Investigation of peptide lipid interaction by fluorescence correlation spectroscopy

    INVESTIGATION OF PEPTIDE‐LIPID  INTERACTION BY FLUORESCENCE  CORRELATION SPECTROSCOPY            GUO LIN  (B.Sc.)      A THESIS SUBMITTED FOR THE DEGREE OF  DOCTOR OF PHILOSOPHY    DEPARTMENT OF CHEMISTRY  NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE    2010     Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    This  work  was  performed  in  the  Biophysical  Fluorescence  Laboratory,  Department  of  Chemistry, National University of Singapore under the supervision of Associate Professor  Thorsten Wohland.    The results have been partly published in:  Guo, L., J. Y. Har, J. Sankaran, Y. Hong, B. Kannan and T. Wohland (2008). "Molecular  diffusion measurement in lipid bilayers over wide concentration ranges: a  comparative study." Chemphyschem 9(5): 721‐8.  Kannan, B., L. Guo, T. Sudhaharan, S. Ahmed, I. Maruyama and T. Wohland (2007).  "Spatially resolved total internal reflection fluorescence correlation microscopy  using an electron multiplying charge‐coupled device camera." Anal Chem 79(12):  4463‐70.  Yu, L., L. Guo, J. L. Ding, B. Ho, S. S. Feng, J. Popplewell, M. Swann and T. Wohland  (2009). "Interaction of an artificial antimicrobial peptide with lipid  membranes." Biochim Biophys Acta 1788(2): 333‐44.  Leptihn, S., L. Guo, V. Frecer, B. Ho and J. Ding (2010). "One step at a time: Action  mechanism of Sushi1 antimicrobial peptide and derived molecules." Virulence  1(1): 42‐44.  Sankaran, J., M. Manna, L. Guo, R. Kraut and T. Wohland (2009). "Diffusion, transport,  and cell membrane organization investigated by imaging fluorescence cross‐ correlation spectroscopy." Biophys J 97(9): 2630‐9.          I    Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy        Acknowledgement  A doctoral thesis like this, involving various fields, would not be possible without  the  help  of  many  people.  I  would  like  to  take  this  opportunity  to  acknowledge  the  persons who provided great help in my study.  First,  I  would  like  to  acknowledge  my  supervisor  Associate  Professor  Thorsten  Wohland  from  Department  of  Chemistry  for  providing  such  an  interesting  research  project. I am also grateful for his invaluable guidance, support and patience throughout  the project.  I  would  like  to  thank  Professor  Ding  Jeak  Ling  from  Department  of  Biological  Science  and  Associate  Professor  Ho  Bow  from  Department  of  Microbiology  for  their  scientific suggestions and discussions on the project.  I  am  also  grateful  to  all  my  colleagues  from  Biophysical  Fluorescence  Laboratory  for their kind help and support. Especially Lanlan Yu for her great advices on the project  of antimicrobial peptides; Ling Chin Hwang and Xiaotao Pan for their helpful discussions  on Fluorescence Correlation Spectroscopy; Ping Liu, Xianke Shi and Sebastian Leptihn for  their kind support on biological relevant topics; Kannan Balakrishnan, Jia Yi Har, Manna  Manoj Kumar and Jagadish Sankaran for their great help on the Imaging Total Internal  Reflection Fluorescence Correlation Spectroscopy project.  And  last  but  not  least  I  would  like  to  thank  my  parents  for  their  understanding,  support and love for all these years.      II    Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy        Acknowledgement    II  Table of Contents   . III   Summary   . VII  List of Figures   . IX  List of Tables   . XI    Chapter 1  1.1  Introduction  . 1  Introduction to Antimicrobial peptides   3  1.1.1  Antimicrobial peptides   5  1.1.1.1  Biological activities of antimicrobial peptides   5  1.1.1.2  Origins of antimicrobial peptides   5  1.1.1.3  Structural features of antimicrobial peptides  . 8  1.1.1.4  Therapeutic potential of antimicrobial peptides   13  1.1.2  Designed antimicrobial peptides  . 13  1.1.2.1  Designed antimicrobial peptides  . 15  1.1.2.2  De novo designed V peptide family  . 16  1.1.3  Mechanism of antimicrobial peptides   18  1.1.3.1  Biological membranes  . 19  1.1.3.2  Model membranes  . 24  1.1.3.3  Mechanisms of antimicrobial peptides  . 26  1.1.3.4  Methods to study mechanism of antimicrobial peptides   30  1.2  Conventional Fluorescence Correlation Spectroscopy  . 34  1.2.1  Basic Theory – Autocorrelation Function   36  1.2.2  Basic Setup ‐ Confocal Microscope   43  1.2.3  Combining Fluorescence Correlation Spectroscopy with a Laser Scanning  Microscope  . 44  Chapter 2  Investigation of the binding affinity of modified antimicrobial peptide to  membrane mimics  . 46  2.1  Introduction  . 46  2.2  Materials and methods   47  2.2.1  Materials   47  2.2.2  Peptides   47  2.2.3  Small unilamellar vesicles (SUVs) preparation  . 48  2.2.4  Interaction of modified V4 peptides with LPS   48  III    Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy        2.2.5  Interaction of modified V4 peptides with SUVs  . 48  2.2.6  FCS Instrumentation and confocal imaging   49  2.3  Results and Discussion  . 50  2.3.1  Calibration of the FCS setup   50  2.3.2  Modified AMPs are more soluble compared with V4   51  2.3.3  Modified antimicrobial peptide can bind to LPS strongly   55  2.3.4  Modified antimicrobial peptide can bind to POPG strongly   59  2.3.5  Modified antimicrobial peptides show low binding affinity to POPC   61  2.3.6  Comparison between different V peptides  . 62  Chapter 3  Investigation of the mechanisms of antimicrobial peptides interacting with  membrane mimics  . 66  3.1  Introduction  . 66  3.2  Materials and methods   68  3.2.1  Materials   68  3.2.2  Peptides   68  3.2.3  Fluorophore entrapping vesicle preparation   68  3.2.4  Fluorophore labeled vesicle preparation   69  3.2.5  Interaction of MV4s with rhodamine 6G entrapped LUVs (REVs) and Rho‐PE  labeled LUVs (RLVs)  . 69  3.2.6  3.3  FCS instrumentation and confocal imaging   69  Results and discussion  . 70  3.3.1  Modified antimicrobial peptides induce leakage of rhodamine 6G entrapped in  POPG LUVs  . 70  3.3.2  Modified antimicrobial peptides interact with Rho‐PE labeled POPG LUVs  . 74  3.3.3  Modified antimicrobial peptides interact with Rho‐PE labeled POPC LUVs   78  3.3.4  Visualization of Modified peptides interacting with Rho‐PE labeled LUVs  . 79  3.3.5  Comparison between different V peptides  . 79  3.4  Confocal visualization of peptide‐lipid interaction   82  3.4.1  Materials and methods   83  3.4.1.1  Materials   83  3.4.1.2  GUVs preparation   83  3.4.1.3  Immobilization of GUVs on cover slide  . 83  3.4.1.4  Confocal imaging   84  3.4.2  3.5  Visualization of interaction between V4 and GUVs  . 84  In vivo measurements  87  IV    Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy        3.5.1  Materials and methods   88  3.5.1.1  Peptides   88  3.5.1.2  Preparation of bacterial culture   88  3.5.1.3  Bacterial assay   89  3.5.2  Monitoring the GFP leakage from Gram‐negative bacteria  . 89  Chapter 4  Imaging Total Internal Reflection Fluorescence Correlation Spectroscopy as a  tool to monitor the peptide‐lipid interaction  . 92  4.1  Introduction to ITIR‐FCS  . 92  4.1.1  Total internal reflection (TIR) illumination  . 92  4.1.2  Imaging total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy   94  4.1.3  Basic setup  . 98  4.1.4  Basic theory ‐ Autocorrelation function for ITIR‐FCS   100  4.2  Characterization of ITIR‐FCS   102  4.2.1  Introduction to different fluorescence techniques   103  4.2.1.1  Z‐scan FCS  . 104  4.2.1.2  Fluorescence recovery after photobleaching  . 105  4.2.1.3  Single particle tracking   107  4.2.2  Materials and Methods  . 109  4.2.2.1  Lipids and dyes  . 109  4.2.2.2  Peptides   109  4.2.2.3  Preparation of SLB  . 109  4.2.2.4  Preparation of GUVs   110  4.2.2.5  Immobilization of GUVs  . 110  4.2.2.6  FCS instrumentation and measurement  . 110  4.2.2.7  FRAP instrumentation and measurement   111  4.2.2.8  SPT and ITIR‐FCS Instrumentation  . 111  4.2.2.9  SPT measurement   111  4.2.2.10  4.2.3  ITIR‐FCS measurement  . 112  Results and Discussion  . 112  4.2.3.1  Results   112  4.2.3.2  Comparison of different techniques  . 116  4.2.3.3  Features of ITIR‐FCS  . 121  4.3  Utilizing ITIR‐FCS to investigate the behavior of antimicrobial peptides on lipid  membrane   122  V    Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy        4.3.1  Introduction  . 122  4.3.2  Materials and Methods  . 122  4.3.3  Results and Discussion  . 123  Chapter 5  Conclusions and Outlook  . 127  5.1  Conclusion   127  5.2  Outlook  . 131   Reference   . 