Di truyền tế bào ( nguyễn như hiền ) chương 7

153 Chương Di truyền tế bào Lai Soma Mục tiêu: Sau học xong chương học viên có khả năng: - Trình bày khái niệm tế bào soma biệt hóa chúng - Giải thích lai soma khác lai ghép mô quan, khác lai hữu tính - Trình bày hình thái hoạt động sống tế bào lai invitro - Biết nguyên lý qui trình ứng dụng lai tế bào công nghệ tế bào 7.1 Sự biệt hóa tế bào soma Qúa trình phát triển phôi hình thành mô, quan bao gồm hai qúa trình chủ yếu phân bào mitos biệt hóa tế bào (cell differentiation) Sự phân bào mitos bảo đảm cho tất tế bào chủng quần toàn thể nhiễm sắc ổn định 2n, xảy giai đoạn M chu kỳ tế bào Trong thể trưởng thành, tế bào soma phân bào mitos chủng quần đổi như: biểu mô da, biểu mô ruột, tế bào gốc tuỷ đỏ xương Trong chủng quần ổn định (ví dụ gan) tế bào soma không phân bào có nhân tố kích thích chúng có khả phân bào mitos (khi hàn gắn vết thương) Đối với thực vật tế bào mô soma phân bào tái biệt hóa thành trưởng thành theo kiểu sinh sản sinh dưỡng Sự biệt hóa tế bào qúa trình tạo thành tế bào biệt hóa khác hình thái chức - tức tạo thành tế bào mô quan khác Trong qúa trình phát triển phôi động vật biệt hóa thấy rõ tạo thành ba phôi: phôi (ngoại phôi bì ), phôi (nội phôi bì) phôi (trung phôi bì) từ ba phôi tế bào biệt hóa tạo thành mô khác Sự sinh trưởng biệt hóa xảy giai đoạn G1 chu kỳ sống tế bào 7.6.2 Sự biệt hóa hình thái chức Các tế bào soma khác biệt hình thái chức Có khoảng 200 dạng tế bào soma tập hợp thành 20 dạng mô khác thể người Ví dụ, tế bào hồng cầu không nhân có dạng cầu lõm hai mặt, có chức chuyên chở O2 CO2, tế bào biểu mô ruột có dạng hình khối trụ có nhiều vi nhung mao, có chức hấp thụ chất dinh dưỡng; bạch cầu có dạng cầu có chân giả có khả thực bào; tế bào có dạng hình thoi, chứa nhiều tơ có khả co rút; tế bào thần kinh có dạng hình sao, có nhiều sợi dài có chức dẫn truyền xung động 7.6.2 Sự biệt hóa sinh hóa 154 Các tế bào soma khác mặt sinh hóa, chúng tổng hợp protein đặc thù cho mình, ví dụ hồng cầu chứa hemoglobin, tế bào biểu mô da chứa keratin, tế bào chứa myoglobin, actin miozin, tế bào thần kinh chứa chất trung gian thần kinh v.v Chỉ có tế bào α β đảo tụy tổng hợp insulin glucagon có tế bào tuyến giáp tổng hợp tyroxin Đó protein đặc thù tổng hợp qúa trình biệt hóa tế bào 7.6.2 Sự biệt hóa- hoạt động biệt hóa hệ gen Hoạt động gen thể ba qúa trình: Tự tái ADN nhân đôi thể nhiễm sắc giai đoạn S chu trình tế bào, sở cho phân bào, phương thức truyền thông tin di truyền qua hệ Phiên mã ARN (mARN, rARN tARN) Dịch mã - tổng hợp protein theo khuôn mẫu mARN riboxom lắp ráp axit amin nhờ tARN Sự phiên mã dịch mã xảy giai đoạn G1 tế bào vào tiến trình biệt hóa, tức tổng hợp protein đặc thù để tạo thành tổ hợp phân tử, siêu cấu trúc đặc thù cho hình thái chức tế bào biệt hóa Sự phiên mã dịch mã xảy theo thời gian không gian (vị trí phần phôi) qúa trình phát triển cá thể, nghĩa gen hệ gen hoạt động đóng hay mở theo chế điều hòa nhiều cấp độ Như vấn đề biệt hóa hoạt động hệ gen vấn đề điều hòa hoạt động gen (xem phần trước) 7.2 Lai tế bào soma Trong quần thể sinh sản hữu tính tế bào hợp tử tế bào lai hình thành kết hợp hai giao tử - lai hữu tính Trong nuôi cấy tế bào invitro người ta tạo thành tế bào lai cách kết hợp hai tế bào soma với - lai soma Sự lai soma xảy thể sống thực vật động vật 7.6.2 Lai ghép thực vật Lai ghép lai dinh dưỡng từ lâu thực thực vật có ý nghĩa lớn thực tiễn trồng trọt ăn trái, cảnh v.v số nhà nghiên cứu cho lai dinh dưỡng ghép lai soma, thực chất “lai dinh dưỡng” chẳng qua loại thể khảm vừa mang tế bào mô gốc ghép cành ghép Giữa tế bào mô gốc ghép cành ghép có trao đổi thông tin điều chỉnh trao đổi chất tạo cho cành ghép có số tính chất gốc ghép, xảy hòa hợp nhân để tạo nên tế bào lai thực màng sinh chất màng xenlulozơ hàng rào ngăn cản hòa hợp Hơn tính trạng trung gian có hệ cành ghép, đem gieo hạt cành ghép hệ sau tính trạng trung gian hạt hình thành từ genom cành ghép Tính phổ biến tượng đa bội giới thực vật chủ yếu lai hữu tính nội phân (endomitosis) tạo thành, có trường hợp lai soma Nhiều nhà nghiên cứu cho tượng mixel đơn bội nấm Aspergillus cho mixel lưỡng bội, thụ tinh kép dẫn tới tạo thành tế bào tam bội dạng lai soma 155 7.6.2 Cấy ghép mô động vật Nghiên cứu cấy ghép mô quan động vật ý nghĩa thực tiễn miễn dịch y học, phẫu thuật cấy ghép mô quan mà có ý nghĩa di truyền, di truyền tế bào soma di truyền ung thư v.v Bản chất cấy ghép mô quan tượng tương hợp hay không tương hợp mô quan người nhận người cho, xác định đặc tính di truyền chúng Các nhân tố di truyền (các gen) di truyền theo qui luật Mendel Đặc tính tương hợp hay không tương hợp xem cặp tính trạng đối lập Nguyên nhân tính không tương hợp người nhận lặn hình thành kháng thể chống kháng nguyên xác định gen trội người cho Nói cách khác ta cấy ghép mô có tính khác biệt kháng nguyên người cho người nhận sau thời gian mảnh mô ghép bị chết bị bong Vì vậy, miếng ghép quan ghép tồn ghép mô thể thể sinh đôi trứng Người ta phân biệt kiểu ghép sau: Ghép tự hợp (autotransplantation) trường hợp ghép mô cá thể, ví dụ ghép da bụng vào da mặt người (hoặc nuôi cấy tế bào da người để dùng làm mảnh ghép cho người đó) khả sống đạt 100% Ghép đẳng hợp (isotransplantation) trường hợp ghép mô, quan hai người sinh đôi trứng cá thể thuộc dòng lai nội dòng (inbreeding), khả sống gần 100% Ghép đồng hợp (homotransplantation) trường hợp ghép mô, quan cá thể thuộc dòng loài, thường xảy không tương hợp ghép không kết không sử dụng biện pháp ức chế tính không tương hợp mô Ghép dị hợp (heterotransplantation) trường hợp ghép mô, quan hai cá thể thuộc hai loài khác ghép kết Ghép lai (hybridotransplantation) trường hợp cá thể lai hai dòng nội lai cá thể nhận cá thể lai hai dòng nội lai Mảnh ghép tồn số trường hợp Tính tương hợp hay không tương hợp mô qui định phức hệ protein đặc thù gọi phức hệ tương hợp mô chủ yếu (MHC – Major Histocompatibility Complex), phức hệ protein mã hóa gen gọi gen tương hợp mô (histocompatibility genes) hệ thống gồm mhiều gen, nhiều alen biểu đồng trội Ở người phức hệ MHC gọi phức hệ HLA (Human Leucocyte Antigens) mã hóa họ đa gen định khu vế ngắn thể nhiễm sắc số Sự cấy ghép mô động vật không gây tượng dung hợp tế bào in vivo không vượt qua tính không tương hợp, động vật có vú có thai phôi phát triển xem quan lạ cấy ghép vào thể mẹ, không bị loại thải nhờ chế đặc biệt ức chế tính không tương hợp mô không xảy dung hợp tế bào thai mẹ 7.3 Lai tế bào soma động vật invitro 7.6.2 Sự tạo thành ngẫu nhiên tế bào lai soma invitro 156 Như ta biết in vivo tạo thành tế bào lai soma vô Bằng phương pháp nuôi cấy tế bào invitro người ta nuôi cấy loại tế bào mô mô khác thể thể khác loài thuộc loài khác chí xa Lần năm 1960 tác giả Barski, Sorieul, Cornefert thông báo tạo tế bào lai soma invitro họ nuôi cấy trộn lẫn tế bào sarcoma chuột thuộc hai dòng khác Các dòng tế bào nuôi cấy khác biệt đặc điểm: (1) khả tạo thành u tiêm chúng vào chuột mang tính tương hợp mô (2) số lượng hình thái thể nhiễm sắc Khi phân tích thể nhiễm sắc tế bào lai thấy rõ tổ hợp hai thể nhiễm sắc hai dòng tế bào khởi nguồn (xem bảng 7.1) Bảng 7.1 Bộ thể nhiễm N2 tế bào lai M sắc N1 55 Số lượng thể nhiễm sắc Số lượng thể nhiễm sắc cân tâm dòng tế bào N2 62 9-19 khởi nguồn N1 M 115-116 -15 Khi nuôi cấy trộn lẫn tế bào dòng L (từ chuột C3H) với tế bào dòng MT1 (từ chuột SWR) ngươì ta thu nhận tế bào lai Sử dụng đặc tính khả gây ung thư tiêm tế bào vào chuột mang tính tương hợp mô người ta thấy tiêm tế bào lai cho chuột C3H SWR không gây ung thư, tiêm tế bào lai cho chuột lai (giữa C3H SWR) gây ung thư Điều chứng tỏ tế bào lai chứa hai loại kháng nguyên bề mặt hai dòng tế bào khởi nguồn chúng bị thải loại tiêm cho dòng chuột khởi nguồn, (xem bảng 7.2) Bảng 7.2 Khả tạo ung thư tế bào lai (1) Tế bào L MT1 Lai Nguồn tế bào Chuột C3H Chuột SWR Tế bào L x MT1 Tạo ung thư Chuột C3H có không không Chuột SWR không Có không Chuột lai C3H x SWR có có có Dẫn theo Ringert Savage (1979) Bằng phương pháp chọn lọc dòng tế bào khởi nguồn mang đặc tính đặc trưng để đánh dấu tế bào, ví dụ thiếu loại enzym đặc thù nuôi cấy chúng với tế bào bình thường (có enzym đó) môi trường chọn lọc (có không sản phẩm tác động enzym đó), người ta dễ dàng tạo dòng tế bào lai invitro Khi tế bào lai hình thành từ tế bào khởi nguồn, tế bào lai gọi tế bào đồng nhân (homocaryon), tế bào nuôi cấy thuộc thể khác bậc phân loại, tức loài, giống họ, v.v khác ta thu tế bào lai dị nhân (heterocaryon) Với nghĩa đắn heterocaryon thực tế bào lai 157 Trong nuôi cấy invitro, nuôi cấy trộn lẫn tế bào thuộc hai loài khác nhau, ví dụ tế bào chuột + tế bào người, thu tế bào lai cách ngẫu nhiên, xảy với tần số thấp Khi sử dụng nhân tố kích thích ví dụ hóa chất, virut v.v lai tế bào xảy dễ dàng với tần số lai cao 7.6.2 Lai tế bào sử dụng virut kích thích Năm 1965 nhà nghiên cứu Harris, Watkins, Okada Murayama sử dụng virut Sendai bị bất hoạt xạ tử ngoại, làm tác nhân kích thích nuôi cấy, họ tạo tế bào lai heterocaryon chuột với người, lợn với người Các tế bào lai tăng sinh hệ tế bào lai hợp nhân (syncaryon) Lúc đầu tế bào lai chứa hai nhân - gọi heterocaryon Heterocaryon tồn thời gian bị chết (trường hợp lai ngẫu nhiên), heterocaryon biến thành syncaryon nhân hòa hợp tạo thành nhân chung Các syncaryon có khả phân bào mitos cho hệ nối tiếp tạo nên dòng tế bào lai Ngày nghiên cứu lai tế bào invitro, việc sử dụng virut làm tác nhân kích thích trở thành phổ biến thông dụng Nhiều dạng virut có khả kích thích hòa hợp tế bào invitro virut chứa ADN (nhóm virut Herpes, virut đậu mùa v.v.), virut chứa ARN (virut lợn, virut Niu-cát-xơn, virut Sendai v.v.), virut gây ung thư (virut Sarcoma rous) v.v Nhưng gây hiệu nhiều virut Sendai loại virut chứa ARN có tác động ngưng kết hồng cầu tìm thấy Nhật Bản nên có tên gọi virut HVJ lần phân lập trường Đại học Tohoky Sendai (Nhật bản) nên có tên gọi virut Sendai Virut Sendai cấu tạo lõi ARN bao phân tử glicoprotein có khả làm ngưng kết máu dung hợp tế bào, màng lipoprotein có nguồn gốc từ màng sinh chất tế bào vật chủ Virut Sendai ký sinh tế bào động vật cách liên kết với màng sinh chất tế bào vật chủ tượng nhập bào tạo thành bóng nhập bào để xâm nhập vào tế bào vật chủ Do tính chất virut liên kết với màng tế bào nên chúng làm liên kết màng hồng cầu với tạo nên ngưng kết máu Trong nuôi cấy invitro virut Sendai làm liên kết màng sinh chất hai tế bào với tạo điều kiện cho dung hợp hai tế bào tạo thành heterocaryon Tuy nhiên, dung hợp tế bào tuỳ thuộc vào đặc tính tế bào, vào số lượng hạt virut, vào nồng độ ion, vào độ pH, vào nguồn lượng v.v Để tăng tính liên kết người ta thường sử dụng virut kết hợp với loại hóa chất có khả tạo dung hợp tế bào polyethylen glicol 7.6.2 Các tế bào lai heterocaryon Chúng ta xem xét số công trình nghiên cứu đặc tính di truyền biến dị, tái mã, phiên mã dịch mã tế bào lai, đặc tính biệt hóa tế bào chúng 7.3.3.1 Sự hoạt hóa nhân Khi lai tế bào mang nhân hoạt hóa limpho bào (lymphoblast) chuột, tế bào ung thư Hela (là tế bào ung thư cổ tử cung chị Henrietta tách để nuôi cấy từ năm 1951 chị bị tử vong) người với tế bào mang nhân bất hoạt, ví dụ tế bào hồng cầu 158 gà, người ta thu tế bào lai có chứa nhân hồng cầu gà nhân tế bào chuột (khi lai với tế bào chuột) người (khi lai với tế bào Hela) Trong môi trường tế bào chất tế bào lai, nhân hồng cầu gà hoạt hóa thể tượng sau: - Khối lượng nhân tăng lên, nhân dạng xốp chứa chất nhiễm sắc dạng phân tán - Có xâm nhập protein đặc trưng cho người từ tế bào chất vào nhân - Có hoạt hóa ARN-polymeraza tổng hợp dạng ARN - Có tạo thành hạch nhân tạo nhiều riboxom - Có tổng hợp nhiều loại protein đặc trưng cho gà bao gồm enzym, protein kháng nguyên bề mặt protein thụ thể - Có tổng hợp ADN - Tạo thành tế bào lai