Nhân giống in vitro: Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài.
Công nghệ sinh học thực vật Chương 2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật CHƯƠNG II. CƠNG NGHỆ NI CẤY MƠ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT – NHÂN GIỐNG IN VITRO Những năm 70 kỷ XX thập niên bùng nổ cơng nghệ sinh học thực vật, đặc biệt kỹ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật. Đây cơng cụ nghiên cứu nhiều nhà khoa học. Trong vòng 30 năm trở lại đây, kỹ thuật làm nên cách mạng lớn nhân giống thực vật người ta hướng tới mục tiêu áp dụng kỹ thuật để sản xuất giống thương mại. Kỹ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật trở thành phương pháp nhân giống chuẩn phổ biến nhiều loại trồng như: cơng nghiệp, lâm nghiệp, cảnh, dược liệu, ăn trái rau xanh. Những kiến thức cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật ngày củng cố có nhiều bước tiến rõ rệt. Với phương pháp người ta nhân giống nhiều lồi từ vùng khí hậu khác giới mà phương pháp nhân giống truyền thống khơng thể thực được. 1. Giới thiệu sơ lược cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật 1.1. Giới thiệu Kỹ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật hay nhân giống in vitro thuật ngữ mơ tả phương pháp ni cấy phận thực vật (tế bào đơn, mơ, quan) ống nghiệm có chứa mơi trường dinh dưỡng thích hợp muối khống, vitamin, đường chất điều hòa sinh trưởng thực vật điều kiện vơ trùng. Kỹ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi quan từ mơ lá, thân, hoa, rễ, củ đỉnh sinh trưởng. Trước người ta dùng phương pháp để nghiên cứu đặc tính tế bào phân chia, đặc tính di truyền ảnh hưởng hóa chất tế bào mơ q trình ni cấy. Hiện nay, nhà khoa học sử dụng hệ thống ni cấy mơ thực vật để nghiên cứu tất vấn đề có liên quan đến thực vật sinh lý học, sinh hố học, di truyền học cấu trúc thực vật. Kỹ thuật ni cấy mơ thực vật mở rộng tiềm nhân giống vơ tính lồi trồng quan trọng, có giá trị mặt kinh tế thương mại đời sống hàng ngày người. 1.2. Lịch sử phát triển kỹ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật Năm 1902, nhà thơng thái Haberlandt lần đưa ý tưởng cấy mơ sinh vật ngồi thể ơng dùng tế bào q chun biệt nên khơng thành cơng. 8 Công nghệ sinh học thực vật Chương 2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1934, White thành cơng việc phát sống vơ hạn việc ni cấy tế bào rễ cà chua. Năm 1964, Ball người tìm mầm rễ từ việc ni cấy chồi ngọn. Ơng thành cơng việc chuyển non sen cạn từ mơi trường ni cấy tối thiểu. Tuy nhiên, việc nhân giống chưa hồn chỉnh. Sau nhiều nhà nghiên cứu khám phá thành phần dinh dưỡng quan trọng cần thiết cho phát triển tế bào ni cấy. Năm 1951, Skoog Miller phát hợp chất điều khiển nhân chồi. Năm 1962, Murashige Skoog cải tiến mơi trường ni cấy đánh dấu bước tiến kỹ thuật ni cấy mơ. Mơi trường họ dùng làm sở cho việc ni cấy nhiều loại sử dụng rộng rãi nay. Năm 1960 – 1964, Morel cho nhân giống vơ tính lan ni cấy đỉnh sinh trưởng. Từ kết đó, lan xem ni cấy mơ thương mại hóa. Từ đến nay, cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật phát triển với tốc độ nhanh nhiều khác ứng dụng thương mại hóa. 1.3. Tầm quan trọng kỹ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật Phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật có ý nghĩa vơ to lớn việc nghiên cứu lý luận sinh học bản, đồng thời đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất đời sống. 1.3.1. Về mặt lý luận sinh học Ni cấy mơ mở khả to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc chất sống. Thơng qua ni cấy mơ tế bào, tiến hành so sánh đặc tính thể với hợp phần chúng tách rời khỏi thể, từ rút mối tương quan phận cây. Thực tế cho phép tách ni cấy trước hết mơ phân sinh từ cho nhóm tế bào khơng chun hố gọi mơ sẹo, từ mơ sẹo kích