134          VI        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    Summary  In  this  work  I  investigate  the  action  of  antimicrobial  peptides  (AMPs)  with  single  molecule sensitive fluorescence spectroscopy methods.  AMPs are novel and promising candidates of antibiotics. AMPs kill the pathogen by  permeabilizing the bacterial membrane. So it is very hard for bacteria to develop drug  resistance.  De  novo  designed  AMPs  can  greatly  enlarge  the  pool  of  available  peptide  candidates, eliminating some of the cytotoxic features of the natural ones. As a de novo  designed peptide, V4 originated from a LPS (lipopolysaccharide) ‐binding motif, showed  its good combination of strong antimicrobial effect and low cytotoxic/hemolytic effect.  However, its application is limited due to its low solubility. To overcome this limitation, a  series of modified V4 (MV4s) was designed to have better solubility.   In this study, the interaction between MV4s and different lipid model membranes  was  investigated  using  single  molecule  sensitive  fluorescence  spectroscopy  methods,  such as fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and imaging total internal reflection  fluorescence  correlation  spectroscopy  (ITIR‐FCS),  together  with  laser  scanning  confocal  imaging.  A  similar  mechanism  of  MV4s  compared  to  V4  was  observed:  inducing  lipid  aggregation  before  inducing  the  lipid  membranes  disruption.  By  comparing  different  MV4s,  we  found  that  a)  highly  positively  charged  structure  maintained  preferential  binding to negatively charged lipid, b) higher hydrophobicity gave rise to a higher activity  against both negatively charged and zwitterionic lipid, and c) two binding motifs in MV4s  may play a crucial role to maintain their activity. A good consistency was found between  predicted  and  actual  property  of  peptides.  Further  study  of  AMPs  on  live  E.  coli  VII    Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy        suggested that peptides with medium hydrophobicity showed the highest antimicrobial  activity.   By investigating different members of the V4 peptide family, this study contributes  to our understanding of their mechanism of antimicrobial activity and selectivity. It thus  provides further guidelines for the rational design of antimicrobial peptides.      VIII        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    List of Figures  Fig 1.1 Schematic representation of the Gram‐negative bacteria cell wall.  20  Fig 1.2 Schematic representation of cell wall from Gram‐positive bacteria.  20  Fig 1.3 Structure of lipid A.   21  Fig 1.4 Schematic drawing of different model membrane.  26  Fig 1.5 The barrel‐stave model.  27  Fig 1.6 The carpet model.  28  Fig 1.7 The toroidal model.  29  Fig 1.8 Principle of FCS.   37  Fig 1.9 Principle of ACF curves.   41  Fig 1.10 Schematic drawing of a typical FCS setup  43  Fig 2.1 Principle of affinity measurement.   47  Fig 2.2 Comparison between TV4‐TMR and TMR.  52  Fig 2.3 Comparison between V4norv‐TMR, V4abu‐TMR, V4ala‐TMR and TMR.  52  Fig 2.4 ACF and intensity trace obtained for V4norv‐TMR.  53  Fig 2.5 Confocal image of V4norv‐TMR.  55  Fig 2.6 ACF obtained for V4ala‐TMR.  55  Fig 2.7 ACF curves obtained for titrating LPS into different peptides.   57  Fig 2.8 Interaction between LPS and different peptides.  57  Fig 2.9 LPS dissolved the peptide aggregates.  58  Fig 2.10 V4norv‐TMR, V4abu‐TMR, V4ala‐TMR interacting with POPG SUVs.  60  Fig 2.11 TV4 showed almost no affinity to POPG SUVs.  61  Fig 2.12 binding affinity of different MV4‐TMR to POPG SUVs.  61  Fig 2.13 MV4s showed almost no affinity to POPC SUVs.  63  Fig 3.1 Principle of leakage measurement.  67  Fig 3.2 Principle of disruption measurement.  67  Fig 3.3 Comparison between POPG REV and free R6G.  70  IX        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    peptides on membranes could greatly improve our understanding on the mechanism of  interactions between V peptides and lipid membranes.  To further extend the usage of ITIR‐FCS, it can be combined with AFM. Firstly, in  addition  to  fluorescence  images,  the  fast  dynamics  of  molecules  on  membrane can  be  observed in high‐throughput screening using ITIR‐FCS. At the same time, high resolution  AFM  images  of  the  membrane  morphology  at  the  same  location  can  be  obtained.  Correlations between dynamics and morphology can provide information to resolve the  action  mechanism  of  peptides.  ITIR‐FCS  can  also  be  easily  adapted  to  in  vivo  measurement,  making  it  a  useful  tool  study  peptide  behavior  on  biological  membrane  (mammalian or bacteria cells) which is much more complicated and biological relevant  compared to the model membrane used in vitro.      133        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    References  Adkins,  E.  M.,  D.  J.  Samuvel,  et  al.  (2007).  "Membrane  mobility  and  microdomain  association  of  the  dopamine  transporter  studied  with  fluorescence  correlation  spectroscopy  and  fluorescence  recovery  after  photobleaching."  Biochemistry  46(37): 10484‐97.  Agerberth, B., J. Y. Lee, et al. (1991). "Amino acid sequence of PR‐39. Isolation from pig  intestine  of  a  new  member  of  the  family  of  proline‐arginine‐rich  antibacterial  peptides." Eur J Biochem 202(3): 849‐54.  Alaouie, A. M., R. N. Lewis, et al. (2007). "Differential scanning calorimetry and Fourier  transform infrared spectroscopic studies of phospholipid organization and lipid‐ peptide  interactions  in  nanoporous  substrate‐supported  lipid  model  membranes." Langmuir 23(13): 7229‐34.  Alberts, B. (2002). "Molecular biology of the cell."  Ambroggio, E. E., F. Separovic, et al. (2005). "Direct visualization of membrane leakage  induced  by  the  antibiotic  peptides:  maculatin,  citropin,  and  aurein."  Biophys  J  89(3): 1874‐81.  Andres, E. and J. L. Dimarcq (2004). "Cationic antimicrobial peptides: update of clinical  development." J Intern Med 255(4): 519‐20.  Andreu,  D.  and  L.  Rivas  (1998).  "Animal  antimicrobial  peptides:  an  overview." Biopolymers 47(6): 415‐33.  Axelrod,  D.  (1981).  "Cell‐substrate  contacts  illuminated  by  total  internal  reflection  fluorescence." J Cell Biol 89(1): 141‐5.  Axelrod,  D.,  D.  E.  Koppel,  et  al.  (1976).  "Mobility  measurement  by  analysis  of  fluorescence photobleaching recovery kinetics." Biophys J 16(9): 1055‐69.  Bacia, K., S. A. Kim, et al. (2006). "Fluorescence cross‐correlation spectroscopy in living  cells." Nat Methods 3(2): 83‐9.  Bacia, K., D. Scherfeld, et al. (2004). "Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts  in model and native membranes." Biophys J 87(2): 1034‐43.  Bates, I. R., P. W. Wiseman, et al. (2006). "Investigating membrane protein dynamics in  living cells." Biochem Cell Biol 84(6): 825‐31.  Baumann,  G.  and  P.  Mueller  (1974).  "A  molecular  model  of  membrane  excitability."  J  Supramol Struct 2(5‐6): 538‐57.  Benda,  A.,  M.  Benes,  et  al.  (2003).  "How  to  determine  diffusion  coefficients  in  planar  phospholipid  systems  by  confocal  fluorescence  correlation  spectroscopy." Langmuir 19(10): 4120‐4126.  Berland,  K.  M.,  P.  T.  So,  et  al.  (1995).  "Two‐photon  fluorescence  correlation  spectroscopy: method and application to the intracellular environment." Biophys  J 68(2): 694‐701.  Besenicar, M., P. Macek, et al. (2006). "Surface plasmon resonance in protein‐membrane  interactions." Chem Phys Lipids 141(1‐2): 169‐78.  Blondelle,  S.  E.  and  R.  A.  Houghten  (1992).  "Design  of  model  amphipathic  peptides  having potent antimicrobial activities." Biochemistry 31(50): 12688‐94.  Blondelle,  S.  E.,  K.  Lohner,  et  al.  (1999).  "Lipid‐induced  conformation  and  lipid‐binding  properties  of  cytolytic  and  antimicrobial  peptides:  determination  and  biological  specificity." Biochim Biophys Acta 1462(1‐2): 89‐108.  134        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    Bocchinfuso,  G.,  A.  Palleschi,  et  al.  (2009).  "Different  mechanisms  of  action  of  antimicrobial peptides: insights from fluorescence spectroscopy experiments and  molecular dynamics simulations." J Pept Sci.  Bodanszky, M. (1988). Peptide chemistry: a practical textbook, Springer.  Boman, H. G. (1995). "Peptide antibiotics and their role in innate immunity." Annu Rev  Immunol 13: 61‐92.  Boman, H. G., B. Agerberth, et al. (1993). "Mechanisms of action on Escherichia coli of  cecropin  P1  and  PR‐39,  two  antibacterial  peptides  from  pig  intestine."  