GIÁO TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH học phần 1

Khái niệm về Công nghệ Sinh học CNSH Công nghệ Sinh học Biotechnology là một thuật ngữ xuất hiện cách đâykhoảng 25 năm sau khi có khi có những thành tựu của công nghệ gen kỹ thuật tái tổ

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU VỀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

1.1 Khái niệm về Công nghệ Sinh học (CNSH)

Công nghệ Sinh học (Biotechnology) là một thuật ngữ xuất hiện cách đâykhoảng 25 năm sau khi có khi có những thành tựu của công nghệ gen (kỹ thuật tái tổhợp DNA) Có nhiều định nghĩa khác nhau về CNSH, tuy nhiên định nghĩa theo Liênđoàn Công nghệ Châu âu được nhiều người chấp nhận nhất:

Công nghệ sinh học là các quá trình sản xuất ở qui mô công nghiệp có sự tham gia của các tác nhân sinh học (ở mức độ cơ thể, tế bào hoặc dưới tế bào) dựa trên các thành tựu tổng hợp của nhiều bộ môn khoa học, phục vụ cho việc tăng của cải vật chất của xã hội và bảo vệ lợi ích của con người.

Như vậy CNSH không phải là một môn khoa học như hoá, lý, sinh học, haysinh học phân tử, … mà là một phạm trù sản xuất (công nghệ) Tác nhân sinh học ởmức độ cơ thể như động vật, thực vật, ở mức độ tế bào như tế bào vi sinh vật và ởmức độ dưới tế bào như gen, enzyme

Công nghệ sinh học có tính chất liên ngành, nó ứng dụng những thành tựucủa nhiều ngành khoa học vào sản xuất như di truyền học, hoá sinh học, sinh lý học,

vi sinh vật học, hoá học, tin học, cơ khí, …

Từ định nghĩa trên cho thấy công nghệ gen không phải là CNSH mà nó chỉlà một thành phần chủ chốt, là cơ sở, là động lực để thúc đẩy sự phát triển cực kỳnhanh chóng của công nghệ sinh học

1.2 Phân loại công nghệ sinh học

Tuỳ theo cách nhìn khác nhau mà công nghệ sinh học được phân loại theocác kiểu khác nhau Xét về tác nhân sinh học tham gia vào quá trình CNSH có thểchia thành các nhóm sau:

- CNSH động vật (Animal Biotechnology)

- CNSH thực vật ( Plant Biotechnology)

- CNSH vi sinh vật (Microbial Biotechnology)

- CNSH enzyme hay CN enzyme (Enzyme Biotechnology)

Ngoài ra còn có các khái niệm khác như CN protein (Protein Engineering),

CN gen (Gene Engineering) CN gen và CN protein luôn luôn xuyên suốt và là côngnghệ chìa khoá nằm trong CN thực vật, CN động vật và CN vi sinh vật

Dựa trên đối tượng phục vụ người ta cũng có thể chia CNSH thành:

- CNSH nông nghiệp

- CNSH y tế

- CNSH môi trường

1

- CNSH cổ điển (Ancient Biotechnology)

- CNSH hiện đại (Mordern Biotechnology)

Trong bài giảng này sẽ được trình bày theo cách phân loại CNSH theo đốitượng phục vụ

1.3 Lịch sử phát triển của CNSH

Điểm lại lịch sử cho thấy tổ tiên chúng ta cũng đã biết sử dụng các qui trìnhCNSH trong thực tiễn cuộc sống của mình như làm bánh mì, nấu rượu bia, làmphomat Tuy nhiên họ không hiểu bản chất của các quá trình công nghệ ấy màhành động theo kinh nghiệm và cảm tính

Đến cuối thế kỷ 19, Pasteure đã chỉ ra rằng vi sinh vật đóng vai trò quyếtđịnh trong các quá trình lên men Kết quả nghiên cứu của Pasteure là cơ sở cho sựphát triển của ngành công nghiệp lên men sản xuất dung môi hữu cơ như aceton,ethanol, butanol, isobutanol vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20

Dần dần các quá trình lên men sản xuất dung môi hữu cơ được thay thế bằngngành công nghiệp sản xuất hoá chất từ dầu mỏ Cũng trong giai đoạn này đã cónhững xu hướng cải tiến công nghệ lên men truyền thống Ví dụ: trong công nghệlên men ethanol nếu bổ sung vào môi trường lên men bisulphite (HSO3-) thì quá trìnhtích luỹ sẽ theo hướng tạo glycerol thay vì hướng tích luỹ ethanol Glycerol rất cầnđể chế tạo thuốc nổ

