh tiêu chảy, phiếu theo dõi bệnh nhân tiêu chảy của
Chương trình Quốc gia phịng chống bệnh tiêu chây, bệnh án bệnh nhân tả của Sở Y tế Thừa Thiên Huế ban hành và phiếu trả lời
kết quả xét nghiệm vi sinh của Trung tâm Y tế dự phịng, Bệnh
viện thành phố Huế, Bệnh viện Trưng ương Huế
240 người tình nguyện được huấn luyện về cách cho uống vắcxin, theo dõi báo cáo bệnh nhân tiêu chảy để trạm y tế lấy mẫu gửi về
các labo xét nghiệm
Khoa VÌ sinh Dịch tễ, Viện Vệ sinh Dịch tễ học Hà Nội tập huấn kỹ
thuật thống nhất để chẩn đốn lâm sàng và xét nghiệm ví khuẩn tả cho các labo: Trung tâm Y tế Dự phịng, Bệnh viện thành phố Huế,
Bệnh viện Trung ương Huế `
Tính tỷ lệ mắc tả theo giới, theo nhĩm tuổi, theo tháng giữa nhĩm
uống và khơng uống vắcxin
Hiệu lực vắcxin tính theo cơng thức của WHO như sau:
Số trường hợp tả trong nhĩm khơng uống vãcxin
Tổng số người trong nhĩm khơng uống văcxin
Số trường hợp tả trong nhĩm uống văcxin 8
B=
Tổng số người trong nhĩm uống văcxin
Trang 31Thời điểm và nội dung cơng việc thực hiện: Tháng 10/1992 20/12/1992 3/1/1993 Tháng 1-12/1994 12/1994-6/1995
Tập huấn cho 240 người tình nguyện vê cách điều tra lập danh sánh hộ gia đình và kỹ thuật
cho uống vắcxin ta
Tổ chức cho uống vắcxin tâ lần 1 Tổ chức cho uống vắcxin tả lần 2
Giám sát bệnh nhân tiêu chảy tại phường, xã và
lấy mẫu xét nghiệm tả
Trang 32KẾT QUÁ THỬ NGHIỆM VĂCXIN TẢ UỐNG TẠI THỰC ĐỊA HUẾ
A TINH HINH CHUNG
I ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU:
1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo địa dư
Số người trong các hộ ¿hắn (nhĩm uống văcxin) là 67395 (50,1% người tham
gia), sơ người trong hộ lẻ (hhĩm khơng uống văcxin) là 67058 (49,9% người tham gia), được phân bố theo phường như sau:
Bảng 1 Phân bố người tham gia thử nghiệm và đối chứng theo phường
Trang 332 Phân bố người tham gia theo nhĩm tuổi
Đối tượng nghiên cứu được chia thành các nhĩm tuổi từ 1 đến 5, từ 6 đến 10, từ 11 đến 20, từ 21 đến 40 và trên 40 tuổi, theo các nghiên cứu về văcxin tả
đã thực hiện ở Bangiadesh và các nơi khác, và theo: các chuyên gia của Viện
nghiên cứu y tế quốc gia Mỹ
Ngồi ra, trong số theo dõi, cĩ một số người khơng cĩ thơng tin về tuổi, được xếp vào nhĩm tuổi “khơng rõ”
Bảng 2 Phân bố người tham gia nghiên cứu theo nhĩm tuổi Nhĩm H6 chan Hộ lẻ Cộng tuổi Số % theo Ì % trong | - Số % theo | % trong | Số người % người nhĩm ` hộ , người nhĩm hộlẻ | tuổi chan tudi 1-5 7192 50,5 10,7 | 7057 49,5 10,5 14249 10,6 6-10 8061 49,9 120| 8104| 50,1 12,1 16165 12,0 11-20 13795 50,3] 20,5] 13656| 497) 204 27451 20,4 21-40 22800 50,0 | 33,8 | 22759 50,0 33,9 45559 33,9 >40 14287} 50,0] 21,2; 14283] 50,.0| 21,3 28570 | 21,2 Khơng rõ 1260) 51,2 19Ị f199| 48,8 18 2459 1,8 Cộng 67395 50,1) 100,0 | 67058 49,99] 100,0] 134453 | 100,0
