Giới thiệu enzyme α-Amylase

Enzyme là chất xúc tác sinh học được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống, đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm nó đóng một vai trò quan trọng trong quy trình chế biến.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐH KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC   α- Amylase GVHD: Ts. Nguyễn Hoài Hương NHÓM SVTH: 1.Nguyễn Phan Ngọc Tuyền 2.Trần Lê Hà Tuyên 3.Lương Ngọc Tuấn Anh 4.Đặng Quang Trường 5. Lê Hoàng Đoan Trang -2011- Mục lục Trang 1. Giới thiệu enzyme α-Amylase 1 1.1 Giới thiệu: 1 1.2 Đặc tính của enzyme α-Amylase .1 1.3 Cơ chế tác dụng của enzyme α-Amylase .2 2. Sản xuất enzyme α-Amylase từ Aspergillus oryzae .2 3. Sơ đồ sản xuất .3 4. Thuyết minh quy trình .4 4.1 Các ảnh hưởng đến chất lượng enzyme 4 4.1.1 Ảnh hưởng các nguồn Nito dinh dưỡng 4 4.1.2 Ảnh hưởng của amino acid .5 4.1.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng .5 4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men .6 4.2.1 Độ ẩm (w) môi trường 6 4.2.2 Độ ẩm tương đối của không khí 6 4.2.3 Ảnh hưởng của không khí .6 4.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 6 4.2.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi nấm mốc .6 4.2.6 Ảnh hưởng của pH 6 5. Phương pháp xác định hoạt tính .7 6. Ứng dụng enzyme α-Amylase trong sản xuất bia .7 Tài liệu tham khảo Chương I: Mở đầu 1. Giới thiệu : Enzyme là chất xúc tác sinh học được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống, đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm nó đóng một vai trò quan trọng trong quy trình chế biến. Một số quy trình nếu thiếu enzyme thì không thể tiếp tục được. Ở Việt Nam, công nghệ enzyme chưa phát triển. các nghiên cứu có đề cập đến hầu hết các loại enzyme của động vật, thực vật và VSV, nhưng chưa có enzyme nào được sản xuất theo quy mô công nghiệp. Nước ta vẫn hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn enzyme từ nước ngoài, các loại enzyme đang sử dụng nhiều trong nước là các enzyme của hãng NOVO Đan Mạch. Vì vậy, việc hiểu biết, nghiên cứu, phát triển sản xuất enzyme trong nước là việc rất cần thiết và là 1 ngành công nghiệp đầy tiềm năng. Amylase là 1 trong những enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp thực phẩm, hiện nay nó được sản xuất chủ yếu từ vi sinh vật do có nhiều ưu điểm: tốc độ sinh sản của VSV rất mạnh, enzyme thu nhận từ VSV có hoạt tính rất cao, VSV là giới sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp và nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm. 2. Cơ sở chọn đề tài : Chủng VSV đề nghị sử dụng ở đây là Aspegillus oryzae vì các đặc điểm sau: - Đây là 1 loại nấm mốc rất dễ phát triển trên cơ chất có tinh bột. - Nguyên liệu dùng cho quá trình nuôi mốc đơn giản, dễ kiếm phù hợp với điều kiện của nước ta. - Phương pháp nuôi mốc được sử dụng ở đây là nuôi cấy trên môi trường đặc. Chương II: Tổng quan 1. Giới thiệu enzyme α- Amylase (1,4-α-glucan 4-glucanhydrolase) 1.1. Giới thiệu: - có khả năng cắt các liên kết α-1,4-glucoside của cơ chất một cách ngẫu nhiên - là enzyme nội bào (endoenzyme) - Không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy cả hạt tinh bột nguyên vẹn Cấu trúc không gian của enzyme α-Amylase 1.2. Đặc tính của enzyme α-Amylase: -Trọng lượng phân tử trung bình từ 40000 – 60000 Da. -Bền nhiệt hơn so với các loại enzyme khác (do có ion Ca 2+ giữ vai trò ổn định cấu trúc bậc ba của phân tử enzyme) -Bị kiềm hãm bởi các ion kim loại nặng Cu 2+ , Pb 2+ , Hg 2+ . Các ion Mn 2+ ,Na + ,Mg 2+ không ảnh hưởng đến hoạt tính. -Có thể thu nhận nấm mốc, vi khuẩn, thực vật, mầm lúa -Thường thể hiện hoạt tính trong vùng acid yếu Ví dụ: α-amylase của nấm mốc hoạt động ở pH 4,5 - 5,8 α-amylase của vi khuẩn hoạt động ở pH 5,8 – 6,1 α-amylase của đại mạch hoạt động ở pH 4,7 -5,4 -Những chủng VSV có khả năng sinh tổng hợp α-amylase có ý nghĩa công nghiệp: B.subtilis, B.licheniformis, A.oryzae. 