Giai đoạn phát triển quan trọng thứ hai là quá trình phát triển của CNSH sảnxuất thuốc kháng sinh penicilin Năm 1928 Alexander Fleming đã phát hiện được

khả năng kháng khuẩn của nấm mốc Penicillum notatum Tuy nhiên đến năm 1940

sản xuất penicillin được sản xuất trên qui mô lớn Thuốc kháng sinh penicillin đãcứu hàng triệu thương binh trong thế chiến thứ hai Trong thời kỳ này có một số cảitiến kỹ thuật và thiết bị lên men vô trùng cho phép làm tăng đáng kể năng suất lênmen Ngày nay ngành công nghiệp sản xuất thuốc kháng sinh có doanh thu trên 16tỷ USD (1994)

Sau thế chiến thứ hai, là giai đoạn hoàn thiện các qui trình CNSH truyềnthống, như tối ưu hoá quá trình lên men, chọn lọc và tạo ra các chủng vi sinh vật độtbiến siêu tổng hợp, làm tăng năng suất lên men Song song với những kết quả nàycác nghiên cứu sinh học phân tử, hoá sinh học có bước phát triển nhảy vọt làm cơ sởcho sự hình thành và phát triển cực kỳ nhanh chóng của CNSH hiện đại Đầu tiênphải kể đến công trình của Watson và Crick về mô hình xoắn kép DNA (1953) Sauđó là sự phát hiện hàng loạt các cấu trúc bậc I của các phân tử protein như insulincủa Sanger (1955) Sự phát hiện của restriction enzyme vào năm 1968 là công cụquan trọng của kỹ thuật DNA tái tổ hợp Năm 1972 đánh dấu một mốc quan trọngcủa CNSH khi Berg, Boyer và Cohen (Mỹ) đã tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp trong invitro Từ thành công này mở đầu cho sự phát triển như vũ bão của công nghệ gen,một cuộc cách mạng thực sự đối với sự phát triển sinh học và là động lực thúc đẩysự phát triển mạnh mẽ của CNSH, ngành công nghệ của thế kỷ 21

1.4 Triển vọng phát triển của CNSH ở thế kỷ 21

Như nhiều nhận định của các nhà khoa học và kinh tế thì thế kỷ 21 sẽ là kỷnguyên của CNSH và công nghệ thông tin Một điều lý thú là hai nghành công nghệmũi nhọn của thế kỷ 21 này có mối quan hệ chặt chẽ, tương hỗ cùng thúc đẩy nhauphát triển không ngừng Ví dụ: máy tính giúp các nhà sinh học xây dựng nhanhchóng mô hình phân tử protein, enzyme, thuốc, tìm ra mô hình ưu việt nhất như chohoạt tính sinh học cao hơn, chịu nhiệt tốt hơn bằng cách tạo ra cầu nối –S-S- Máytính giúp các nhà sinh học thực hiện nhanh hơn chương trình giải mã bộ gen Ngượclại CNSH ngày nay đang mở ra một tiềm năng to lớn cho công nghệ máy tính Đó làcác dự án triển vọng sản suất các chip sinh học (bọ điện tử) Đó là việc phát hiện ra

phân tử protein Bacteriorhodopsine của vi khuẩn Halobacterium hấp thụ ánh sáng và

dẫn đến biến đổi cấu trúc nội tại giống như lý thuyết nhị phân (có, không) cơ bảncủa máy tính Chip sinh học có khả năng lưu trữ thông tin rất lớn 1 bit/1nm3 so với1bit/1012nm của máy tính hiện nay Số lượng bài toán giải được trong 1s là 1020 sovới 1012 của máy tính nhanh nhất Ngoài ra chip sinh học ít tiêu tốn năng lượng

Triển vọng tiếp theo của CNSH phải kể đến các chương trình giải mã bộ gencủa người, vi sinh vật, thực vật (GENOMICS) Đáng chú ý nhất là chương trình giảimã bộ gen người với 3 tỷ nucleotide, chứa hơn 100.000 gen hiện nay đã có nhữngbước tiến đáng kể và dự tính là đến năm 2010 sẽ giải mã và xác định chức năng củatất cả các gen Thành tựu này có ý nghĩa quan trọng trong liệu pháp gen, chữa trị tậngốc các bệnh di truyền, bệnh ung thư, AIDS và nhiều bệnh khác Công việc nàycũng tiến hành tương tự với vi sinh vật, thực động vật và sẽ là một trong nhữngthành tựu vĩ đại nhất của con người trong tìm hiểu sinh giới