thích để tái sinh hồn chỉnh. Đây ưu mà nhà sinh lý, hố sinh di truyền học dễ dàng sử dụng cơng việc mình. Trong thể khó phân biệt giai đoạn cách cụ thể xác theo chu kỳ phát triển cá thể. Phương pháp ni cấy mơ khắc phục khó khăn dễ dàng tạo bước phát sinh hình thái phân biệt cách rõ rệt. Điều tạo thuận lợi cho cơng tác nghiên cứu quy luật sinh trưởng, phát triển mối quan hệ chúng với bên ngồi. Từ tìm mấu chốt thúc đẩy phát triển trồng theo 9 Công nghệ sinh học thực vật Chương 2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật hướng mong muốn. Bằng phương pháp ni cấy mơ tế bào, tiến hành nghiên cứu mối quan hệ ký sinh ký chủ. Như vậy, rõ ràng nhiều vấn đề bệnh lý giải cách bản. Từ đó, tìm chế miễn dịch thực vật, giúp cho việc phòng bệnh cho tốt hơn, đỡ tốn hơn. 1.3.2. Về mặt thực tiễn sản xuất Phương pháp ni cấy mơ sử dụng để bảo quản nhân nhanh giống q, có giá trị kinh tế cao. Hiện nay, phương pháp ngày phổ biến cơng tác giống trồng. Bằng phương pháp ni cấy mơ, sau thời gian ngắn tạo sinh khối lớn có hoạt chất: sinh khối tạo giữ ngun thuộc tính, nghĩa giữ khả tổ hợp chất thứ cấp alkaloid, glycosid, steroid dùng y học, chất dính dùng cơng nghiệp thực phẩm, chất kìm hãm sinh trưởng vi khuẩn nơng nghiệp. Hình 2.1. Nhân giống trồng phương pháp ni cấy mơ 2. Các bước nhân giống in vitro 2.1. Chọn lựa khử trùng mẫu cấy Mẫu cấy mảnh mơ thực vật đặt vào mơi trường ni cấy. Để tiến hành ni cấy in vitro thành cơng, lựa chọn mơ cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý quan dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng lấy mẫu, kích thước vị trí lấy mẫu đó. Mẫu cấy sau chọn lựa rửa xà phòng khử trùng bề mặt chất khử trùng hóa học calcium hypochloride, sodium dichloroisocyanurate, chlorur thủy ngân, . 2.2. Tạo thể nhân giống in vitro Mẫu ni cấy mơi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in vitro. Có thể nhân giống in vitro thể chồi thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngồi tự nhiên trồng. Đối với lồi khơng có khả nhân giống, người ta thường nhân giống cách tạo cụm chồi từ mơ sẹo. Trong mơi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 chất hữu khác. 10 Công nghệ sinh học thực vật Chương 2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.3. Nhân giống in vitro Đây giai đoạn quan trọng nhân giống trồng phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu ni cấy thể chồi, mơi trường ni cấy thường giống mơi trường tạo thể chồi, đơi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với q trình nhân giống kéo dài. Điều kiện ni cấy thích hợp giúp cho q trình tăng sinh diễn nhanh. Cây nhân giống in vitro trạng thái trẻ hóa trì thời gian dài. Hình 2.2. Các bước nhân giống in vitro 2.4. Tái sinh in vitro hồn chỉnh Đây giai đoạn tạo hồn chỉnh có đầy đủ thân, rễ để chuẩn bị chuyển vườn ươm. Cây phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống mơi trường bình thường. Các chất có tác dụng tạo chồi loại bỏ, thay vào chất kích thích q trình tạo rễ. Điều kiện ni cấy gần với điều kiện tự nhiên bên ngồi, bước làm thích nghi trước tách khỏi điều kiện in vitro. Sự rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, trẻ hóa mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để kích thích q trình rễ in vitro. 