1.3 Cơ chế tác dụng của enzyme α-Amylase: α-amylase ( 1,4-α-glucan-glucanhydrolase ) từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất ( tinh bột hoặc glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc đột rất chậm. Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn. + Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ):Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh ( các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh ). + Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose( vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6-7 gốc glucopiranose 1 ). + Sau đó, các poliglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên ( 72% maltose và 19% glucose ) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%. Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. 2. Nấm mốc Aspergyllus oryzae : - Là một loại vi nấm thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes. - Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngăn , chia sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào ). Từ những sợi nằm ngang này hình thành những sợi đứng thằng gọi là cuống đính bào tử, ở đó có cơ quan sinh sản vô tính. Cuống đính bào tử của Aspergyllus oryzae thường dài 1-2 mm nên có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Phía đầu cuống đính bào tử phồng lên gọi là bọng. Từ bọng này phân chia thành những tế bào nhỏ, thuôn, dài, gọi là những tế bào hình chai. Ðầu các tế bào hình chai phân chia thành những bào tử đính vào nhau, nên gọi là đính bào tử. Ðính bào tử của Asp.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau… - Đặc điểm của giống Aspergyllus oryzae là giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào ( amylase, protease, pectinasa,… ), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen ,vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới. Chương III: Quy trình công nghệ sản xuất enzyme α- amylase từ Aspergyllus oryzae 1. Bảo quản giống Aspergyllus oryzae: -Cho cát vào ống nghiệm, tiệt trùng trong autoclave 130 o C trong 30 phút. -Trộn bào tử vào cát. -Sấy chân không < 40 o C (độ ẩm 5%). -Dùng parafin rắn đun chảy và đổ lên nút bông. -Thời gian bảo quản: 1 năm hoặc hơn. 2. Nguyên liệu : -Nguồn tinh bột: cám gạo: chứa khoảng 20% tinh bột, 10–15% chất béo, 10-14% protein, 8-16% cellulose, các chất hoà tan không chứa nitơ 37-59%. -Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20-30%, không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%. -Các phụ phẩm thêm vào để tăng độ thoáng khí cho môi trường nuôi cấy: trấu, mạt cưa… 3. Sơ đồ công nghệ: NGUYÊN LIỆU XỬ LÝ THANH TRÙNG LÀM NGUỘI PHỐI TRỘN THU NHẬN ENZYME THÔ NUÔI CẤY GIỐNG VSV SẤY NGHIỀN MỊN TRÍCH LY LỌC KẾT TỦA EYME THU NHẬN ENZYME THÔ SẮC KÝ SẤY THÀNH PHẨM BAO GÓI 4. Thuyết minh quy trình: -Xử lý nguyên liệu: cám gạo, trấu và mạt cưa được xử lý để loại bỏ các tạp chất. Trấu cho vào với tỉ lệ 20-25% so với khối lượng cám gạo. -Thanh trùng: Nhiệt độ thanh trùng là 95 o C trong 60 phút. Đồng thời phải thanh trùng khay lên men. -Rải nguyên liệu lên khay có kích thước 2x3 m, độ dày 2-3 cm, dùng 3kg môi trường/khay. -Sau khi làm nguội, tiến hành cấy mốc giống với nồng độ 5-10% so với khối lượng của môi trường ở mỗi khay. -Đưa khay lên các giá đỡ -Nhiệt độ phòng nuôi cấy được giữ ở 25-30 o C, độ ẩm 60-65%, đồng thời phải thoáng khí. -Đến khoảng 30-32 giờ sau khi cấy giống, ta thu nhận enzyme thô. Cần thu nhận enzyme thô vào thời điểm trước khi nấm sinh bào tử vì khi nấm sinh bào tử là lúc quá trình tổng hợp enzyme đa yếu đi. Do đó cần một bước nuôi cấy thử nghiệm để xác định thời điểm thu nhận enzyme thô. Chế phẩm enzyme thô thu được chứa tế bào nấm, cơ chất, nước và enzyme -Để giữ hoạt tính của enzyme, sấy chế phẩm thô này ở nhiệt độ 30-40 o C, độ ẩm sau sấy là 10%. -Nghiền mịn: chế phẩm enzyme thô được nghiền với cát và