Infect  Immun 61(7): 2978‐84.  Boman,  H.  G.,  D.  Wade,  et  al.  (1989).  "Antibacterial  and  antimalarial  properties  of  peptides that are cecropin‐melittin hybrids." FEBS Lett 259(1): 103‐6.  Brabetz, W., S. Muller‐Loennies, et al. (1997). "Deletion of the heptosyltransferase genes  rfaC and rfaF in Escherichia coli K‐12 results in an Re‐type lipopolysaccharide with  a high degree of 2‐aminoethanol phosphate substitution." Eur J Biochem 247(2):  716‐24.  Breithaupt, H. (1999). "The new antibiotics." Nat Biotechnol 17(12): 1165‐9.  Brock, R. and T. Jovin (1998). "Fluorescence correlation microscopy (FCM)‐fluorescence  correlation spectroscopy (FCS) taken into the cell." Cellular and molecular biology  (Noisy‐le‐Grand, France) 44(5): 847.  Brogden,  K.  A.  (2005).  "Antimicrobial  peptides:  pore  formers  or  metabolic  inhibitors  in  bacteria?" Nat Rev Microbiol 3(3): 238‐50.  Brogden, K. A., A. J. De Lucca, et al. (1996). "Isolation of an ovine pulmonary surfactant‐ associated  anionic  peptide  bactericidal  for  Pasteurella  haemolytica."  Proc  Natl  Acad Sci U S A 93(1): 412‐6.  Brotz,  H.,  G.  Bierbaum,  et  al.  (1998).  "The  lantibiotic  mersacidin  inhibits  peptidoglycan  synthesis by targeting lipid II." Antimicrob Agents Chemother 42(1): 154‐60.  Brozell, A. M., M. A. Muha, et al. (2006). "A class of supported membranes: formation of  fluid phospholipid bilayers on photonic band gap colloidal crystals." J Am Chem  Soc 128(1): 62‐3.  Bulet,  P.,  C.  Hetru,  et  al.  (1999).  "Antimicrobial  peptides  in  insects;  structure  and  function." Dev Comp Immunol 23(4‐5): 329‐44.  Burkhardt,  M.,  K.  G.  Heinze,  et  al.  (2005).  "Four‐color  fluorescence  correlation  spectroscopy  realized  in  a  grating‐based  detection  platform."  Opt  Lett  30(17):  2266‐8.  Burkhardt,  M.  and  P.  Schwille  (2006).  "Electron  multiplying  CCD  based  detection  for  spatially resolved fluorescence correlation spectroscopy." Optics Express 14(12):  5013‐5020.  Chang,  W.  K.,  W.  C.  Wimley,  et  al.  (2008).  "Characterization  of  antimicrobial  peptide  activity  by  electrochemical  impedance  spectroscopy."  Biochim  Biophys  Acta  1778(10): 2430‐6.  Chen,  H.  C.,  J.  H.  Brown,  et  al.  (1988).  "Synthetic  magainin  analogues  with  improved  antimicrobial activity." FEBS Lett 236(2): 462‐6.  Chen,  Y.,  B.  C.  Lagerholm,  et  al.  (2006).  "Methods  to  measure  the  lateral  diffusion  of  membrane lipids and proteins." Methods 39(2): 147‐53.  Csordas,  A.  and  H.  Michl  (1970).  "Isolation  and  structure  of  a  haemolytic  polypeptide  from  the  defensive  secretion  of  European  Bombina  species."  Monatsh.  Chem  101: 182‐189.  135        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    Culbertson,  C.  T.,  S.  C.  Jacobson,  et  al.  (2002).  "Diffusion  coefficient  measurements  in  microfluidic devices." Talanta 56(2): 365‐373.  Dathe, M., J. Meyer, et al. (2002). "General aspects of peptide selectivity towards lipid  bilayers and cell membranes studied by variation of the structural parameters of  amphipathic helical model peptides." Biochim Biophys Acta 1558(2): 171‐86.  Dathe, M., M. Schumann, et al. (1996). "Peptide helicity and membrane surface charge  modulate  the  balance  of  electrostatic  and  hydrophobic  interactions  with  lipid  bilayers and biological membranes." Biochemistry 35(38): 12612‐22.  Dathe, M. and T. Wieprecht (1999). "Structural features of helical antimicrobial peptides:  their  potential  to  modulate  activity  on  model  membranes  and  biological  cells." Biochim Biophys Acta 1462(1‐2): 71‐87.  Dathe, M., T. Wieprecht, et al. (1997). "Hydrophobicity, hydrophobic moment and angle  subtended by charged residues modulate antibacterial and haemolytic activity of  amphipathic helical peptides." FEBS Lett 403(2): 208‐12.  De  Smet,  K.  and  R.  Contreras  (2005).  "Human  antimicrobial  peptides:  defensins,  cathelicidins and histatins." Biotechnol Lett 27(18): 1337‐47.  Dertinger,  T.,  V.  Pacheco,  et  al.  (2007).  "Two‐focus  fluorescence  correlation  spectroscopy:  a  new  tool  for  accurate  and  absolute  diffusion  measurements." Chemphyschem 8(3): 433‐43.  Dertinger,  T.,  I.  von  der  Hocht,  et  al.  (2006).  "Surface  sticking  and  lateral  diffusion  of  lipids in supported bilayers." Langmuir 22(22): 9339‐44.  Destoumieux, D., M. Munoz, et al. (2000). "Penaeidins, a family of antimicrobial peptides  from penaeid shrimp (Crustacea, Decapoda)." Cell Mol Life Sci 57(8‐9): 1260‐71.  Digman, M. A.,  P. Sengupta, et al.  (2005). "Fluctuation correlation spectroscopy with a  laser‐scanning  microscope:  exploiting  the  hidden  time  structure."  Biophys  J  88(5): L33‐6.  Dinarello, C. A. (2000). "Proinflammatory cytokines." Chest 118(2): 503‐8.  Dittrich, P. S. and P. Schwille (2002). "Spatial two‐photon fluorescence cross‐correlation  spectroscopy for controlling molecular transport in microfluidic structures." Anal  Chem 74(17): 4472‐9.  Ehret‐Sabatier,  L.,  D.  Loew,  et  al.  (1996).  "Characterization  of  novel  cysteine‐rich  antimicrobial peptides from scorpion blood." J Biol Chem 271(47): 29537‐44.  Eigen, M. and R. Rigler (1994). "Sorting single molecules: application to diagnostics and  evolutionary biotechnology." Proc Natl Acad Sci U S A 91(13): 5740‐7.  Eisenberg,  D.,  E.  Schwarz,  et  al.  (1984).  "Analysis  of  membrane  and  surface  protein  sequences  with  the  hydrophobic  moment  plot."  Journal  of  Molecular  Biology  179(1): 125.  Elson,  E.  and  D.  Magde  (1974).  "Fluorescence  correlation  spectroscopy.  I.  Conceptual  basis and theory." Biopolymers 13(1).  Elson,  E.  L.  (1985).  "Fluorescence  Correlation  Spectroscopy  and  Photobleaching  Recovery." Annual Review of Physical Chemistry 36(1): 379‐406.  Epand,  R.  M.  (1998).  "Lipid  polymorphism  and  protein‐lipid  interactions."  Biochim  Biophys Acta 1376(3): 353‐68.  Epand,  R.  M.  and  H.  J.  Vogel  (1999).  "Diversity  of  antimicrobial  peptides  and  their  mechanisms of action." Biochim Biophys Acta 1462(1‐2): 11‐28.  Erridge,  C.,  E.  Bennett‐Guerrero,  et  al.  (2002).  "Structure  and  function  of  lipopolysaccharides." Microbes Infect 4(8): 837‐51.  136        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    Falla, T. J., D. N. Karunaratne, et al. (1996). "Mode of action of the antimicrobial peptide  indolicidin." J Biol Chem 271(32): 19298‐303.  Fauchere,  J.  (1996).  "Lipophilicity  in  peptide  chemistry  and  peptide  drug  design." Lipophilicity in Drug Action and Toxicology, VCH, Weinheim: 355.  Florack, D. E. and W. J. Stiekema (1994). "Thionins: properties, possible biological roles  and mechanisms of action." Plant Mol Biol 26(1): 25‐37.  Fox,  C.  B.,  J.  R.  Wayment,  et  al.  (2009).  "Single‐Molecule  Fluorescence  Imaging  of  Peptide Binding to Supported Lipid Bilayers." Anal Chem.  Frecer,  V.,  B.  Ho,  et  al.  (2000).  "Interpretation  of  biological  activity  data  of  bacterial  endotoxins by simple molecular models of mechanism of action." Eur J Biochem  267(3): 837‐52.  Frecer,  V.,  B.  Ho,  et  al.  (2004).  "De  novo  design  of  potent  antimicrobial  peptides." Antimicrob Agents Chemother 48(9): 3349‐57.  Ganz,  T.  (2003).  "Defensins:  antimicrobial  peptides  of  innate  immunity."  Nat  Rev  Immunol 3(9): 710‐20.  Gell,  C.,  D.  J.  Brockwell,  et  al.  (2001).  "Accurate  Use  of  Single  Molecule  Fluorescence  Correlation  Spectroscopy  to  Determine  Molecular  Diffusion  Times."  Single  Mol  2(3): 177‐181.  Gordon,  G.  W.,  B.  Chazotte,  et  al.  (1995).  "Analysis  of  simulated  and  experimental  fluorescence  recovery  after  photobleaching.  Data  for  two  diffusing  components." Biophys J 68(3): 766‐78.  Gordon,  Y.  J.,  L.  C.  Huang,  et  al.  (2005).  "Human  cathelicidin  (LL‐37),  a  multifunctional  peptide, is expressed by ocular surface epithelia and has potent antibacterial and  antiviral activity." Curr Eye Res 30(5): 385‐94.  Gordon, Y. J., E. G. Romanowski, et al. (2005). "A review of antimicrobial peptides and  their therapeutic potential as anti‐infective drugs." Curr Eye Res 30(7): 505‐15.  Gosch,  M.,  H.  Blom,  et  al.  (2005).  "Parallel  dual‐color  fluorescence  cross‐correlation  spectroscopy using diffractive optical elements." J Biomed Opt 10(5): 054008.  Gosch,  M.,  A.  Serov,  et  al.  (2004).  "Parallel  single  molecule  detection  with  a  fully  integrated single‐photon 2x2 CMOS detector array." J Biomed Opt 9(5): 913‐21.  