2.5. Chuyển in vitro vườn ươm Cây rễ lấy khỏi ống nghiệm, rửa agar đặt chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp, . Sau khoảng tuần, bắt đầu thích nghi với điều kiện bên ngồi, lúc tăng cường độ chiếu sáng hạ độ ẩm. Đây giai đoạn quan trọng quy trình nhân giống vơ tính thường bị chết khác biệt điều kiện sống in vitro ex vitro. Cây in vitro ni cấy điều kiện ổn định dinh 11 Công nghệ sinh học thực vật Chương 2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên chuyển đất, với điều kiện tự nhiên hồn tồn khác hẳn dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, độ ẩm thấp, dễ dàng bị stress, dễ nước mau héo dẫn đến tượng chết. Để tránh tình trạng này, vườn ươm cấy mơ phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, độ ẩm cao. Cây thường cấy luống ươm có chất dễ nước, tơi xốp, giữ độ ẩm, ngày cần phủ nylon để giảm nước (thường 7-10 ngày kể từ ngày cấy). Rễ tạo q trình ni cấy mơ lụi rễ xuất hiện, thường xử lý rễ cách ngâm rễ hay phun lên hợp chất kích thích rễ nồng độ thấp để rút ngắn thời gian rễ. 3. Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy mơ thực vật 3.1. Ảnh hưởng mẫu cấy Vật liệu ni cấy yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển in vitro: Kiểu di truyền Khả tái sinh thực vật đa dạng. Những hai mầm thơng thường có khả tái sinh mạnh mầm hạt trần khó tái sinh (trừ chúng non). Trong số hai mầm Solanaceae, Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae Cruciferae họ thực vật dễ tái sinh nhất. Nếu lồi dễ tái sinh quan mơi trường tự nhiên chúng dễ tái sinh in vitro. Cũng có trường hợp ngoại lệ đoạn cắt từ Kalanchoe farinacea khơng có khả hình thành chồi bất định in vivo thực điều kiện in vitro, điều hấp thu chất điều hòa sinh trưởng có mơi trường ni cấy. Tuổi Các mơ phơi thường có khả tái sinh cao ngũ cốc người ta thường dùng phơi hạt làm vật liệu cấy mơ. Khi già đi, khả tái sinh chúng giảm theo phận non dễ tái sinh trường hợp bụi. Khi mơ phân sinh chồi đỉnh tách khỏi mẹ chúng giữ đặc tính già hay non điều kiện in vitro tùy vào điều kiện ban đầu. Đơi qua nhiều lần cấy chuyền, mơ phân sinh già bước trẻ hóa tăng khả tái sinh phân chia tế bào. Điều chứng minh đối tượng nho (Pinus vinifera), táo tây (Malus sylvestris), tuyết tùng (Cryptomeria japonica). Tuổi mơ quan Những mơ non mềm thường dễ ni cấy mơ cứng có nhiều trường hợp ngoại lệ. Các mẫu cấy từ cuống non tái 12 Công nghệ sinh học thực vật Chương 2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật sinh tốt mẫu cấy từ cuống già quan chúng già nên khả tái sinh phân chia tế bào giảm. Khả tái sinh lồi khác tăng lên suốt giai đoạn hoa: phận phát hoa non đơi tái sinh mạnh, ví dụ cải âm (Lunaria annua), báo xn (Primula obconica). Tình trạng sinh lý Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả tái sinh phân chia tế bào in vitro. Thơng thường phận giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh giai đoạn sinh sản. Các mẫu cấy từ vảy huệ tây giai đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt mẫu cấy giai đoạn sinh sản. Các chồi giai đoạn ngủ đơng khó ni cấy in vitro chồi vượt qua giai đoạn này. Vị trí mẫu cấy Ever (1984) khảo sát ảnh hưởng vị trí mẫu cấy lên sinh trưởng phát triển in vitro sau tách mẫu lãnh sam (Pseudotsuga menziesii), ơng nhận thấy chồi ban đầu tách từ vị trí thấp phát triển mơi trường in vitro tốt hơn, chồi gốc tăng trưởng nhanh chồi nách. Sự hình thành giả hành bất định mẫu cấy lan hương tách từ phần gốc vảy hành tốt từ phần đỉnh. Điều đáng lưu ý mơ sẹo phát sinh từ mẫu cấy có nguồn gốc từ phần khác rễ, chồi, cuống có phản ứng in vitro giống nhau. Kích thước mẫu cấy Các cấu trúc nhỏ tế bào, cụm tế bào mơ phân sinh khó cảm ứng để tăng trưởng cấu trúc lớn thân, lá, củ. Các phần tách rời khỏi tự cung cấp chất dinh dưỡng hormone, mẫu cấy có kích thước lớn dễ tái sinh phát triển. Các phận có chứa nhiều chất dinh dưỡng dự trữ củ, thân hành thường dễ tái sinh mơi trường in vitro quan chất dự trữ. Đối với mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt bị tổn thương ảnh hưởng đến khả tái sinh. Vết thương Sự tổn thương bề mặt mẫu cấy đóng vai trò quan trọng tái sinh mẫu cấy. Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng hấp thu chất dinh dưỡng chất điều hòa đồng thời ethylene tạo nhiều hơn. Ngồi ra, tăng cường hình thành rễ bất định vết thương. Phương pháp cấy Các mẫu cấy đặt mơi trường theo nhiều cách khác nhau: có cực (thẳng đứng với phần gốc cắm xuống mơi trường) khơng có cực (cắm phần xuống mơi trường). Chồi rễ thường tái sinh dễ nhanh mẫu cấy khơng cực. Mẫu tái sinh tốt cung cấp đầy đủ oxy 13 Công nghệ sinh học thực vật Chương 2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật nhân tố khác đóng vai trò quan trọng. Phần gốc mẫu cấy khơng cực có chất dự trữ khơng có khả khuếch tán vào agar khơng tiếp xúc với mơi trường. Như trường hợp tất thuộc họ Amaryllidaceae, tái sinh xảy phần gốc vảy hành, phương pháp cấy khơng cực dẫn đến hình thành thân hành bất định tốt phương pháp cấy có cực. 3.2. Ảnh hưởng mơi trường ni cấy Một yếu tố quan trọng tăng trưởng phát sinh hình thái tế bào mơ thực vật ni cấy thành phần mơi trường. Thành phần thay đổi tuỳ theo lồi phận ni cấy. Đối với mẫu cấy tùy theo mục đích thí nghiệm mà thành phần mơi trường thay đổi. Mơi trường thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa mẫu cấy. Tuy nhiên, tất mơi trường ni cấy bao gồm năm thành phần: khống đa lượng, khống vi lượng, vitamin, đường (nguồn carbon) chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Khống đa lượng: nhu cầu khống mơ, tế bào thực vật tách rời khơng khác nhiều so với trồng điều kiện tự nhiên. Các ngun tố đa lượng cần phải cung cấp N, P, K, Ca, Mg Fe. Khống vi lượng: nhu cầu khống vi lượng ni cấy mơ thực vật in vitro lĩnh vực nghiên cứu. Trước đây, kỹ thuật ni cấy mơ đời, người ta khơng nghĩ đến việc bổ sung khống vi lượng vào mơi trường ni cấy. Các thí nghiệm lúc thành cơng agar hố chất dùng để pha mơi trường khơng tinh khiết mà có lẫn số ngun tố vi lượng cung cấp phần cho mơi trường ni cấy. Các ngun tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Mn, Zn, Cu, B, Co, I, Mo… Carbon nguồn lượng: ni cấy in vitro, nguồn carbon giúp mơ tế bào thực vật tổng hợp nên chất hữu để tế bào phân chia, tăng sinh khối khơng phải từ q trình quang hợp mà nguồn carbon bổ sung vào mơi trường dạng đường. Hai dạng đường thường gặp glucose sucrose. Các nguồn carbonhydrate khác tiến hành thử nghiệm lactose, galactose, rafinose, maltose tinh bột carbonhydrate có hiệu so với glucose sucrose. Sucrose nguồn carbon quan trọng mơ tế bào ni cấy. Nồng độ sucrose ban đầu ảnh hưởng đến số tham số ni cấy tốc độ tăng trưởng sản lượng hợp chất thứ cấp tế bào ni cấy. Vitamin: thơng thường thực vật tổng hợp vitamin cần thiết cho tăng trưởng phát triển chúng. Chúng cần vitamin để xúc tác q trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào mơ ni cấy in vitro vài vitamin trở 14 Công nghệ sinh học thực vật Chương 2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật thành yếu tố giới hạn cho phát triển chúng. Các vitamin thường sử dụng nhiều ni cấy mơ là: thiamine (B1), acid nicotinic, pyridoxine (B6) myo-inositol. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: có nhóm chất điều hồ quan trọng ni cấy mơ thực vật: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid ethylen. Miller người nhận thấy tỉ lệ auxin/cytokinin xác định dạng phân hố quan tế bào thực vật ni cấy. Cả auxin cytokinin bổ sung vào mơi trường ni cấy để kích thích phát sinh hình thái tỷ lệ hormone sử dụng để kích thích tạo chồi hay tạo rễ khơng giống nhau. Auxin tự nhiên hợp chất tương đối đơn giản: indol-3-acetic acid (IAA). Các chất có cấu trúc gần giống IAA có vai trò với IAA vài quan gọi auxin (như IBA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T phenoxyaxetic acid). Auxin phối hợp với cytokinin giúp tăng trưởng chồi non khởi phát tạo mơ phân sinh chồi từ nhu mơ. Tuy nhiên, nồng độ cao, auxin cản trở phát triển phát thể chồi vừa thành lập hay chồi nách (các chồi trạng thái tiềm sinh). Auxin nồng độ cao kích thích tạo sơ khởi