Kỹ thuật nuôi cấy meristem và tạo cây sạch bệnh virus

CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG NÔNG NGHIỆP Chuyên đề: Kỹ thuật nuôi cấy meristem tạo bệnh virus Nhóm 2: 1.Phạm Thanh Hà 2.Nguyễn Thị Thu Hằng I. Kỹ thuật nuôi cấy meristem (nuôi cấy đỉnh sinh trưởng) 1. Khái niệm Đỉnh sinh trưởng phần chóp búp thân nơi sinh phần từ đó, đỉnh sinh trưởng thường mềm yếu mẫn cảm với ánh sáng, chứa nhiều Auxin, nơi diễn trao đổi chất mạnh Kỹ thuật nuôi cấy meristem (hay gọi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng) sử dụng mô phân sinh với 3-4 tiền phát khởi lá, tức đỉnh sinh trưởng có kích thước từ 0,1– 0,15mm tính từ chóp sinh trưởng. 2. Nuôi cấy 2.1 Mục đích - Khử trùng mẫu đỉnh chồi - Khảo sát tái sinh trực tiếp từ nuôi cấy dỉnh chồi - Khảo sát thành lập protocorm từ nuôi cấy đỉnh chồi 2.2 Nuôi cấy phát triển thành trực tiếp a, Nguyên vật liệu Đoạn thân non b, Môi trường nuôi cấy Môi trường MS bổ sung BA 2ppm NAA 0,2ppm c, Tiến hành - Các cành mẫu non lấy từ vườn ươm cắt bỏ hết lá, cắt thành đoạn 2-3cm, cho vào bécher - Rửa cành mẫu nước xà phòng loãng, sau rửa xà phòng nước máy - Đưa cành mẫu vào tủ cấy vô trùng, ngâm cồn 70% 2-3 phút - Rửa cồn nước cất vô trùng lần - Xử lý mẫu Ca(OCl)2 6% 10 phút sau thay dung dịch Ca(OCl)2 5% phút - Rửa mẫu nước cất vô trùng 6-7 lần cho hết mùi javel - Cành mẫu cắt bỏ cuống đầu phần thân bị chất khử trùng tẩy trắng. Chia cành mẫu thành đốt 1cm. - Cắm đốt vào môi trường muôi cấy chuận bị, cho phần cuống hướng lên trên, chồi ngủ phải nằm mặt thoáng môi trường - Nuôi mẫu điều kiện sáng 2000lux/16h/ngày 250C Lá mầm Chóp đỉnh sinh trưởng Chồi nách Vòm tăng trưởng Mô phân sinh Hình: Đỉnh sinh trưởng 3. Nuôi cấy sinh trưởng địa lan Năm 1962 George Morel lần thành công việc nuôi cấy mô địa lan. Phương pháp nuôi cấy: - Chọn giống mô phân sinh - Chuẩn bi mô để nuôi cấy - Môi trường nuôi cấy - Phương pháp thử virus có độ xác cao - Hệ số nhân giống vô tính cao - Trồng vật liệu bệnh ban đầu điều kiện cách ly tốt, tránh tái nhiễm - Mức độ (diện tích) cho phép cung cấp đủ giống năm 3. Một số phương pháp làm Virus Có hai phương pháp xử lý nhiệt nuôi cấy đỉnh phân sinh 3.1 Xử lý nhiệt Quá trình xử lý nhiệt coi biện pháp làm bệnh có sở thực tiễn. Với giả thiết chung virus bị ức chế sinh sản nhiệt độ từ 34-400C. Quá trình sinh trưởng thực vật xử lý nhiệt bị ức chế phận Vừa sinh trưởng thường nghèo virus. Tỷ lệ bệnh mẫu phụ thuộc vào thời gian xử lý nhiệt độ tới hạn phụ thuộc vào khả chịu nhiệt giống. Xử lý nhiệt có tác dụng tốt với đa số trường hợp, song mô tế bào nhiễm virus không bị loại trừ nhiệt độ cao chủng virus có khả sinh sản nhiệt độ này. 3.2 Nuôi cấy đỉnh phân sinh Phối hợp xử lý nhiệt với nuôi cấy đỉnh phân sinh phương pháp thuận lợi thông qua xử lý nhiệt trình sinh sản virus chồi bị ức chế mạnh thông qua trình phân hóa đỉnh phân sinh tính virus đảm bảo với độ xác suất cao sử dụng môi trường Murashige-Skoog White. 3.3 Biện pháp bổ trợ Xử lý hóa chất: Là sử dụng hoá chất mà dẫn xuất halogen tiền thân trao đổi chất axit nucleic. 