PE PGRS proteins in mycobacterial pathogenicity and host response

PE­PGRS PROTEINS IN MYCOBACTERIAL  PATHOGENICITY AND HOST RESPONSE  KOH KAH WEE  (B.Sc.(Hons.), NUS  A THESIS SUBMITTED  FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY  DEPARTMENT OF MICROBIOLOGY  NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE Acknowledgements  I  wish  to  extend  my  heartfelt  appreciation  and  deepest  gratitude  to  the  following  people.  My  thesis  supervisor,  Dr  Seah  Geok  Teng,  for  her  guidance,  encouragement  and  patience  throughout  my  course  of  study.  Her  advice  beyond  academic and research concerns has been, and will always be, appreciated. My thesis  advisory  committee  member  Dr  Norbert  Lehming,  for  his  invaluable  guidance  and  advice  on  the  ubiquitin  study,  and  for  generously  contributing  some  molecular  reagents  and  vectors.  Senior  laboratory  officer,  Mrs  KT  Thong,  for  her  technical  assistance  and  encouragement,  and  ensuring  that  the  laboratory  is  always  well  equipped. Staff at Tan Tock Seng Hospital (TB Control Unit) and Clifford Dispensary,  for  patient  recruitment  and  phlebotomy.  My  laboratory  colleagues  for  processing  blood  samples  and  storing  serum  samples  (Joanne),  assistance  in  generating  recombinant  Rv3812 PE­PGRS  protein  (Shu  E),  culturing  Mycobacterium  tuberculosis  for obtaining genomic DNA (Carmen), assistance in animal care and organ processing  (Peiying and Radiah). For sharing cell lines, mouse strains, vectors or equipment used  in  this  study,  NUS  Yong  Loo  Lin  School  of  Medicine  faculty  members  A/Prof YH  Gan (B3Z  cells),  Dr  M  Taylor  (J774A.1  cells),  Prof  ML  Ng  (HeLa  cells),  Dr  SH  Wong (DC2.4 cells), Prof DM Kemeny (OT­1 mice), Dr E Hung (pcDNA3 plasmid),  Prof  SH  Chan  and  Hongxiang  (FPLC  system  for protein  purification).  My  past  and  present  laboratory  colleagues,  Caiyun,  Carmen,  Chai  Lian,  Irene,  Jen  Yan,  Nicola,  Winnie and Wei Xing for their encouragement and friendship. Last but not least, my  dearest  family  and  Zhengxiu  for  their  understanding,  care  and  concern,  and  always  being there for me. i  Table of Contents  Acknowledgements  i  Table of Contents  ii  Summary  vii  List of Tables  viii  List of Figures  ix  List of Abbreviations  xi  Chapter 1: Thesis overview, Aims and Approaches  1  1.1 Thesis overview  1  1.2 Aims and approaches  3  Chapter 2: Literature Review  6  2.1 Tuberculosis  2.1.1 Clinical aspects  2.1.2 Pathogenesis and host response  6  6  8  2.1.2.1 Mycobacterium interactions with host macrophages  2.1.2.2 Granuloma formation  2.1.2.3 Mycobacterium antigen presentation  2.1.2.4 T cell antigens  2.1.2.5 B cell antigens  2.1.2.6 Roles of T and B cells in immune protection  2.1.2.6.1 CD4 +  T cells  2.1.2.6.2 CD8 +  T cells  2.1.2.6.3 Mycobacterium­specific antibodies  2.1.2.7 T cell cytokines which influence cell­mediated immunity to tuberculosis  2.1.2.7.1 Interferon­gamma  2.1.2.7.2 Interleukin­10  2.1.2.8 Mycobacterium strategies for subverting and evading host immunity  2.1.2.8.1 Suppression of innate immune response  2.1.2.8.2 Remodelling phagosomes  2.1.2.8.3 Resistance against reactive nitrogen intermediates  2.1.2.8.4 Down­regulating antigen processing and presentation  2.1.3 Genome sequence of Mycobacterium tuberculosis  2.1.3.1 PE and PPE multigene families  2.2 The PE­PGRS family of proteins  2.2.1 Structural role of Rv1818c PE­PGRS  protein  8  9  12  12  13  14  14  15  16  17  17  18  19  19  20  21  22  22  23  23  25 ii  2.2.2 PE­PGRS proteins as virulence factors  2.2.3 PE­PGRS proteins in mycobacterium persistence  2.2.4 Antigenic properties of PE­PGRS proteins  2.2.5 Polymorphisms associated with antigenic variation  2.2.6 Differential expression of PE­PGRS proteins  2.2.7 PE­PGRS protein interactions with host immunity  2.2.7.1. Induction of macrophage death  2.2.7.2 Induction of T cell apoptosis  2.2.8 Characteristics of two specific PE­PGRS proteins  2.2.8.1 Rv0978c PE­PGRS  protein  2.2.8.2. Rv3812 PE­PGRS  protein  2.2.8.3 Microarray studies  2.2.8.4 Computational predictions of Rv0978c PE­PGRS  and Rv3812 PE­PGRS  localisation  26  27  27  28  31  34  34  36  37  37  37  38  40  Chapter  3:  Human  Antibody  Responses  to  Rv0978c PE­PGRS  and  Rv3812 PE­  PGRS  proteins  41  3.1 Abstract  41  3.2 Introduction  42  3.3 Materials and methods  3.3.1 Generating recombinant Rv0978c PE­PGRS  and Rv3812 PE­PGRS  proteins  44  44  3.3.1.1 Bacterial strains and growth conditions  3.3.1.1.1 Bacterial strains  3.3.1.1.2 Growth medium and conditions  3.3.1.2 Plasmid vectors  3.3.1.3 Genomic DNA extraction  3.3.1.4 Polymerase chain reaction (PCR)  3.3.1.5 Purification of PCR amplicons  3.3.1.6 Cloning of specific gene amplicons into expression vector  3.3.1.7 Preparation of chemically competent cells  3.3.1.8 Transformation of Escherichia coli  3.3.1.9 Plasmid extraction  3.3.1.10 Plasmid analysis and DNA sequencing  3.3.1.11 Expression of recombinant proteins  3.3.1.12 Extraction of inclusion bodies  3.3.1.13 Protein purification by affinity chromatography  3.3.1.14 Protein dialysis  3.3.1.15 Concentrating recombinant proteins  3.3.1.16 Protein electrophoresis (SDS­PAGE) and Coomassie brilliant blue staining  3.3.1.17 Western blot analysis  3.3.1.18 In­gel digestion and MS/MS sequencing of the protein digest  3.3.1.19 Quantifying protein using Bradford Assay  3.3.2 Immunological study of antibody responses to PE­PGRS proteins  3.3.2.1 Selection of human study cohort  3.3.2.2 Enzyme­linked immunosorbent assay (ELISA)  3.3.2.3 Statistical analysis  3.4 Results  3.4.1 PE domain consensus sequence  3.4.2 Expression of recombinant PE­PGRS proteins  3.4.3 Confirmation of identity of purified recombinant proteins  44  44  44  44  45  46  47  48  48  49  50  50  52  52  53  54  55  55  56  58  59  60  60  62  63  64  64  66  66 iii  3.4.4 Optimisation of serum dilutions by titrations against recombinant proteins  70  3.4.5 Antibody responses of different clinical groups to PE­PGRS proteins  74  3.4.6 Antibody responses to