Gough,  M.,  R.  E.  Hancock,  et  al.  (1996).  "Antiendotoxin  activity  of  cationic  peptide  antimicrobial agents." Infect Immun 64(12): 4922‐7.  Grunwald, D., A. Hoekstra, et al. (2006). "Direct observation of single protein molecules  in aqueous solution." Chemphyschem 7(4): 812‐5.  Habermann, E. (1972). "Bee and wasp venoms." Science 177(46): 314‐22.  Hamuro,  Y.,  J.  Schneider,  et  al.  (1999).  "De  Novo  Design  of  Antibacterial  [beta]‐ Peptides." J. Am. Chem. Soc 121(51): 12200‐12201.  Hancock, R. E. (1997). "Peptide antibiotics." Lancet 349(9049): 418‐22.  Hancock,  R.  E.  (1999).  "Host  defence  (cationic)  peptides:  what  is  their  future  clinical  potential?" Drugs 57(4): 469‐73.  Hancock,  R.  E.  and  D.  S.  Chapple  (1999).  "Peptide  antibiotics."  Antimicrob  Agents  Chemother 43(6): 1317‐23.  Hancock,  R.  E.  and  R.  Lehrer  (1998).  "Cationic  peptides:  a  new  source  of  antibiotics." Trends Biotechnol 16(2): 82‐8.  Hansen,  R.  and  J.  Harris  (1998).  "Total  internal  reflection  fluorescence  correlation  spectroscopy  for  counting  molecules  at  solid/liquid  interfaces."  Anal.  Chem  70(13): 2565‐2575.  137        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    Harwig,  S., K.  Swiderek,  et  al.  (1995).  "Determination  of  disulphide  bridges  in  PG‐2,  an  antimicrobial peptide from porcine leukocytes." Journal of Peptide Science 1(3).  Hassler,  K.,  M.  Leutenegger,  et  al.  (2005).  "Total  internal  reflection  fluorescence  correlation spectroscopy (TIR‐FCS) with low background and high count‐rate per  molecule." Optics Express 13(19): 7415‐7423.  Haustein,  E.  and  P.  Schwille  (2007).  "Fluorescence  correlation  spectroscopy:  novel  variations of an established technique." Annu Rev Biophys Biomol Struct 36: 151‐ 69.  Hebert, B., S. Costantino, et al. (2005). "Spatiotemporal image correlation spectroscopy  (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living  CHO cells." Biophys J 88(5): 3601‐14.  Heinze, K. G., M. Jahnz, et al. (2004). "Triple‐color coincidence analysis: one step further  in  following  higher  order  molecular  complex  formation."  Biophys  J  86(1  Pt  1):  506‐16.  Heinze,  K.  G.,  A.  Koltermann,  et  al.  (2000).  "Simultaneous  two‐photon  excitation  of  distinct  labels  for  dual‐color  fluorescence  crosscorrelation  analysis."  Proc  Natl  Acad Sci U S A 97(19): 10377‐82.  Heinze, K. G., M. Rarbach, et al. (2002). "Two‐photon fluorescence coincidence analysis:  rapid measurements of enzyme kinetics." Biophys J 83(3): 1671‐81.  Hergannan, J. A. and J. V. Rechhart (1997). "Drosophila immunity." Trends Cell Biol 7(8):  309‐16.  Hide, M., T. Tsutsui, et al. (2002). "Real‐time analysis of ligand‐induced cell surface and  intracellular  reactions  of  living  mast  cells  using  a  surface  plasmon  resonance‐ based biosensor." Anal Biochem 302(1): 28‐37.  Hoess,  A.,  S.  Watson,  et  al.  (1993).  "Crystal  structure  of  an  endotoxin‐neutralizing  protein  from  the  horseshoe  crab,  Limulus  anti‐LPS  factor,  at  1.5  A  resolution." EMBO J 12(9): 3351‐6.  Hruby, V. J. and G. Tollin (2007). "Plasmon‐waveguide resonance (PWR) spectroscopy for  directly  viewing  rates  of  GPCR/G‐protein  interactions  and  quantifying  affinities." Curr Opin Pharmacol 7(5): 507‐14.  Hughes,  V.  M.  and  N.  Datta  (1983).  "Conjugative  plasmids  in  bacteria  of  the  'pre‐ antibiotic' era." Nature 302(5910): 725‐6.  Hultmark,  D.,  H.  Steiner,  et  al.  (1980).  "Insect  immunity.  Purification  and  properties  of  three  inducible  bactericidal  proteins  from  hemolymph  of  immunized  pupae  of  Hyalophora cecropia." Eur J Biochem 106(1): 7‐16.  Huttner,  W.  B.  and  A.  A.  Schmidt  (2002).  "Membrane  curvature:  a  case  of  endofeelin'." Trends Cell Biol 12(4): 155‐8.  Hwang,  L.  C.,  M.  Gosch,  et  al.  (2006).  "Simultaneous  multicolor  fluorescence  cross‐ correlation  spectroscopy  to  detect  higher  order  molecular  interactions  using  single wavelength laser excitation." Biophys J 91(2): 715‐27.  Hwang,  L.  C.  and  T.  Wohland  (2004).  "Dual‐color  fluorescence  cross‐correlation  spectroscopy  using  single  laser  wavelength  excitation."  Chemphyschem  5(4):  549‐51.  Hwang,  L.  C.  and  T.  Wohland  (2005).  "Single  wavelength  excitation  fluorescence cross‐ correlation  spectroscopy  with  spectrally  similar  fluorophores:  resolution  for  binding studies." J Chem Phys 122(11): 114708.  138        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    Hwang, L. C. and T. Wohland (2007). "Recent advances in fluorescence cross‐correlation  spectroscopy." Cell Biochem Biophys 49(1): 1‐13.  Hwang,  P.  M.,  N.  Zhou,  et  al.  (1998).  "Three‐dimensional  solution  structure  of  lactoferricin  B,  an  antimicrobial  peptide  derived  from  bovine  lactoferrin." Biochemistry 37(12): 4288‐98.  Kalfa,  V.  C.,  H.  P.  Jia,  et  al.  (2001).  "Congeners  of  SMAP29  kill  ovine  pathogens  and  induce  ultrastructural  damage  in  bacterial  cells."  Antimicrob  Agents  Chemother  45(11): 3256‐61.  Kang,  S.  and  M.  Elimelech  (2009).  "Bioinspired  single  bacterial  cell  force  spectroscopy." Langmuir 25(17): 9656‐9.  Kannan, B., L. Guo, et al. (2007). "Spatially resolved total internal reflection fluorescence  correlation  microscopy  using  an  electron  multiplying  charge‐coupled  device  camera." Anal Chem 79(12): 4463‐70.  Kannan, B., J. Y. Har, et al. (2006). "Electron multiplying charge‐coupled device camera  based fluorescence correlation spectroscopy." Anal Chem 78(10): 3444‐51.  Kask,  P.,  P.  Piksarv,  et  al.  (1985).  "Fluorescence  correlation  spectroscopy  in  the  nanosecond  time  range:  Photon  antibunching  in  dye  fluorescence."  European  Biophysics Journal 12(3): 163‐166.  Kask,  P.,  P.  Piksarv,  et  al.  (1989).  "Separation  of  the  rotational  contribution  in  fluorescence correlation experiments." Biophysical Journal 55(2): 213‐220.  Kastrup,  L.,  H.  Blom,  et  al.  (2005).  "Fluorescence  fluctuation  spectroscopy  in  subdiffraction focal volumes." Phys Rev Lett 94(17): 178104.  Kaushalya, S. K., J. Balaji, et al. (2005). "Fluorescence correlation microscopy with real‐ time alignment readout." Appl Opt 44(16): 3262‐5.  Kawabata,  S.,  R.  Nagayama,  et  al.  (1996).  "Tachycitin,  a  small  granular  component  in  horseshoe  crab  hemocytes,  is  an  antimicrobial  protein  with  chitin‐binding  activity." J Biochem 120(6): 1253‐60.  Kim, H., D. Lee, et al. (2002). "Antibacterial activities of peptides designed as hybrids of  antimicrobial peptides." Biotechnology Letters 24(5): 347‐353.  Kiss,  G.  and  H.  Michl  (1962).  "On  the  venomous  skin  secretion  of  the  orange  speckled  frog Bombina variegata." Toxicon 1: 33‐39.  Kolin, D. L.,  D. Ronis, et al. (2006).  "k‐Space image correlation spectroscopy: a method  for  accurate  transport  measurements  independent  of  fluorophore  photophysics." Biophys J 91(8): 3061‐75.  Kondejewski, L. H., S. W. Farmer, et al. (1996). "Gramicidin S is active against both gram‐ positive and gram‐negative bacteria." Int J Pept Protein Res 47(6): 460‐6.  Kondejewski,  L.  H.,  S.  W.  Farmer,  et  al.  (1996).  "Modulation  of  structure  and  antibacterial and hemolytic activity by ring size in cyclic gramicidin S analogs." J  Biol Chem 271(41): 25261‐8.  Kondejewski, L. H., M. Jelokhani‐Niaraki, et al. (1999). "Dissociation of antimicrobial and  hemolytic  activities  in  cyclic  peptide  diastereomers  by  systematic  alterations  in  amphipathicity." J Biol Chem 274(19): 13181‐92.  Koppel,  D.  E.  (1974).  "Statistical  accuracy  in  fluorescence  correlation  spectroscopy." Physical Review A 10(6): 1938‐1945.  Kreil, G. (1994). "Antimicrobial peptides from amphibian skin: an overview." Ciba Found  Symp 186: 77‐85; discussion 85‐90.  139        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    Krichevsky,  O.  and  G.  Bonnet  (2002).  "Fluorescence  correlation  spectroscopy:  the  technique and its applications." Reports on Progress in Physics 65(2): 251‐298.  Ladokhin, A. S. and S. H. White (2001). "'Detergent‐like' permeabilization of anionic lipid  vesicles by melittin." Biochim Biophys Acta 1514(2): 253‐60.  Laederach, A.,  A.  H.  Andreotti,  et  al.  (2002).  "Solution  and  micelle‐bound  structures  of  tachyplesin  I  and  its  active  aromatic  linear  derivatives."  Biochemistry  41(41):  12359‐68.  Lee,  C.  (2008).  "Therapeutic  challenges  in  the  era  of  antibiotic  resistance."  