4. Quy trình làm virus Cây bị nhiễm bệnh -Xác định virus - Xử lý nhiệt độ cao Nuôi cấy mô phân sinh Cấy môi trường thích hợp -Xử lý nhiệt độ tiếp - Xử lý hóa chất - Điều kiện nuôi cấy thích hợp Tái sinh Trồng vườn ươm -Duy trì bệnh (thanh lọc, cách ly) - Nhân nhiều phương Xét nghiệm virus bằng: -Cây thị - Kính hiển vi điện tử - Ghép - Huyết thanh, elisa Cây bệnh Người sử dụng 5. Kết thực tiễn sản xuất 5.1 Tạo giống bệnh a, Cây khoai tây Khoai tây trồng Châu Âu nhân giống vô tính bị virus phá hoại nhiều nhất. Người ta tạo giống bệnh quy trình thử virus trồng khu vực bệnh để tránh tái nhiễm thông qua loài rệp lá. Quy trình sử dụng chủ yếu giết thảo truyền bệnh vào củ khoai tây. Quy trình nâng cao hiệu suất thông qua xử lý nhiệt nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Giống khoai tây bệnh, virus b, Cây hoa Ở đối tượng hoa chỉ gặp những nhân giống vô tính thường bị bệnh virus bước đầu người ta chỉ tập trung làm sạch bệnh ở những hoa có ý nghĩa kinh tế quan trọng (ví dụ: hoa cúc, hoa anh túc, hoa thủy tiên .). Hiện nay, người ta bắt đầu nuôi cấy các loài hoa khác. Xử lý nhiệt kết hợp với nuôi cấy đỉnh phân sinh được sử dụng để làm sạch virus ở hoa anh túc và hoa cúc. Cây hoa lan hoa đồng tiền bệnh, virus c, Cây ăn Cây ăn quả thường bị virus phá hoại một cách mạnh nhất. Các thể virus gây bệnh không những lan truyền nhân giống vô tính mà cả nhân giống bằng hạt. Quá trình xử lý nhiệt đối với ăn quả đến thường được tiến hành chủ yếu ở những đoạn cành mà các mắt của chúng sẽ được xử dụng để ghép sau này. Cây dâu tây bệnh virus 5.2 Kiểm định tính bệnh virus Có số phương pháp xét nghiệm virus áp dụng cho số loại ví dụ như: - Xét nghiệm thị. - Phương pháp thử huyết thanh. - Xét nghiệm lai phân tử. - Xét nghiệm kính hiển vi. - Kiểm định tính virus. 5.3 Duy trì tính bệnh Vấn đề quyết định cuối cùng đối với thực tiễn nông nghiệp liên quan tới thời gian trì được trồng sạch virus. Để tạo điều kiện cho các xí nghiệp sản xuất công nghiệp giống thu được những thành tích to lớn nữa thì việc đầu tư hàng năm cho công tác chống bệnh virus trở nên cần thiết. Trong trường hợp nhân giống vô tính in vitro thì việc làm sạch virus càng phải được coi là điều kiện trước tiên. [...]... vào nhân giống II Tạo cây sạch bệnh virus 1 Cơ sở khoa học Làm sạch virus là việc phải giải phóng các thực vật bị nhiễm virus khỏi virus Các phương pháp làm sạch virus - Xử lí nhiệt và hóa chất - Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và chọn lọc bằng phương pháp thử virus 2 Nguyên lý Nuôi cấy đỉnh phân sinh là nuôi cấy các mẫu nhỏ của đỉnh chồi lên môi trường dinh dưỡng thích hợp để chúng sinh trưởng và tạo cây. .. sạch bệnh a, Cây khoai tây Khoai tây là cây trồng ở Châu Âu được nhân giống vô tính và bị virus phá hoại nhiều nhất Người ta tạo ra các giống cây sạch bệnh bằng quy trình thử virus và trồng ở các khu vực sạch bệnh để tránh tái nhiễm thông qua các loài rệp lá Quy trình sử dụng chủ yếu là giết các cây thảo có thể truyền bệnh vào củ khoai tây Quy trình này có thể nâng cao hiệu suất thông qua xử lý nhiệt và. .. cao Nuôi cấy mô phân sinh Cấy trong môi trường thích hợp -Xử lý nhiệt độ tiếp - Xử lý hóa chất - Điều kiện nuôi cấy thích hợp Tái sinh cây Trồng trong vườn ươm -Duy trì sự sạch bệnh (thanh lọc, cách ly) - Nhân bằng nhiều phương Xét nghiệm virus bằng: -Cây chỉ thị - Kính hiển vi điện tử - Ghép - Huyết thanh, elisa Cây sạch bệnh Người sử dụng 5 Kết quả trong thực tiễn sản xuất 5.1 Tạo các giống cây sạch. .. mẫu và nuôi cấy invitro cây địa lan A Chồi non tách từ cây mẹ ngoài vườn ươm B Chồi non tách sơ bộ các lớp lá bao ngoài trước khi khử trùng C Tách đỉnh sinh trưởng dưới kính lúp trong điều kiện vô trùng D Protocorm và chồi non hình thành sau 6-8 tuàn nuôi cấy E Chồi non phát triển sau 6 tuần nuôi cấy có 2-3 lá, cao khoảng 4cm F Chồi non hình thành rễ sau 6 tuần nuôi cấy 4 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây. .. phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để thu được cây khoai tây không chứa virus Phương pháp nuôi cấy: - Trồng khoai tây vào đất, khi mầm cao 15cm lấy phần ngọn 6-8cm cắm vào đất bùn đã vô trùng - Sau 3-4 tuần cắt bỏ ngọn mầm để thúc các chồi nách phát triển - Khi cây có nhiều lá,cắt đoạn và nhân lên nhiều cây, đồng thời đưa ra chuẩn đoán virus trên cây chỉ thị - Sau khi đã chắc chắn không còn virus trên... thường sạch hoặc nghèo virus Tỷ lệ sạch bệnh của mẫu phụ thuộc vào thời gian xử lý nhiệt độ tới hạn và phụ thuộc vào khả năng chịu nhiệt của giống Xử lý nhiệt có tác dụng tốt với đa số trường hợp, song đôi khi mô tế bào của cây nhiễm virus nhưng không bị loại trừ ở nhiệt độ cao do chủng virus vẫn có khả năng sinh sản ở nhiệt độ này 3.2 Nuôi cấy đỉnh phân sinh Phối hợp xử lý nhiệt với nuôi cấy đỉnh... chúng sẽ được xử dụng để ghép sau này Cây dâu tây sạch bệnh virus 5.2 Kiểm định tính sạch bệnh virus Có một số phương pháp xét nghiệm virus được áp dụng cho một số loại cây ví dụ như: - Xét nghiệm bằng cây chỉ thị - Phương pháp thử huyết thanh - Xét nghiệm bằng lai phân tử - Xét nghiệm bằng kính hiển vi - Kiểm định tính sạch virus 5.3 Duy trì tính sạch bệnh Vấn đề quyết định cuối cùng đối... nhiệt kết hợp với nuôi cấy đỉnh phân sinh được sử dụng để làm sạch virus ở hoa anh túc và hoa cúc Cây hoa lan và hoa đồng tiền sạch bệnh, virus c, Cây ăn quả Cây ăn quả thường bị virus phá hoại một cách mạnh nhất Các thể virus gây bệnh không những lan truyền khi nhân giống vô tính mà cả khi nhân giống bằng hạt Quá trình xử lý nhiệt đối với cây ăn quả đến nay... thông qua xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Giống khoai tây sạch bệnh, virus b, Cây hoa Ở đối tượng cây hoa chỉ gặp những cây nhân giống vô tính thường bị bệnh virus trong khi bước đầu người ta chỉ tập trung làm sạch bệnh ở những cây hoa có ý nghĩa kinh tế quan trọng (ví dụ: hoa cúc, hoa anh túc, hoa thủy tiên ) Hiện nay, người ta bắt đầu nuôi cấy các loài hoa... sinh sản của virus trong chồi ngọn bị ức chế mạnh và thông qua quá trình phân hóa đỉnh phân sinh tính sạch virus sẽ được đảm bảo với độ xác suất cao và sử dụng môi trường Murashige-Skoog hoặc White 3.3 Biện pháp bổ trợ Xử lý hóa chất: Là sử dụng hoá chất mà đó là những dẫn xuất halogen tiền thân của sự trao đổi chất axit nucleic 4 Quy trình làm sạch virus Cây bị nhiễm bệnh -Xác định virus - Xử lý . TRONG NÔNG NGHIỆP Chuyên đề: Kỹ thuật nuôi cấy meristem và tạo cây sạch bệnh virus Nhóm 2: 1.Phạm Thanh Hà 2.Nguyễn Thị Thu Hằng I. Kỹ thuật nuôi cấy meristem (nuôi cấy đỉnh sinh trưởng) 1 Nuôi cấy sinh trưởng cây địa lan Năm 1962 George Morel lần đầu tiên thành công trong việc nuôi cấy mô địa lan. Phương pháp nuôi cấy: - Chọn cây giống và mô phân sinh - Chuẩn bi mô để nuôi cấy - Môi. đoạn và nhân lên nhiều cây, đồng thời đưa ra chuẩn đoán virus trên cây chỉ thị. - Sau khi đã chắc chắn không còn virus trên khoai tây, các ống nghiệm được đưa vào nhân giống II. Tạo cây sạch bệnh