Rv0978c PE  and Rv0978c PE­PGRS  proteins  76  PE  PE­PGRS  3.4.7 Antibody responses to Rv3812  and Rv3812  proteins  77  3.4.8 Antibody responses to 38­kDa antigen  79  3.4.9 Correlation of antibody responses to full­length and truncated Rv3812 PE­PGRS  proteins  81  3.5 Discussion  84  Chapter  4:  PGRS  Domain  Mediates  Resistance  to  Proteasome  Degradation  96  4.1 Abstract  96  4.2 Introduction  97  4.3 Materials and Methods  101  4.3.1 Bacterial strains and growth conditions  101  4.3.2 Eukaryotic expression vector  101  4.3.3 Amplification of genes via Polymerase Chain Reaction  102  4.3.4 Purification of sequencing products  105  4.3.5 pcDNA3­UbX­2HA­eGFP constructs  106  4.3.6 pcDNA3­UbX­2HA­Rv0978c PE / PE­PGRS  constructs  107  4.3.7 In vitro transfection  107  4.3.8 Co­immunoprecipitation  109  4.3.9 MHC Class I­peptide presentation assay  109  4.3.10 Enzyme­linked immunosorbent assay for IL­2 measurement  110  4.3.11  Generating  primary  bone  marrow  derived  macrophages  (BMDM)  and  dendritic cells (BMDC)  111  4.3.12 Murine immunisation and cell preparation  112  4.3.13 Cytotoxicity assays  114  4.3.14 Statistical analysis  116  4.4 Results  117  4.4.1 Designing stable and unstable eGFP fusion proteins  117  4.4.2 PE domain is susceptible to proteasomal degradation  119  4.4.3 Full­length PE­PGRS is relatively stable to proteasomal degradation  123  4.4.4 MHC class I epitope recognition and cytotoxic response  124  4.4.5 T cells responding to PE­PGRS protein are less lytic against mycobacterium­  infected cells  129  4.5 Discussion  131  Chapter  5:  Biological  and  Immunological  Roles  of  Rv3812 PE­PGRS  protein  140  5.1 Abstract  140  5.2 Introduction  141 iv  5.3 Materials and Methods  5.3.1 Bacterial strains and growth conditions  5.3.2 Generating BCG strains overexpressing Mb3842 PE­PGRS  protein  143  143  143  5.3.2.1 Plasmid vectors  5.3.2.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)  5.3.2.3 Preparation of competent M.  bovis BCG for transformation  5.3.2.4 Transformation of M.  bovis BCG  5.3.2.5 Plasmid extraction from transformed M. bovis BCG  143  144  145  146  147  5.3.3 Generation of polyclonal anti­Rv3812 PE­PGRS  antibodies  147  5.3.4 Enzyme­linked immunosorbent assay  148  5.3.5 Mycobacterium cell fractionation  150  5.3.6 Western Blot  152  5.3.7 Bacterial growth kinetics  152  5.3.8 Measurement of survival of BCG strains in macrophages  153  5.3.9 Measurement of infectivity of BCG strains in macrophages  154  5.3.10 Preparation of complement­inactivated polyclonal rabbit IgG  155  5.3.11 Endotoxin removal  156  5.3.12 Measurement of endotoxin levels and endotoxin suppression  156  5.3.13 Murine immunisation and cell processing  157  5.3.14 Lymphocyte stimulation for cytokine measurement  158  5.3.15 Enzyme­linked immunospot (ELISPOT) assay  159  5.3.16  Assay  of  induction  of  TNF­a  in  primary  macrophages  treated  with  PE­PGRS proteins  160  5.3.17 Statistical analysis  160  5.4 Results  161  5.4.1 Over­expression of Mb3842 PE­PGRS  and specificity of anti­serum  161  PE­PGRS  5.4.2  Overexpression  Mb3842  does  not  confer  survival  advantage  in  non­  replicating persistence  163  PE­PGRS  5.4.3 Titration of anti­Rv3812  antibody responses  165  5.4.4 Localisation of Mb3842 PE­PGRS  in cell wall and cell membrane  167  PE­PGRS  5.4.5 Effects of Mb3842  overexepression on bacterium­cell interactions  168  5.4.6 Blocking Mb3842 PE­PGRS  protein does not affect BCG cell entry  171  5.4.7 Cytokine responses to Rv3812 PE­PGRS  174  PE­PGRS  5.4.8 Primary macrophage response to Rv3812  176  5.4.9 Murine immunisation with Rv3812 PE­PGRS  177  5.5 Discussion  181  Chapter 6: Final discussion  189  6.1 Summary of research findings  189  6.2 Future directions  190  6.2.1 PE­PGRS polymorphisms and clinical correlates of serological responses  190  6.2.2 Processing and presentation of PE­PGRS proteins  191  6.2.3 In  vivo  functional  roles  of  Rv3812 PE­PGRS  and  nature of  protective  immunity  192  6.2.4 Rv3812 PE­PGRS  as a vaccine or immunotherapy  193 v  Chapter 7: References  195  Chapter 8: Appendices  215  8.1 Preparation of plasmid miniprep extraction solutions  8.1.1 Cell resuspension solution  8.1.2 Cell lysis solution  8.1.3 Neutralisation solution  215  215  215  215  8.2 Preparation of Glucose­Tris­EDTA solution (GTE)  215  8.3 Preparation of buffers for E. coli inclusion body extraction  8.3.1 Resuspension buffer  8.3.2 Lysis buffer  8.3.3 Wash Buffer 1  8.3.4 Wash Buffer 2  216  216  216  216  216  8.4 Preparation of buffer for protein purification using FPLC  8.4.1 Buffer B (pH 8.0)  8.4.2 Buffers C – F  217  217  217  8.5 Preparation of reagents required for SDS­PAGE  8.5.1 Casting of SDS­PAGE gels  8.5.2 SDS­PAGE running buffer, 5x (pH 8.3)  8.5.3 SDS sample (loading) buffer, 6x  8.5.4 SDS­PAGE Gel staining Solution  8.5.5 SDS­PAGE Gel de­staining Solution  217  217  218  218  219  219  8.6 Preparation of reagents for Western Blot  8.6.1 Protein Transfer Buffer, 5x (pH 8.3)  8.6.2 Tris buffered saline – 0.05 % Tween 20 (TBS­T)  8.6.3 Blocking and immunodetection solutions  8.6.4 Membrane Stripping Buffer  219  219  219  220  220  8.7 Preparation of buffers for Enzyme­linked immunosorbent assay (ELISA) 220  8.7.1 Coating Buffer (pH 8.0)  220  8.7.2 Washing Buffer  220  8.7.3 Blocking Buffer  221  8.8 Preparation of FAC (triple supplement), 10 x  221  8.9 Expression of recombinant proteins  8.9.1 Expression vectors and host strains  8.9.2 Protein purification strategy  221  221  222  8.10 Properties of some family members of PE­PGRS proteins  223  8.11  IgG  levels  of  individual  subjects  to  PE­PGRS  proteins  and  mycobacterial  38­kDa antigen  225 vi  Summary  The  PE­PGRS  protein  family  is  unique  to  and  abundantly  found  in  mycobacteria,  yet  their  functions  are  largely  unknown.  