Quá trình tổng hợp L-dopa gồm 4 bước sau: Ester hóa L-tyrosinl thu được L-tyrosỉn methyl ester 9, acyl hóa 9 trong pyridìn thu được 0,N-dỉacyl-L-tyrosin methyl ester 10, thực hiện phản ứ
Trang 1NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP L-DOPA LÀM THUÓC
ĐIÈU TRỊ PARKINSON
Vũ Đức Hoàn*' Phạm Thị Hiền^ HDKH; PGS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu^
PGS.TS Nguyễn Đình Luyện^
'Abbott laboratories.
^Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia - Trường Đại học Dược Hà Nội
Từ khóa: 3,4-dihydroxyphenyl-L-alanin, L-dopa, levodopa, L-íyrosin, parkinson Tóm tắt
L-dopa là thuổc chủ yếu được dung trong điều trị bệnh Parkinson Hiện nay L-dopa vẫn nằm trong nhóm thuốc chưa được sản xuất trong nước Mục tiêu của nghiên cứu là tổng hợp được L-dopa từ L-tyrosin đạt tiêu chuấn về hàm lượng theo Dược điển Anh 2009 Quá trình tổng hợp L-dopa gồm 4 bước sau: Ester hóa L-tyrosin(l) thu được L-tyrosỉn methyl ester (9), acyl hóa (9) trong pyridìn thu được 0,N-dỉacyl-L-tyrosin methyl ester (10), thực hiện phản ứng chuyển vị (10) với xúc tác AlClỉ trong nitrobenzen thu được (3-acetyl-4- hydroxyphenyl)-N-acetyl-L-alanin (11), thực hiện phản ứng oxy hóa và thủy phân (11) thu được L-dopa cẩu trúc của sản phẩm và các chất trung gian được xác định bằng phương pháp đo phổ ^H-NMR, MS, IR.
Đặt vấn đề
Bệnh Parkinson là bệnh lý thoái hóa thần kinh trung ương thường gặp ở bệnh nhân trên 60 tuổi Bệnh gây ra do sự mất các nơron trong chất đen ở thân não, các nơron này chứa các chất dẫn ưuyền thần kinh là dopamin Nguyên nhân: độc chất, môi trường L-dopa là tiền chất được chuyển hóa thành dopamin nhờ enzym dopa-decarboxylase ở Việt Nam L-dopa vẫn được coi là thuốc chủ chốt trong điều trị Parkinson Do đó nhu cầu sử dụng L-dopa rất cao Tuy nhiên, các doanh nghiệp trong nước vẫn chưa thể sản xuất được L-dopa Nhóm nghiên cứu
đã tiến hành tổng hợp L-dopa từ L-tyrosin (một sản phẩm thu được từ quá trình thủy phân các nguồn keratin khác nhau; sừng, tóc, móng ) Đó là nguồn nguyên liệu có sẵn ở Việt Nam
Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu: L-tyrosin là sản phẩm của quá trình thủy phân các nguồn keratin
khác nhau (lông, sừng, tóc, móng )
Hóa chất: Aceton, acid hydrocloric, acid sunfuric, ethanol tuyệt đối, ether dầu
hỏa, ethyl acetat, methanol, natri hydroxid, ninhydrin, pyridin (tinh khiết hóa học
- Trung Quốc), anhydrid acetic, hydro peroxid, natri carbonat klian, nhôm clorid
Trang 2khan, nitrobenzen (Merck-Đức), giấy chỉ thị màu, nước cất (Tiêu chuẩn cơ sở - Việt Nam)
Phương pháp nghiên cứu
Tổng hợp L-dopa từ L-tyrorin qua 4 giai đoạn như sơ đồ sau [1, 2, 5]:
,C O O H
MeOHmzSq^
70-80°C /12h
H O
C O O M e
A c ị O / p y rid in
l0 -4 0 “C /4h A cO
,C O O H
H C I/C H 3 C O O H - H O
C O O H
HjOî/NaOH
( 10 )
A lC lj/n itro b e n zen
100 - 125°C/4-6h
CO O H
H O
N H A c