10 năm tuổi đầu tiên chiếm tỷ lệ cao (tổng cộng hai nhĩm 1-5 và 6-10 chiếm 22,6%), tỷ lệ của các nhĩm khác thấp hơn (nhĩm 10 năm tuổi thứ hai, từ 11-
20, chiếm 20,4%; nhĩm 20 năm tuổi, từ 21-40 chỉ chiếm cĩ 33,9%; và nhĩm
cuối cùng, tử 41 đến 102 chiếm 21,2%) Điều này phù hợp với hình thái số liệu của các tháp tuổi trong các cuộc tổng điều tra So với thành phần của hộ chắn (50,1% trong mẫu) và hộ lẻ (49,9% trong mẫu), phân bố hộ chẵn, lẻ trong từng khoảng tuổi khơng chênh lệch nhiều Sự khác biệt giữa phân bố
theo nhĩm tuổi của những người trong hộ chẵn và những người trong hộ lẻ
Trang 34
3 Phân bố người tham gia theo giới tính
Bảng 3 Phân bố người tham gia nghiên cứu theo giới tính
Giới Hộ chẵn Hộ lẻ Cộng
Số % theo | % trong Số % theo | % trong | Số người % người giới hộ người giới hộ lễ tính chan tinh Nữ 35173 50,1 52,2 | 35024 49,9 52,2 70197 52.2 Nam 32222 + 50,1 47,8 | 32034 49,9 47,8 64256 478 Cộng 67395 30,1 | 100,0 | 67058 49,9] 100,0| 134453 | 100,0
Phân bố giới tính của những người trong hộ chẵn và những người trong hộ lẻ hồn tồn như nhau (nữ 52,2%, nam 47,8% ở cả hai loại hộ) Số liệu này cũng phù hợp với số liệu của các cuộc tổng điều tra dân số
4 Độ lớn của hộ gia đình
Do cĩ nhiều người tình nguyện tham gia trong việc ghi chép SỐ sách, xác định hộ, điều này thường dẫn đến những sai số trong nghiên cứu, nên một số hộ được ghi nhận cĩ quá đơng người, như các nđhà lớn, tập thể lớp học, chùa chiền, tuy nhiên số lượng này chiếm khơng nhiều (63 hộ từ 20 người trở lên, chiếm 0,3% số hộ) Số người thường gặp trong các hộ là 4-6 người ở cả hai nhĩm chẩn, lả, khơng cĩ sự khác biệt lớn giữa độ lớn của các hộ chẵn và độ lớn của các hộ lẻ (Bảng 4)
~
5, Phân bố theo nguồn nước
Bang 5 Phân bĩ người nghiên cứu theo nguồn nước Nguồn H6 chan Hộ lễ Cộng
nước Sơ % theo | % trong Sơ % theo | % trong | Số người %
, người | Tnguồn hộ ”| ngứồi | nguồn | hộ lẻ
Trang 38Trong số theo dõi, nguồn nước của một số người tham gia khơng được ghi nhận, số này chiếm 3,6% tổng số đối tượng Đây cũng là điều thường xảy ra ở các nghiên cứu lớn
Nhìn chung phân bố theo các nguồn nước giếng, máy, nước sơng và các nguồn khác (hồ ao, nước phải mua từ nơi khác +} của hai nhĩm chẵn, lẻ tương đối đồng nhất, cĩ sự khác biệt xây ra trong số những người dùng nước mưa của hệ chan va hộ lẻ Tuy nhiên, nếu thay đổi phân loại khác một chút, thay vì phân thành 4 nhĩm dùng nước giếng, máy, mưa, sơng và khác, sẽ phân theo nguồn nước sạch (nước máy, nước mưa) và nguồn nước khơng sạch (nước sơng, nước khác và nước giếng, ở đây giếng thường khơng đảm bảo vệ sinh), thì sẽ thấy sự đồng nhất giữa nhĩm hộ chẵn và nhĩm hộ lẻ (47240 người/65097 so với 46840/64565, p=0,9356)