bột thạch anh. Cát và bột thạch anh được rửa sạch, sấy khô trước. -Trích ly: sau khi nghiền, dùng nước để trích ly. Cứ 1l enzym thô, cho 4-5l nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch. -Lọc: dịch sau trích ly lọc bằng lọc tiếp tuyến. -Kết tủa enzyme: kết tủa được thực hiện bằng ethanol phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzym.Khi đổ chất làm kết tủa enzym vào dung dịch enzym thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính. Nhiệt độ từ 3-10 o C và dùng 2 l ethanol cho 1 l enzyme. -Enzyme thu được là 1 hỗn hợp nhiều enzyme khác nhau như: amylase, proteinase, cellulase… Do đó, phải tiến hành sắc ký lọc gel để thu được enzyme amylase. Gel sử dụng là Sephadex G200. -Sấy: sản phẩm sau sắc ký được sấy ở nhiệt độ 30-40 o C để bảo đảm hoạt tính cho enzyme, độ ẩm sản phẩm là 5%. 5. Ưu và nhược điểm của phương pháp này: 5.1. Ưu điểm: Quy trình công nghệ thường không phức tạp. Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm. - Chế phẩm enzyme thô ( bao gồm thành phần môi trường sinh khối VSV, enzyme và nước ). Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản. - Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém. - Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, rất dễ xử lý. Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. 5.2. Nhược điểm: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy. Trong phương pháp này VSV phát triển trên bề mặt môi trường nên cần nhiều diện tích. 6. Các ảnh hưởng đến chất lượng enzyme: 6.1. Ảnh hưởng các nguồn Nito dinh dưỡng: Nguồn dinh dưỡng Nito hết sức quan trọng. Khi chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để nuôi nấm mốc Asp.oryxae để tạo enzym α-amylase, người ta dùng muối vô cơ Natri Nitrat là nguồn Nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi tạo α-amylase. Hàm lượng thường dùng là 0.91% Natri Nitrat và Amoni Nitrat có hiệu quả hơn so với các muối khác( Kali Nitrat, Magie Nitrat, Amoni Sunfat…) Cho nguồn Nito nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác Nguồn Nito Liều lượng muối, % theo N Hoạt động enzyme sau 6 ngày nuôi đối với 100ml α-amylase Glucomylase NaNO 3 0.3 145 8000 NaNO 3 0.15 26 3300 (NH 4 ) 2 SO 2 0.15 - - NH 4 NO 3 0.15 98 4100 NH 4 NO 3 0.3 45 4900 NH 4 H 2 PO 4 0.3 5.5 8000 Bảng ảnh hưởng của nguồn Nito tới sinh tổng hợp các enzyme amylase 6.2. Ảnh hưởng của amino acid: - Amino acid có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon, nguồn nito vừa là nguồn năng lượng. - Một số amino acid riêng rẻ (glutamic acid, aspatic acid .) đóng vai trò vô cùng quan trọng trong trao đổi amino acid, cụ thể là sinh tổng hợp nhiều amino acid khác trong quá trình chuyển amine hóa. - Nhiều amino acid tham gia vào thành phần của các vitamin tan trong nước như: pantotenic acid, biotin, folic acid,…các vitamin này có ý nghĩa sinh học rất lớn. Ngoài ra sự tổng hợp ARN trong tế bào một số vi sinh vật phụ thuộc vào sự có mặt của amino acid trong môi trường nuôi. - Amino acid có tính đặc hiệu của sự cảm ứng và kiềm chế sinh tổng hợp enzyme. Một số amino acid kích thích và làm tăng cường sinh tổng hợp các enzyme amylase, một số lại có tác dụng ức chế ngược và một số khác thì không có ảnh hưởng gì cả 6.3. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: - Mg 2+ có ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzyme. Thiếu MgSO 4 sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp mọi amylase bởi nấm sợi. khi đó sự tổng hợp α-amylase bị ức chế hoàn toàn. Nồng độ tối ưu của muối này cho tổng hợp α-amylase là 0.05%. - Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất (nucleic phospholipide acid) và nhiều coenzyme, đồng thời đề phosphoryl hóa glucide trong quá trình oxy hóa sinh học. phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi, do vậy mà tăng cường tổng hợp enzyme. Các muối phospho thường được dùng với nồng độ cao tới 0.15M. Hoạt độ của α-amylase