C O M e
- Sử dụng các phương pháp hóa học, vật lý, hóa lý để tinh chế và thu lấy các chất trung gian và sản phẩm
- Theo dõi phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc ký lóp mỏng (bản mỏng silicagel GF254 với hệ dung môi n-butanol: acid acetic: nước
= 9:2:2,5)
- Xác định cấu trúc các chất trung gian và sản phẩm bằng phương pháp
đo phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy Perkin Elmer (Mỹ) Phổ khối lượng (MS) được ghi trên máy máy Agilent 6310 lon Trap (Đức) Phổ khối lượng phân giải cao được ghi trên máy FT-ICR-MS-Varian 910MS (Đức) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ('H-NMR) được ghi trên máy được ghi trên máy Bruker AV-500 (Mỹ)
- Kiểm tra hàm lượng L-dopa theo tiêu chuẩn Dược điển Anh 2009 Kết quả
Tổng họp L-dopa từ L-tyrosin
Tông hợp L-tyrosin methyl ester (9)
Thực hiện phản ứng ester hóa với 15g (0,083 mol) L-tyrosin với 400 ml methanol, xúc tác acid H2S0 4đặc Hỗn hợp phản ứng được hồi lưu trong 12 giờ Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lóp mỏng Phản ứng kết thúc, hỗn họp phản ứng được làm mát ở nhiệt độ phòng, cất thu hồi dung môi Phần còn lại được hòa tan trong nước, điều chỉnh pH về 8-9 bằng dung dịch NaaCOa bão hòa, xuất hiện tủa Lọc thu được tủa thô 9 Tinh chế tủa thô 9: hòa tan trong dung dịch HCl IM, làm lạnh và điều chỉnh pH 8-9 bằng dung dịch Na2CƠ3 bão hòa, xuất hiện tủa Lọc, rửa sản phẩm thu được 10,86g (2) H=67,2%
Sản phẩm; Nhiệt độ nóng chảy 134-136°c, Rf=0,45, IR (KBr, cm“'): 3208
(-NH2), 3100-3010 (-CHthơm), 2833 (H3C-), 1731 (-C=0 ester)
Trang 3Tổng hợp o, N-diacetyl-L-tyrosin methyl ester (10)
Lấy 18,0 ml pyridin cho vào bình cầu 2 cổ dung tích 100 ml Nghiền nhỏ
5,85g 9 (30,0 mmol) cho vào dung môi đã chuẩn bị ở trên Sau đó nhỏ từ từ 8,5
ml anhydrid acetic (90,0 mmol) vào hỗn hợp trên cho đến khi nguyên liệu 9 tan
hết sao cho nhiệt độ không quá 25°c Khuấy tiếp khối phản ứng ở nhiệt độ này trong 5 giờ Khi phản ứng kết thúc, thêm vào hỗn hợp phản ứng 100,0 ml ethyl acetat Khuấy rồi chiết với dung dịch HCl IM (3 lần, mỗi lần 70,0 ml) để loại pyridin Cuối cùng, rửa bằng nước thu được pha hữu cơ chứa sản phẩm Làm khan bằng 10,0g natri Sulfat khan Sau đó, cất thu hồi dung môi đến khi thu được dạng siro Thêm 10 ml ethylacetat và khuấy cho tan hoàn toàn, sau đó thêm 10
ml ether dầu hỏa, khuấy thu được kết tủa Lọc, sấy thu được 6,2g tủa thô 10
Tủa thô 10 được tinh chế như sau: Hòa tan hoàn toàn 6,2g tủa thô 10 trong
50 ml ethanol 50% sôi, khuấy 15 phút, sau đó làm lạnh Để kết tinh lạnh qua đêm, xuất hiện tinh thể màu trắng Lọc, sẩy tới khối lượng không đổi thu được 4,2g 10 tinh khiết
Sản phẩm 10: Nhiệt độ nóng chảy 105-107°c, Rf=0,88, IR (KBr, cm’’):
3256 (-NH -amid), 1745 (-C=0 ester), 1633 (-C=0 amid), 1558 (-C=C- thơm), ESI - MS (m/z): 301,6 ([M+Na]-")
Tổng hợpß-(3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N-acetyl-L-alanin