Những chỉ số trên cho thấy sự đồng nhất giữa nhĩm thử nghiệm - được uống văcxin, và nhĩm đối chứng - khơng uống văcxin
II TINH HINH UỐNG VACXIN
1 Tinh hinh uéng vaexin trên thực địa
Bảng 6 Tỉnh hình uống văcxin trong các nhĩm nghiên cứu Số liều Ha chan Hộ lẻ Cộng Số người | % trong | Số người | % trong | Số người % hé chan hộ lễ 0 10771 16,0 65530 97,7 76301 56,7 1 4462 6,6 101 0,2 4563 3,4 2 52162 77,4 1427| 2 53589 39,9 Cộng 67395 100,0 67058 100,0| 134453 100,0
Theo nguyên tắc, tất cả mọi người trên 1 tuổi ở các hộ chẵn phải được uống hai liều văcxin cách nhau 14 ngày, và tất cả mọi người ở hộ lẻ khơng uống văcxin Tuy nhiên, ở một nghiên cứu cĩ quy mơ lớn như vậy, với lượng người tham gia trên thực địa lớn (240 người tình nguyện), khơng tránh khỏi những Sai sĩt xảy ra
Trang 39một liều văcxin Do đĩ để tránh sai số khi phân tích, kết quả sẽ được tính trên mẫu số là tất cả những người trong hộ chẵn và tất cả những người trong hộ lễ 2 Khoảng cách giữa hai liều văcxin
Bảng 7 Khoảng cách giữa hai lần uống vaexin
(ghi chú: khơng tính những người ngày uống ghi khơng rõ ràng) Số ngày Số người Tỷ lệ % 10 29 0,1 11 186 0,3 12 903 1,7 13 2064 3,9 14 7286 13,6 15 28608 53,6 16 8837 16,6 17 3698 6,9 18 1129 2,1 19 450 0,8 20- 167 0,8 21 37 0,1 - Cộng 53394 100,0
Thời gian bắt đầu của hai đợt cho uống vaexin duge thiét ké cach nhau hai tuần, mỗi đợt kéo dài 7 ngày Theo quy định, liễu 2 cách liều 1 hai tuần Trên thực tế, trong số những người uống đủ hai liều, khoảng cách gần nhất là 10 ngày, xa nhất là 21 ngày; Quá nửa số người uống với khoảng cách là 15 ngày Số người uống với khoảng cách tử 13-18 ngày chiếm 94,6% Số cịn lại, 5,4%, cĩ khoảng cách dưới 13 ngày hoặc trên 18 ngày, đối với văcxin tả uống, những khoảng cách này là chấp nhận được, nhưng đối với loại văcxin khác địi hỏi khoảng cách nghiêm ngặt thì cần chú ý đến việc bế trí lịch cho
thich hop = - B KET QUA NGHIEN CUU
Trang 401 TÌNH HÌNH BỆNH TẢ LÂM SÀNG
1 Phân bố bệnh nhân tả lâm sảng theo tuần
Bảng 8 Phân bố bệnh nhân tả lâm sàng theo tuần Tuần Hộ chẵn Hộ lẻ Cộng thứ Số người | % trong | Số người | % trong | Số người % hé chan hd id 34 2 2,1 4 1,2 6 1,4 35 12 12,4 26 8,0 33° 9,0 36 23 23,7 91 279 114 27,0 37 27 27,8 88 27,0 115 27,2 38 20 20,6 70 21,5 30 21,3 39 7 9 9,3 32 9,8 41 9,7 40 4 41 15 4.6 19° 45 Céng 97 100,0 326 100,0 423 100,0
Trong cả hai nhĩm hộ chấn và lẻ, bệnh tả đều xảy ra từ tuần 34 đến tuần 40, cùng với tỷ lệ cao vào các tuần 36, 37, 38 Sự khác biệt của phân bố bệnh
nhân theo thời gian giữa hộ chẵn và hộ lẻ khơng cĩ ý nghĩa thống kê (p=
0,8605)
2 Phân bố bệnh nhân tả lâm sàng theo giới
Trong số các bệnh nhân của nhĩm hộ chẵn, nữ chiếm 55,7% (54/973, của
nhĩm hộ lẻ nữ chiếm 52,8% (172/326), sự khác biệt này chưa cĩ ý nghĩa
thống kê (p=0,6977)
3 Phân bố bệnh nhân theo nhĩm tuổi