tăng cao khi có 0.1% KH 2 PO 4 . - Canxi cần cho tổng hợp và ổn định α-amylase hoạt độ vì nó là cấu tử không thể thiếu của enzyme này. Canxi còn có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác dụng của protease. Muốn tích lũy nhiều α-amylase cần có lượng Ca trong môi trường là 0.01- 0.05%. - Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylase. Lưu huỳnh với hàm lượng 0.04g/ml môi trường là sự thích hợp nhất. Ngoài các yếu tố đa lượng cần chú ý tới các yếu tố vi lượng. Chẳng hạn: coban, kẽm…và các yếu tố gây ức chế sự tổng hợp enzyme amylase như: đồng, thủy ngân, … 7. Các yếu tối ảnh hưởng đến quá trình lên men: 7.1. Độ ẩm môi trường: Tốt nhất cho sự hình thành enzyme của nấm mốc Asp.oryzae là 55-60%. Độ ẩm môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử là khoảng 45% nên cần giữ cho độ ẩm môi trường không bị giảm trong quá trình phát triển. Ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-amylase của Asp.oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt: Phương án thí nghiệm 20 giờ 34 giờ 42 giờ Độ ẩm % Hoạt độ amylase với canh trường khô Độ ẩm % Hoạt độ amylase với canh trường khô Độ ẩm % Hoạt độ amylase với canh trường khô Khay để hở 27.8 15.0 23.8 18.0 22.0 20.5 Khay đậy nắp 46.4 20.4 42.4 32.9 42.4 36.7 Bảng: ảnh hưởng của việc giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-amylase cùa Asp.oryzae nuôi bằng phương pháp bề mặt Điều này cần sự cần thiết phải giữ ẩm cho môi trường ở mức độ tối thích. Cần thông khí liên tục trong suốt thời kì sinh trưởng của nấm mốc và còn phụ thuộc vào kích thước, chiều dày của lớp môi trường nuôi. 7.2. Độ ẩm tương đối của không khí: Độ ẩm cho phép từ 80% trở lên đến mức bão hòa tức là 100% W đều thích hợp cho nấm mốc phát triển. trong phòng nuôi cần giữ cho độ ẩm không khí bão hòa để tránh cho môi trường khỏi bị khô. [...]... - Cơ chất của α-amylase là tinh bột và destrin, sản phẩm tạo ra là maltose và các destrin mạch ngắn Enzyme này hoạt động tối ưu ở pHopt = 5.8, topt = 72 – 76 C - Xác định hoạt tính α-amylase bằng phương pháp Smith and roe: Nguyên tắc: Hoạt tính α-Amylase biểu thị khẳ năng của enzyme amylase xúc tác thủy phân tình bột đến dextrin trong 1 phút ở 50oC và được thể hiện bằng số đơn vị của enzyme trong 1g... phân tinh bột Chương IV Kết luận: Tóm lại, có thể nói rằng, việc nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm enzyme ngày càng được chú trọng ở các lĩnh vực khác nhau Trong 20 năm cuối thế kỷ XX và các năm đầu của thế kỷ XXI các enzyme khác nhau đã được ứng dụng Ở Việt Nam bước đầu đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các enzyme trong chế biến nông sản, thực phẩm, nhất là trong lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh... phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa được thủy phân sẽ tạo phản ứng màu với iod và được so màu bằng máy so màu quang học ở bước sóng 620nm - Đơn vị đo hoạt tính: 9 Ứng dụng enzyme α-Amylase trong sản xuất bia: Trong công nghệ sản xuất bia truyền thống, các nước phương Tây chủ yếu sử dụng enzym amylase của malt để thủy phân tinh bột trong malt, sau đó đến giai đoạn rượu hóa bởi... trong không khí đạt 8% 7.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng của chủng nấm mốc này và sự tạo thành các enzyme amylase Nhiệt đọ thích hợp cho sự phát triển và hình thành enzyme là 28-32oC Nhiệt độ do nấm mốc tỏa ra môi trường có thể nóng lên 40oC hoặc hơn Do vậy cần gữi cho nhiệt độ môi trường không xuống dưới 27oC và không cao hơn 36oC... sản, thực phẩm, nhất là trong lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh bột (Viện công nghiệp thực phẩm, Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội…) Việc nghiên cứu các enzyme phục vụ nông nghiệp, công nghiệp cũng được quan tâm và có các kết quả đáng khích lệ Tài liệu tham khảo 1 Nguyễn Đức Lượng và một số tác giả, Công nghệ enzym, NXB Đại học quốc gia Tp.HCM, 2004 2