rễ (phát thể non rễ), cản trở tăng trưởng sơ khởi này. Trong tạo rễ, auxin cần phối hợp với vitamine (như thiamine mà rễ khơng tổng hợp được), amino acid (như arginin), hợp chất orthodiphenolic (như cafeic acid, chlorogenic acid). Cytokinin loại hormone thực vật kích thích tế bào phân chia. Các hợp chất xuất phát từ purine adenin, base DNA RNA. Hợp chất cytokinin khám phá kinetin, zeatin – hợp chất có phần lớn thực vật vài vi khuẩn, cấu trúc gần giống kinetin hoạt tính cao gấp 10 lần. Sau zeatin, 30 cytokinin khác lập. Ngày nay, người ta gọi cytokinin để nhóm hợp chất, thiên nhiên hay nhân tạo, có đặc tính sinh lý giống kinetin. Nhiều chất tổng hợp có hoạt tính cytokinin, chúng aminopurin thay vị trí thứ 6, thí dụ BA. Cytokinin kích thích phân chia tế bào với điều kiện có auxin. Cytokinin tác động hai bước phân chia tế bào: phân nhân phân bào. Trong ni cấy mơ nghèo cytokinin (mơ lõi thuốc lá, vỏ rễ đậu), auxin kích thích phân đơi nhiễm sắc thể, chí tạo tế bào hai nhân, khơng có phân vách; phân vách xảy có cytokinin ngoại sinh. Cytokinin giúp gia tăng kích thước tế bào sinh tổng hợp protein. Trong thân rễ, cytokinin cản kéo dài kích thích tăng rộng tế bào trưởng thành. Trong nghiên cứu ni cấy mơ thực vật, tỷ lệ Auxin/Cytokinin (A/C) yếu tố quan trọng: A/C cao giúp tạo rễ, A/C thấp giúp tạo chồi. Như vậy, cytokinin hỗ trợ auxin tăng trưởng đồng thời có đối 15 Công nghệ sinh học thực vật Chương 2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật kháng auxin (giúp tạo rễ) cytokinin (giúp tạo chồi); cân hai kiểu hormone yếu tố kiểm sốt phát triển. Hình 2.3. Cơng thức số chất điều hòa sinh trưởng thực vật Ngồi năm thành phần trên, người ta bổ sung số chất hữu có thành phần xác định (amino acid, EDTA,…) số chất có thành phần khơng xác định nước dừa, dịch chiết nấm men,… vào mơi trường ni cấy. Các hợp chất hữu khơng xác định: bổ sung nhiều chất trích hữu khác vào mơi trường ni cấy thường mang lại kết thuận lợi cho tăng trưởng mơ. Các chất bổ sung là: protein hydrolysate, nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước cam, nước cà chua. Tuy nhiên, có nước dừa protein hydrolysate sử dụng rộng rãi. Amino acid nguồn cung cấp nitrogen khác: tế bào có khả tổng hợp tất amino acid cần thiết bổ sung amino acid vào mơi trường ni cấy để kích thích tăng trưởng tế bào. Amino acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu cầu tế bào nguồn nitơ tế bào hấp thu nhanh so với nitơ vơ cơ. Các nguồn nitơ hữu thường sử dụng hỗn hợp amino acid casein hydrolysate, Lglutamine, L-asparine adenine. Than hoạt tính: việc bổ sung than hoạt tính vào mơi trường ni cấy có tác dụng khử độc. Ảnh hưởng than hoạt tính: hút hợp chất cản, hút chất điều hồ sinh trưởng làm đen mơi trường. Người ta cho tác dụng cản tăng trưởng mơ cấy mơi trường có than hoạt tính hút chất điều hồ sinh trưởng mơi trường như: NAA, kinetin, BAP, IAA 2iP. Khả 16 Công nghệ sinh học thực vật Chương 2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật kích thích tăng trưởng mơ thực vật than hoạt tính kết hợp với hợp chất phenol độc mơ tiết suốt thời gian ni cấy. Yếu tố làm đặc mơi trường: agar chất thường sử dụng để tạo mơi trường đặc hay mơi trường bán rắn ni cấy mơ thực vật. Khi agar trộn chung với nước tạo dạng gel tan nhiệt độ 60 - 100oC, đặc lại nhiệt độ xuống 45oC agar ổn định tất điều kiện nhiệt độ mơi trường khơng bị phân hủy enzyme thực vật. Hơn nữa, agar khơng phản ứng với chất mơi trường. Độ cứng agar định nồng độ agar sử dụng pH mơi trường. Có số cơng thức mơi trường thường sử dụng chủ yếu để ni cấy mơ tế bào thực vật mơi trường MS (Murashige Skoog), B5 (Gamborg cộng sự), SH (Schenk Hilderbrandt) có hàm lượng khống đa lượng cao số mơi trường khác mơ tả White, Gautheret, Nitsch, Loyd Mc Cown có hàm lượng