HÓA SINH HỌC THỰC NGHIỆM CHƯƠNG NHỮNG NGUYÊN TẮC VÀ CHUẨN BỊ CƠ BẢN TRONG CÁC NGHIÊN CỨU HÓA SINH HỌC Những nguyên tắc an toàn làm việc với phòng thí nghiệm hóa sinh học - Cần tuân thủ nghiêm ngặt quy định phòng thí nghiệm - Một số hóa chất có độc tính cao, gây bỏng, gây mê, gây dị ứng có ảnh hưởng - - - a b c d nghiêm trọng, lâu dài đến sức khỏe người cần bảo quản nguyên tắc, sử dụng phương tiện bảo vệ thích hợp tiếp xúc Khi có cố làm đổ hóa chất rat ay, chân, quần áo hay phòng thí nghiệm phải dùng biện pháp sơ cứu thích hợp để nhanh chóng hạn chế tác hại sau phải báo cho cán hướng dẫn người có chuyên môn hay nghiệp vụ để xử lý Các hóa chất phóng xạ có quy định riêng làm việc với chất phóng xạ phải đọc kỹ quy định an toàn phóng xạ phải học qua lớp an toàn phóng xạ tổ chức có thẩm quyền huấn luyện Các loại tế bào mang thể tái tổ hợp nhiều phế thải thí nghiệm cần xử lý thải bỏ theo phương thức phù hợp để tránh gây tác hại đến người môi trường Bảo quản sử dụng hóa chất Bảo quản sử dụng hóa chất điều kiện đảm bảo thí nghiệm thành công thí nghiệm Bảo quản cất giữ hóa chất theo yêu cầu hãng sản xuất hay dẫn sách tra cứu Cần sử dụng hóa chất đạt độ tinh khiết phù hợp theo yêu cầu thí nghiệm Khi pha hay chuẩn bị hóa chất cần lưu ý nồng độ hòa tan tối đa chất khác nước dung môi hữu (ethanol, isopropanol,… ) khác Thời gian sử dụng bảo quản hóa chất tùy thuộc vào nồng độ hóa chất loại hóa chất Một số hóa chất phải chuẩn bị dạng vô trùng: dùng nồi hấp màng lọc tùy theo loại hóa chất Hạn chế tối đa làm nhiễm bẩn hóa chất trước, sử dụng phần lớn vật tư tiêu hao dùng cho hóa sinh học sinh học phân tử nên dùng lần dạng vô trùng Cách chuẩn bị số hóa chất dung dịch thường dùng Một số nồng độ 3.1 Nồng độ phần trăm Nồng độ phần trăm theo thể tích (w/v): số gam chất tan 100ml dung dịch VD: pha 80ml dd Na2CO3 2,5% Nồng độ phần trăm theo khối lượng (w/w): số gam chất tan 100g dung dịch VD: pha 250ml dd Na2CO3 14% Nồng độ phần trăm theo thể tích (v/v): số ml chất 100ml dung dịch Nồng độ mg% có nghĩa số mg chất 100g nguyên liệu hay hỗn hợp e Nồng độ % bão hòa nồng độ % so với khả hòa tan tối đa chất dung dịch f Nồng độ part per million (ppm) phần chất triệu g 3.2 Nồng độ phân tử gam M = mole/L: số phân tử gam chất tan có lít dung dịch VD: NaOH 0,3M, có nghĩa có 0,3x40=12g NaOh lít dung dịch 3.3 Nồng độ đương lượng N số đương lượng gam chất tan có lít dung dịch a Với acid nồng độ đương lượng tính số phân tử gam chất tan chia cho số ion H+ tham gia phản ứng trao đổi VD: HCl 1N, tức có 36,5g HCl lít dung dịch; H2SO4 1N, tức có 98g:2=49g H2SO4 lít dd b Với bazơ nồng độ đương lượng tính số phân tử gam chia cho số nhóm hydroxyl (OH-) phân tử chất VD: NaOH 2N, tức có 2x(40:1)=80g NaOH lít dung dịch; Mg(OH)2 0,5N tức có 0,5x(41:2)=10,25g Mg(OH)2 lít dd c Với chất oxy hóa-khử KmnO4 phản ứng với H2O2 … Ngoài ra, người ta dùng nồng độ “x” loại dung dịch chứa nhiều thành phần khác nhau, việc liệt kê đầy đủ thành phần, nồng độ thời gian nên đệm có tên