Int  J  Antimicrob Agents 32 Suppl 4: S197‐9.  Lee, D. G., Y. Park, et al. (2004). "Structure‐antiviral activity relationships of cecropin A‐ magainin 2 hybrid peptide and its analogues." J Pept Sci 10(5): 298‐303.  Lee, D. L. and R. S. Hodges (2003). "Structure‐activity relationships of de novo designed  cyclic antimicrobial peptides based on gramicidin S." Biopolymers 71(1): 28‐48.  Lee, J. Y., A. Boman, et al. (1989). "Antibacterial peptides from pig intestine: isolation of  a mammalian cecropin." Proc Natl Acad Sci U S A 86(23): 9159‐62.  Lee, M. T., F. Y. Chen, et al. (2004). "Energetics of pore formation induced by membrane  active peptides." Biochemistry 43(12): 3590‐9.  Lehrer,  R.  I.,  A.  Barton,  et  al.  (1989).  "Interaction  of  human  defensins  with  Escherichia  coli. Mechanism of bactericidal activity." J Clin Invest 84(2): 553‐61.  Lemaitre,  B.,  J.  M.  Reichhart,  et  al.  (1997).  "Drosophila  host  defense:  differential  induction  of  antimicrobial  peptide  genes  after  infection  by  various  classes  of  microorganisms." Proc Natl Acad Sci U S A 94(26): 14614‐9.  Leptihn, S., J. Y. Har, et al. (2009). "Single molecule resolution of the antimicrobial action  of quantum dot‐labeled sushi peptide on live bacteria." BMC Biol 7: 22.  Li, A., P. Y. Lee, et al. (2007). "Atomic force microscopy study of the antimicrobial action  of  Sushi  peptides  on  Gram  negative  bacteria."  Biochim  Biophys  Acta  1768(3):  411‐8.  Li, D., J. Xiong, et al. (2004). "Three‐dimensional tracking of single secretory granules in  live PC12 cells." Biophys J 87(3): 1991‐2001.  Li, P., M. Sun, et al. (2006). "Molecular mechanisms that govern the specificity of Sushi  peptides  for  Gram‐negative  bacterial  membrane  lipids."  Biochemistry  45(35):  10554‐62.  Li,  P.,  T.  Wohland,  et  al.  (2004).  "Perturbation  of  Lipopolysaccharide  (LPS)  Micelles  by  Sushi 3 (S3) antimicrobial peptide. The importance of an intermolecular disulfide  bond in S3 dimer for binding, disruption, and neutralization of LPS." J Biol Chem  279(48): 50150‐6.  Liu,  D.  and  W.  F.  DeGrado  (2001).  "De  novo  design,  synthesis,  and  characterization  of  antimicrobial beta‐peptides." J Am Chem Soc 123(31): 7553‐9.  Liu,  P.,  S.  Ahmed,  et  al.  (2008).  "The  F‐techniques:  advances  in  receptor  protein  studies." Trends Endocrinol Metab 19(5): 181‐90.  Liu, P., T. Sudhaharan, et al. (2007). "Investigation of the dimerization of proteins from  the  epidermal  growth  factor  receptor  family  by  single  wavelength  fluorescence  cross‐correlation spectroscopy." Biophys J 93(2): 684‐98.  Lourenzoni,  M.  R.,  A.  M.  Namba,  et  al.  (2007).  "Study  of  the  interaction  of  human  defensins  with  cell  membrane  models:  relationships  between  structure  and  biological activity." J Phys Chem B 111(38): 11318‐29.  140        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    Ludtke, S. J., K. He, et al. (1996). "Membrane pores induced by magainin." Biochemistry  35(43): 13723‐8.  Madl,  J.,  S.  Rhode,  et  al.  (2006).  "A  combined  optical  and  atomic  force microscope for  live cell investigations." Ultramicroscopy 106(8‐9): 645‐51.  Magde, D., E. Elson, et al. (1972). "Thermodynamic Fluctuations in a Reacting System— Measurement  by  Fluorescence  Correlation  Spectroscopy."  Physical  Review  Letters 29(11): 705‐708.  Magde,  D.,  E.  L.  Elson,  et  al.  (1974).  "Fluorescence  correlation  spectroscopy.  II.  An  experimental realization." Biopolymers 13(1): 29‐61.  Maget‐Dana,  R.  (1999).  "The  monolayer  technique:  a  potent  tool  for  studying  the  interfacial  properties  of  antimicrobial  and  membrane‐lytic  peptides  and  their  interactions with lipid membranes." Biochim Biophys Acta 1462(1‐2): 109‐40.  Maher,  S.  and  S.  McClean  (2006).  "Investigation  of  the  cytotoxicity  of  eukaryotic  and  prokaryotic antimicrobial peptides in intestinal epithelial cells in vitro." Biochem  Pharmacol 71(9): 1289‐98.  Makovitzki,  A.  and  Y.  Shai  (2005).  "pH‐dependent  antifungal  lipopeptides  and  their  plausible mode of action." Biochemistry 44(28): 9775‐84.  Mandard,  N.,  P.  Sodano,  et  al.  (1998).  "Solution  structure  of  thanatin,  a  potent  bactericidal  and  fungicidal  insect  peptide,  determined  from  proton  two‐ dimensional nuclear magnetic resonance data." Eur J Biochem 256(2): 404‐10.  Matsuzaki,  K.  (1999).  "Why  and  how  are  peptide‐lipid  interactions  utilized  for  self‐ defense?  Magainins  and  tachyplesins  as  archetypes."  Biochim  Biophys  Acta  1462(1‐2): 1‐10.  Matsuzaki,  K.,  M.  Harada,  et  al.  (1991).  "Physicochemical  determinants  for  the  interactions of magainins 1 and 2 with acidic lipid bilayers." Biochim Biophys Acta  1063(1): 162‐70.  Matsuzaki, K., O. Murase, et al. (1996). "An antimicrobial peptide, magainin 2, induced  rapid  flip‐flop  of  phospholipids  coupled  with  pore  formation  and  peptide  translocation." Biochemistry 35(35): 11361‐8.  Matsuzaki,  K.,  K.  Sugishita,  et  al.  (1997).  "Interactions  of  an  antimicrobial  peptide,  magainin  2,  with  outer  and  inner  membranes  of  Gram‐negative  bacteria." Biochim Biophys Acta 1327(1): 119‐30.  Matsuzaki,  K.,  K.  Sugishita,  et  al.  (1998).  "Relationship  of  membrane  curvature  to  the  formation of pores by magainin 2." Biochemistry 37(34): 11856‐63.  Matsuzaki,  K.,  K.  Sugishita,  et  al.  (1999).  "Interactions  of  an  antimicrobial  peptide,  magainin  2,  with  lipopolysaccharide‐containing  liposomes  as  a  model  for  outer  membranes of gram‐negative bacteria." FEBS Lett 449(2‐3): 221‐4.  McGillivray,  D.  J.,  G.  Valincius,  et  al.  (2009).  "Structure  of  functional  Staphylococcus  aureus alpha‐hemolysin channels in tethered bilayer lipid membranes." Biophys J  96(4): 1547‐53.  McPhee,  J.  B.  and  R.  E.  Hancock  (2005).  "Function  and  therapeutic  potential  of  host  defence peptides." J Pept Sci 11(11): 677‐87.  Mecke,  A.,  D.  K.  Lee,  et  al.  (2005).  "Membrane  thinning  due  to  antimicrobial  peptide  binding: an atomic force microscopy study of MSI‐78 in lipid bilayers." Biophys J  89(6): 4043‐50.  Meseth,  U.,  T.  Wohland,  et  al.  (1999).  "Resolution  of  fluorescence  correlation  measurements." Biophys J 76(3): 1619‐31.  141        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    Milon,  S.,  R.  Hovius,  et  al.  (2003).  "Factors  influencing  fluorescence  correlation  spectroscopy  measurements  on  membranes:  simulations  and  experiments." Chemical Physics 288(2): 171‐186.  Miyata, T., F. Tokunaga, et al. (1989). "Antimicrobial peptides, isolated from horseshoe  crab  hemocytes,  tachyplesin  II,  and  polyphemusins  I  and  II:  chemical  structures  and biological activity." J Biochem 106(4): 663‐8.  Mozsolits,  H.  and  M.  I.  Aguilar  (2002).  "Surface  plasmon  resonance  spectroscopy:  an  emerging  tool  for  the  study  of  peptide‐membrane  interactions."  Biopolymers  66(1): 3‐18.  Mozsolits,  H.,  H.  J.  Wirth,  et  al.  (2001).  "Analysis  of  antimicrobial  peptide  interactions  with  hybrid  bilayer  membrane  systems  using  surface  plasmon  resonance." Biochim Biophys Acta 1512(1): 64‐76.  Naito,  A.,  T.  Nagao,  et  al.  (2000).  "Conformation  and  dynamics  of  melittin  bound  to  magnetically  oriented  lipid  bilayers  by  solid‐state  (31)P  and  (13)C  NMR  spectroscopy." Biophys J 78(5): 2405‐17.  Nakamura, T., H. Furunaka, et al. (1988). "Tachyplesin, a class of antimicrobial peptide  from  the  hemocytes  of  the  horseshoe  crab  (Tachypleus  tridentatus).  Isolation  and chemical structure." J Biol Chem 263(32): 16709‐13.  Nikaido,  H.  and  M.  Vaara  (1985).  "Molecular  basis  of  bacterial  outer  membrane  permeability." Microbiol Rev 49(1): 1‐32.  Ohsugi,  Y.,  K.  Saito,  et  al.  (2006).  "Lateral  mobility  of  membrane‐binding  proteins  in  living  cells  measured  by  total  internal  reflection  fluorescence  correlation  spectroscopy." Biophys J 91(9): 3456‐64.  Oppenheim,  J.  J.,  A.  Biragyn,  et  al.  (2003).  "Roles  of  antimicrobial  peptides  such  as  defensins in innate and adaptive immunity." Ann Rheum Dis 62 Suppl 2: ii17‐21.  Oren, Z., J. Hong, et al. (1999). "A comparative study on the structure and function of a  cytolytic  alpha‐helical  peptide  and  its  antimicrobial  beta‐sheet  diastereomer." Eur J Biochem 259(1‐2): 360‐9.  Orivel,  J.,  V.  Redeker,  et  al.  (2001).  "Ponericins,  new  antibacterial  and  insecticidal  peptides from the venom of the ant Pachycondyla goeldii." J Biol Chem 276(21):  17823‐9.  Ormo,  M.,  A.  B.  Cubitt,  et  al.  (1996).  "Crystal  structure  of  the  Aequorea  victoria  green  fluorescent protein." Science 273(5280): 1392‐5.  Otvos, L., Jr. (2000). "Antibacterial peptides isolated from insects." J Pept Sci 6(10): 497‐ 511.  Otvos,  L.,  Jr.,  I.  O,  et  al.  (2000).  "Interaction  between  heat  shock  proteins  and  antimicrobial peptides." Biochemistry 39(46): 14150‐9.  Pan, C. Y., T. T. Chao, et al. (2007). "Shrimp (Penaeus monodon) anti‐lipopolysaccharide  factor  reduces  the  lethality  of  Pseudomonas  aeruginosa  sepsis  in  mice."  Int  Immunopharmacol 7(5): 687‐700.  Pan, X., W. Foo, et al. (2007). "Multifunctional fluorescence correlation microscope for  intracellular and microfluidic measurements." Rev Sci Instrum 78(5): 053711.  Pan,  X.,  H.  Yu,  et  al.  (2007).  "Characterization  of  flow  direction  in  microchannels  and  zebrafish  blood  vessels  by  scanning  fluorescence  correlation  spectroscopy."  J  Biomed Opt 12(1): 014034.  Parillo,  J.  (1993).  "Mechanisms  of  disease:  Pathogenic  mechanisms  of  septic  shock."  N  Eng J Med 328: 1471‐1477.  142        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    Park,  C.  B.,  H.  S.  Kim,  et  al.  (1998).  "Mechanism  of  action  of  the  antimicrobial  peptide  buforin II: buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and  inhibiting cellular functions." Biochem Biophys Res Commun 244(1): 253‐7.  Park,  Y.  and  K.  S.  Hahm  (2005).  "Antimicrobial  peptides  (AMPs):  peptide  structure  and  mode of action." J Biochem Mol Biol 38(6): 507‐16.  Patrzykat,  A.,  C.  L.  Friedrich,  et  al.  (2002).  "Sublethal  concentrations  of  pleurocidin‐ derived  antimicrobial  peptides  inhibit  macromolecular  synthesis  in  Escherichia  coli." Antimicrob Agents Chemother 46(3): 605‐14.  Pawley, J. B. (2006). Handbook of Biological Confocal Microscopy. New York, Springer.  Petersen,  N.  O.,  P.  L.  Hoddelius,  et  al.  (1993).  "Quantitation  of  membrane  receptor  distributions  by  image  correlation  spectroscopy:  concept  and  application." Biophys J 65(3): 1135‐46.  Petrasek, Z. and P. Schwille (2007). "Precise measurement of diffusion coefficients using  scanning fluorescence correlation spectroscopy." Biophys J.  Piers, K. L., M. H. Brown, et al. (1994). "Improvement of outer membrane‐permeabilizing  and lipopolysaccharide‐binding activities of an  antimicrobial cationic peptide by  C‐terminal modification." Antimicrob Agents Chemother 38(10): 2311‐6.  Poo,  M.  and  R.  A.  Cone  (1974).  "Lateral  diffusion  of  rhodopsin  in  the  photoreceptor  membrane." Nature 247(5441): 438‐441.  Pouny,  Y.,  D.  Rapaport,  et  al.  (1992).  "Interaction  of  antimicrobial  dermaseptin  and  its  fluorescently  labeled  analogues  with  phospholipid  membranes."  Biochemistry  31(49): 12416‐23.  Powers, J. P., A. Rozek, et al. (2004). "Structure‐activity relationships for the beta‐hairpin  cationic  antimicrobial  peptide  polyphemusin  I."  Biochim  Biophys  Acta  1698(2):  239‐50.  Prenner,  E.  J.,  R.  N.  Lewis,  et  al.  (1999).  "The  interaction  of  the  antimicrobial  peptide  gramicidin  S  with  lipid  bilayer  model  and  biological  membranes."  Biochim  Biophys Acta 1462(1‐2): 201‐21.  Przybylo, M., J. Sykora, et al. (2006). "Lipid diffusion in giant unilamellar vesicles is more  than  2  times  faster  than  in  supported  phospholipid  bilayers  under  identical  conditions." Langmuir 22(22): 9096‐9.  Qian,  H.  and  E.  Elson  (1991).  "Analysis  of  confocal  laser‐microscope  optics  for  3‐D  fluorescence correlation spectroscopy." Appl. Opt 30(10): 1185?195.  Qian,  H.,  M.  P.  Sheetz,  et  al.  (1991).  "Single  particle  tracking.  Analysis  of  diffusion  and  flow in two‐dimensional systems." Biophys J 60(4): 910‐21.  Quinn, J. G., S. O'Neill, et al. (2000). "Development and application of surface plasmon  resonance‐based  biosensors  for  the  detection  of  cell‐ligand  interactions."  Anal  Biochem 281(2): 135‐43.  Quinones‐Mateu, M. E., M. M. Lederman, et al. (2003). "Human epithelial beta‐defensins  2 and 3 inhibit HIV‐1 replication." AIDS 17(16): F39‐48.  Raetz, C. R. (1990). "Biochemistry of endotoxins." Annu Rev Biochem 59: 129‐70.  Raetz, C. R. and C. Whitfield (2002). "Lipopolysaccharide endotoxins." Annu Rev Biochem  71: 635‐700.  Reddy,  K.  V.,  R.  D.  Yedery,  et  al.  (2004).  "Antimicrobial  peptides:  premises  and  promises." Int J Antimicrob Agents 24(6): 536‐47.  143        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    Ried, C., C. Wahl, et al. (1996). "High affinity endotoxin‐binding and neutralizing peptides  based  on  the  crystal  structure  of  recombinant  Limulus  anti‐lipopolysaccharide  factor." J Biol Chem 271(45): 28120‐7.  Rigler, R. (1995). "Fluorescence correlations, single molecule detection and large number  screening. Applications in biotechnology." J Biotechnol 41(2‐3): 177‐86.  Rigler,  R.,  Mets,  et  al.  (1993).  "Fluorescence  correlation  spectroscopy  with  high  count  rate  and  low  background:  analysis  of  translational  diffusion."  European  Biophysics Journal 22(3): 169‐175.  Rosenfeld,  Y.,  N.  Papo,  et  al.  (2006).  "Endotoxin  (lipopolysaccharide)  neutralization  by  innate immunity host‐defense peptides. Peptide properties and plausible modes  of action." J Biol Chem 281(3): 1636‐43.  Rossetto, G., P. Bergese, et al. (2007). "Atomic force microscopy evaluation of the effects  of  a  novel  antimicrobial  multimeric  peptide  on  Pseudomonas  aeruginosa." Nanomedicine 3(3): 198‐207.  Rossi,  C.,  J.  Homand,  et  al.  (2003).  "Differential  mechanisms  for  calcium‐dependent  protein/membrane  association  as  evidenced  from  SPR‐binding  studies  on  supported biomimetic membranes." Biochemistry 42(51): 15273‐83.  Rozek,  A.,  C.  L.  Friedrich,  et  al.  (2000).  "Structure  of  the  bovine  antimicrobial  peptide  indolicidin  bound  to  dodecylphosphocholine  and  sodium  dodecyl  sulfate  micelles." Biochemistry 39(51): 15765‐74.  Ruttinger, S., R. Macdonald, et al. (2006). "Accurate single‐pair Forster resonant energy  transfer  through  combination  of  pulsed  interleaved  excitation,  time  correlated  single‐photon  counting,  and  fluorescence  correlation  spectroscopy."  J  Biomed  Opt 11(2): 024012.  Saenko,  E.,  A.  Sarafanov,  et  al.  (2001).  "Comparison  of  the  properties  of  phospholipid  surfaces formed on HPA and L1 biosensor chips for the binding of the coagulation  factor VIII." J Chromatogr A 921(1): 49‐56.  Saito,  T.,  S.  Kawabata, et  al.  (1995).  "A  novel  big  defensin  identified  in horseshoe  crab  hemocytes: isolation, amino acid sequence, and antibacterial activity." J Biochem  117(5): 1131‐7.  Sako, Y., S. Minoghchi, et al. (2000). "Single‐molecule imaging of EGFR signalling on the  surface of living cells." Nat Cell Biol 2(3): 168‐72.  Salomon,  R.  A.  and  R.  N.  Farias  (1992).  "Microcin  25,  a  novel  antimicrobial  peptide  produced by Escherichia coli." J Bacteriol 174(22): 7428‐35.  Sansom, M. S. (1991). "The biophysics of peptide models of ion channels." Prog Biophys  Mol Biol 55(3): 139‐235.  Saxton, M. J. and K. Jacobson (1997). "Single‐particle tracking: applications to membrane  dynamics." Annu Rev Biophys Biomol Struct 26: 373‐99.  Schibli, D. J., P. M. Hwang, et al. (1999). "Structure of the antimicrobial peptide tritrpticin  bound  to  micelles:  a  distinct  membrane‐bound  peptide  fold."  Biochemistry  38(51): 16749‐55.  Schnaitman, C. A. and J. D. Klena (1993). "Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in  enteric bacteria." Microbiol Rev 57(3): 655‐82.  Schuster, F. L. and L. S. Jacob (1992). "Effects of magainins on ameba and cyst stages of  Acanthamoeba polyphaga." Antimicrob Agents Chemother 36(6): 1263‐71.  144        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    Schwille,  P.,  U.  Haupts,  et  al.  (1999).  "Molecular  dynamics  in  living  cells  observed  by  fluorescence  correlation  spectroscopy  with  one‐  and  two‐photon  excitation." Biophys J 77(4): 2251‐65.  Schwille,  P.  and  E.  Haustein  (2001).  "Fluorescence  correlation  spectroscopy.  An  introduction to its concepts and applications." Biophysics Textbook Online: 1?3.  Schwille, P., F. J. Meyer‐Almes, et al. (1997). "Dual‐color fluorescence cross‐correlation  spectroscopy  for  multicomponent  diffusional  analysis  in  solution."  Biophys  J  72(4): 1878‐86.  