khống đa lượng thấp hơn. 4. Ni cấy mơ tạo hồn chỉnh 4.1. Ni cấy nốt đơn thân Phương pháp ni cấy sử dụng mẫu cấy chồi chồi bên có mang đoạn thân ngắn. Chồi kích thích cho tăng trưởng, rễ để tạo thành ngun vẹn. Chồi thu từ chồi nách lá, sau cấy lên mơi trường dinh dưỡng với điều kiện thích hợp để tăng trưởng. Chồi tăng trưởng mang nhiều chồi bên nách tiếp tục cấy chuyền đến đạt đủ số lượng chồi cần thiết chúng cảm ứng rễ để trở thành hồn chỉnh chuyển trồng đất. Tuy nhiên áp dụng phương pháp có số điểm cần lưu ý: Phương pháp khơng thể áp dụng với có xếp theo dạng hoa hồng (như cúc đồng tiền) mẫu cấy có khả bị nhiễm cao. Đối với phải sử dụng phương pháp ni cấy chồi đỉnh. Để giảm khả bị nhiễm, nên chọn chồi khép kín. Nếu bị nhiễm từ bên tốt sử dụng phương pháp ni cấy đỉnh sinh trưởng. Tốc độ nhân giống phụ thuộc vào số lượng chồi có sẵn. Chồi tăng trưởng tạo nhiều số lượng chồi bên nhiều dẫn đến tăng tốc độ nhân giống. Các chồi trẻ hóa, đặc biệt thân gỗ, tăng trưởng nhiều so với chồi trưởng thành. Sự tạo rễ chồi trưởng thành khó thực cần phải trẻ hóa chồi để cảm ứng rễ. 17 Công nghệ sinh học thực vật Chương 2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Phương pháp thực thành cơng số đối tượng như: măng tây, khoai tây, lê, hoa hồng, cà chua, dưa chuột, cà tím,… 4.2. Ni cấy chồi bên Về ngun tắc, phương pháp giống phương pháp ni cấy nốt đơn thân. Điểm khác phương pháp ni cấy nốt đơn thân có kéo dài chồi, thân thường khơng cần đến cytokinin để phát triển. Trong phương pháp nhân chồi bên, chồi lập mơi trường dinh dưỡng chồi bên từ nách phát triển ảnh hưởng cytokinin với nồng độ cao. Vai trò cytokinin lúc hạn chế ưu tính chồi bên phát triển. Các chồi bên tiếp tục chuyển sang mơi trường có bổ sung cytokinin chồi bên lại tiếp tục tạo . Sau chồi chuyển sang mơi trường rễ đưa ngồi vườn ươm có rễ hồn chỉnh. Thực tế, hai phương pháp thường áp dụng chung: đầu tiên, chồi tăng trưởng bình thường, sau bổ sung cytokinin vào mơi trường ni cấy để cảm ứng hình thành chồi bên. Phương pháp nhân giống chồi bên tiến hành lần cẩm chướng, dâu tây, cúc đồng tiền. Hiện nay, phương pháp áp dụng cho nhiều lồi thực vật phổ biến số lồi ăn trái. 4.3. Ni cấy đỉnh sinh trưởng Nhiễm virus ngun nhân gây ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển thực vật. Đặc biệt, virus chuyển sang hệ q trình thực vật sinh sản hữu tính q trình nhân giống vơ tính in vitro. Trong đỉnh sinh trưởng thực vật có cạnh tranh sinh sản virus phân chia tế bào mơ phân sinh để tạo tế bào con. Ở vùng mơ phân sinh, suốt q trình phân chia tế bào, khả sinh tổng hợp nucleic acid tận dụng để phân chia tế bào gây bất lợi cho tăng sinh virus. Để có nhiều đỉnh sinh trưởng bệnh virus làm nguồn mẫu cho ni cấy in vitro, trước tiên phải tiến hành tạo chồi bất định, sau thu đỉnh sinh trưởng từ chồi bất định này. Nếu đỉnh sinh trưởng lập trạng thái hoạt động hội loại trừ virus lớn hơn. Nếu đỉnh sinh trưởng lập có kích thước lớn hội thu bệnh thấp. Phương pháp ni cấy đỉnh sinh trưởng áp dụng với trồng quan trọng như: khoai tây, thuốc lá, lily, . Một số thân gỗ anh đào, mâm 18 Công nghệ sinh học thực vật Chương 2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật xơi, nho, đầu xn, . ni cấy đỉnh sinh trưởng để tạo bệnh. 4.4. Ni cấy bao phấn hạt phấn Kỹ thuật ni cấy bao phấn hạt phấn kỹ thuật tạo đơn bội kép (DH, double haploid). Phương pháp tạo đơn bội kép chọn lọc phương pháp chọn tạo giống có hiệu chọn lọc cao, đặc biệt kết hợp với phương pháp tạo biến dị di truyền khác lai hữu tính gây đột biến nhân tạo. Đây kỹ thuật khơng phức tạp lắm, lại có hiệu chọn tạo giống trồng, trồng cho hạt lúa. Kỹ thuật ni cấy bao phấn hạt phấn phát triển thành phương pháp chọn tạo giống đơn bội. Sử dụng phương pháp này, nhà chọn giống lúa rút ngắn nhiều thời gian giảm bớt chi phí lao động, khơng gian cần thiết để tạo dòng thuần. 