chung theo ký tự cho dễ thực hiện, theo dõi Nồng độ làm việc nồng độ 1x Chuẩn bị nhanh dung dịch từ nồng độ nồng độ biết a Pha loãng nồng độ dung dịch n lần: ta cần lấy n-1 thể tích dung môi cho thêm thể tích dung dịch cần pha loãng dung dịch có nồng độ nhỏ n lần VD: Pha ATP 200mM thành ATP 2,4mM, ta lấy 200:2,4=83,3 lần Ta lấy n(83,3)1=82,3 thể tích (dung môi, nước) bổ sung 1thể tích ATP 200mM vào, lắc đều, ta có dung dịch ATP 2,4mM b Pha dung dịch có nồng độ phần trăm tương ứng từ dung dịch có nồng độ cao hơn: Ta cần pha X% từ dung dịch Y% có nồng độ cao ta lấy Xml dung dịch Y% bổ sung thêm nước đến Yml Cách chuẩn bị dung dịch đệm: có cách Cách Pha hai thành phần đệm ( có tính acid, có tính bazo) sau trộn chúng lại với theo tỉ lệ ghi bảng đệm để có dung dịch đệm với pH và nồng độ mong muốn Cách 2: Tính toán nồng độ và thể tích cần pha của đệm sau đó cân lượng hóa chất cần thiết của thành phần thứ nhất, hòa tan một thể tích nước vừa phải sau đó bổ sung từ từ thành phần thứ hai để đưa về giá trị pH cần pha, sau đó thêm nước để đạt thể tích tính toán ban đầu Lưu ý sử dụng đệm: - Đệm chỉ có khả đệm (duy trì pH hỗn hợp phản ứng ổn định) một vùng pH nhất định, thường là phạm vi dưới đơn vị pH so với giá trị pKa của đệm - - • - pH của một số đệm thay đổi theo nhiệt độ, độ pha loãng hay được bổ sung một số thành phần khác Chính vì vậy, cần kiểm tra pH của dung dịch đệm thay đổi nhiệt độ, pha loãng hay bổ sung thêm chất nào đó Một số đệm có thể hấp thụ ánh sáng tử ngoại, can thiệp vào phân tích, có thể thâm nhập qua màng tế bào và gây độc Trong một số phản ứng đệm phản ứng thường rất phức tạp, ngoài dung dịch đệm đảm bảo sự ổn định của pH thì người làm việc phải bổ sung thêm các chất khác như: NaCl,KCl, muối kim loại, gelatin, albumin… Các tính chất của hệ thống đệm tốt: pKa nằm ở vùng - Có độ hòa tan cao các hệ thống với dung môi chủ yếu là nước Không bị hoặc ít bị vận chuyển bởi các màng sinh học Bị ảnh hưởng tối thiểu bởi các muối Ít bị ảnh hưởng phân ly thành phần ion, hay thay đổi nồng độ, nhiệt độ Không tạo phức giữa đệm và ion kim loại Bền vững về mặt hóa học Ít hấp thụ ánh sáng tử ngoại và nhìn thấy Sẵn có ở dạng tinh khiết CHƯƠNG CÁC QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM THÔNG THƯỜNG Thu thập, chuẩn bị bảo quản mẫu nghiên cứu a Thu thập mẫu nghiên cứu - Mẫu nghiên cứu phải có nguồn gốc, lý lịch rõ ràng - Mẫu phải đủ về số lượng, chủng loại, khối lượng để triển khai đủ tạo số liệu tin cậy - Mẫu bảo quản phù hợp để không bị biến đổi hạn chế tối đa thay đổi sau • - lấy mẫu b Chuẩn bị mẫu nghiên cứu Các hợp chất sinh học tồn tại ở một hai dạng ngoại bào hoặc nội bào Việc thu nhận các hợp chất ngoại bào thường dùng ly tâm hoặc lọc để loại bỏ tế bào và các chất không tan khác.Tuy vậy, nhóm chất ngoại bào chỉ chiếm một phần rất nhỏ so với các chất nội bào Để thu dịch chiết tế bào hay mô, cần có phương pháp phá vỡ tế bào/mô phù hợp Các phương pháp chính được dùng: Nghiền đồng thể: sử dụng máy nghiền mô