Scott, M. G., M. R. Gold, et al. (1999). "Interaction of cationic peptides with lipoteichoic  acid and gram‐positive bacteria." Infect Immun 67(12): 6445‐53.  Shai, Y. (1999). "Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid  bilayer  membranes  by  alpha‐helical  antimicrobial  and  cell  non‐selective  membrane‐lytic peptides." Biochim Biophys Acta 1462(1‐2): 55‐70.  Shai,  Y.  (2002).  "From  innate  immunity  to  de‐novo  designed  antimicrobial  peptides." Curr Pharm Des 8(9): 715‐25.  Shai,  Y.  and  Z.  Oren  (2001).  "From  "carpet"  mechanism  to  de‐novo  designed  diastereomeric cell‐selective antimicrobial peptides." Peptides 22(10): 1629‐41.  Shaw,  J.  E.,  J.  R.  Alattia,  et  al.  (2006).  "Mechanisms  of  antimicrobial  peptide  action:  studies of indolicidin assembly at model membrane interfaces by in situ atomic  force microscopy." J Struct Biol 154(1): 42‐58.  Shi,  J.,  C.  R.  Ross,  et  al.  (1996).  "Antibacterial  activity  of  a  synthetic  peptide  (PR‐26)  derived  from  PR‐39,  a  proline‐arginine‐rich  neutrophil  antimicrobial  peptide." Antimicrob Agents Chemother 40(1): 115‐21.  Sinha, S., N. Cheshenko, et al. (2003). "NP‐1, a rabbit alpha‐defensin, prevents the entry  and  intercellular  spread  of  herpes  simplex  virus  type  2."  Antimicrob  Agents  Chemother 47(2): 494‐500.  Sisan,  D.  R.,  R.  Arevalo,  et  al.  (2006).  "Spatially  resolved  fluorescence  correlation  spectroscopy using a spinning disk confocal microscope." Biophys J 91(11): 4241‐ 52.  Sitaram, N. and R. Nagaraj (1999). "Interaction of antimicrobial peptides with biological  and model membranes: structural and charge requirements for activity." Biochim  Biophys Acta 1462(1‐2): 29‐54.  Skinner, J. P., Y. Chen, et al. (2005). "Position‐sensitive scanning fluorescence correlation  spectroscopy." Biophys J 89(2): 1288‐301.  Sorscher, S. M., J. C. Bartholomew, et al. (1980). "The use  of fluorescence correlations  spectroscopy  to  probe  chromatin  in  the  cell  nucleus."  Biochim  Biophys  Acta  610(1): 28‐46.  Soumpasis, D. M. (1983). "Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery  experiments." Biophys J 41(1): 95‐7.  Starchev,  K.,  J.  Zhang,  et  al.  (1998).  "Applications  of  Fluorescence  Correlation  Spectroscopy—Particle  Size  Effect."  Journal  of  colloid  and  interface  science  203(1): 189‐196.  Steiner,  H.,  D.  Hultmark,  et  al.  (1981).  "Sequence  and  specificity  of  two  antibacterial  proteins involved in insect immunity." Nature 292(5820): 246‐8.  Stout,  A.  and  D.  Axelrod  (1989).  "Evanescent  field  excitation  of  fluorescence  by  epi‐ illumination microscopy." Appl. Opt 28(24): 5237?242.  145        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    Subbalakshmi,  C.  and  N.  Sitaram  (1998).  "Mechanism  of  antimicrobial  action  of  indolicidin." FEMS Microbiol Lett 160(1): 91‐6.  Tam, J. P., Y. A. Lu, et al. (2002). "Correlations of cationic charges with salt sensitivity and  microbial  specificity  of  cystine‐stabilized  beta  ‐strand  antimicrobial  peptides."  J  Biol Chem 277(52): 50450‐6.  Tamba,  Y.  and  M.  Yamazaki  (2005).  "Single  giant  unilamellar  vesicle  method  reveals  effect  of  antimicrobial  peptide  magainin  2  on  membrane  permeability." Biochemistry 44(48): 15823‐33.  Tan, N. S., B. Ho, et al. (2000). "High‐affinity LPS binding domain(s) in recombinant factor  C of a horseshoe crab neutralizes LPS‐induced lethality." FASEB J 14(7): 859‐70.  Tan, N. S., M. L. Ng, et al. (2000). "Definition of endotoxin binding sites in horseshoe crab  factor  C  recombinant  sushi  proteins  and  neutralization  of  endotoxin  by  sushi  peptides." FASEB J 14(12): 1801‐13.  Tang,  M.,  A.  J.  Waring,  et  al.  (2007).  "Phosphate‐mediated  arginine  insertion  into  lipid  membranes and pore formation by a cationic membrane peptide from solid‐state  NMR." J Am Chem Soc 129(37): 11438‐46.  Tang,  Y.  Q.,  J.  Yuan,  et  al.  (1999).  "A  cyclic  antimicrobial  peptide  produced  in  primate  leukocytes by the ligation of two truncated alpha‐defensins." Science 286(5439):  498‐502.  Tencza,  S.  B.,  J.  P.  Douglass,  et  al.  (1997).  "Novel  antimicrobial  peptides  derived  from  human  immunodeficiency  virus  type  1  and  other  lentivirus  transmembrane  proteins." Antimicrob Agents Chemother 41(11): 2394‐8.  Terry, B., E. Matthews, et al. (1995). "Molecular characterization of recombinant green  fluorescent  protein  by  fluorescence  correlation  microscopy."  Biochemical  and  biophysical research communications 217(1): 21‐27.  Thennarasu,  S.,  D.  K.  Lee,  et  al.  (2005).  "Membrane  permeabilization,  orientation,  and  antimicrobial mechanism of subtilosin A." Chem Phys Lipids 137(1‐2): 38‐51.  Thompson,  N.  (1991).  "Fluorescence  correlation  spectroscopy."  Topics  in  fluorescence  spectroscopy 1: 337?78.  Thompson,  N.  L.  and  D.  Axelrod  (1983).  "Immunoglobulin  surface‐binding  kinetics  studied  by  total  internal  reflection  with  fluorescence  correlation  spectroscopy." Biophys J 43(1): 103‐14.  Thompson,  N.  L.,  T.  P.  Burghardt,  et  al.  (1981).  "Measuring  surface  dynamics  of  biomolecules  by  total  internal  reflection  fluorescence  with  photobleaching  recovery or correlation spectroscopy." Biophys J 33(3): 435‐54.  Thompson,  N.  L.  and  B.  L.  Steele  (2007).  "Total  internal  reflection  with  fluorescence  correlation spectroscopy." Nat Protoc 2(4): 878‐90.  Tollin, G., Z. Salamon, et al. (2003). "Plasmon‐waveguide resonance spectroscopy: a new  tool for investigating signal transduction by G‐protein coupled receptors." Life Sci  73(26): 3307‐11.  Tossi,  A.,  L.  Sandri,  et  al.  (2000).  "Amphipathic,  alpha‐helical  antimicrobial  peptides." Biopolymers 55(1): 4‐30.  Tracey, K. J., Y. Fong, et al. (1987). "Anti‐cachectin/TNF monoclonal antibodies prevent  septic shock during lethal bacteraemia." Nature 330(6149): 662‐4.  Triantafilou,  M.  and  K.  Triantafilou  (2005).  "The  dynamics  of  LPS  recognition:  complex  orchestration of multiple receptors." J Endotoxin Res 11(1): 5‐11.  146        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    Utsugi, T., A. J. Schroit, et al. (1991). "Elevated expression of phosphatidylserine in the  outer  membrane  leaflet  of  human  tumor  cells  and  recognition  by  activated  human blood monocytes." Cancer Res 51(11): 3062‐6.  Varki, A., R. Cummings, et al. (2002). Essentials of glycobiology, CSHL Press.  Wang,  W.,  S.  M.  Owen,  et  al.  (2004).  "Activity  of  alpha‐  and  theta‐defensins  against  primary isolates of HIV‐1." J Immunol 173(1): 515‐20.  Weidemann, T., M. Wachsmuth, et al. (2002). "Analysis of ligand binding by two‐colour  fluorescence cross‐correlation spectroscopy." Single Molecules 3(1): 49‐61.  Widengren,  J.,  R.  Rigler,  et  al.  (1994).  "Triplet‐state  monitoring  by  fluorescence  correlation spectroscopy." Journal of Fluorescence 4(3): 255‐258.  Wieprecht,  T.,  M.  Dathe,  et  al.  (1997).  "Modulation  of  membrane  activity  of  amphipathic,  antibacterial  peptides  by  slight  modifications  of  the  hydrophobic  moment." FEBS Lett 417(1): 135‐40.  Wiseman, P. W., J. A. Squier, et al. (2000). "Two‐photon image correlation spectroscopy  and image cross‐correlation spectroscopy." J Microsc 200(Pt 1): 14‐25.  Wohland, T., R. Rigler, et al. (2001). "The standard deviation in fluorescence correlation  spectroscopy." Biophys J 80(6): 2987‐99.  Wolf,  D.  E.  (1989).  "Designing,  building,  and  using  a  fluorescence  recovery  after  photobleaching instrument." Methods Cell Biol 30: 271‐306.  Yamada,  K.,  S.  S.  Shinoda,  et  al.  (2006).  "Synthesis  of  low‐hemolytic  antimicrobial  dehydropeptides based on gramicidin s." J Med Chem 49(26): 7592‐5.  Yang, L., T. A. Harroun, et al. (2001). "Barrel‐stave model or toroidal model? A case study  on melittin pores." Biophys J 81(3): 1475‐85.  Yang, L., T. M. Weiss, et al. (1999). "Supramolecular structures of peptide assemblies in  membranes  by  neutron  off‐plane  scattering:  method  of  analysis."  Biophys  J  77(5): 2648‐56.  Yasin, B., W. Wang, et al. (2004). "Theta defensins protect cells from infection by herpes  simplex virus by inhibiting viral adhesion and entry." J Virol 78(10): 5147‐56.  Yenugu, S., K. G. Hamil, et al. (2004). "The androgen‐regulated epididymal sperm‐binding  protein,  human  beta‐defensin  118  (DEFB118)  (formerly  ESC42),  is  an  antimicrobial beta‐defensin." Endocrinology 145(7): 3165‐73.  Yonezawa,  A.,  J.  Kuwahara,  et  al.  (1992).  "Binding  of  tachyplesin  I  to  DNA  revealed  by  footprinting  analysis:  significant  contribution  of  secondary  structure  to  DNA  binding and implication for biological action." Biochemistry 31(11): 2998‐3004.  Yu, L. (2006). Investigation of the Interaction of Antimicrobial Peptides with Lipids  and  Lipid  Membranes.  Department  of  Chemistry,  National  University  of  Singapore.  Ph.D. Thesis.  Yu, L., J. Ding, et al. (2008). "Investigation of the Mechanisms of Antimicrobial Peptides  Interacting  with  Membranes  by  Fluorescence  Correlation  Spectroscopy."  The  Open Chemical Physics Journal 1(1): 62‐79.  Yu, L., J. L. Ding, et al. (2005). "Investigation of a novel artificial antimicrobial peptide by  fluorescence  correlation  spectroscopy:  an  amphipathic  cationic  pattern  is  sufficient  for  selective  binding  to  bacterial  type  membranes  and  antimicrobial  activity." Biochim Biophys Acta 1716(1): 29‐39.  Yu,  L.,  L.  Guo,  et  al.  (2009).  "Interaction  of  an  artificial  antimicrobial  peptide  with lipid  membranes." Biochim Biophys Acta 1788(2): 333‐44.  147        Investigation of Peptide‐Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy    Yu,  L.,  M.  Tan,  et  al.  (2006).  "Determination  of  critical  micelle  concentrations  and  aggregation numbers by fluorescence correlation spectroscopy: aggregation of a  lipopolysaccharide." Anal Chim Acta 556(1): 216‐25.  Zasloff,  M.  (1987).  "Magainins,  a  class  of  antimicrobial  peptides  from  Xenopus  skin:  isolation,  characterization  of  two  active  forms,  and  partial  cDNA  sequence  of  a  precursor." Proceedings of the National Academy of Sciences 84(15): 5449‐5453.  Zasloff,  M.  (2002).  "Antimicrobial  peptides  of  multicellular  organisms."  Nature  415(6870): 389‐95.  Zasloff,  M.,  B.  Martin,  et  al.  (1988).  "Antimicrobial  activity  of  synthetic  magainin  peptides  and  several  analogues."  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences 85(3): 910‐913.  Zhu,  W.  L.  and  S.  Y.  Shin  (2009).  "Antimicrobial  and  cytolytic  activities  and  plausible  mode of bactericidal action of the cell penetrating peptide penetratin and its lys‐ linked two‐stranded peptide." Chem Biol Drug Des 73(2): 209‐15.        148    [...]... The  reduction  of disulfide  bonds  presented  in  β‐sheet  structures  may  change  the  activity  or  even  mechanism of the interaction of peptides (Andreu et al. 1998).   12    Investigation of Peptide Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy       1.1.1.4 Therapeutic potential of antimicrobial peptides  Considering  the  possibilities  of thousands  of natural  peptides  and ... modifications of V4 peptides were proposed in the current study. Fluorescence imaging  and  spectroscopy were  used  in  this  study  to  investigate  how  peptides  interact  with  different membrane system. More specifically, the aims are:  To  investigate  how  different  hydrophobicity  would  affect  the  solubility  of the  1        Investigation of Peptide Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy ... adsorption  when  peptides  interact  with  lipid membranes.  Moreover  investigation could  be  performed  on  different  types  and  strains  of Gram‐negative  and  2    Investigation of Peptide Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy       Gram‐positive  bacteria,  providing  a  much  more  comprehensive  idea  on  the  effect  of AMPs on different bacteria.  In this thesis fluorescence imaging and spectroscopy are proved to be useful tools .. .Investigation of Peptide Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy       Fig 3.4 Interaction between different peptides and POPG REVs.  73  Fig 3.5 Different peptides showed different activity against POPG REVs.  74  Fig 3.6 Interaction between different peptides and POPG RLVs.  75  Fig 3.7 ACF and intensity trace for POPG RLV aggregates and fragments.  76  Fig 3.8 Different peptides showed different activity against POPG RLVs. ... of AMPs neutralizing LPS can help to lower the risk of suffering endotoxic shock during  and  after  treatment  of bacterial  infection  (Hancock  1999).  The  eradication  of Gram‐ 16    Investigation of Peptide Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy       negative  bacteria  by cationic  peptides  targeting  LPS  (Boman  1995;  Gough  et  al.  1996;  Hancock 1999) brings the idea of de novo design of AMPs based on this LPS‐/LA‐ binding  motif.  ... negatively  charged  phospholipids.  In  constrast,  the  outer  leaflet  of mammalian  cells  is  mainly  composed  of zwitterionic  lipids,  most  of the  negatively  charged  lipids  are  segregated  into the inner leaflet, thus possessing a neutrally charged outer surface (Matsuzaki 1999).  19        Investigation of Peptide Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy   The difference in the surface charge between bacterial and mammalian cells gives rise to ... from scorpion. Thoinin from a number of plant species (Florack et al. 1994), bacteriocins  (Hancock  et  al.  1999)  from  Gram‐positive  and  Gram‐negative  bacteria  and  LLPs  from   virus (Tencza et al. 1997) are identified.    7    Investigation of Peptide Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy       Other  promising  sources  of AMPs  are  synthetic  peptides.  A  series  of AMPs  have  been synthesized by modifying the sequence of their natural analogues, or according to ... activity  of the  peptides  will be provided.  To  elucidate  the  possible  mechanisms  of interaction between  AMP  and  membranes.  To apply new techniques (imaging total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy)  to study the peptide lipid interaction.   The  study  is  aimed  to  enhance  the  understanding  of the  specificity  of the  V  peptide family  and  their  mode  of ... Table 1.1 Clinical developments of cationic antimicrobial peptides      14      Investigation of Peptide Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy   side‐effects on the host organism. And in this section, a brief overview of these studies  will be provided.    1.1.2.1 Designed antimicrobial peptides  In  general,  researchers  attempt  to  improve  the  performance  of certain  AMPs  based ... Fig 4.14 Another set of ITIR‐FCS data showing different result.  125  Fig 4.15 TIRF image of uneven distribution of V4.  126    X    Investigation of Peptide Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy       List of Tables  Table 1.1 Clinical developments of cationic antimicrobial peptides.  14  Table 1.2 Predicted molecular properties of modified V4.  18  Table 2.1 Comparison between different MV4‐TMR and TMR.  53  . of Chemistry,NationalUniversity of Singaporeunderthesupervision of AssociateProfessor ThorstenWohland.  Theresultshavebeenpartlypublishedin: Guo,L.,J.Y.Har,J.Sankaran,Y.Hong,B.KannanandT.Wohland(2008)."Molecular diffusionmeasurementin lipid bilayersoverwideconcentrationranges:a comparativestudy."Chemphyschem9(5):721‐8. Kannan,B.,L.Guo,T.Sudhaharan,S.Ahmed,I.MaruyamaandT.Wohland(2007). "Spatiallyresolvedtotalinternalreflection fluorescence correlation microscopy usinganelectronmultiplyingcharge‐coupleddevicecamera."AnalChem79(12): 4463‐70. Yu,L.,L.Guo,J.L.Ding,B.Ho,S.S.Feng,J.Popplewell,M.SwannandT.Wohland (2009)." ;Interaction of anartificialantimicrobial peptide with lipid membranes."BiochimBiophysActa1788(2):333‐44. Leptihn,S.,L.Guo,V.Frecer,B.HoandJ.Ding(2010)."Onestepatatime:Action mechanism of Sushi1antimicrobial peptide andderivedmolecules."Virulence 1(1):42‐44. Sankaran,J.,M.Manna,L.Guo,R.KrautandT.Wohland(2009)."Diffusion,transport, andcellmembraneorganizationinvestigated by imaging fluorescence cross‐ correlation spectroscopy. "BiophysJ97(9):2630‐9.    Investigation of Peptide Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy   II  Acknowledgement Adoctoralthesislikethis,involvingvariousfields,wouldnotbepossiblewithout the.  activity. By investigatingdifferentmembers of theV4 peptide family,thisstudycontributes toourunderstanding of theirmechanism of antimicrobialactivityandselectivity.Itthus providesfurtherguidelinesfortherationaldesign of antimicrobialpeptides.  Investigation of Peptide Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy   IX  List of Figures Fig1.1Schematicrepresentation of theGram‐negativebacteriacellwall.. affect the solubility of the Investigation of Peptide Lipid Interaction by Fluorescence Correlation Spectroscopy   2  peptides.  To study the binding affinity of modified V4 to