5. Một số hệ thống ni cấy 5.1. Ni cấy lỏng có sục khí – Bioreactor Hiện nay, hầu hết hệ thống vi nhân giống thực hệ thống bình ni cấy khác có điểm chung mẫu cấy phát triển mơi trường đặc. Ni cấy mơi trường đặc chủ yếu thiết bị ni có kích thước nhỏ nên mơi trường ni cấy khơng đủ đáp ứng cho phát triển lâu dài mẫu cấy. Hơn nữa, ni cấy mơi trường đặc, mơi trường bị lãng phí khơng hấp thu hết chất dinh dưỡng phần đáy bình ni cấy. Các hệ thống ni cấy lỏng máy lắc ban đầu dựa mơ hình ni cấy vi sinh vật tế bào động vật nhằm phục vụ nghiên cứu ni cấy tế bào thu nhận hợp chất thứ cấp. Mẫu cấy mơi trường lỏng có khả tăng trưởng nhanh so với mơi trường đặc. Có thể mẫu cấy tiếp xúc hồn tồn mơi trường nên hấp thu chất dinh dưỡng từ mơi trường. Ngày nay, hệ thống bioreactor với cấu trúc bình lên men cánh khuấy kim loại thay ống silicon sục khí, điều khiển tốc độ dòng khí vào để hạn chế tương tác bất lợi mẫu cấy, hạn chế tổn thương mẫu. Vì thế, hệ thống bioreactor sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác như: ni cấy chồi phơi thực vật, chồi hoa thu hải đường, củ khoai tây bi in vitro, hoa lily, số thân gỗ đặc biệt ni cấy thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học ni cấy rễ nhân sâm. 19 Công nghệ sinh học thực vật Chương 2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Hình 2.4. Hệ thống ni cấy bioreactor 5.2. Ni cấy quang tự dưỡng Ni cấy quang tự dưỡng giáo sư Kozai cộng đẩy mạnh nghiên cứu thập niên 90. Từ đến có nhiều nghiên cứu thành cơng việc ứng dụng phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng vào sản xuất giống trồng. Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm phương pháp truyền thống. Nó thúc đẩy tăng trưởng in vitro, rút ngắn thời gian ni cấy làm hạ giá thành in vitro. Phương pháp trọng đến tác nhân vật lý mơi trường ni cấy (ion, khuyết tán khí hòa tan) yếu tố ảnh hưởng đến phát triển bình ni cấy (cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, thành phần khơng khí, ẩm độ, nhiệt độ tốc độ ln chuyển khơng khí bình ni cấy,…) thay nghiên cứu thành phần hóa học mơi trường ni cấy nồng độ đường, muối khống, vitamin hay chất điều hòa sinh trưởng thực vật mà nhà ni cấy mơ thường quan tâm. Trong vi nhân giống quang tự dưỡng, đường khơng sử dụng mơi trường ni cấy. Nói khơng sử dụng chất hữu bao gồm chất điều hòa tăng trưởng thực vật, vitamin, amino acid, ngoại trừ chất khống cho vào mơi trường. Điều dựa sở tự nhiên tất xanh chứa diệp lục tố điều có khả tự quang hợp để tồn phát triển. Tất quan dùng ni cấy mơ có diệp lục tố có khả quang hợp. Chúng nhận CO2 khơng khí làm nguồn carbon q trình quang hợp mà khơng cần đường vitamin q trình ni cấy. Phương pháp ni cấy mơ quang tự dưỡng tạo điều kiện tối đa cho bình ni cấy sử dụng khí CO2 có sẵn khơng khí làm nguồn carbon cho q trình tăng trưởng phát triển cây. Sự loại bỏ đường 20 Công nghệ sinh học thực vật Chương 2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật mơi trường ni cấy dẫn đến tỷ lệ nhiễm nấm, khuẩn q trình ni cấy giảm. Điều đem lại ý nghĩa lớn sản xuất chi phí cơng lao động giảm đáng kể song song với việc giảm ngun vật liệu. Theo khái niệm ni cấy mơ quang tự dưỡng hộp chứa cấy mơ xem nhà kính thu nhỏ. Với phương pháp tăng trưởng phát triển in vitro phần lớn chịu ảnh hưởng tác nhân vật lý mơi trường ni cấy ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ, nồng độ CO2, trao đổi khí. Nồng độ CO2 ánh sáng hai yếu tố quan trong ni cấy mơ quang tự dưỡng với quan có diệp lục tố. Sự gia tăng khác biệt nồng độ CO2 bên bên ngồi hộp ni cấy với gia tăng cường độ ánh sáng làm cho hiệu suất quang hợp tăng. 6. Ưu nhược điểm phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật Phương pháp ni cấy mơ tế bào thực vật có ưu điểm vượt trội so với phương pháp truyền thống: Có khả tái sinh từ vùng mơ quan khác như: trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn, . mà ngồi tự nhiên khơng thể thực được. Có thể sản xuất số lượng lớn giống thời gian ngắn, diện tích nhỏ nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại. Cây tạo đồng mặt di truyền. Tạo virus thơng qua xử lý nhiệt hay ni cấy đỉnh sinh trưởng. Sản xuất quanh năm chủ động kiểm sốt yếu tố ngoại cảnh nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, . Bảo quản nguồn giống in vitro với số lượng lớn lại chiếm diện tích nhỏ. Tạo có khả hoa, tạo sớm. Tạo dòng tồn (cây chà là) tồn đực (cây măng tây) theo mong muốn. Dễ dàng tạo giống trồng phương pháp chuyển gene. Bên cạnh ưu điểm bật thuận lợi cho mục đích nhân giống đề cập phần phương pháp vi nhân giống có nhược điểm cần phải khắc phục: Giá thành sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống cao. Tiến trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan cần khoảng thời gian dài trước thích ứng trồng ngồi vườn ươm. Sự đa dạng dòng sản phẩm nhân giống hạn chế, nghĩa tạo thường đồng mặt kiểu hình. Có thể xảy đột biến tác dụng chất điều hòa sinh trưởng bổ sung vào mơi trường ni cấy. 21 [...]... Chúng có thể nhận CO2 trong khơng khí làm ngu ình quang h à khơng c à vitamin trong q trình ni c trong bình ni c chính cho q trình t có s à phát tri 2 àm ngu 20 Công nghệ sinh học thực vật Chương 2 Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật ình ni c ì chi phí cơng lao gi gi ên v Theo khái ni phát tri ìh à kính thu nh in vitro ph à 2, N 2 và ánh sáng là hai y quang t ùng v uan có di 2 bên trong và bên... vitro, hoa lily, một số cây thân gỗ và đặc biệt là ni cấy thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học như ni cấy rễ nhân sâm 19 Công nghệ sinh học thực vật Chương 2 Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật Hình 2. 4 Hệ thống ni cấy bioreactor 5 .2 Ni cấy quang tự dưỡng Ni cấy quang tự dưỡng đã được giáo sư Kozai và các cộng sự đẩy mạnh nghiên cứu trong thập niên 90 Từ đó đến nay có rất nhiều nghiên cứu...Công nghệ sinh học thực vật Chương 2 Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật Phương pháp này đã được thực hiện thành cơng trên một số đối tượng như: cây măng tây, khoai tây, lê, hoa hồng, cà chua, dưa chuột, cà tím,… 4 .2 Ni cấy chồi bên Về ngun tắc, phương pháp này giống như phương pháp ni cấy nốt đơn thân Điểm khác nhau là trong... àt ào th so v Có kh ph à ngồi t Có th trên m Cây con t T S ã ên khơng th h à ch B n ngu in vitro v tích r T T òng tồn cây cái (cây chà là) ho mong mu D àng t Bên c ên thì ph Ti ình nhân gi kho S òng s t Có th b y òn khá cao ên quan và c à cây con ình òa sinh tr 21 ... sạch bệnh thấp Phương pháp ni cấy đỉnh sinh trưởng được áp dụng với những cây trồng quan trọng như: khoai tây, thuốc lá, lily, Một số cây thân gỗ như anh đào, mâm 18 Công nghệ sinh học thực vật Chương 2 Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật xơi, nho, cây đầu xn, cũng được ni cấy đỉnh sinh trưởng để tạo cây sạch bệnh 4.4 Ni cấy bao phấn và hạt phấn Kỹ thuật ni cấy bao phấn và hạt phấn là kỹ thuật . cấy rễ nhân sâm. Công nghệ sinh học thực vật Chương 2. Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật 20 Hình 2. 4. Hệ thống ni cấy bioreactor 5 .2. Ni cấy quang tự dưỡng Ni cấy quang tự dưỡng đã được. các chất hữu cơ khác. Hình 2. 1. Nhân giống cây trồng bằng phương pháp ni cấy mơ Công nghệ sinh học thực vật Chương 2. Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật 11 2. 3. Nhân giống in vitro Đây. giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài. Hình 2. 2. Các bước nhân giống in vitro 2. 4. Tái sinh cây in vitro hồn chỉnh Đây là giai đoạn tạo cây con hồn chỉnh có