syncaryon chứa nhân, đa số thể nhiễm sắc gà bị thải loại Ta xem xét số tượng biến đổi đây: Tổng hợp ARN ADN tế bào lai + Trong tế bào lai hồng cầu gà với tế bào Hela diễn tổng hợp ARN, tức phiên mã từ nhân hồng cầu Sử dụng H3-uridin để đánh dấu theo dõi tổng hợp ARN tổng hợp ARN tăng lên theo tăng thể tích tăng độ xốp chất nhiễm sắc nhân hồng cầu vào ngày sau dung hợp, dạng ARN tổng hợp mARN sau rARN xuất sau xuất hạch nhân + Khoảng 10 - 15 sau dung hợp nhân hồng cầu tế bào lai heterocaryon tăng cao thể tích giai đoạn G1 Sử dụng H3-timidin để đánh dấu theo dõi tổng hợp ADN quan sát thấy sau 48 hàm lượng ADN nhân hồng cầu tăng lên Sự tăng cao thể tích nhân không tương ứng với tổng hợp ADN, cần có tác động nhân tố (các protein) đến từ tế bào chất tế bào Hela vào nhân hồng cầu + Khi sử dụng tế bào nhân bất hoạt mức độ vừa phải so với nhân hồng cầu, ví dụ đại thực bào Bình thường đại thực bào không tổng hợp ADN tế bào giai đoạn biệt hóa G1, chúng chứa hạch nhân nhỏ tổng hợp ARN Khi nuôi cấy đại thực bào (từ thỏ chuột) với tế bào hoạt hóa tế bào Hela tế bào melanom người, tạo nên tế bào lai heterocaryon, nhân đại thực bào tăng cao thể tích chúng tổng hợp ARN tăng - 10 lần so với bình thường sau dung hợp sau ba xảy tổng hợp ADN Điều chứng tỏ so với nhân hồng cầu gà, nhân đại thực bào bất hoạt mức thấp Khi nghiên cứu tiến trình tổng hợp ARN ADN tế bào lai đại thực bào tế bào melanom, người ta chứng minh tổng hợp ADN nhân đại thực bào không phụ thuộc vào tổng hợp ARN protein nhân đại thực bào mà phụ thuộc vào nhân tố đến từ tế bào chất tế bào melanom + Sử dụng virut Sendai làm tác nhân kích thích tạo tế bào lai từ tế bào soma (2n) với tế bào giao tử (n) tinh trùng tế bào trứng 159 Khi lai với tinh trùng nhân tinh trùng tồn tế bào lai lâu (có thể tới vài tháng) trạng thái bất hoạt, đem lai tinh tử (spermatide) với tế bào soma (ví dụ lai tinh tử chuột cống với tế bào soma chuột nhắt) tạo nên tế bào lai có khả phân bào Khi đem tế bào trứng chưa thụ tinh chuột nhắt lai với tế bào soma khác như: tế bào chuột cống, khỉ người tạo nên tế bào lai tế bào lai phát triển tới giai đoạn phôi dâu (morula) Sự thụ tinh dung hợp tinh trùng trứng để tạo nên hợp tử chứa nhân tinh trùng nhân trứng - xem tế bào lai hai tế bào đơn bội loài khác loài xảy invitro ống dẫn trứng (hoặc phần xoang bụng ống dẫn trứng) chương trình hóa gen chúng Trong nuôi cấy invitro để thực thụ tinh tinh trùng trứng tinh trùng phải xử lý để làm thay đổi tính chất sinh lý chúng gọi khả hóa (capacitation), sử dụng virut Sendai tinh trùng không cần phải “khả hóa” thực thụ tinh với trứng Sự điều hòa tổng hợp ADN ARN tế bào lai Khi sử dụng dạng tế bào soma có đặc tính hoạt hóa hay bất hoạt khác tổng hợp ARN ADN nhân để tạo tế bào lai nghiên cứu tổng hợp ADN ARN tế bào lai người ta thấy: Bảng 7.3 Sự tổng hợp ARN ADN tế bào bố mẹ I II tế bào lai heterocaryon (I x II) Heterocaryon ARN Tế bào I ARN AD N Hela (người) + + Hela (người) + + + + + - + + Hela (người) Đại thực bào (thỏ) Nguyên bào (chuột) Tế bào (chuột) Melanocy t (chuột) Ghi chú: + Tế bào II ARN Đại thực bào (thỏ) Tế bào limpho (chuột) Hồng cầu (gà) Hồng cầu (gà) Hồng cầu (gà) ADN I II I II + - + + - + + - + - + + - + + - - - + + - - - - - - - Hồng cầu (gà) Đại thực + + + bào (thỏ) có; - không, + - có không + - AD N + + + + + + - + + + + + - - + + - 160 Tế bào có hoạt tính cao tham gia vào tế bào lai kích thích nhân tế bào hoạt tính có hoạt tính thấp tổng hợp ADN ARN tích cực (trừ trường hợp nhân tế bào hoạt tính lớn nhiều lần so với nhân tế bào hoạt tính cao, heterocaryon tạo thành từ tế bào qúa già) Nhân hoạt tính có hoạt tính thấp đạt mức tổng hợp ADN ARN nhân có hoạt tính Ví dụ, dùng tế bào có hoạt tính tổng hợp ARN mà không tổng hợp ADN (tế bào cơ, đại thực bào) tế bào lai, nhân không hoạt tính tổng hợp có ARN (xem bảng 7.3) Tín hiệu phát động tổng hợp ARN ADN đến từ tế bào chất tế bào có hoạt tính cao không mang tính đặc trưng mô loài Cơ chế nguyên tắc điều hòa tổng hợp ADN (tái mã) ARN (phiên mã) diễn tế bào lai tương tự tế bào bình thường Nhiều gen bất hoạt tế bào hoạt tính giữ trạng thái bất hoạt tế bào lai chứng tỏ chúng không mang tính ngược chiều, nhiều gen bất hoạt trở lại hoạt động tế bào lai chứng tỏ chúng có tính ngược chiều Những công trình cấy ghép nhân nhân vô tính từ tế bào soma chứng tỏ tuỳ loại tế bào, tuỳ mức độ giai đoạn biệt hóa mà tính ngược chiều hoạt động gen thể khác từ gen riêng lẻ, họ gen hay toàn genom 7.3.3.2 Biến đổi thể nhiễm sắc tế bào lai Phân tích thể nhiễm sắc tế bào lai có tầm quan trọng việc xác định tế bào dung hợp có thực tế bào lai hay không cho phép nghiên cứu vấn đề cấu trúc, tập tính thể nhiễm sắc cấu trúc hiển vi chứa thông tin di truyền tế bào Bằng phương pháp đánh dấu thể nhiễm sắc phương pháp tế bào học khác xây dựng kiểu nhân, nhuộm cắt băng phương pháp lai ADN v.v người ta làm sáng tỏ nhiều vấn đề di truyền biến dị tế bào lai soma Trong tế bào lai khác loài, ví dụ chuột người, chuột với khỉ, chuột với gà v.v hai thể nhiễm sắc hai tế bào bố mẹ tổ hợp lại với xảy biến số thể nhiễm sắc hai hai thể nhiễm sắc (xem bảng 7.4) Theo dõi biến đổi thể nhiễm sắc dòng tế bào lai qua hệ thấy quần thể tế bào lai chứa thể nhiễm sắc đa dạng mức bội thể (heteropolyploid) tuỳ thuộc không loài mà tuỳ thuộc vào loại mô bố mẹ (tim, gan, thận, tuỷ xương, tuyến ức, lách, não, v.v.) tuỳ thuộc vào trạng thái thể nhiễm sắc tế bào bố mẹ trước đem lai (bị đột biến chiếu xạ, hóa chất ung thư v.v.) trạng thái hoạt động gen Xu thể nhiễm sắc bị tổn thương, thể nhiễm sắc chứa nhiều gen hoạt động bị thải loại tế bào lai Bảng 7.4 Sự biến thể nhiễm sắc tế bào lai khác loài Tế bào lai Loài bị thể nhiễm sắc 161 Người + Chuột nhắt Người Người + Chuột hamster Người Chuột nhắt + Khỉ Khỉ Chuột nhắt + Chuột cống Chuột nhắt, chuột cống Chuột nhắt + Gà Gà Chuột hamster + Gà Gà Số lượng thể nhiễm sắc bị tốc độ tuỳ thuộc vào khác biệt chủng loại tế bào bố mẹ tuỳ thuộc vào dòng tế bào lai qua hệ sống Ví dụ, tế bào lai chuột nhắt với chuột hamster thải loại thể nhiễm sắc xảy chậm, tế bào lai người với gà, thải loại thể nhiễm sắc xảy nhanh giai đoạn sống sau thải loại xảy chậm dần tế bào lai mang số thể nhiễm sắc ổn định (giữ lại từ đến ba thể nhiễm sắc người) Trong dòng tế bào lai thải loại thể nhiễm sắc diễn khác nhau, ví dụ tế bào lai chuột người có dòng giữ nguyên thể nhiễm sắc người suốt bốn tháng, thời gian có dòng bị thải loại tới 50% thể nhiễm sắc người Để thuận tiện phân tích thể nhiễm sắc nhà nghiên cứu thường sử dụng tế bào chuột hamster Trung Quốc (2n = 22) lai với tế bào người (2n = 46) Các tế bào lai qua thời gian sống từ - tuần cho dòng ổn định với toàn bộ thể nhiễm sắc chuột - thể nhiễm sắc người thích hợp cho việc nghiên cứu Sự giữ lại thải loại thể nhiễm sắc thể nhiễm sắc bố mẹ tế bào lai xảy ngẫu nhiên mà chắn tuân theo chế tương tác hai genom trạng thái tế bào chất chung tế bào lai với môi trường nuôi cấy invitro Trong tế bào lai xảy biến đổi cấu trúc thể nhiễm sắc Các tế bào bố mẹ dùng để lai nuôi cấy giai đoạn khác chu kỳ tế bào: có tế bào giai đoạn M (Mitosis - giai đoạn phân bào), có tế bào giai đoạn gian kỳ I (Interphase - gian kỳ gồm G1, S, G2) Khi tế bào bố mẹ dung hợp tạo thành tế bào lai heterocaryon chứa nhân dung hợp thống với hai vài thể nhiễm sắc, thường quan sát thấy biến đổi cấu trúc thể nhiễm sắc đông đặc hóa, đứt đoạn v.v Nếu tế bào bố mẹ giai đoạn M nhân tế bào bố mẹ hai giai đoạn G1, S G2 Nếu G1 người ta quan sát thấy sợi nhiễm sắc qua tế bào dạng đông đặc sợi đơn, G2 tức giai đoạn sau tổng hợp ADN, sợi nhiễm sắc đông đặc dạng sợi đôi gần giống tiền kỳ mitos bình thường Nếu S dạng đông đặc dạng mảnh vụn Người ta cho ảnh hưởng nhân tố phân bào tế bào hai làm biến đổi cấu trúc thể nhiễm sắc tế bào một, sang dạng đông đặc gần giống với dạng đông đặc co ngắn thể nhiễm sắc kỳ phân bào mitos bình thường Các thể nhiễm sắc bị đông đặc đứt mảnh bị thải loại qua kỳ phân bào tế bào lai syncaryon Trong nuôi cấy, syncaryon có xu đồng thời hóa (synchronisation) pha qua hệ phân bào để thuận tiện cho việc nghiên cứu tế bào lai nhà nghiên cứu thường thực phương pháp làm đồng thời hóa pha tế bào bố mẹ trước đem nuôi cấy để lai để loại trừ tượng đông đặc hóa Nhưng cần nghiên cứu so sánh trạng thái mở xoắn xốp hóa chất nhiễm sắc gian kỳ với trạng thái xoắn đông đặc thể nhiễm sắc phân bào, cần nghiên cứu ảnh hưởng tác nhân gây đột biến (như xạ, hóa chất) lên cấu trúc chất nhiễm sắc gian kỳ nhà nghiên cứu thường sử dụng tế bào lai mang thể nhiễm sắc đông đặc 162 7.6.2 Sự hoạt hóa gen tế bào lai Khi ta cho lai hai loại tế bào soma khác loài invitro ta thu tế bào lai dạng heterocaryon chứa hai nhân vài nhân riêng biệt, sau nhân heterocaryon dung hợp tạo nên nhân độc chứa tổ hợp thể nhiễm sắc tế bào lai gọi syncaryon Các heterocaryon tồn lâu chết biến thành syncaryon Người ta theo dõi số phận đời sống tế bào lai qua đặc tính như: biểu hệ gen thành tính trạng kiểu hình (phenotip) chủ yếu tổng hợp protein, enzym, tạo thành siêu cấu trúc, biệt hóa tế bào hình thái môt số đặc tính sinh lý sinh hóa khác phản ứng với tác nhân kích thích, sinh sản phát triển v.v Để nghiên cứu biểu tính trạng tế bào lai syncaryon người ta thường sử dụng: tế bào bố mẹ có đặc tính tính toàn (totipotential) đa (multipotential) ví dụ tế bào trứng thụ tinh, tế bào phôi giai đoạn sớm, tế bào teratoma (tế bào ung thư quan sinh dục) tế bào phôi giai đoạn phát triển muộn, tế bào mô động vật trưởng thành; tế bào dị bội (heteroploide) chưa biệt hóa không biệt hóa nuôi cấy lâu dài Điển hình cho hai loại tế bào tế bào Hela người tế bào L chuột nhắt Để theo dõi biểu tính trạng tế bào lai người ta thường dựa vào phân tích tính chất sau xem kiểu đánh dấu: + Đặc tính hình thái, tốc độ tăng trưởng, ức chế tiếp xúc già (kiểu đánh dấu A) + Các đặc tính sinh lý miễn dịch, nhu cầu chất dinh dưỡng (kiểu đánh dấu B) + Các protein đặc trưng, ví dụ enzym, globulin miễn dịch, hormon (kiểu đánh dấu C) + Đặc tính nhạy cảm với chất có hoạt tính sinh học (kiểu đánh dấu D) Ta cần chọn hai dạng tế bào bố mẹ khác đặc tính nêu ta xem kiểu đánh dấu để theo dõi phân tích tế bào lai Ví dụ, ta chọn tế bào bố mẹ có tính chất ABCD tế bào bố mẹ hai tính chất (ta ký hiệu abcd) dựa vào cặp tính chất (kiểu đánh dấu ABCD abcd) để phân tích tế bào lai dòng khác có hay tính trạng Một kiểu đánh dấu sử dụng nhiều phân tích protein gồm enzym, protein đặc thù hormon Enzym protein đóng vai trò chất xúc tác sinh học có vai trò quan trọng qúa trình trao đổi chất đặc trưng cho toàn thể, ví dụ enzym đường phân (glycolyse), chu trình Krebs, enzym tham gia tái mã phiên mã v.v Các enzym dùng kiểu đánh dấu thường lactatdehydrogenaza, malatdehydrogenaza, β-glucoronidaza, glucozo-6-photphat dehydrogenaza dạng isoenzym chúng Các protein đặc thù sử dụng làm kiểu đánh dấu thường globulin miễn dịch, kháng nguyên bề mặt, chất hoạt tính thần kinh (như protein S-100, axetilcholinesteraza), protein cấu trúc như: hemoglobin, actin, albumin, collagen v.v Các hormon sử dụng làm kiểu đánh dấu thường hormon sinh trưởng v.v Sử dụng protein đặc thù làm kiểu đánh dấu người ta theo dõi biểu gen mã hóa cho protein qúa trình biệt hóa tế bào lai, ví dụ hemoglobin protein đặc thù cho hướng biệt hóa hồng cầu, protein S-100 protein dẫn tới biệt hóa tế bào thần kinh v.v Nhưng cần phải lưu ý là: protein actin đặc thù tế bào cơ, actin có mặt nhiều dạng tế bào tạo nên cấu trúc vi sợi có chức khung xương tế 163 bào tham gia kiểu vận động nội bào vận động tế bào chất, vận động amip quan sát thấy bạch cầu, đại thực bào v.v Vì vậy, để đánh giá trạng thái biệt hóa tế bào lai cần sử dụng kiểu đánh dấu hình thái sinh lý ví dụ để đánh giá dạng biệt hóa nơron cần phân tích cấu trúc vi sợi thần kinh, sợi lồi tế bào chất, hoạt tính điện sinh