ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀO QUY TRÌNH SẢN XUẤT VI TẢO Nguyễn Văn Công Học viên cao học K19 – Khoa sau đại học – Trường Đại học Vinh Email: htc48ts.dhv@gmail.com.vn ĐT: 01276 180008 TÓM TẮT Xác định được cách cấy trên đĩa agar để giữ giống tảo gốc và đưa ra phương pháp cấy tảo trên đĩa môi trường agar. Nghiên cứu và đưa ra được các phương pháp, các công đoạn cấy và sự phát triển của vi tảo đó là gồm có phương pháp cấy tảo ở mức độ ống nghiệm, phương pháp làm tảo ở chai thủy tinh 250ml, phương pháp làm tảo ở chai thủy tinh 1l, phương pháp làm tảo chai 1l, phương pháp làm tảo chai 2l, phương pháp làm tảo bình 18l, phương pháp làm tảo bình 20l. Từ khóa: Vi tảo, đơn bào. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Vi tảo là loại thức ăn có thành phần dinh dưỡng cao, tảo ngày nay đã và đang được ứng dụng vào việc tạo ra các sản phẩm có lợi phục vụ cho con người như dược liệu, các nguồn nguyên liệu quan trọng nhằm phục vụ đời sống con người và đặc biệt vi tảo được sử dụng để nghiên cứu, nuôi thu sinh khối để phục vụ cho ngành nuôi trồng thủy sản bởi vì nó phù hợp với cỡ miệng tôm, cá và một số thủy đặc sản khác góp phần không nhỏ vào quá trình sản xuất giống và có ý nghĩa thực tiễn trong nghiên cứu khoa học thực nghiệm. Vi tảo là loại thức ăn không thể thiếu của tôm ở giai đoạn Zoea – Mysis và có vai trò quan trọng trong thành công của trại sản xuất tôm giống. Nhận thấy giá trị to lớn và tiềm năng kinh tế từ việc nghiên cứu vi tảo nên Tôi tiến hành công trình: “Ứng dụng công nghệ sinh học vào quy trình sản xuất vi tảo”. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Các loài vi tảo như tảo Thalassiosira pseudonana, Thalassiosira weissflogii, Thalassiosira sp, Chaetoceros sp được lấy từ phòng lưu trữ giống tảo của Công ty đã được phân lập. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu: 20/03/2011 đến 30/11/2011. 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu Tập đoàn Choen porkphand – C.P Việt Nam – Chi nhánh Bình Định 3, Mỹ an – Phù mỹ - Bình định. 2.2. Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất thí nghiệm. • Nồi hấp tiệt trùng • Tủ sấy diệt khuẩn • Bếp điện từ (hoặc lò vi sóng) • Tủ vô khuẩn • Cân điện tử • Đèn cồn (bật lửa) • Kính hiển vi • Pipet thuỷ tinh • Pipet tự động • Cao su để hút (quả bóp cao su) • Thanh gạt thuỷ tinh (que cấy vi khuẩn) • Đĩa nuôi tảo (đĩa petri) • Thanh gạt bằng kim loại • Giấy parafilm • Kéo • Thức ăn nuôi tảo gốc • Nước mặn • Agar (thạch) 2.2.1. Chuẩn bị nguồn nước Nước biển được bơm vào bể chứa, lắng được xử lý chlorin nồng độ 25ppm kết hợp sục khí. Nước trong bể lắng được sục khí và phơi nắng từ 2 – 3 ngày cho hết chlorin tiếp tục được bơm vào bể bạt (stock) 14m 3 qua hệ thống lọc tinh. Nước trong bể stock tiếp tục được xử lý chlorin 30ppm, 2 – 3 ngày sau xử lý Thiosunphat và EDTA để trung hòa dư lượng chlorin, tắt sục khí. 1- 2h sau thì cấp vào bể chìm dự trữ nước để phục vụ quá trình nuôi. Nước ngọt được bơm từ giếng khoan lên qua hệ thống lắng lọc để phục vụ cho quá trình sản xuất. 2.2.2. Vệ sinh các dụng cụ nuôi Đĩa petri , ống nghiệm, chai thủy tinh 250ml, 1l, 2l, bình nhựa 20l, dây dẫn khí, đá bọt: ngâm axit HCL 1% trong thời gian 24h – 48h sau đó rửa lại bằng soludine 1000ppm + nước rửa chén và cuối cùng là rửa lại thật sạch bằng nước ngọt. 2.3. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp điều tra tài liệu. Phương pháp làm trực tiếp tham gia nghiên cứu. Phương pháp thu thập tài liệu và ghi kết quả nhận được từ thí nghiệm thực tế. 