3

Các triển vọng khác trong nông nghiệp là các động vật chuyển gen(transgenic animal), thực vật chuyển gen (transgenic plant), tiếp tục được phát triểnvà nhân rộng Đưa các gen kháng thuốc diệt cỏ, các gen tổng hợp thuốc trừ sâu sinhhọc, gen tạo nốt sần cố định nito, gen cho năng suất cao, chất lượng tốt, dễ bảo quảncho cây trồng Đối với vật nuôi chuyển gen kháng bệnh, tăng chất lượng thịt, tạodòng vô tính (như cừu Dolly) để sản xuất ra hàng loạt vật nuôi cho năng suất và chấtlượng thịt tốt Ngoài ra đưa các gen mã hoá cho hocmon, vaccin, thuốc vào trongthực vật, tuyến sữa của vật nuôi để con người phòng và chữa bệnh bằng cách ănchuối hoặc uống sữa

Tài nguyên sinh học và môi trường cũng là một lãnh vực hứa hẹn những pháttriển và ứng dụng của CNSH trong thế kỷ 21 Chúng ta tin tưởng rằng CNSH thế kỷ

21 sẽ giúp con người phát triển bền vững hơn nữa tài nguyên và môi trường sống củamình

CHƯƠNG II: KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP DNA

Kỹ thuật tái tổ hợp DNA (Recombinant DNA technology) thường được gọi làkỹ thuật di truyền ra đời trên cơ sở hàng loạt những thành tựu của sinh học phân tử,hoá sinh học, vi sinh vật học, di truyền học, … Kỹ thuật tái tổ hợp DNA bao gồm mộttập hợp các kỹ thuật tách, cắt, nối ghép, chuyển và biểu hiện gen như mong muốn

Sự ra đời của kỹ thuật tái tổ hợp DNA bắt đầu từ những năm 1972-1973 khinhóm nghiên cứu của Berg, Boyer và Cohen (Mỹ) lần đầu tiên tạo được một phân từDNA tái tổ hợp từ ba nguồn vật liệu khác nhau là bộ gen của virus SV 40 gây bệnhung thư ở khỉ, một phần của bộ gen phage  và các gen của operon lactose của vikhuẩn E coli Đến năm 1977 có thể coi là một mốc lịch sử của kỹ thuật tái tổ hợpDNA với thành tựu của Boyer tạo ra hoc môn của não Somatostatin từ E coli đượcchuyển gen Sau đó một năm cũng Boyer tạo ra insulin (hoc môn tuyến tuỵ) từ E.coli

Có hai phát hiện quan trọng là công cụ cơ bản của kỹ thuật di truyền là sựphát hiện restriction enzyme và vector plasmid

2.1 Các enzyme rectriction endonuclease

Năm 1962 Arber lần đầu tiên đã chứng minh rằng vi khuẩn có nhữngenzyme đặc biệt có khả năng phân biệt được DNA của mình và DNA lạ Các

enzyme này có khả năng hạn chế (rectriction) sự phát triển của các phage trong tế

bào vi khuẩn bằng cách phân huỷ DNA của phage một cách đặc hiệu, do đó cácenzyme này được gọi là enzyme cắt hạn chế (restriction enzyme) Các restrictionenzyme có vai trò rất quan trọng trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA

Các restriction enzyme là một endonuclease nghĩa là chúng cắt liên kết phospho diester của phân tử DNA ở những điểm đặc hiệu nằm trong chuỗi DNA.

Các restriction enzyme chia làm ba nhóm, nhưng nhóm II là nhóm thường được sửdụng trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA Các restriction enzyme nhóm II nhận biết DNA

mạch kép ở những trình tự nhận biết và cắt ngay điểm nhận biết hoặc kế cận Các

trình tự nhận biết (recognition sequences) thường có 4 – 6 cặp nucleotide, đôi khitới 8 cặp nucleotide Những trình tự nhận biết đối xứng đảo ngược nhau gọi là

palindrom.