bằng tay hay gắn mô tơ… Siêu âm: phá vỡ bằng cách tạo sự va đập của mẫu tác động rung siêu âm tạo Thay đổi áp suất đột ngột: ép mẫu với một áp suất lớn rồi thả đột ngột Lắc hay va đập với cát thủy tinh: dùng máy làm vỡ hạt/tế bào tạo lực va đập, đồng thời mẫu có thêm cát thủy tinh thì mô và tế bào bị phá vỡ rất nhanh Phá vỡ bằng enzyme: Sử dụng enzyme phân hủy thành tế bào lysozyme và mutanolysin Phá vỡ bằng chất tẩy rửa: Một số chất tẩy rửa có thể phá vỡ các tế bào hay quan tử Phá vỡ bằng áp suất thẩm thấu: VD hồng cầu Phá vỡ bằng làm đông – làm tan đột ngột: Là pp dùng sự thay đổi nhiệt độ từ chỗ rất lạnh để tế bào bị đông cứng sau đó cho vào nhiệt độ làm tan đá để phá vỡ tế bào c Bảo quản mẫu nghiên cứu: - Các mẫu sinh học rất dễ bị biến đổi quá trình bảo quản, vì vậy sử dụng biện pháp bảo quản thích hợp cũng là vấn đề hết sức cần thiết Với mẫu sinh học thông thường lá, quả, mô động vật, dịch nuôi cấy vi khuẩn … bảo quản 40C Hạt hay mẫu mô thực vật (lá, thân) phơi khô bảo quản nhiệt độ phòng Những mẫu vật cần bảo quản lâu dài, dịch chiết tế bào, nhiều chế phẩm enzyme cần bảo quản nhiệt độ thấp Bố trí thí nghiệm xử lý kết a Nguyên tắc chung: Để một nghiên cứu có kết quả tốt, người làm thí nghiệm phải xác định rõ mục đích và các tiêu chí phải đạt được của nghiên cứu đó Từ đó, xác định các nội dung, phạm vi thí nghiệm cần thực hiện, xác đinh hay lựa chọn các phương pháp, kỹ thuật phải sử dụng Sau đó, lập kế hoạch thực hiện các thí nghiệm với các quy trình cụ thể b Xây dựng Protocol phân tích - Nguyên tắc phương pháp hay phép phân tích - Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị, máy móc dụng cụ - Cách làm hay bước tiến hành - Tính toán kết - Các vấn đề cần lưu ý - Kiểm tra độ tin cậy kết thu Phân tích định tính định lượng hợp chất sinh học Độ nhạy giới hạn thấp mà phép đo/phân tích đo/phân tích cách tin cậy Độ đặc hiệu phép đo/phân tích chất giới hạn hay khả phép đo/phân tích cho phép phân biệt chất với chất khác, đặc biệt chất tương tự Mức độ tin cậy phân tích khả lặp lại thí nghiệm kết Các phương pháp phân tích hóa sinh - Phương pháp chuẩn độ: La phương pháp có tính cổ điển dựa tương tác hóa học hợp chất quan tâm với chất khác có nồng độ biết kèm theo chất thị màu để đảm bảo phát điểm dừng phản ứng, từ tính lượng hay nồng độ chất quan tâm - Phương pháp đo quang phổ: Định lượng chất phép đo quang phổ phương pháp sử dụng phổ biến tất phân tích hóa sinh tính xác thuận tiện Phương pháp dựa hấp thụ ánh sáng số hợp chất vùng bước sóng định hàm lượng chất tính theo nguyên tắc định luật Lambert Beer Theo định luật độ hấp thụ ánh sang chất tỷ lệ với nồng độ chất thể qua công thức A = logI0/I = ε.l.c A: độ hấp thụ ánh sang I0: Cường độ tia tới ε: hệ số tắt phân tử gam I: Cường độ ánh sáng truyền qua l: độ dày dung dịch c: Nồng độ chất phân tích Hệ số tắt phân tử gam độ hấp thụ chất nồng độ 1M, sử dụng cuvette đo có chiều dày dung dịch 1cm điều kiện nhiệt độ, pH xác định Phương pháp huỳnh quang: Các pp đo huỳnh