lý v.v., dạng biệt hóa tế bào cấu trúc tơ v.v Đặc tính nhạy cảm với chất có hoạt tính sinh học đặc biệt sử dụng thường tác nhân gây đột biến (mutagen), kiểu đánh dấu để phân tích nuôi cấy lai tế bào bố mẹ bị đột biến Sử dụng kiểu đánh dấu ta theo dõi biểu gen thể nhiễm sắc thường (autosome) gen thể nhiễm sắc giới tính đặc biệt thể nhiễm sắc X Ví dụ, lai tế bào người với tế bào chuột nhắt ta dùng kiểu đánh dấu enzym lactatdehydrogenaza β-glucoronidaza kháng thể HLA người kháng thể H2 chuột, ta theo dõi biểu trội lặn biểu tương tác gen mã hóa cho protein tế bào lai qua hệ Nhiều kết nghiên cứu chứng minh tế bào lai gen chuột thường trạng thái trội (tức có tổng hợp protein), gen người thường trạng thái lặn (tức không tổng hợp protein) Khi sử dụng enzym glucozo-6-photphat dehydrogenaza enzym di truyền liên kết với thể nhiễm sắc X (gen mã hóa nằm X) để theo dõi biểu gen tế bào lai thấy tế bào lai quan sát hai dạng enzym bố mẹ, đồng thời xuất dạng enzym tổ hợp gồm tiểu đơn vị hai enzym bố mẹ Điều chứng tỏ thể nhiễm sắc X bị bất hoạt hóa qúa trình phát triển phôi (quan sát dạng chất nhiễm sắc giới tính - thể Barr) tái hoạt hóa tế bào lai Để nghiên cứu qúa trình biệt hóa tế bào lai người ta thường sử dụng tế bào bố mẹ đặc biệt tế bào ung thư mô tế bào melanom (tế bào ung thư sắc tố), hepatom (tế bào ung thư gan), teratom (tế bào ung thư sinh dục), neuroblastom (tế bào ung thư thần kinh), tế bào chủng quần biệt hóa cao ổn định như: tế bào limpho, tế bào sợi, tế bào dòng hồng cầu v.v Ví dụ lai tế bào melanom chuột hamster (là tế bào có chứa sắc tố melanin dạng hạt đen tế bào chất) với tế bào L (là tế bào nuôi giữ invitro không chứa melanin chuột, ta thu tế bào lai với dòng khác không chứa melanin Bình thường melanin xuất tế bào sắc tố (melanocyte) chuyển hóa tirozin thành melanin xúc tác enzym diphenoloxydaza gen mã hóa cho enzym phải trạng thái hoạt động tức phiên mã dịch mã Như vậy, tế bào lai không xuất melanin chứng tỏ gen tế bào melanom bị ức chế Ví dụ, đem lai tế bào hepatom chuột nhắt (là tế bào tích cực tổng hợp albumin) với tế bào bạch cầu người (là tế bào không tổng hợp albumin) người ta thu tế bào lai thể nhiễm sắc chuột nhắt giữ nguyên đa số thể nhiễm sắc người bị thải loại, người ta quan sát thấy số tế bào lai tổng hợp hai loại albumin chuột người Điều chứng tỏ ảnh hưởng trạng thái hoạt động gen chuột làm hoạt hóa gen mã hóa albumin người tế bào lai Để nghiên cứu đặc tính biệt hóa hình thái người ta thường sử dụng tế bào ung thư thần kinh - neuroblastom Trong nuôi cấy invitro tế bào neuroblastom thể hàng loạt đặc tính biệt hóa nơron như: đặc tính điện màng, hoạt tính axetylcholinesteraza cao, xuất cấu tạo hình thái vi sợi thần kinh, phân nhánh tế bào chất v.v Khi sử dụng tế bào neuroblastom chuột nhắt lai với loại tế bào khác tế bào L chuột nhắt, nguyên sợi bào (fibroblast) người ta thu nhận quần thể tế bào lai đa dạng kiểu đánh dấu tế bào nơron, ví dụ tế bào lai từ neuroblastom chuột nhắt với fibroblast người, thể 164 hoạt tính cholinaxetyltransferaza cao hàng 100 lần so với tế bào bố mẹ phân tích thể nhiễm sắc tế bào lai thấy chúng giữ lại thể nhiễm sắc người số tế bào lai Sự xuất đặc tính nơron tế bào lai đa dạng từ hoạt tính enzym đến cấu trúc như: vi sợi thần kinh, nhánh lồi thần kinh, điều chứng tỏ qúa trình biệt hóa nơron, đặc tính xuất theo giai đoạn có điều hòa phối hợp lẫn 7.6.2 Các bào quan tế bào lai Trong qúa trình hình thành phát triển tế bào lai invitro xảy nhiều biến đổi bào quan dính kết hai màng sinh chất hai tế bào bố mẹ để tạo thành màng sinh chất chung, dung hợp hai nhân để tạo thành nhân độc với thể nhiễm sắc hỗn hợp, biến đổi hoạt động riboxom, ty thể v.v Ta xem xét số vấn đề có liên quan đến biến đổi riboxom ty thể: Khi theo dõi tổng hợp rARN-28S tế bào lai tế bào chuột nhắt tế bào người với sử dụng phương pháp nguyên tử đánh dấu H3-hipoxantin người ta quan sát thấy: tế bào lai chứa gần đủ thể nhiễm sắc người chuột tế bào lai tổng hợp hai loại rARN người chuột, dòng tế bào lai chứa đủ thể nhiễm sắc chuột thể nhiễm sắc người bị thải loại nhiều rARN tổng hợp chuột phân tích thể nhiễm sắc tế bào lai chúng không chứa thể nhiễm sắc kèm (thể nhiễm sắc số 13, 14, 15, 21 22) thể nhiễm sắc có chứa vùng NOR (Nucleolus Organizing Region) tức chứa gen rARN - 45S từ phiên mã thành rARN 45S sau chế biến để tạo thành rARN 28S; 5,8S 18S riboxom Các thể nhiễm sắc bị thải loại gen bị thải loại Nghiên cứu hoạt động ty thể (Mitochondria) tế bào lai đóng góp nhiều dẫn liệu cho nghiên cứu di truyền ty thể - bào quan nằm tế bào chất bị kiểm tra hệ gen nhân chúng giữ đặc tính di truyền tự lập chúng có chứa ADN hệ tổng hợp protein riêng (rARN tARN) Ty thể chuột người chứa phân tử ADN kép, trần, dạng vòng có kích thước dài khoảng micron chứa vài chục gen mã hóa cho khoảng 13 protein riêng ty thể (chiếm 5% tổng số protein ty thể), rARN tARN ty thể Loại ADN có ty thể gọi ADN-ty thể (mtADN) có tính tự tái phiên mã diễn ty thể Khi theo dõi chủng quần tế bào lai chuột nhắt người theo dõi mtADN người ta thấy có tương quan thải loại thể nhiễm sắc thải loại mtADN Ở chủng quần tế bào lai có đủ thể nhiễm sắc chuột đa số thể nhiễm sắc người có mtADN chuột người, theo đà thể nhiễm sắc người bị thải loại dần mtADN người bị thải loại tương ứng tế bào lai không chứa thể nhiễm sắc người tìm thấy mtADN chuột mà Điều chứng tỏ có tương quan mật thiết gen nhân với mtADN ty thể Điều lý thú tế bào lai mà có hai loại mtADN chuột người, phát loại mtADN lai tức mtADN tái tổ hợp người chuột Khi nghiên cứu tế bào lai người ta xác định hệ enzym ty thể gen nhân kiểm soát hệ enzym ty thể gen ty thể (mtADN) kiểm soát 165 7.4 Lập đồ gen Nghiên cứu đặc tính di truyền biến dị tế bào lai soma cung cấp nhiều dẫn liệu làm sáng tỏ nhiều vấn đề di truyền tế bào, di truyền phân tử tập tính thể nhiễm sắc chu kỳ tế bào, tái tổ hợp soma, điều hòa hoạt động