Mỗi một restriction enzyme có trình nhận biết đặc trưng Nếu vị trí cắt củarestriction enzyme ở giữa trình tự nhận biết thì tạo nên chuỗi DNA đầu bằng (bluntends) Ví dụ:

- Enzyme Hae III (Từ vi khuẩn Haemophilus aegyptium) có trình tự:

Nếu vị trí cắt nằm cạnh trình tự nhận biết thì tạo ra đầu lệch, còn gọi là đầudính (cohesive ends) Khi tạo thành đầu dính vì các base bổ sung nhau nên phân tửDNA dễ gắn lại với nhau như lúc chưa bị cắt Ví dụ:

7

- Enzyme EcoR I ( Từ vi khuẩn E.coli):

- Enzyme Bam HI (Từ Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens)

Hiện nay người ta đã phát hiện được trên 500 restriction enzyme với trên 120trình tự nhận biết khác nhau

2.2 Thu nhận gen

Ngay từ năm 1969 Becwitt và Shapiro đã phân lập được gen từ operonlactose của E.coli bằng các phương pháp vật lý và di truyền vi sinh cổ điển Ngàynay nguồn gen được thu nhận bằng ba phương pháp:

2.2.1 Tách thu nhận gen từ bộ gen

Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi ngay từ buổi đầu của kỹ thuật táitổ hợp DNA Toàn bộ bộ gen của sinh vật được cắt nhỏ thành những đoạn 15.000 –20.000 cặp base bằng phương pháp cơ học hoặc bằng restriction enzyme Sau đó cácđoạn DNA này được gắn vào plasmid tạo DNA tái tổ hợp Đây là phương pháp mangtính chất ngẫu nhiên, mò mẫm vì bộ gen của sinh vật chứa rất nhiều gen nên rất khóphân lập được gen cần thiết một cách chính xác (Ví dụ: ở người có trên 100.000gen) Tuy nhiên phương pháp này hiện nay vẫn sử dụng để thành lập ngân hàng gencủa các sinh vật (bank of genomic DNA)

2.2.2 Tổng hợp gen bằng phương pháp hoá học

Năm 1969 nhóm của Khorana đã tổng hợp nhân tạo được gen đầu tiên là genmã hoá tổng hợp tRNA của alanin của nấm men Gen này có chiều dài 77 cặpnucleotide, nhưng do không có trình tự điều hoà nên không hoạt động

Để tổng hợp nhân tạo gen bằng phương pháp hoá học cần biết được trình tựnucleotide của gen Trình tự nucleotide của gen được xác định phương pháp nghiêncứu trình tự axit amin của protein mà gen mã hoá hoặc bằng các phương pháp xácđịnh trình tự nucleotide

Lần đầu tiên vào năm 1977, Itakura và Boyer đã tổng hợp thành công genmã hoá cho hoc mon somatostatin của động vật có vú, và gen này đã biểu hiện trongtế bào E coli Sau thành công này nhiều gen đã được tổng hợp nhân tạo như gen mãhoá cho protein như gen tổng hợp hoc mon tăng trưởng của người somatotropin, hocmon trị tiểu đường insulin.

2.2.3 Sinh tổng hợp gen từ mRNA tương ứng

Đây là phương pháp mà ngày nay kỹ thuật tái tổ hợp DNA sử dụng rộng rãi.Phương pháp này dựa vào quá trình phiên mã ngược nhờ sử dụng enzyme phiên mã

ngược là reverse transcriptase Đây là enzyme xúc tác cho quá trình tổng hợp nên

DNA một mạch từ khuôn mRNA DNA tổng hợp từ mRNA gọi là c-DNA(complementary DNA) Từ c-DNA mạch đơn sẽ tổng hợp thành c-DNA mạch képnhờ enzyme DNA polymerase và nuclease S1 (hình 2.1)

Hình 2.1: Sinh tổng hợp gen từ mRNA

Ơû Eukaryote quá trình phiên mã xảy ra khá phức tạp Sau khi mRNA đượctổng hợp từ gen (tiền mRNA) thì mRNA phải trải qua giai đoạn trưởng thành(splicing) cắt bỏ những đoạn intron và nối các đoạn exon lại và ra tế bào chất đểtổng hợp protein Như vậy nếu tách được m RNA trưởng thành để tổng hợp cDNA thìgen sẽ mã hoá một cách chính xác cho protein

9

Để tách mRNA người ta dựa vào tính chất của mRNA có gắn đuôi poly Anên rất dễ tách nó ra khỏi hỗn hợp RNA bằng cách cho hỗn hợp chảy qua cốt có gắnpoly T Ngoài ra cơ thể động vật có nhiều tế bào chuyên hoá như tế bào tuỷ xươngtổng hợp hồng huyết cầu do đó trong tế bào này rất giàu mRNA của globin, hoặctuyến tơ của tằm chứa nhiều mRNA mã hoá tổng hợp fibroin do đó rất dễ táchmRNA.