The  proteins  consist  of  a  conserved  N­terminal  Pro­Glu  (PE)  domain  and  C­terminal  polymorphic  GC­rich  repetitive sequences (PGRS) which are multiple tandem repetitions of Gly­Gly­Ala or  Gly­Gly­Asn  motifs. This study  investigated  immune responses directed against two  such proteins and their roles in host­pathogen interactions. Human patients with active  or  latent  tuberculosis  infection,  but  not  uninfected  persons,  showed  strong  antibody  responses to Rv3812 PE­PGRS  protein, but not to Rv0978c PE­PGRS , although responses to  both  PE  domains  were  minimal.  Using  a  system  for  studying  ubiquitin­proteasome  mediated  protein  degradation,  the  Gly­Ala  rich  PGRS  domain  was  shown  to  protect  the highly unstable PE domain of Rv0978c PE­PGRS  from proteolytic degradation, hence  influencing  antigen  processing  via  the  major  histocompatibility  complex  class  I  pathway,  leading  to reduced  CD8 +  T  cell  recognition  and  suggesting  a  possible  role  for  PE­PGRS  proteins  in  immune  evasion.  Rv3812 PE­PGRS  protein  was  found  to  be  a  cell  wall  and  cell­membrane  associated  protein,  but  it  is  unlikely  to  be  involved  in  mycobacterium entry into host macrophages. Cellular immune responses to the PGRS  but not the PE domain of this protein were observed in mycobacterium­infected mice.  Murine  immunisation  with  recombinant  Rv3812 PE­PGRS  induced  B  and  T  cell  responses to both domains, suggesting that this vaccine may be both prophylactic and  therapeutic  in  overcoming  the  failure  of  natural  Mycobacterium  infections  to  elicit  adaptive responses to the PE domain of this protein family. This study has elucidated  some  immune  mechanisms  underlying  the  role  of  PE­PGRS  proteins  in  Mycobacterium  interactions  with  host  cells,  with  relevance  to  immunodiagnosis  and  immunoprophylaxis of early tuberculosis infection. vii  List of Tables  Table 3­1: Primers for gene cloning to generate full­length and truncated  Rv0978c PE­PGRS  and Rv3812 PE­PGRS  proteins.  47  Table 3­2: Primers used for DNA sequencing of cloned plasmid vectors  51  Table 3­3: Immunological criteria for patient selection and their antibody responses  to PE­PGRS proteins.  75  Table 3­4: Disease extent and response to Rv3812 PE­PGRS  and Rv3812 PE  proteins in  active TB patients.  83  Table 4­1: Primers for gene cloning  104  Table 4­2: Primers used for DNA sequencing of cloned plasmid vectors.  105  Table 4­3: Amino acid sequences of SIINFEKL fusion polypeptides.  126  Table 5­1: Primers used for cloning and sequencing pMV361­Mb3842 and verifying  transformants  145  Table 8­1: Properties of PE­PGRS proteins.  224  Table 8­2 (part 1): IgG levels (relative OD units / ml) of individual subjects to PE­  PGRS proteins and mycobacterial 38­kDa antigen.  226  Table 8­2 (part 2): IgG levels (relative OD units / ml) of individual subjects to PE­  PGRS proteins and mycobacterial 38­kDa antigen.  227  Table 8­2 (part 3): IgG levels (relative OD units / ml) of individual subjects to PE­  PGRS proteins and mycobacterial 38­kDa antigen.  228 viii  List of Figures  Fig. 3­1: PE domain consensus sequence.  65  Fig. 3­2: Expression vector.  66  Fig. 3­3: SDS­PAGE and Western blot analysis of Rv0978c PE / PE­PGRS  and Rv3812 PE  / PE­PGRS  recombinant proteins.  67  Fig. 3­4: Mass spectrometry (MS/MS) analysis of peptide masses following AspN  treatment.  69  Fig. 3­5: Optimising serum dilutions for Rv0978c PE­PGRS .  71  Fig. 3­6: Optimising serum dilutions for Rv3812 PE­PGRS .  72  Fig. 3­7: Optimising serum dilutions for 38­kDa protein.  73  Fig. 3­8: Serum antibody responses to Rv0978c PE  and Rv0978c PE­PGRS  proteins.  77  Fig. 3­9: Serum antibody responses to Rv3812 PE  and Rv3812 PE­PGRS  proteins.  78  Fig. 3­10: Serum antibody responses to Mtb 38­kDa protein.  80  Fig. 3­11: Correlations between responses to Rv3812 PE­PGRS  and Rv3812 PE  proteins.  82  Fig. 4­1: Plasmid map of eukaryotic expression vector pcDNA3.  102  Fig. 4­2: Plasmid map of pcDNA3­UbX­2HA­eGFP vector.  106  Fig. 4­3: Ubiquitin fusions for targeting eGFP or PE­PGRS proteins for proteasomal  degradation.  118  Fig. 4­4: Proteolytic stability of eGFP fusion proteins.  119  Fig. 4­5: Ub­PE fusion proteins are highly unstable and their degradation is reduced  by adding proteasome inhibitor.  122  Fig. 4­6: PGRS domain containing GA repeats prevents proteasome­dependent  degradation of the PE domain.  124  Fig. 4­7: PE and PGRS epitopes at N­terminus of SIINFEKL fusion polypeptide  reduce specific T cell recognition of SIINFEKL.  127  Fig. 4­8: Antigen­presenting cell processing and presentation of PE­PGRS­  SIINFEKL fusion polypeptides results in reduced SIINFEKL­specific CD8 +  T  cell cytotoxicity.  128 ix  Chapter 7: References  _____________________________________________________________________  Via LE, Fratti RA, McFalone M, Pagan­Ramos E, Deretic D and Deretic V (1998).  Effects of cytokines on mycobacterial phagosome maturation. J Cell Sci 111  ( Pt 7): 897­905.  Via  LE,  Lin  PL,  Ray  SM,  Carrillo  J,  Allen  SS,  Eum  SY,  Taylor  K,  Klein  E,  Manjunatha  U,  Gonzales  J,  Lee  EG,  Park  SK,  Raleigh  JA,  Cho  SN,  McMurray  DN,  Flynn  JL  and  Barry  CE,  3rd  (2008).  Tuberculous  granulomas  are  hypoxic  in  guinea  pigs,  rabbits,  and  nonhuman  primates.  Infect Immun 76(6): 2333­40.  Vordermeier HM, Harris DP, Friscia G, Roman E, Surcel HM, Moreno C, Pasvol G  and Ivanyi J (1992). T cell repertoire in tuberculosis: selective anergy to an  immunodominant  epitope  of  the  38­kDa  antigen  in  patients  with  active  disease. Eur J Immunol 22(10): 2631­7.  Voskuil  MI,  Schnappinger  D,  Rutherford  R,  Liu  Y  and  Schoolnik  GK  (2004).  Regulation  of  the  Mycobacterium  tuberculosis  PE/PPE  genes.  Tuberculosis  (Edinb) 84(3­4): 256­62.  Voskuil  MI,  Schnappinger  D,  Visconti  KC,  Harrell  MI,  Dolganov  GM,  Sherman  DR  and  Schoolnik  GK  (2003).  Inhibition  of  respiration  by  nitric  oxide  induces  a  Mycobacterium  tuberculosis  dormancy  program.  J  Exp  Med  198(5): 705­13.  Voskuil  MI,  Visconti  KC  and  Schoolnik  GK  (2004).  Mycobacterium  tuberculosis  gene  expression  during  adaptation  to  stationary  phase  and  low­oxygen  dormancy. Tuberculosis (Edinb) 84(3­4): 218­27.  Wadee  AA,  Kuschke  RH  and  Dooms  TG  (1995).  The  inhibitory  effects  of  Mycobacterium  tuberculosis  on  MHC  class  II  expression  by  monocytes  activated  with  riminophenazines  and  phagocyte  stimulants.  Clin  Exp  Immunol 100(3): 434­9.  Walburger  A, Koul  A, Ferrari G, Nguyen  L, Prescianotto­Baschong C, Huygen  K,  Klebl B, Thompson C, Bacher G and Pieters J (2004). Protein kinase G from  pathogenic  mycobacteria  promotes  survival  within  macrophages.  Science  304(5678): 1800­4.  Wang JP, Rought SE, Corbeil J and Guiney DG (2003). Gene expression profiling  detects  patterns of  human  macrophage  responses  following  Mycobacterium  tuberculosis infection. FEMS Immunol Med Microbiol 39(2): 163­72.  Wayne  LG  and  Hayes  LG  (1996).  An  in  vitro  model  for  sequential  study  of  shiftdown  of  Mycobacterium  tuberculosis  through  two  stages  of  nonreplicating persistence. Infect Immun 64(6): 2062­9.  WHO (2008). Global tuberculosis control : surveillance, planning, financing : WHO  report 2008. Geneva, Switzerland, World Health Organisation.  Wilkinson  RJ,  Haslov  K,  Rappuoli  R,  Giovannoni  F,  Narayanan  PR,  Desai  CR,  Vordermeier  HM,  Paulsen  J,  Pasvol  G,  Ivanyi  J  and  Singh  M  (1997).  Evaluation  of  the  recombinant  38­kilodalton  antigen  of  Mycobacterium  tuberculosis as a potential immunodiagnostic reagent. J Clin Microbiol 35(3):  553­7.  Winau  F,  Weber  S,  Sad  S,  de  Diego  J,  Hoops  SL,  Breiden  B,  Sandhoff  K,  Brinkmann  V,  Kaufmann  SH  and  Schaible  UE  (2006).  Apoptotic  vesicles  crossprime  CD8  T  cells  and  protect  against  tuberculosis.  Immunity  24(1):  105­17.  Wojciechowski W, DeSanctis J, Skamene E and Radzioch D (1999). Attenuation of  MHC  class  II  expression  in  macrophages  infected  with  Mycobacterium 213  Chapter 7: References  _____________________________________________________________________  bovis  bacillus  Calmette­Guerin  involves  class  II transactivator  and  depends  on the Nramp1 gene. J Immunol 163(5): 2688­96.  Wong  DK,  Lee  BY,  Horwitz  MA  and  Gibson  BW  (1999).  Identification  of  fur,  aconitase,  and  other  proteins  expressed  by  Mycobacterium  tuberculosis  under  conditions  of  low  and  high  concentrations  of  iron  by combined  two­  dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Infect Immun 67(1):  327­36.  Worku S and Hoft DF (2003). Differential effects of control and antigen­specific T  cells on intracellular mycobacterial growth. Infect Immun 71(4): 1763­73.  Ye  ZH,  Song  YR,  Marcus  A  and  Varner  JE  (1991).  Comparative  localization  of  three classes of cell wall proteins. Plant J 1(2): 175­83.  Yin Y, Manoury B and Fahraeus R (2003). Self­inhibition of synthesis and antigen  presentation  by  Epstein­Barr  virus­encoded  EBNA1.  Science  301(5638):  1371­4.  Zanetti  S,  Bua  A,  Delogu  G,  Pusceddu  C,  Mura  M,  Saba  F,  Pirina  P,  Garzelli  C,  Vertuccio  C,  Sechi  LA  and  Fadda  G  (2005).  Patients  with  pulmonary  tuberculosis develop a strong humoral response against methylated heparin­  binding hemagglutinin. Clin Diagn Lab Immunol 12(9): 1135­8.  Zhang  GL,  Srinivasan  KN,  Veeramani  A,  August  JT  and  Brusic  V  (2005).  PREDBALB/c:  a  system  for  the  prediction  of  peptide  binding  to  H2d  molecules,  a  haplotype  of  the  BALB/c  mouse.  Nucleic  Acids  Res  33(Web  Server issue): W180­3.  Zhao  W,  Schorey  JS,  Groger  R,  Allen  PM,  Brown  EJ  and  Ratliff  TL  (1999).  Characterization of the fibronectin binding motif for a unique mycobacterial  fibronectin attachment protein, FAP. J Biol Chem 274(8): 4521­6.  Zhong J, Gilbertson B and Cheers C (2003). Apoptosis of CD4+ and CD8+ T cells  during  experimental  infection  with  Mycobacterium  avium  is  controlled  by  Fas/FasL  and  Bcl­2­sensitive  pathways,  respectively.  Immunol  Cell  Biol  81(6): 480­6.  Zhu  XW  and  Friedland  JS  (2006).  Multinucleate  giant  cells  and  the  control  of  chemokine  secretion  in  response  to  Mycobacterium  tuberculosis.  Clin  Immunol 120(1): 10­20. 214  Chapter 8: Appendices  _____________________________________________________________________  Chapter 8: Appendices  8.1 Preparation of plasmid miniprep extraction solutions  8.1.1 Cell resuspension solution  25 ml of 1 M Tris HCl at pH 7.5  10 ml of 0.5 M EDTA at pH 8.0  The above components were made up to 500 ml with distilled water then autoclaved  (121  °C  for  15  min).  Prior  to  use,  50  mg  of  RNAse  A  was  added.  The  buffer  was  stored at 4 °C.  8.1.2 Cell lysis solution  440 ml of distilled water  10 ml of 10 M NaOH  50 ml of 10 % SDS  The solution was used without autoclaving, and stored at room temperature.  8.1.3 Neutralisation solution  64.7224  g  of  potassium  acetate  was  dissolved  in  distilled  water,  adjusted  to  pH  4.8  using glacial acetic acid, and made up to 500 ml with distilled water. The solution was  autoclaved at prior to use, and stored at room temperature.  8.2 Preparation of Glucose­Tris­EDTA solution (GTE)  10 ml of 0.5 M Glucose  2.5 ml of 1 M Tris HCl (pH 8.0)  2 ml of 0.5 M EDTA (pH 8.0)  The above components were made up to 100 ml with distilled water, and autoclaved  for sterilisation. Lysozyme (final concentration 20 mg/ml) was added prior to use. 215  Chapter 8: Appendices  _____________________________________________________________________  8.3 Preparation of buffers for E. coli inclusion body extraction  8.3.1 Resuspension buffer  25 ml of 1 M Tris HCl, pH 8.0 (0.05 M)  250 g sucrose (50 % w/v)  1 ml of 0.5 M EDTA (1 mM)  1 g sodium azide (0.2 % w/v)  The buffer was made up to 500 ml with distilled water and stored at 4 °C till required  for use.  8.3.2 Lysis buffer  50 ml of 1 M Tris HCl, pH 8.0 (0.05 M)  10 ml TritonX­100 (1 % v/v)  10 mg sodium deoxycholate (0.001 % w/v)  5.8 g NaCl (100 mM)  1 g sodium azide (0.1 % w/v)  The buffer was made up to 1000 ml with distilled water and stored at 4 °C.  8.3.3 Wash Buffer 1  50 ml of 1 M TrisHCl, pH 8.0 (0.05 M)  5 ml TritonX­100 (0.5 % v/v)  5.8 g NaCl (100 mM)  2 ml of 0.5 M EDTA (1 mM)  1 g sodium azide (0.1 % w/v)  The  