Cho vào bình cầu 1 cổ, dung tích 100 ml: 3,0g (10,75 mmol) nguyên liệu
10 và 36,0 ml nitrobenzen Khuấy cho tan hết Sau đó, thêm vào bình cầu 3,6g (26,96 mmol) AICI3 khan, hỗn họp được đun trong khoảng 4 giờ ở nhiệt độ 100- 130T
Hỗn họp phản ứng được làm lạnh, thêm 60,0 ml nước đá Khuấy trong 15 phút tạo hỗn dịch Thêm tiếp 6,0 ml HCl đặc Khuấy trong 30 phút Chiết hỗn hợp 2 lần bằng ethyl acetat (lần 1 với 100,0 ml, lần 2 với 70,0 ml) Thu lẩy dịch chiết pha hữu cơ Chiết pha hữu cơ bằng NaOH 2N hai lần (lần 1 11,0 ml, lần 2 3,0 ml) Thu lấy dịch chiết pha nước Loại nitrobenzen còn lẫn trong pha nước bằng 30,0 ethyl acetat Sau đó pha nước được làm lạnh về 5°c và được điều chỉnh về pH 1 bằng HCl đặc Để lạnh 2 giờ, 11 bắt đầu kểt tinh Lọc, rửa với
nước lạnh thu được tủa 11 sấy khô tủa thu được l,25g hợp chất 11 Hiệu suất
43,87%
Sản phẩm 11: nhiệt độ nóng chảy 146-148°c, Rf=0.61; IR (KBr, cm''):
3355 (-NH-amid), 1726 (-C=0 ester), 1641 (-C=0 amid), 1554 (-C=C- thơm), ESI-MS (m/z): 263,9 ([M-H]') ’H-NMR (500 MHz, DMSO) ô (ppm): 11,82 (IH, s, HO), 8,19 (IH, d (J = 8,0), HN), 7,75 (IH, d (J = 2,0), H Q.), 7,39 (IH,
dd (J = 8,0, 2,0), H-Cß.), 6,87 (IH, d (J = 7, 5), H -C 5 O , 4,39 (IH, m, HC
Trang 4-COOH), 3,02 (IH, dd (J = 13,5, 4,5), Hb-Ca), 2,82 (IH, m, Ha-Cj), 2,62 (3H, s, HjC-CO-Ar), 1,78 (3H, s, H3C-CO-NH)
Tổng hợp L-dopa
Hòa tan 1,5g (5,66 mmol) nguyên liệu 11 trong 13,0 ml dung dịch NaOH
IN Thêm từ từ dung dịch H2O2 7,1% Phản ứng được duy trì ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Hỗn họp phản ứng được acid hóa bằng 2,16 ml dd HCl IN, sau đó được cất đến kiệt Chất rắn được hoà tan với aceton nóng, phần muối vô cơ không tan được lọc qua phễu lọc thủy tinh Dịch lọc được cất đến kiệt một lần nữa thu được tủa thô 1 2
Hợp chất 12 được hòa tan trong 12,0 ml hỗn hợp HCl đặc và acid acetic
băng với tỷ lệ thể tích CH3COOH băng/HCl đặc = 2/1 Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu ở 118°c trong vòng 2 giờ cất loại bỏ bớt acid và thêm 1 0 phần nước sôi Dung dịch được thêm 0,1 g NaaSaOs và 0,3g than hoạt để tẩy màu trong vòng
30 phút Lọc loại bỏ than hoạt, dịch lọc được làm lạnh ở 0°c và đưa về pH 5,5
bằng dung dịch NaOH 2N thu được 1 Tủa thô 1 được lọc và rửa sạch với nước
lạnh, sau đó với aceton Sản phẩm được sấy khô trong chân không đến nhiệt độ không đổi
Tinh chế sản phẩm: tủa thô được hòa tan trong acid HCl 32%, sau đó hỗn hợp được làm nóng và tẩy màu bằng Ig than hoạt Lọc nóng, làm lạnh dịch lọc về
5°c rồi điều chỉnh pH 5,5 bằng dung dịch NaOH 2N thu được 0,9g 1 Hiệu suất
80,6%
L-dopa: nhiệt độ nóng chảy 275-276°C, Rf "= 0,45, IR (KBr, em '): dải hấp thụ 3600-3000 (phenol-OH và -NH2), 3076 (-CH thơm), 1730 (-C=0 acid), 1570 (-C=C- thơm), 1254 (-C0- phenol); ESI-MS (m/z): 198 ([M+H]"^); Công thức phân tử: C9H11N O4.
Phổ cộng hưởng tò hạt nhân proton: ’H-NMR (500MHz, DíO+CFjCOOD)! ỏ (ppm )ĩ6,65 (1H, d (J = 8,0), H-C5O, 6,57 (IH, d (J = 1,5), H-
C2.), 6,49 (IH, dd (J = 8,0, 1,5), H-CôO, 4,04 (IH, dd (J = 7,0, 5,5), H -C2), 3,00 (IH, dd (J = 14,5, 5,0), Hb-Ca), 2,87 (IH, dd (J = 14,5, 11,5) Ha-Cj)
Giá trị ỗ (ppm) của đồng phân D-dopa trên phổ 'H- NMR [3]: 6,99 (d, J = 8,0), 6,93 (s), 6,83 (d, J = 8,0), 4,43 (dd, J = 7,2, 5,6), 3,32 (dd, J = 14,4, 5,6) and 3,20 (dd, J = 14, 4, 7,2) Từ các dữ liệu thu được sau khi phân tích phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưỏTig từ hạt nhân có thể khẳng định sản phẩm thu được là LD hay (S)-2-amino-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propanoic
Kiểm tra L-dopa đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh 2009
Kết quả: Hàm lưọng L-dopa đạt 99,4% (đạt tiêu chuẩn Dược điển Anh
2009 từ 99,0- 101,0%)
Trang 5Bàn luận
- Phản ứng tổng hợp diacyl từ L-tyrosin methyl ester; Khi tỷ lệ mol anhydrid acetic: L-tyrosin methyl ester tăng thì hiệu suất phản ứng tăng Nguyên nhân có thể là do: phản ứng diacyl nên tỷ lệ mol tối thiểu là 2/1, khi tăng tỷ lệ mol lên 2,25/1 thì hiệu suất tăng lên, thời gian phản ứng giảm xuống Tăng tiếp
tỷ lệ này, hiệu suất phản ứng thay đổi không đáng kể
- Phản ứng tổng họp 11 rtr nguyên liệu diacyl: Phản ứng được xúc tác
bởi lượng thừa acid Lewis (AICI3), do có sự hình thành phức với cả nguyên liệu
và sản phẩm Một trong những điều kiện để acid Lewis phát huy tác dụng là phản ứng phải thực hiện dưới điều kiện khan nước Sự hiện diện của một lưọng nhỏ nước làm ngưng phản ứng do acid Lewis sẽ tác dụng ngay lập tức với nước và bị phân hủy Vì vậy, phản ứng cần được thực hiện trong dung môi hữu cơ khan nước, dung môi sử dụng là nitrobenzen, xúc tác AICI3 khan, hóa chất và thiết bị cần được làm khô trước khi phản ứng [4],
- Trong các nghiên cứu về phản ứng thủy phân 12 đến 1, các tác giả đều
sử dụng tác nhân là HBr 48% Tuy nhiên, khi sử dụng tác nhân này thì phản ứng xảy ra mãnh liệt, dung dịch hóa đen nhanh, gây ra khó khăn khi tinh chế sản phẩm Vì vậy chúng tôi đã thay thế HBr bằng hỗn hợp acid với tỷ lệ thể tích HCl đặc: acid acetic băng (1:2) thì phản ứng xảy ra tốt, hiệu suất cao, sản phẩm dễ tinh chế
Kết luận
Đã xây dựng được quy trình tổng họp L-dopa từ L-tyrosin đạt tiêu chuẩn
về định tính và định lưọng theo Dược điển Anh 2009 Hiệu suất chung của cả
quy trình đạt khoảng 18,37%, trong đó phản ứng chuyển vị Fries để tổng họp 4
có hiệu suất thấp nhất (50,7%) Quá trình phản ứng không có sự racemic hóa
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tổng hợp được L-dopa từ L-tyrosin Quá trình tổng hợp L-dopa gồm các giai đoạn: Ester hóa L-tyrosin với methanol
thu được L-tyrosin methyl ester (9); Acyl hóa 2 trong pyridin thu được 0,N- diacetyl-L-tyrosin methyl ester (10); Thực hiện phản ứng chuyển vị 10 với xúc
tác AICI3 thu được (3-acetyl-4-hydroxyphenyl)-N-acetyl-L-alanin (11); oxy hóa
và thủy phân 11 thu được L-dopa cấu trúc cùa sản phẩm và các chất trung gian được khẳng định bằng các phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ’H-NMR L-dopa tổng hợp được có hàm lượng 99,4% (đạt tiêu chuẫn Dược điển Anh 2009)
Trang 6Tài liệu tham ỉdiảo
1 Bemardi L., Golfredo o (1973), Process fo r the preparation o f L-dopa., The
Unites States Patent and Trademark Office, us 3717673
2 Brady w T (1957), The synthesis of 0-methyl-N-acetyl-L-tyrosine,
California Institute o f Technology.
3 Chen F Y., Uang B J (2001), "Enantioselective Synthesis of (R)-3-(3, 4-
Dihydroxyphenyl) alanine from tert-Butyl Glycinate", The Journal o f Organic Chemistry, 66(10), pp 3650-3652.
4 Ogata Y Tabuchi H (1964), "A study on the mechanism of Fries reaction",
Tetrahedron, 20(7), pp 1661-1666.
5 Wolcke u., Bretschneider H Hohenlohe-Oehringen K., Kaiser A., (1973),
"Eine neue Synthese des 3-[3,4-Dihydroxy-phenyl]-L-alanins (L-DOPA) aus L-
Tyrosin", Helvetica chimica acta, 56(8), pp 2857-2860.