gen; phôi sinh học vấn đề lai loài xa nhau, vấn đề biệt hóa tế bào, đồng thời phương pháp lai tế bào soma áp dụng để giải vấn đề thực tiễn lập đồ gen, nghiên cứu ung thư, nghiên cứu tác nhân độc hại môi trường (virut, chất độc) công nghệ nuôi cấy tế bào mô công nghệ gen Để lập đồ gen nhà di truyền học sử dụng nhiều phương pháp có phương pháp lai tế bào soma Khi lai tế bào khác loài tế bào lai xảy đông đặc thải loại có chọn lọc thể nhiễm sắc hai loài Vì vào phân tích kiểu hình thể nhiễm sắc cho phép ta xác định gen định khu thể nhiễm sắc nào, xác định nhóm liên kết gen từ xác lập đuợc đồ gen thể nhiễm sắc Hơn sử dụng tế bào lai để phân tích tính bổ trợ gen tức sai lệch di truyền tế bào có liên quan đến nhiều locut gen khác Người ta sử dụng tế bào lai để lập đồ gen nhiều loài động vật thuộc bậc phân loại xa gần chuột nhắt, chuột cống, thỏ, ngựa, lừa, khỉ thấp, khỉ cao người để nghiên cứu sở phân tử di truyền tiến hóa phân loại Ngay từ năm 1975 nhà nghiên cứu phát kiểm tra lại hàng trăm gen định khu tất 22 đôi thể nhiễm sắc thường hàng chục gen định khu thể nhiễm sắc X Y người phương pháp lai tế bào soma tế bào người với tế bào động vật khác như: chuột nhắt, chuột cống, chuột hamster v.v Ví dụ, để xác định gen TK (gen mã hóa cho enzim thymidin kinaza) định vị thể nhiễm sắc 23 thể nhiễm sắc người, M C Weiss H Green thực phép lai tế bào chuột (mang gen TKkhông có khả tổng hợp thimidin kinaza, với tế bào người TK+ có khả tổng hợp thymidin kinaza) Trong dòng tế bào lai chuột- người, đa số thể nhiễm sắc người bị loại bỏ giữ lại số thể nhiễm sắc nhiễm sắc số 17 Đem nuôi tế bào lai môi trường chọn lọc có chất aminopterin thấy: tế bào lai TK- không mọc (vì thymidin kinaza nên chuyển hóa thymidin cần cho tổng hợp ADN) Đối với dòng TK+, chúng mọc bình thường (vì có thymidin kinaza), đem phân tích kiểu nhân tế bào lai người ta thấy chúng chứa thể nhiễm sắc số 17 người Điều chứng tỏ gen TK nằm thể nhiễm sắc 17 (hình 7.1) Để kiểm chứng thêm, người ta đem nuôi dòng tế bào lai môi trường có chứa chất bromodeoxiuridin (BUDR) (là chất chuyển hóa thymidin kinaza có khả gắn vào ADN làm tế bào chết), người ta thấy dòng tế bào mọc (chứng tỏ thymidin kinaza) không nhiễm sắc 17 (hình 7.1) Bằng phương pháp phân tích dòng tế bào lai kiểu nhân, người ta phát 19 gen vị trí phân bố chúng thể nhiễm sắc số 166 Hình 7.1 Sơ đồ phương pháp xác định vị trí gen TK thể nhiễm sắc số 17 tế bào lai soma 7.5 Lai tế bào soma công nghệ tế bào thực vật Tế bào thực vật khác biệt với tế bào động vật nhiều đặc tính, có đặc điểm tồn tế bào thực vật lớp thành vỏ xenlulozơ bao màng sinh chất Vỏ xenlulozơ ngăn cản tế bào thực vật dung hợp với invitro Bằng phương pháp học (vi phẫu thuật) hóa học (xử lý enzym) người ta tách bỏ lớp vỏ xenlulozơ tế bào trở thành nguyên bào hay gọi tế bào trần (protoplast) Trong nuôi cấy invitro tế bào trần dễ dàng dung hợp tạo tế bào lai giống tế bào động vật có ưu chỗ tế bào lai phát triển thành khối tế bào đa (callus) từ tạo thành phôi (được gọi phôi soma) phát triển thành hoàn chỉnh 7.6.2 Phương pháp tạo tế bào trần (protoplast) Phương pháp học - vi phẫu thuật Người ta cho miếng mô vào dung dịch ưu trương để khối tế bào chất màng sinh chất tách khỏi vỏ xenlulozơ Sử dụng kim nhọn dao phẫu thuật để tách cắt mô lớp vỏ sau ngâm vào môi trường nuôi cấy pha loãng, tế bào chất phồng to tách khỏi vỏ xenlulozơ tạo thành tế bào trần tự Phương pháp sử dụng enzym Người ta sử dụng enzym: xenlulaza, pectinaza hemixenlulaza để phân huỷ lớp vỏ xenlulozơ tạo tế bào trần Enzym sử dụng phải tinh khiết chứa nhiều proteaza peroxydaza làm hỏng tế bào trần Hiệu tạo tế bào trần tuỳ thuộc vào loại mô sử dụng 167 Cũng cần ý tế bào trần sống invitro tái tạo lại vỏ xenlulozơ trở thành tế bào nhiều nhân nhân đa bội tượng nội phân, tượng liên kết hai vài tế bào loại tế bào thực vật có đặc tính liên kết tế bào chất với qua cầu nối tế bào chất (plamadesma) chúng dễ dàng hợp với lớp vỏ xenlulozơ để tạo thành tế bào đa nhân Vì nuôi cấy invitro tế bào trần thuộc loài chi khác ta cần phải xác định xác tế bào lai heterocaryon thực có chứa gen hai loài 7.6.2 Sự liên kết dung hợp tế bào trần Sự liên kết dung hợp tế bào trần để tạo thành tế bào lai heterocaryon mô loài thuộc loài khác tuỳ thuộc vào nồng độ ion natri, kali canxi độ pH môi trường nuôi cấy, đồng thời tuỳ thuộc vào số chất có tác dụng tăng cường liên kết tế bào lysozym đặc biệt polyethylen glicol cấu trúc phân tử chúng tạo nên liên kết ion với chất có bề mặt màng sinh chất tế bào Sử dụng polyethylen glicol (với nồng độ 0,2 - 0,3M) tạo tế bào lai đạt từ 25 - 50% tế bào lai tồn qua nhiều hệ Sự tạo thành mô sẹo (callus) tái sinh từ tế bào lai syncaryon không phụ thuộc vào phương pháp tạo tế bào lai 7.6.2 Sự phát triển tế bào lai Các tế bào trần nuôi cấy invitro chết, dung hợp thành tế bào lai chứa nhân khác loài - heterocaryon Nếu heterocaryon tái sinh thành vỏ xenlulozơ phân bào xem chúng sống phát triển Điều lý thú lai tế bào trần thực vật chúng có khả biểu hoạt động gen sinh trưởng biệt hóa giống tế bào lai động vật mà có khả tái sinh thành toàn vẹn xem lai soma Khi heterocaryon phân chia nhân hệ tế bào chưa dung hợp thành nhân lai độc chúng có xu đồng thời hóa mitos, số heterocaryon qua vài hệ nhanh chóng bị chết Trong heterocaryon có nhân cạnh qua mitos hai thể nhiễm sắc hợp nhân lai hệ sau tế bào tế bào lai chứa nhân lai độc - syncaryon Tất tế bào phát triển từ syncaryon tạo nên dòng lai (clon line): Các tế bào lai syncaryon giống tế bào soma thực vật cho khối mô đa tiềm (mô sẹo - callus) nuôi cấy chúng với hormon thực vật chế độ chiếu sáng khác biệt hóa thành chồi rễ tái sinh thành toàn vẹn hoa kết lai hữu tính Ví dụ, lai tế bào trần hai loài thuốc Nicotiana tạo lai soma giống lai hữu tính 7.6.2 Chọn lọc xác định dòng tế bào lai mô sẹo Để xác định dòng tế bào lai soma thực vật nhà nghiên cứu sử dụng đánh dấu tế