buffer  was  adjusted  to  pH  8.0  using  1  M  NaOH  and  made  up  to  1000  ml  with  distilled water. The buffer was filter­sterilised and stored at 4 °C.  8.3.4 Wash Buffer 2  50 ml of 1 M TrisHCl, pH 8.0 (0.05 M)  2 ml of 0.5 M EDTA (1 mM)  1 g sodium azide (0.1 % w/v)  The  buffer  was  adjusted  to  pH  8.0  using  1  M  NaOH  and  made  up  to  1000  ml  with  distilled water. The buffer was filter­sterilised and stored at 4 °C. 216  Chapter 8: Appendices  _____________________________________________________________________  8.4 Preparation of buffer for protein purification using FPLC  8.4.1 Buffer B (pH 8.0)  7.80 g NaH2PO4  (100 mM)  0.60 g Tris­base (10 mM)  240.25 g urea (8 M)  The buffer was adjusted to pH 8.0 using 1 M NaOH, made up to a final volume of 500  ml with nano­pure water, and the buffer was filtered (to de­gas medium) prior to use.  8.4.2 Buffers C – F  Buffers C – F have chemical components similar to Buffer B (Section 8.4.1) and the  only difference is the final adjusted pH of the buffer.  Buffer C (100 ml) was adjusted to pH 6.3 using 1 M NaOH / 1 N HCl.  Buffer D (50 ml) was adjusted to pH 5.9 using 1 N HCl.  Buffer E (50 ml) was adjusted to pH 5.0 using 1 N HCl.  Buffer F (50 ml) was adjusted to pH 4.5 using 1 N HCl.  All  buffers  were  made  up  to  the  required  volume  with  nano­pure  water  and  filtered  prior to use. All buffers (buffers B – F) were freshly prepared and used immediately.  8.5 Preparation of reagents required for SDS­PAGE  8.5.1 Casting of SDS­PAGE gels  Separating gel ­ 10 %  8.0 ml nano­pure water  6.6 ml 30 % acrylamide/ 0.8 % bisacrylamide  5.0 ml 1.5 M Tris HCl (pH 8.8)  200 μl 10 % SDS  200 μl 10 % APS (ammonium persulfate)  8 μl TEMED (N,N,N',N'­Tetramethylethylenediamine)  Isopropanol was added on top of the gel in the gel casting plates to isolate the molten  gel from air. 217  Chapter 8: Appendices  _____________________________________________________________________  Separating gel ­ 12 %  6.6 ml nano­pure water  8.0 ml 30 % acrylamide/ 0.8 % bisacrylamide  5.0 ml 1.5 M Tris HCl (pH 8.8)  200 μl 10 % SDS  200 μl 10 % APS  8 μl TEMED  Isopropanol was added on top of the gel in the gel casting plates to isolate the molten  gel from air.  Stacking gel ­ 4 %  6.1 ml nano­pure water  1.3 ml 30 % acrylamide/ 0.8 % bisacrylamide  2.5 ml 0.5 M Tris HCl (pH 6.8)  100 μl 10 % SDS  100 μl 10 % APS  10 μl TEMED  The isopropanol on top of the polymerised separating gel was removed. The stacking  gel  mixture  was  overlaid  above  the  separating  gel  in  the  gel  casting  plates  and  the  well comb was inserted.  8.5.2 SDS­PAGE running buffer, 5x (pH 8.3)  3 g Tris­base  14.4 g glycine  10 ml 10 % SDS  The buffer was made up to 1000 ml with nano­pure water to prevent precipitation.  1 x running buffer was prepared by adding 100 ml of 5x SDS­PAGE running buffer to  400 ml of nanopure water.  8.5.3 SDS sample (loading) buffer, 6x  7 ml 0.5 M Tris HCl (pH 6.8)  3 ml glycerol (30 % final)  1 g SDS (10 % final)  0.93 g DTT (0.6 M final)  1.2 mg bromophenol blue (0.012 % final)  Buffer was made up to 10 ml with distilled water, aliquoted and stored at – 80 °C till  required. 218  Chapter 8: Appendices  _____________________________________________________________________  8.5.4 SDS­PAGE Gel staining Solution  100 ml acetic acid  200 ml methanol  0.2 g Coomassie blue  The  solution  was  made  up  to  1000  ml  with  distilled  water,  filtered  (Whatman  no.  2  paper) and stored at room temperature.  8.5.5 SDS­PAGE Gel de­staining Solution  100 ml acetic acid  200 ml methanol  The  solution  was  made  up  to  1000  ml  with  distilled  water,  and  stored  at  room  temperature.  8.6 Preparation of reagents for Western Blot  8.6.1 Protein Transfer Buffer, 5x (pH 8.3)  29 g Tris­base  145 g glycine  5.0 g SDS  The buffer was made up to 1000 ml with distilled water and autoclaved to sterilise.  1  x  protein  transfer  buffer  was  prepared  by  adding  200  ml  of  5x  Protein  Transfer  Buffer to 200 ml of methanol and made up to 1000 ml with distilled water. Buffer was  prepared fresh prior to use.  8.6.2 Tris buffered saline – 0.05 % Tween 20 (TBS­T)  100 ml of 1 M Tris HCl, pH 7.6  30 ml of 5 M NaCl  10 ml of 10 % Tween­20  The buffer was made up to 1000 ml with distilled water and autoclaved to sterilise. 219  Chapter 8: Appendices  _____________________________________________________________________  8.6.3 Blocking and immunodetection solutions  8.6.3.1 Blocking solution  1 g Skim milk powder (5 % w/v; Anlene)  200 mg BSA (1 % w/v)  The solution was made up to 20 ml with TBS­T and stirred with a magnetic stirrer till  fully dissolved.  8.6.3.2 Primary and secondary antibody solution  0.5 g Skim  milk powder (5 % w/v;  Anlene) was made up to 10 ml with TBS­T and  stirred  with  a  magnetic  stirrer.  Appropriate  amount of  primary  antibody  or  1.5  μl  of  anti­mouse  or  anti­rabbit  IgG,  Horseradish  Peroxidase  (HRP)­linked  antibody  (GL  Biosciences) was added prior to use.  8.6.4 Membrane Stripping Buffer  6.25 ml of 1 M Tris HCl, pH 8.0  2.0 g SDS  The  buffer  was  adjusted  to  pH  6.7  using  1  N  HCl  and  made  up  to  100  ml  with  distilled  water.  A  volume  of  0.697  ml  of  β­mercaptoethanol  was  added  to  the  stripping buffer prior to use.  8.7  Preparation  of  buffers  for  Enzyme­linked  immunosorbent  assay  (ELISA)  8.7.1 Coating Buffer (pH 8.0)  0.1 M sodium carbonate  0.1 M sodium bicarbonate  8.7.2 Washing Buffer  100 ml 10 x PBS (pH 7.4)  5 ml 10 % v/v Tween­20 (0.05 % final)  The buffer was made up to 1000 ml with nano­pure water. 220  Chapter 8: Appendices  _____________________________________________________________________  8.7.3 Blocking Buffer  100 ml Wash buffer (Section 7.7.2)  250 mg BSA (0.25 % v/w final)  Blocking buffer was prepared fresh prior to use.  8.8 Preparation of FAC (triple supplement), 10 x  25 mg ferric ammonium citrate (50 μg/ml)  1 g sodium glutamate (0.2 %)  1 g L­asparagine (0.2 %)  The  above  components  were  mixed  and  made  up  to  50  ml  with  nano­pure  water,  filter­sterilised and stored at 4 °C in the dark.  8.9 Expression of recombinant proteins  8.9.1 Expression vectors and host strains  Many different types of expression vectors and host strains are commercially  available  when  using  the  E.  coli  expression  system.  