quang dựa đặc trưng số chất có khả nhận ánh sáng kích thích mức lượng cao xạ ánh sáng mức lượng thấp bước sóng đặc trưng nên người ta định lượng chất cần quan tâm Phương pháp miễn dịch: Trường hợp chất cần xác định có tính kháng nguyên, người ta dựa vào tương tác kháng nguyên – kháng thể tương ứng tạo để định lượng kỹ thuật phân tích hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme gọi tắt ELISA ( Enzyme linked Immunosorbant Assay) Kháng thể phép phân tích thường kháng thể đơn dòng có tính đặc hiệu cao o - - Minh họa: CPT+KTSC - KTTC+E — chất - sản phẩm có màu Enzyme có khả chuyển hóa chất không màu thành sản phẩm có màu Nồng độ chất cần phân tích định lượng qua nồng độ chất màu tạo thành đo theo nguyên tắc đo quang phổ hấp thụ - - Phương pháp phóng xạ: PP dựa sở đánh dấu hợp chất quan tâm nguyên tố phóng xạ.Nguyên tố đồng vị phóng xạ nguyên tố có hạt nhân không bền vững, phân rã kèm theo xạ hạt hay tia xạ đo thiết bị phóng xạ Phương pháp khổi phổ MS: Khối phổ phổ khối lượng Nguyên lý phép đo khối phổ là: hai phân tử A B xác định có khối lượng hoàn toàn giống chất, đặc biệt phân tử chất A cắt thành mảnh nhỏ, sau phân tích khối lượng mảnh nhỏ thấy phổ khối lượng thu giống hoàn toàn khối phổ chất B biết, chắn A B o Phân tích khối phổ sắc ký khí (Gass chromatography mass spectrometryGCMS) vào thời gian độ lớn đỉnh chất so với chất chuẩn có hàm lượng biết người ta nhận biết định lượng chất quan tâm o MALDI:(Matrix assisted laser desortion inoization) phương pháp ion hóa phản hấp thụ laser hỗ trợ chất PP MALDI ion protein tạo gia tốc qua trường điện từ chúng qua ống bay để đến detector Như thời gian bay (TOF) ion protein hay peptid ống thước đo tỷ số khối lượng điện tích (m/z) o Và, ESI MS ( Electrospray ionization mass spectrometry) phân tích khối phổ ion hóa phun điện tử Dung dịch protein phân tán thành giọt nhỏ tích điện nhờ cho qua kim nhỏ điện trường điện cao - a - b - a Cộng hưởng từ hạt nhân: Là PP đo phổ hấp thụ với số đặc trưng tương tự đo phổ nhìn thấy tử ngoại Nguyên lý dựa đặc trưng tất hạt nhân tích điện dương Các biện pháp nâng cao tính xác phân tích Các phương pháp nâng cao độ nhạy phép đo Cô đặc mẫu: Khi giới hạn phương pháp cho phép phát hàm lượng chất cần phân tích nhỏ cô đặc mẫu phương pháp đơn giản phép phân tích thực có kết Sửa dụng chất đồng vị phóng xạ: Sử dụng chất phát huỳnh quang Nhân Tích lũy hay quay vòng Các phương pháp nâng cao độ đặc hiệu phép đo Sử dụng phản ứng đặc trưng chất cần phân tích để tăng tính đặc hiệu Dựa tương tác đặc hiệu sinh học: Các tương tác sinh học sở để phát triển phép đo có tính đặc hiệu cao như: tương tác enzyme cà chất hay chất ức chế cạnh tranh, enzyme cofactor hay coenzyme, kháng nguyên kháng thể, hormone vitamine với thụ thể tương ứng, hay đoạn oligonucleotid có trình tư bổ sung lẫn Phân tích hoạt độ enzyme Nguyên tắc: E + S ↔ ES↔ES* ↔ E + P E: Enzyme S: chất P: sản phẩm ES: Phức chất hình thành enzyme chất ES*: phức chất enzyme với chất mà chất biến đổi gần