Bằng phương pháp này người ta đã tổng hợp được gen globin của người, độngvật, chim, gen mã hoá ovalbumin trứng, fibroin tơ tằm, inteferon của người…

2.3 Các vector chuyển gen

Để chuyển gen từ sinh vật này sang sinh vật khác có thể thực hiện biến nạpbằng DNA hoặc bơm thẳng DNA vào tế bào Tuy nhiên bằng cách đơn giản nàyhiệu quả thấp vì phần lớn DNA lạ xâm nhập vào tế bào sẽ bị phân huỷ, DNA khôngtái tổ hợp thì không thể tự sao chép thành nhiều bản, do đó nó sẽ mất dần

Vì vậy cần phải có các vector để vận chuyển gen Vector chuyển gen là mộtphân tử DNA có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập trong tế bào và mang được gencần chuyển Các vector phải thoả mãn yêu cầu tối thiểu sau đây:

- Có trình tự khởi sự sao chép ori (Origin) để có thể tự sao chép mà tồn tại

độc lập

- Có các trình tự nhận biết (recognition sequence) để các restriction

enzyme cắt và gắn gen lạ vào Các trình tự nhận biết này phải cách xatrình tự khởi sự sao chép để tránh bị cắt nhầm

- Có các trình tự điều hoà (promoter) để có thể phiên mã gen lạ.

- Có các gen đánh dấu để dễ dàng phát hiện gen lạ trong quá trình chọn

lọc tế bào tái tổ hợp

- Các vector phải có kích thước càng nhỏ càng tốt để có thể mang mộtlượng tối đa DNA lạ Hơn nữa kích thước của vector nhỏ thì dễ dàng xâmnhập vào vi khuẩn và sao chép nhanh, hiệu quả hơn

2.3.1 Các vector chuyển gen là plasmid

Plasmid là những đoạn DNA ngắn (2-5 kb), dạng vòng, nằm ngoài nhiễm sắcthể, được tìm thấy lần đầu tiên ở vi khuẩn Sự sao chép của plasmid không phụthuộc vào sự sao chép của nhiễm sắc thể vi khuẩn Plasmid thường mang các genkháng thuốc kháng sinh như gen kháng tetracilin (TcR), gen kháng ampicilin (ApR).Mỗi tế bào vi khuẩn chứa tới hàng trăm plasmid Các vector plasmid có thể nhận 8-9

kb DNA lạ

Ví dụ: plasmid pBR 322 là một plasmid thông dụng, pBR 322 có 4363 bp,mang hai gen kháng thuốc kháng sinh là ApR và TcR và 20 vị trí nhận biết duy nhấtduy nhất của các restriction enzyme (hình 2.2) 11 trong số đó nằm vào các genkháng thuốc kháng sinh nên việc gắn xen một gen lạ vào một trong các vị trí đó sẽlàm mất tính kháng kháng sinh tương ứng, điều này rất tiện lợi để chọn lọc tế bào táitổ hợp.

Hình 2.2: Cấu trúc plasmid pBR 322 với 20 trình tự nhận biết của restrictionenzyme

Hiện nay plasmid đã trải qua ba thế hệ, các plasmid không ngừng được cảitiến, ngày càng có thêm nhiều đặc tính quí cho kỹ thuật tái tổ hợp

2.3.2 Các vector phage

Phage (thực khuẩn thể) là virus xâm nhiễm và làm tan vi khuẩn Việc sửdụng các phage làm vector có nhiều ưu điểm hơn so với plasmid :

- Phage được trang bị một hệ thống xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và cókhả năng sinh sôi rất nhanh vì vậy hiệu quả xâm nhiễm của phage caohơn nhiều so với plasmid

- Kích thước đoạn gen lạ mà vector phage mang được lớn hơn rất nhiều sovới plasmid Phage có thể tiếp nhận gen lạ có kích thước từ 15-23 kb.Phần lớn các vector phage sử dụng hiện nay đều bắt nguồn từ phage  Phage

 có kích thước là 48502 bp Tuy nhiên phage  có 1/3 số base không quan trọng

(stuffer) có thể cắt bỏ để tăng khả năng nhận gen lạ có kích thước lớn hơn

2.3.3 Các loại vector khác

11