In  this  study,  a  pET  expression  system  using  pET­11a  expression  vector  (Novagen)  was  used  to  express  the  PE­PGRS recombinant proteins. This system allows production of a large quantity of  proteins under the control of inducing agents.  pET­11a  expression  vectors  contain  several  elements  required  for  protein  expression. They includes a lacI gene which codes a lac repressor protein, a phage T7  promoter which specifically  binds T7 RNA polymerase, a lac operator which blocks  transcription  in  the  presence  of  the  lac  repressor  protein,  a  polylinker  to  simplify  insertion  of  genes  in  the  correct  orientation,  an  ampicillin  resistance  gene,  and  a  ColE1 origin of replication. Expression of the desired gene is under the control of the 221  Chapter 8: Appendices  _____________________________________________________________________  T7lac  promoter  and  operator.    The  presence  of  ampicillin  resistance  gene  confers  a  selective  pressure  for  maintaining  the  plasmid,  and  at  the  same  time,  serves  as  a  selection  marker  during  transformation.  The  genome  of  the  E.  coli  expression  host  contains an  inducible promoter which  is activated to express T7 RNA polymerase in  the presence of isopropyl thiogalactoside (IPTG). Being an analogue of lactose, IPTG  also displaces the lac repressor which blocks the transcription of the gene of  interest  by  binding  to  the  lac  operator.  The  expressed  T7  RNA  polymerase  binds  to  the  T7  promoter,  which  in  turn,  initiates  the  transcription  of  the  gene  of  interest.  This  IPTG­inducible system allows manipulation of the level of protein expression and the  control of when the expression of the recombinant protein occurs.  BL21(DE3) pLysS E. coli contains a pLysS gene and produces a low amount  of  T7  lysozyme.  This  is  a  natural  inhibitor  of  T7  polymerase,  and  reduces  the  transcription  of  the  gene  of  interest  during  the  ‘uninduced’  state.  In  this  study,  BL21­CodonPlus ®  (DE3)­RIPL E. coli was used for the expression of Rv3812 PE­PGRS  recombinant protein. This strain has genes that encode extra copies of  argU, ileY, and  leuW  and  proL  tRNA  genes.  This  allows  higher  expression  levels  of  heterologous  proteins from organisms with AT­ or GC­rich genomes and at the same time, reduces  the  risk  of  incorrect  translation.  Therefore,  this  strain  was  used  for  high­level  expression  of  the  GC­rich  Rv3812 PE­PGRS  protein,  which  was  otherwise  difficult  to  express in regular host strains of E. coli.  8.9.2 Protein purification strategy  Recombinant  proteins  expressed  as  fusion  proteins  containing  an  addition  stretch  of  amino  acids  at  its  N­  or  C­terminus,  aids  in  the  identification  and 222  Chapter 8: Appendices  _____________________________________________________________________  purification  of  recombinant  proteins.  These  fusion  proteins  can  be  easily  purified  using  various  chromatographic  techniques  base  on  ion  exchange,  hydrophobic  interaction,  size­exclusion  or  affinity.    In  this  study,  a  poly­histidine  (6x­His)  was  cloned in the N­terminal of the recombinant protein to generate a fusion protein which  allows  Ni­based  purification  due  to  the  affinity  for  histidine.  Being  relatively  small  and non­immunogenic, its presence does not affect the immunogenicity of the protein,  and therefore, removal of the tag is not necessary. In addition to the poly­histidine tag,  a  haemagglutinin  (HA)  molecule  was  cloned  downstream  of  the  poly­histidine.  This  allows for alternative methods of Western blot analysis of the recombinant proteins to  be performed using anti­His or anti­HA antibodies.  Affinity  chromatography  is  one  of  the  most  powerful  protein  purification  methods  which  involve  the  specific  interaction  of  a  target  molecule  with  an  immobilised  ligand.  In  this  study,  metal  affinity  chromatography  involving  specific  and reversible binding of the poly­histidine tagged proteins to nickel immobilised on  agarose beads was used to obtain purified recombinant proteins via  fast performance  liquid chromatography (FPLC).  8.10 Properties of some family members of PE­PGRS proteins  A  summary  of  properties  of  some  family  members  of  PE­PGRS  proteins  which have been published is shown in Table 8­1. 223  Chapter 8: Appendices  _____________________________________________________________________  Postulated Roles of PE­PGRS proteins  Rv0279c  w  Repressed in the presence of iron in vitro­ role in iron acquisition  Rv0834c  w  Acid­  and  hypoxia  inducible  gene  –  resistance  against  acidic  and  low  oxygen  tension  within granuloma  Rv0978c  w  Up­regulated in lungs of mice and within IFN­g­activated­ and naïve Mø culture – required  for intracellular survival in vivo and in vitro  Rv0980c  w  Up­regulated in lungs of mice – required for intracellular survival within Mø  w  Immunisation elicits Ab response  Rv1651c  w  Homolog in M. marinum – required for replication and persistence  w  Up­regulated at late­log and early stationary phases in vitro and during chronic infection in  mice – role in persistence  w  Rv1759c  w  Cell­surface protein  w  Expressed in vivo during infection – elicits Ab response against PGRS domain  w  Virulence  factor  involves  in  mediating  the  attachment  of  mycobacterium  to  fibronectin­  coated cell surfaces of host  w  Immunisation elicits Th­1 type cellular immune response  w  Immunisation  confers  protection  against  TB  reactivation  –  has  role  in  maintaining  latent  infection  Rv1818c  w  Cell surface exposed, cell wall structural protein  w  Virulence factor involves in host­pathogen and mycobacterium­mycobacterium interactions  w  Expressed in vitro in medium and in vivo during infection in mice.  w  Rv1818c PE  domain  immunisation  elicits  Th­1  type  immune  response,  which  confers  protection against Mtb infection  w  Immunisation elicits Ab response against the PGRS domain  w  Activate TNF­a­induced innate immunity via interaction with TLR2  w  Induce T cell apoptosis – killing effector T cells within granulomas for persistence  Rv2741  w  Iron­inducible gene – role in virulence  Rv3097c  w  Up­regulated during early infection in Mø – role in intracellular adaptation  Rv3367  w  Expressed in vivo during early TB infection in humans  w  Elicits antibody response directed against PGRS domain  Rv3812  w  Homolog in M. marinum – required for replication and persistence  w  Immunisation elicits Th­1 type cellular and humoral responses  Table 8­1: Properties of PE­PGRS proteins. 