Kỹ thuật nuôi cấy meristem và tạo cây sạch bệnh virus

CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG NÔNG NGHIỆP Chuyên đề: Kỹ thuật nuôi cấy meristem và tạo cây sạch bệnh virus Nhóm 2: 1.Phạm Thanh Hà 2.Nguyễn Thị Thu Hằng... Kỹ thuật nuôi cấy meristem nuôi

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRONG NÔNG NGHIỆP

Chuyên đề: Kỹ thuật nuôi cấy meristem và

tạo cây sạch bệnh virus

Nhóm 2: 1.Phạm Thanh Hà

2.Nguyễn Thị Thu Hằng

I Kỹ thuật nuôi cấy meristem (nuôi cấy

đỉnh sinh trưởng)

Đỉnh sinh trưởng là phần chóp của búp lá hoặc thâncây nơi có thể sinh ra những phần mới từ đó, đỉnh

sinh trưởng thường mềm yếu rất mẫn cảm với ánh

sáng, nó chứa rất nhiều Auxin, nơi diễn ra trao đổi

chất rất mạnh

Kỹ thuật nuôi cấy meristem (hay còn gọi là nuôi cấyđỉnh sinh trưởng) là sử dụng mô phân sinh ngọn với 3-4 tiền phát khởi lá, tức là các đỉnh sinh trưởng có

kích thước từ 0,1– 0,15mm tính từ chóp sinh trưởng

2.2 Nuôi cấy phát triển thành cây trực tiếp

a, Nguyên vật liệu

Đoạn thân non của cây

b, Môi trường nuôi cấy

Môi trường MS bổ sung BA 2ppm và NAA

0,2ppm

c, Tiến hành

- Các cành mẫu non lấy từ vườn ươm về được cắt bỏ hết lá, cắt thành đoạn 2-3cm, cho vào bécher

- Rửa sạch cành mẫu bằng nước xà phòng loãng,

sau đó rửa sạch xà phòng bằng nước máy

- Đưa cành mẫu vào tủ cấy vô trùng, ngâm trong cồn 70% trong 2-3 phút

- Rửa sạch cồn bằng nước cất vô trùng 1 lần

- Rửa sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 6-7 lần cho hết mùi javel

- Cành mẫu được cắt bỏ cuống lá và 2 đầu của phần thân đã bị chất khử trùng tẩy trắng Chia cành mẫu thành các đốt 1cm.

- Cắm các đốt vào môi trường muôi cấy đã chuận bị, cho phần cuống lá hướng lên trên, chồi ngủ phải nằm trên mặt thoáng của môi trường

- Nuôi mẫu trong điều kiện sáng 2000lux/16h/ngày ở

250C

Lá mầm Chóp đỉnh sinh trưởng Chồi lá nách

Vòm tăng trưởng

Mô phân sinh

Hình: Đỉnh sinh trưởng

3 Nuôi cấy sinh trưởng cây địa lan

trong việc nuôi cấy mô địa lan

Phương pháp nuôi cấy:

- Chọn cây giống và mô phân sinh

- Chuẩn bi mô để nuôi cấy

- Môi trường nuôi cấy

A Chồi non tách từ cây mẹ ngoài vườn ươm

B Chồi non tách sơ bộ các lớp lá bao ngoài trước khi khử trùng

Phương pháp lấy mẫu và nuôi cấy invitro cây địa lan

C Tách đỉnh sinh trưởng dưới kính lúp trong điều kiện vô trùng

D Protocorm và chồi non hình thành sau 6-8 tuàn nuôi cấy

E Chồi non phát triển sau 6 tuần nuôi cấy có 2-3 lá, cao khoảng 4cm

F Chồi non hình thành rễ sau 6 tuần nuôi cấy

4 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây khoai tây

Morel Martin (1955) là những người đầu tiên dùngphương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để thu đượccây khoai tây không chứa virus

Phương pháp nuôi cấy:

- Trồng khoai tây vào đất, khi mầm cao 15cm lấy phần ngọn 6-8cm cắm vào đất bùn đã vô trùng

- Sau 3-4 tuần cắt bỏ ngọn mầm để thúc các chồi

nách phát triển

- Khi cây có nhiều lá,cắt đoạn và nhân lên nhiều cây, đồng thời đưa ra chuẩn đoán virus trên cây chỉ thị

- Sau khi đã chắc chắn không còn virus trên khoai

tây, các ống nghiệm được đưa vào nhân giống

II Tạo cây sạch bệnh virus

2 Nguyên lý

Nuôi cấy đỉnh phân sinh là nuôi cấy các mẫu nhỏcủa đỉnh chồi lên môi trường dinh dưỡng thích hợp đểchúng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh Phần mô

thường được dùng là vòm phân sinh (meristem dome)cộng thêm cặp lá đầu tiên

Mức độ hữu hiêu của quá trình làm sạch virus đốivới thực tiễn phụ thuộc vào những yếu tố sau:

- Khả năng xử lý nhiệt

- Khả năng nuôi cấy đỉnh phân sinh

- Phương pháp thử virus có độ chính xác cao

- Hệ số nhân giống vô tính cây khá cao

- Trồng các vật liệu sạch bệnh ban đầu dưới điều

kiện cách ly tốt, tránh được tái nhiễm

- Mức độ (diện tích) cho phép cung cấp đủ cây giống mới trong mỗi năm

3 Một số phương pháp làm sạch Virus

nuôi cấy đỉnh phân sinh

3.1 Xử lý nhiệt

Quá trình xử lý nhiệt được coi như là biện pháp làmsạch bệnh có cơ sở thực tiễn Với giả thiết chung là

trình sinh trưởng của thực vật trong khi xử lý nhiệt

cũng bị ức chế nhưng ít hơn vì thế những bộ phận

Vừa được sinh trưởng thường sạch hoặc nghèo virus

Tỷ lệ sạch bệnh của mẫu phụ thuộc vào thời gian xử

lý nhiệt độ tới hạn và phụ thuộc vào khả năng chịu

nhiệt của giống Xử lý nhiệt có tác dụng tốt với đa sốtrường hợp, song đôi khi mô tế bào của cây nhiễm

virus nhưng không bị loại trừ ở nhiệt độ cao do chủngvirus vẫn có khả năng sinh sản ở nhiệt độ này

3.2 Nuôi cấy đỉnh phân sinh

Phối hợp xử lý nhiệt với nuôi cấy đỉnh phân sinh là

phương pháp rất thuận lợi bởi vì thông qua xử lý nhiệtquá trình sinh sản của virus trong chồi ngọn bị ức chếmạnh và thông qua quá trình phân hóa đỉnh phân sinhtính sạch virus sẽ được đảm bảo với độ xác suất cao

và sử dụng môi trường Murashige-Skoog hoặc White

3.3 Biện pháp bổ trợ

Xử lý hóa chất: Là sử dụng hoá chất mà đó là những dẫn xuất halogen tiền thân của sự trao đổi chất axit nucleic.

4 Quy trình làm sạch virus

Nuôi cấy mô phân sinh

Cấy trong môi trường thích

-Duy trì sự sạch bệnh (thanh lọc, cách ly)

- Nhân bằng nhiều phương Cây bị nhiễm bệnh

5 Kết quả trong thực tiễn sản xuất 5.1 Tạo các giống cây sạch bệnh

a, Cây khoai tây

Khoai tây là cây trồng ở Châu Âu được nhân giống

vô tính và bị virus phá hoại nhiều nhất Người ta tạo racác giống cây sạch bệnh bằng quy trình thử virus vàtrồng ở các khu vực sạch bệnh để tránh tái nhiễm

thông qua các loài rệp lá Quy trình sử dụng chủ yếu

là giết các cây thảo có thể truyền bệnh vào củ khoaitây Quy trình này có thể nâng cao hiệu suất thông

qua xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Giống khoai tây sạch bệnh, virus

b, Cây hoa

Ở đối tượng cây hoa chỉ gặp những cây nhân

giống vô tính thường bị bệnh virus trong khi bước đầu người ta chỉ tập trung làm sạch bệnh ở những cây hoa có ý nghĩa kinh tế quan trọng (ví dụ: hoa cúc, hoa anh túc, hoa thủy tiên ) Hiện nay,

người ta bắt đầu nuôi cấy các loài hoa khác Xử lý nhiệt kết hợp với nuôi cấy đỉnh phân sinh được sử dụng để làm sạch virus ở hoa anh túc và hoa cúc

Cây hoa lan và hoa đồng tiền sạch bệnh, virus

c, Cây ăn quả

Cây ăn quả thường bị virus phá hoại một cách

mạnh nhất Các thể virus gây bệnh không những lantruyền khi nhân giống vô tính mà cả khi nhân giốngbằng hạt Quá trình xử lý nhiệt đối với cây ăn quả đếnnay thường được tiến hành chủ yếu ở những đoạncành mà các mắt của chúng sẽ được xử dụng để

ghép sau này

Cây dâu tây sạch bệnh virus

5.2 Kiểm định tính sạch bệnh virus

Có một số phương pháp xét nghiệm virus được ápdụng cho một số loại cây ví dụ như:

- Xét nghiệm bằng cây chỉ thị

- Phương pháp thử huyết thanh

- Xét nghiệm bằng lai phân tử

- Xét nghiệm bằng kính hiển vi

- Kiểm định tính sạch virus

5.3 Duy trì tính sạch bệnh

Vấn đề quyết định cuối cùng đối với thực tiễn nôngnghiệp liên quan tới thời gian duy trì được cây trồngsạch virus

Để tạo điều kiện cho các xí nghiệp sản xuất công

nghiệp cây giống thu được những thành tích to lớn

hơn nữa thì việc đầu tư hàng năm cho công tác chốngbệnh virus trở nên cần thiết Trong trường hợp nhângiống vô tính in vitro thì việc làm sạch virus càng phải

được coi là điều kiện trước tiên.