sản phẩm phản ứng Hoạt độ enzyme xác định cách phân tích chất lại hay sản phẩm tạo thành phản ứng đơn vị thời gian, kết hợp hai Hoạt độ xúc tác enzyme tính đơn vị hoạt độ Một đơn vị hoạt độ enzyme lượng enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa micromol chất thành sản phẩm thời gian phút điều kiện phân tích Hoạt độ riêng enzyme tính số đơn vị hoạt độ enzyme miligram hay gram protein Hoạt độ riêng phản ánh mức độ tinh chế phẩm enzyme Để phân tích xác hoạt độ enzyme phản ứng xác định hoạt độ enzyme cần phải sử dụng nồng độ dư thừa chất cofactor (nếu enzyme cần cofactor) để phản ứng diễn khoảng thời gian xác định b Các phương pháp phân tích hoạt độ enzmyme: - Phân tích liên tục: phương pháp đo chất bị biến đổi liên tục hay sản phẩm tạo thành cách liên tục theo thời gian Áp dụng chất hay cách làm ngừng phản ứng thích hợp áp dụng với số enzyme dễ bị hoạt tính xúc tác điều kiện phân tích - Phân tích gián đoạn: pp cho enzyme tác dụng với chất điều kiện thích hợp sau khoảng thời gian định làm ngừng phản ứng enzyme, sau đo lượng chất lại sản phẩm tạo thành - Ngoài hai pp chủ yếu có số phương pháp khác như: PP đo độ nhớt, pp phân cực kế, pp đo áp suất khí……Tùy theo enzyme mà người ta thiết kế chất phù hợp pp thích hợp để định tính hay định lượng enzyme cần phân tích c Một số lưu ý phân tích hoạt độ hay thực phản ứng enzyme - pH nhiệt độ - Cơ chất, thành phần đệm, lực ion hay nồng độ muối, chất làm - Thời gian phản ứng mẫu phân tích phải đồng - Phải luôn có mẫu kiểm tra thích hợp để tránh sai số - Phương pháp làm ngừng phản ứng thích hợp CHƯƠNG PHÂN TÁCH CÁC CHẤT BẰNG LY TÂM Giới thiệu chung ly tâm Các loại ly tâm Một số điều cần lưu ý dùng ly tâm CHƯƠNG PHÂN TÁCH CÁC CHẤT BẰNG SẮC KÝ Nguyên tắc chung phương pháp sắc ký Sắc ký mỏng Sắc ký lọc gel Sắc ký trao đổi ion Sắc ký lực Một số loại sắc ký khác CHƯƠNG PHÂN TÁCH CÁC CHẤT BẰNG ĐIỆN DI Giới thiệu chung điện di Điện di gel polyacrylamide Điện di gel agarose Điện di xung trường Điện di miễn dịch thẩm tách miễn dịch Điện di hai chiều CHƯƠNG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC HỢP CHẤT SINH HỌC THƯỜNG GẶP Phương pháp định lượng Protein Phương pháp tách chiết DNA Phương pháp tách chiết RNA Phương pháp định lượng acid nucleic Phân tích số hợp chất sinh học phân tử nhỏ Phân tích hoạt độ số enzyme chất ức chế enzyme Tách chiết tinh protein ... phân tử chất VD: NaOH 2N, tức có 2x(40 :1) =80g NaOH lít dung dịch; Mg(OH )2 0,5N tức có 0,5x( 41: 2) =10 ,25 g Mg(OH )2 lít dd c Với chất oxy hóa- khử KmnO4 phản ứng với H2O2 … Ngoài ra, người ta dùng nồng... n lần VD: Pha ATP 20 0mM thành ATP 2, 4mM, ta lấy 20 0 :2, 4=83,3 lần Ta lấy n(83,3 )1= 82, 3 thể tích (dung môi, nước) bổ sung 1thể tích ATP 20 0mM vào, lắc đều, ta có dung dịch ATP 2, 4mM b Pha dung dịch... VD: HCl 1N, tức có 36,5g HCl lít dung dịch; H2SO4 1N, tức có 98g :2= 49g H2SO4 lít dd b Với bazơ nồng độ đương lượng tính số phân tử gam chia cho số nhóm hydroxyl (OH-) phân tử chất VD: NaOH 2N, tức