224  Chapter 8: Appendices  _____________________________________________________________________  8.11  IgG  levels  of  individual  subjects  to  PE­PGRS  proteins  and  mycobacterial 38­kDa antigen  The  IgG  levels  (relative  OD  units  /  ml)  of  individual  subjects  to  Rv0978c PE­PGRS  and  Rv3812 PE­PGRS  proteins  and  mycobacterial  38­kDa  antigen  are  shown in Tables 8­2.1 – 8­2.3. 225  Chapter 8: Appendices  ____________________________________________________________________________________________________________________  Healthy  Comm.  (ESAT –,  PPD –)  Rv3812  PE­PGRS  Rv3812  PE  Rv0978c  PE­PGRS  Rv0978c  PE  38­kDa  G31  670  225.33  51.9  47.6  216.8  G43  528  193.33  47.7  30.4  G49  562.5  187  43.8  24.1  G50  626.5  203  38.3  G52  567.5  216.67  G53  662  228  G56  617  G57  G58  LTBI­  (ESAT­ ,  PPD +),  Contacts  Rv3812  PE­PGRS  Rv3812  PE  Rv0978c  PE­PGRS  Rv0978c  PE  38­kDa  T7  647  250  49.9  37.7  163.3  149.3  T37  445.5  194  35  29.3  154.5  209.8  T93  544.5  240  48.8  35.4  263.8  28.6  123.5  T105  855.5  221  55.6  29.8  124  48.9  43.2  166.3  T122  856  273.33  47.1  40.9  218  42.2  30.6  177.5  T124  625.5  190.33  28.3  25.3  237.3  219  54.6  26.3  174  T214  674  230  60  43.5  167.5  795.5  295.33  86.7  55.3  292  T215  359  170.33  15.7  10.3  130.5  528  154.33  52.5  26.9  108  T223  491.5  213.67  39  36.1  336.3  G59  563.5  172  187.3  32.3  208.3  T224  445.5  234.33  81.9  30.6  181.5  G65  636  162.67  42.6  27.1  168.3  T230  529.5  173  81.4  28.5  200.5  G68  492  156.67  40.9  23.8  142.8  T233  360  159.67  33  21.4  195.8  G71  381  124  104.5  22.2  129  T237  590  299  40.8  29.3  281.5  G72  586.5  173.67  48.3  31.7  255.8  T248  715  268.67  139.3  46.7  283.3  G74  590  162.33  96.9  31.7  155.8  T249  511.5  181.33  58.4  18.2  129  G81  555  183.33  115  36.9  190.3  T266  568.5  194.33  38.9  26.8  216.8  G83  434  182.67  41.4  28.6  189.8  T270  535.5  206  100.1  17.3  191.3  G88  441  133.33  50.5  24.7  127.5  T286  490  259.33  41.4  37.4  247.3  G90  508  149.67  34.8  23.9  204.5  T287  430.5  220.67  33.8  20.7  167.3  G92  778.5  219  45  48.9  141  T304  291.5  137.67  81.6  11  255.5  Median  565.5  183  48.6  29.5  171.1  Median  532.5  217.17  48  29.3  198.1  25th  percentile  75th  percentile  523  160.9  42.5  25.9  142.3  445.5  188.1  37.9  21.2  166.3  628.9  217.2  62.6  33.4  205.4  25th  percentile  75th  percentile  630.9  242.5  65.4  36.4  249.3  Table 8­2 (part 1): IgG levels (relative OD units / ml) of individual subjects to PE­PGRS proteins and mycobacterial 38­kDa antigen. 226  Chapter 8: Appendices  ____________________________________________________________________________________________________________________  LTBI+  (ESAT+,  PPD+),  Contacts  Rv3812  PE­PGRS  Rv3812  PE  Rv0978c  PE­PGRS  Rv0978c  PE  38­kDa  Active TB  (ESAT+,  PPD +)  Extent of  disease  Rv3812  PE­PGRS  Rv3812  PE  Rv0978c  PE­PGRS  Rv0978c  PE  38­kDa  T120  863  206  43.2  31.5  187.5  T125  Minimal  571.5  154.67  31.9  21.3  288.75  T159  765.5  171.33  30.1  26.6  155.5  T175  Minimal  874.5  253.67  52.4  35.7  248.25  T165  758.5  211.67  50.3  48.2  183.8  T176  Moderate  527.5  193.67  29.5  31.1  157.75  T171  733.5  200.67  31.8  22.8  368  T195  Moderate  604.5  216.33  44.8  30.5  731.5  T172  671  191  37.4  27  311  T204  Moderate  795  303.33  72.5  50.2  288.25  T173  695.5  216  40.8  36.2  227.8  T220  Moderate  587.5  167.67  198.7  27.8  214.75  T189  387.5  122.33  8.5  10.6  78.5  T239  Moderate  789  214  59.4  35.9  388  T218  620.5  181  42.6  22.5  279.3  T245  Minimal  556.5  201.67  133.2  19.9  248.5  T219  741.5  241.33  94.2  53  293  T246  Moderate  462  177.75  29.1  28.5  113.5  T252  758  182.33  32.4  25.4  146.8  T272  Moderate  527.5  170.33  29.6  19.1  157.5  T268  641.5  138.33  31.1  20.6  171.5  T273  Advanced  618  161  19.8  36.3  211.75  T269  756  295  49.4  30.1  197.3  T275  Moderate  755.5  223.33  92  45.3  819.75  T271  477  104.33  28.4  11.7  99  T276  Minimal  363.5  143.67  31.2  26.6  166  T274  632  151.33  30.2  27.9  164.5  T284  Advanced  885  310.67  84.4  61.5  668  T293  670  143.67  45  28.4  459.3  T347  Minimal  716.5  213.33  67.9  36.8  465  T295  448.5  162  31.1  22.3  263  T381  Minimal  807  193.33  43.3  24.7  147.5  T296  816  215  199.7  33.6  369.8  T383  Moderate  590  178.67  114.2  27.2  550  T350  785.5  172.67  52.6  26.8  222.3  T385  Moderate  778.5  609.33  46.1  34.8  140.75  T374  765  175  71.2  33.8  514  T399  Moderate  481  168.67  38.3  23.2  128.5  T402  Moderate  692  270.33  204.4  36.2  470.75  Median  733.5  181  40.8  27  222.25  Median  611.25  197.67  49.25  30.8  248.375  25th  percentile  75th  percentile  636.8  156.7  31.1  22.7  168  549.25  169.915  31.725  26.125  157.6875  761.8  208.8  49.9  32.6  302  25th  percentile  75th  percentile  781.125  230.915  86.3  36.225  466.4375  Table 8­2 (part 2): IgG levels (relative OD units / ml) of individual subjects to PE­PGRS proteins and mycobacterial 38­kDa antigen.  The state of tuberculosis disease of the active TB patients is also shown. 