bào lai động vật Các tiêu hình thái thường dùng để đánh dấu cho giai đoạn phát triển tế bào lai, mô sẹo tái sinh toàn vẹn có mặt hay không loại lạp thể (bạch lạp, sắc lạp, lục lạp), sinh trưởng mô sẹo tuỳ thuộc vào hormon auxin, mức độ phát triển biểu mô, hình dạng tái sinh v.v Các đánh dấu như: số lượng thể nhiễm sắc, chất isoenzym, biểu gen v.v sử dụng để theo dõi, xác định chọn lọc dòng tế bào lai Phân tích kiểu nhân tế bào lai thực vật đóng vai trò quan trọng tế bào lai động vật mà ta xem xét 168 Sử dụng đột biến bổ trợ gen làm tiêu đánh dấu người ta phát trạng thái hoạt động gen so sánh tế bào lai lai soma với tế bào bố mẹ lai hữu tính Ví dụ, đem lai soma từ tế bào trung mô hai thể đột biến thuốc Nicotiana tobacum (đều khả tổng hợp chlorophil nên sinh trưởng chậm màu xanh) người ta thu nhận tế bào lai từ tái sinh thành toàn vẹn, lai soma giống lai hữu tính (giữa thể đột biến) đặc điểm như: tổng hợp chlorophil, có màu xanh sinh trưởng bình thường Khi nghiên cứu tượng bổ trợ gen nhà nghiên cứu phát thấy tế bào lai soma hai loài thuốc Nicotiana xuất phức hệ enzym diphotphoribulozocacboxilaza (có khối lượng phân tử 550.000D) enzym tham gia vào qúa trình quang hợp (cố định CO2) lục lạp phân tử lai Phức hệ chứa hai đơn vị mã hóa gen lục lạp thuộc loài bố mẹ, đơn vị lại enzym mã hóa hai gen hai loài bố mẹ Điều chứng tỏ có hoạt động bổ trợ ức chế gen thuộc hai loài chúng phối hợp hoạt động 7.6.2 Ưu lai soma thực vật Trong tự nhiên mức độ thể khó vượt qua hàng rào giới tính để xảy lai hữu tính cá thể thuộc loài khác lai hữu thụ, điều kiện invitro với phương pháp lai soma người ta tạo nhiều dạng lai loài xa chí chi, họ Ưu tế bào lai thực vật so với tế bào lai động vật không phương diện phương pháp, phân tích di truyền v.v mà quan trọng ứng dụng thực tiễn, từ tế bào lai thực vật người ta dễ dàng tái sinh toàn diện sử dụng việc tạo giống tăng suất trồng Ta xem xét số ưu đó: Sử dụng mô hình tế bào lai thực vật nghiên cứu nhiều vấn đề di truyền tế bào tế bào lai động vật: biểu điều chỉnh hoạt động gen qúa trình biệt hóa, bổ trợ tái tổ hợp gen Đồng thời kỹ thuật lai tế bào trần thực vật không đòi hỏi phức tạp như: lai động vật môi trường dinh dưỡng, hoạt chất kích thích dung hợp phức tạp virut, mà cần sử dụng polyethylen glicol kết hợp với xử lý ion canxi dễ dàng tạo tế bào lai với hiệu suất cao Từ mô thực vật thu nhận nhiều loại tế bào trần đơn bội, lưỡng bội, đa bội lệch bội từ dễ dàng chọn lọc nguyên liệu đồng để nghiên cứu mà không cần phải sử dụng kỹ thuật chọn dòng (clonning) phức tạp tế bào động vật Các dòng tế bào trần sống lâu dễ dàng tạo tế bào lai Đối với tế bào lai thực vật sử dụng nhiều đặc tính hình thái dễ quan sát làm kiểu đánh dấu như: có mặt lục lạp, đặc tính mô callus đặc tính hình thái tái sinh Ưu trội tế bào lai thực vật chỗ không tế bào trần mà tế bào lai nuôi cấy invitro phát triển thành mô callus từ tái sinh thành toàn vẹn, nghiên cứu biểu gen qúa trình phát sinh hình thái (morphogenesis) ứng dụng vào công nghệ tế bào công nghệ gen để tạo giống lai với đặc tính mong muốn, có suất cao, có khả chống chịu bệnh tật, thích nghi với điều kiện ngoại cảnh v.v 169 7.6 Công nghệ tế bào lai thực tiễn sản xuất Ở đề cập đến số ứng dụng thực tiễn công nghệ lai tế bào soma việc tạo giống trồng thực tiễn y học 7.6.2 Tạo chọn lọc giống trồng Như ta biết giới thực vật động vật sinh sản hữu tính cá thể hình thành từ thụ tinh hai cá thể bố mẹ, cá thể lai hữu tính chúng hữu thụ lai loài lai hữu tính khó vượt qua hàng rào phân loại Sự lai soma invitro tạo điều kiện cho phép lai tế bào thực vật động vật thuộc bậc phân loại xa Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần lai tế bào trần thực vật cho phép tái sinh dạng lai theo tính trạng mà nhà chọn giống thiết kế trước Tế bào trần tế bào lai mô hình lý tưởng để thực kỹ thuật chuyển gen, chuyển bào quan (ty thể, lục lạp), vi khuẩn virut vào tế bào, vào nhân từ tạo nên dạng lai, tái tổ hợp khác Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần tế bào lai có ý nghĩa đặc biệt quan trọng công tác tạo chọn giống trồng giống sinh sản hữu tính như: chuối, mía, khoai tây, sắn,v.v Ví dụ phương pháp kỹ thuật tế bào trần lai soma người ta tạo giống cải lai Brassica napus, Brassica campestris Raphanus sativus có mang đặc tính di truyền kiểu nhân B napus gen tái tổ hợp ty thể (R sativus) với lục lạp (B campestris) Cây lai có suất cao mà có khả chống chịu với thuốc diệt cỏ 7.6.2 Sản xuất kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) Kỹ thuật lai tế bào soma động vật invitro không để nghiên cứu di truyền tế bào soma mà ứng dụng thực nghiệm y học để sản xuất kháng thể đơn dòng kháng thể có tính đồng cấu trúc tính chất sử dụng miễn dịch học để nhận dạng phân tích kháng nguyên đặc thù, sử dụng kỹ thuật cấy ghép mô quan, chẩn đoán ung thư, dẫn dắt định hướng thuốc đễn nơi cần đến v.v Kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng tóm tắt sau (hình 7.2): 170 Hình 7.2 Mô hình sản xuất kháng thể đơn dòng - Chuột nhắt gây miễn dịch kháng nguyên đó, huyết miễn dịch chuột có chứa kháng thể đa dòng khác dòng tế bào limpho B sản xuất loại kháng thể đơn dòng - Bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro với môi trường chọn lọc có chứa HAT (gồm Hypoxantin, Aminopterin Timidin) người ta nuôi tế bào limpho B tách từ lách chuột miễn dịch với tế bào u tủy myeloma người ta thu nhận tế bào lai (hybridoma) - Các tế bào limpho B có khả tổng hợp kháng thể chống chịu môi trường chứa HAT chúng không sống lâu nhanh chóng bị chết Các tế bào u tuỷ myeloma khả tổng hợp kháng thể chúng có khả sống lâu điều kiện nuôi cấy invitro, môi trường chọn lọc có HAT chất chúng không chống chịu chúng bị chết Trái lại tế bào lai vừa có khả tổng hợp kháng thể, sống môi trường chứa HAT lại vừa có khả phân bào sống lâu dài Bằng kỹ thuật chọn dòng (clonning) để tạo quần thể tế bào xuất phát từ tế bào lai dòng tế bào lai sản xuất loại phân tử kháng thể hoàn toàn giống - kháng thể đơn dòng Kháng thể đơn dòng sản xuất hàng loạt có nhiều ứng dụng thực tiễn Chúng dùng để chẩn đoán chữa trị bệnh nhiễm trùng, dùng để thử nghiệm miễn dịch để phát kháng nguyên với nồng độ thấp Các kháng thể đơn dòng chống kháng nguyên ung thư sử dụng để chẩn đoán điều trị ung thư đặc biệt có hiệu dùng kết hợp với hóa chất độc ricin chẳng hạn Có thể dùng kháng thể đơn dòng dẫn dắt hướng chất thuốc đến mô ung thư để tiêu diệt chúng không gây ảnh hưởng tác hại đến mô lành Kết hợp với kỹ thuật chuyển gen với kỹ thuật lai soma, người ta chế kháng thể đơn dòng đặc hiệu người không gây nên phản ứng miễn dịch có hại dùng chúng 171 Vấn đề thảo luận chương 7: Trình bày tiêu chí phân biệt tế bào soma tế bào sinh dục Giải thích chế biệt hóa tế bào mức độ hình thái chức hoạt hóa gen Tế bào lai soma gì? Nêu đặc điểm tế bào lai soma Nêu số ví dụ công nghệ tế bào công nghệ tế bào lai soma Thực hành kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật thực vật, công nghệ tế bào trần, tạo tế bào lai tái sinh thực vật [...]... tế bào lai người ta thường sử dụng tế bào bố mẹ đặc biệt là các tế bào ung thư của các mô như tế bào melanom (tế bào ung thư sắc t ), hepatom (tế bào ung thư gan), teratom (tế bào ung thư sinh dục), neuroblastom (tế bào ung thư thần kinh), hoặc các tế bào của các chủng quần biệt hóa cao ổn định như: tế bào limpho, tế bào sợi, tế bào dòng hồng cầu v.v Ví dụ khi lai tế bào melanom của chuột hamster (là... và tế bào trở thành nguyên bào hay còn gọi là tế bào trần (protoplast) Trong nuôi cấy invitro các tế bào trần dễ dàng dung hợp tạo các tế bào lai giống như tế bào động vật và còn có ưu thế hơn ở chỗ các tế bào lai có thể phát triển thành các khối tế bào đa năng (callus) và từ đó tạo thành phôi ( ược gọi là phôi soma) và sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh 7. 6.2 Phương pháp tạo tế bào trần (protoplast)... bromodeoxiuridin (BUDR) (là chất được chuyển hóa bởi thymidin kinaza và có khả năng gắn vào ADN làm tế bào chết), người ta thấy những dòng tế bào mọc được (chứng tỏ không có thymidin kinaza) đều không có thể nhiễm sắc 17 (hình 7. 1) Bằng phương pháp phân tích các dòng tế bào lai và kiểu nhân, người ta đã phát hiện được 19 gen và vị trí phân bố của chúng trong thể nhiễm sắc số 1 166 Hình 7. 1 Sơ đồ phương... nhiễm sắc số 17 bằng tế bào lai soma 7. 5 Lai tế bào soma và công nghệ tế bào thực vật Tế bào thực vật khác biệt với tế bào động vật về nhiều đặc tính, trong đó có đặc điểm tồn tại ở tế bào thực vật lớp thành vỏ xenlulozơ bao ngoài màng sinh chất Vỏ xenlulozơ ngăn cản các tế bào thực vật dung hợp với nhau invitro Bằng các phương pháp cơ học (vi phẫu thuật) hoặc hóa học (xử lý bằng enzym) người ta có... động tức là phiên mã và dịch mã Như vậy, trong tế bào lai không xuất hiện melanin chứng tỏ các gen đó của tế bào melanom đã bị ức chế Ví dụ, khi đem lai tế bào hepatom của chuột nhắt (là tế bào tích cực tổng hợp albumin) với tế bào bạch cầu người (là tế bào không tổng hợp albumin) người ta thu được tế bào lai trong đó bộ thể nhiễm sắc của chuột nhắt được giữ nguyên nhưng đa số thể nhiễm sắc của người... Trình bày tiêu chí phân biệt tế bào soma và tế bào sinh dục 2 Giải thích cơ chế của sự biệt hóa tế bào ở mức độ hình thái chức năng và hoạt hóa của gen 3 Tế bào lai soma là gì? Nêu các đặc điểm của tế bào lai soma 4 Nêu một số ví dụ về công nghệ tế bào và công nghệ tế bào lai soma 5 Thực hành về kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật và thực vật, về công nghệ tế bào trần, tạo tế bào lai và tái sinh cây ở thực... tính axetylcholinesteraza cao, xuất hiện các cấu tạo hình thái như vi sợi thần kinh, các phân nhánh tế bào chất v.v Khi sử dụng tế bào neuroblastom chuột nhắt lai với các loại tế bào khác nhau như tế bào L chuột nhắt, nguyên sợi bào (fibroblast) người ta thu nhận được quần thể tế bào lai đa dạng về kiểu đánh dấu tế bào nơron, ví dụ tế bào lai từ neuroblastom chuột nhắt với fibroblast người, thể 164... tế bào trần Hiệu quả tạo tế bào trần còn tuỳ thuộc vào loại mô và cây được sử dụng 1 67 Cũng cần chú ý là các tế bào trần có thể sống invitro và tái tạo lại vỏ xenlulozơ và trở thành tế bào nhiều nhân hoặc nhân đa bội do hiện tượng nội phân, hoặc do hiện tượng liên kết của hai hoặc vài tế bào cùng loại vì tế bào thực vật có đặc tính liên kết tế bào chất với nhau qua cầu nối tế bào chất (plamadesma)... của ty thể (mtADN) kiểm soát 165 7. 4 Lập bản đồ gen Nghiên cứu các đặc tính di truyền và biến dị của các tế bào lai soma đã cung cấp nhiều dẫn liệu làm sáng tỏ nhiều vấn đề của di truyền tế bào, di truyền phân tử như tập tính của thể nhiễm sắc trong chu kỳ tế bào, sự tái tổ hợp soma, sự điều hòa hoạt động của gen; của phôi sinh học như vấn đề lai các loài rất xa nhau, vấn đề biệt hóa tế bào, đồng thời... thành mô sẹo (callus) và tái sinh cây từ tế bào lai syncaryon không phụ thuộc vào phương pháp tạo tế bào lai 7. 6.2 Sự phát triển của tế bào lai Các tế bào trần được nuôi cấy invitro có thể chết, có thể dung hợp thành tế bào lai chứa 2 nhân khác loài - heterocaryon Nếu heterocaryon tái sinh thành vỏ xenlulozơ và phân bào sẽ được xem như chúng sống và phát triển Điều lý thú đối với lai tế bào trần ở thực ... (người) + + Hela (người) + + + + + - + + Hela (người) Đại thực bào (th ) Nguyên bào (chuột) Tế bào (chuột) Melanocy t (chuột) Ghi chú: + Tế bào II ARN Đại thực bào (th ) Tế bào limpho (chuột) Hồng... (tế bào ung thư sắc t ), hepatom (tế bào ung thư gan), teratom (tế bào ung thư sinh dục), neuroblastom (tế bào ung thư thần kinh), tế bào chủng quần biệt hóa cao ổn định như: tế bào limpho, tế. .. dụng: tế bào bố mẹ có đặc tính tính toàn (totipotential) đa (multipotential) ví dụ tế bào trứng thụ tinh, tế bào phôi giai đoạn sớm, tế bào teratoma (tế bào ung thư quan sinh dục) tế bào phôi