227  Chapter 8: Appendices  ____________________________________________________________________________________________________________________  Treated  TB  (ESAT+,  PPD +)  T128  Rv3812 PE­  PGRS  Rv3812  PE  Rv0978c  PE­PGRS  Rv0978c  PE  38­kDa  590  252.33  258.3  38.6  997.75  T199  400  99  17.9  7.8  82.75  T201  320  134.33  47  11.1  447.75  T221  506  153  32.8  6.7  242.75  T227  595.5  200.33  39.2  31.3  789.75  T260  647.5  316.67  86.5  58.2  425.25  T267  471.5  163.33  30.7  17.8  891  T289  390  143.33  35.6  17.5  822.5  T290  475  196.33  36.9  30.8  166.75  T299  479.5  251.33  120.2  18.4  422.75  T309  381  185.33  57.3  17.2  341  T310  685.5  259.67  28.9  42.7  154  T312  360.5  163.67  21.8  13.8  959.5  T314  472  180.33  19.8  17.9  200.5  T331  428.5  247.33  49.6  32.2  94  T375  324.5  142.33  58.6  16.9  95  T376  379.5  189.33  38.5  26.3  472.25  T378  430.5  166.33  36  18.3  336.75  T390  428.5  246.33  214.8  26  846  T393  359  197  21.9  22.3  448.25  Median  429.5  187.33  37.7  18.35  424  25th  percentile  75th  percentile  380.625  160.7475  30.25  17.125  192.0625  486.125  246.58  57.625  30.925  797.9375  Table 8­2 (part 3): IgG levels (relative OD units / ml) of individual subjects to PE­PGRS proteins and mycobacterial 38­kDa antigen. 228  [...]... To compare humoral responses against two Mtb PE PGRS proteins in latent  and active  tuberculosis  patients,  thereby  assessing  differential  antibody  responses  against  various  PE PGRS family  members  and how  these  are  influenced by clinical disease status.  2.  To evaluate relative stability to proteasomal degradation of the PE domain,  full­length PE PGRS protein, and their component peptides, and assess their ... 3.  PE PGRS To study immunogenicity and biological properties of Rv3812  protein  and its role in host pathogen interactions  The approaches used in this study to address these aims are as follows:  Although  it  is  known  that  some  PE PGRS proteins may  elicit  antibodies  during  tuberculosis  infection,  differential  expression  of  various  PE PGRS proteins in people  with  latent  and ... full­length PE PGRS proteins.   PE PGRS Finally, a specific member of this protein family, Rv3812  was chosen  for study of its role in macrophage­bacterium interactions and immunogenicity of its  PE PGRS different  domains  to  T  cells.  The  Mb3842  protein  of  M.  bovis  bacille  PE PGRS Calmette­Guérin  (BCG)  is  identical  to  Mtb  Rv3812  ,  thus  a  BCG  strain  PE PGRS overexpressing  Mb3842 ... Chapter 1: Thesis overview, Aims and Approaches  _  protein,  and its  role  in mycobacterium  latency  and macrophage  entry.  Murine  immunisation with the full­length protein or its PE domain was performed to study  cellular and humoral immune responses elicited in the host.   Overall,  this  work  is  intended  to  further  the  understanding  of  the  role  of  specific PE PGRS proteins in mycobacterium host interactions. The impact of such ... in mycobacteria (Brennan and Delogu, 2002). All  members of the PE protein  family  contain  a  highly  conserved  N­terminal  PE domain  of  ~  110  amino­acid  residues predicted to have a globular structure, and a C­terminal segment that varies  in size,  sequence  and number  of  repeats.  One  of  the  PE subfamilies  contains  proteins with the PE domain alone, and another contains the PE domain followed by ... be  expressed  in vivo  during  infection  and speculated  to  be  required  for  replication  and persistence  in macrophages,  respectively.  This  was  performed  to  investigate whether relative seroreactivity was linked to the extent of host infection  or disease. The relative  immunogenicity of  full­length PE PGRS proteins and their  PE domains were  investigated  in the light of previous evidence that there could be ... investigated.  With  respect  to  the  most  studied  Mtb  PE PGRS protein  PE PGRS (Rv1818c  ), mice immunised with DNA encoding its full­length protein or its  PE domain elicited, respectively, only antibodies directed against the PGRS domain  and only  cellular  responses  to  the  PE domain  (Delogu  and Brennan,  2001).  It  has  been  suggested  that  the  Gly­Ala  rich  PGRS domain  influences  major ... proteins with the PE domain alone, and another contains the PE domain followed by  a unique PGRS sequence (Cole et al., 1998). This PE PGRS family of Mtb proteins is the focus of this study.  2.2 The PE PGRS family of proteins The  largest  of  the  PE protein  subfamilies  is  the  PE PGRS (polymorphic  GC­rich repetitive  sequences) subfamily, consisting of 61  members. This  family  is  rich in glycine (~ 40 %) and alanine (~ 25 %) residues. These proteins consist of an ... cytokine  in granuloma  formation  (Saunders  and Britton,  2007),  inducing  the  production  of  chemokines,  and generating  chemokine gradients that recruit immune cells to the infection site (Russell, 2007).  Chemokines such as monocyte chemotactic protein­1 (MCP­1), macrophage  inflammatory  protein  (MIP)­1a,  chemokine  (C­C  motif)  ligand  5  (CCL5),  interleukin­8 (IL­8) and interferon­inducible 10­kDa protein (IP­10) are involved in ... (Brennan  and Delogu,  2002).  If  Gly­Ala  repeats  in the  PGRS domain  limit  processing  and presentation  of  PE PGRS proteins,   this  could  be  a  strategy  utilised by mycobacteria to evade host immunity during its intracellular existence.  Some possible  functions of a  few  members of the PE PGRS protein  family  PE PGRS have been elucidated. Rv1759c  is a cell­surface protein which allows Mtb to  . (Carmen),assistance in animalcare and organprocessing (Peiying and Radiah).Forsharingcelllines,mousestrains,vectorsorequipmentused in this study, NUSYong Loo LinSchoolof Medicine faculty. 66 3.4.3Confirmationofidentityofpurifiedrecombinant proteins 66 iv 3.4.4Optimisationofserumdilutionsbytitrationsagainstrecombinant proteins 70 3.4.5AntibodyresponsesofdifferentclinicalgroupstoPEPGRS proteins 74 3.4.6AntibodyresponsestoRv0978c PE and Rv0978c PEPGRS proteins . severalofthemare involved in mycobacterium host interactions. 1.2Aims and approaches Thespecificaimsof thisprojectare: 1. TocomparehumoralresponsesagainsttwoMtbPEPGRS proteins in latent and