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Cách cấy trên đĩa Agar để giữ giống tảo gốc Là phương pháp nuôi vô khuẩn kể cả tạp chất khác phù hợp với tảo như tảo Chaetoceros sp, Thalassiosra sp. 3.1.1. Phương pháp cấy tảo trên đĩa môi trường (agar) 1 2 3 4 5 Chuẩn bị thức ăn agar cứng để tách và nuôi tảo. Cân Agar độ đậm đặc 0.8 - 1.5% trong thể tích nước cần dùng. Nấu thạch (agar) cho tan ra. Đem hấp để diệt khuẩn ở nồi áp suất nhiệt độ đạt 121 o C khoảng 15'. Chờ nhiệt độ của dung dịch agar hạ xuống còn 50-60 o C, bổ sung dung dịch môi trường đã qua diệt khuẩn có độ đậm đặc bình thường. Lắc đều dung dịch. Đổ dung dịch vào đĩa khoảng 1/2- 2/3 của đáy đĩa nuôi tảo Để agar khô và lật ngược đĩa để trong tủ vô khuẩn sau một đêm có thể sử dụng nuôi tảo gốc trên các đĩa này. Đĩa Agar đã chuẩn bị nên dùng hết trong một lần. Không nên để quá một ngày. Cách làm tảo gốc tinh khiết: từ tảo gốc có thể làm hai cách Kỹ thuật cấy đĩa *Cấy tảo từ ống nghiệm sang đĩa thạch Lấy thanh gạt bằng thuỷ tinh nhúng vào cồn 96%, sau đó hơ qua lửa cho đỏ rồi để nguội. Đổ nước có tảo vào đĩa thạch hoặc lấy thanh kim loại nhúng vào ống nghiệm có tảo sau đó cho vào bề mặt đĩa thạch. Lấy thanh gạt bằng thuỷ tinh dàn đều khắp bề mặt thạch cho đến lúc bề mặt thạch khô. Lấy giấy parafilm đậy đĩa vừa cấy tảo lại, lật ngược đĩa để phần có agar lên trên để tiếp xúc với ánh sáng. *Cấy tảo từ đĩa sang đĩa Từ đĩa agar trước cho vào đĩa agar mới nhằm bảo quản tảo gốc hoặc từ đĩa agar trước có các tạp chất cho vào đĩa agar mới nhằm tạo tảo gốc tinh khiết. Các công đoạn đều được thực hiện trong tủ vô khuẩn. Lấy thanh gạt bằng kim loại đem đốt phía đầu cho đỏ lên rồi để nguội. Dùng thanh gạt kim loại chọn 1 colony tảo đẹp (to và có màu vàng sẫm hoặc đen). Cấy lên đĩa thạch mới theo 3 đường giống như hình ở trên ( từ 1 sang 2). Dùng giấy farafim bọc kín đĩa tảo vừa làm xong, đặt lật ngược đĩa và cung cấp ánh sáng. Kỹ thuật tráng đĩa Lấy thanh gạt bằng kim loại đem đốt phía đầu cho đỏ lên rồi để nguội Dùng Autopipet hút tảo trong ống nghiệm nhỏ nước có tảo lên trên bề mặt agar. Lấy thanh gạt bằng kim loại gạt nước có tảo lan toả khắp bề mặt thạch theo hình chữ chi. Lấy giấy parafilm bọc đĩa lại, sau đó lật ngược đĩa để phần có agar tiếp xúc với ánh sáng. Giai đoạn phát triển từ 7-14 ngày. Kiểm tra các tạp chất với mắt thường hoặc kính hiển vi để làm tảo gốc phát triển và nuôi tiếp. 3.2. Các công đoạn cấy và sự phát triển của tảo 3.2.1. Cấy tảo ở mức độ ống nghiệm * Cấy tảo gốc(Original line) Thời gian làm tảo gốc mới thường từ 5-7 ngày Đốt thanh gạt bằng kim loại cho đỏ, rồi để nguội Gạt colony tảo từ đĩa tảo gốc tinh khiết cho vào trong ống nghiệm ( ống nghiệm đã có nước nuôi và môi trường, thể tích 7ml), đánh tan, rồi hơ qua đèn cồn và đậy nắp, cho vào giá để ống nghiệm. Ghi mã số tảo và ngày nhân giống. Đặt lên giàn nuôi và cung cấp ánh sáng 24/24h Giai đoạn phát triển của tảo khoảng 4-10 ngày tùy thuộc vào kích cỡ của tảo gốc và lượng nước nuôi. Chọn ống nghiệm Original line có tế bào đã hoàn chỉnh, tuyệt đối không có tạp chất và đang trong thời kỳ phân chia tế bào khoảng 10% bằng cách xem qua kính hiển vi để nhân giống tiếp. Nên cấy tảo gốc ở ống nghiệm Original line cho đủ số lượng để có thể nhân giống ở các mức tiếp theo. Đối với tảo gốc ở ống nghiệm Original line có thể đem nhân ở Dilution line. * Cấy tảo ở mức Dilution line Thời gian nuôi khoảng 3-5 ngày Hút nước nuôi đã chuẩn bị sẵn cho vào ống nghiệm đã tiệt trùng, mỗi ống 10ml, hút 3 ống. Hút tảo ở ống nghiệm Original line với thể tích 2ml cho vào ống nghiệm thứ nhất ( gọi là ống A), lắc ống nghiệm A nhẹ bằng máy lắc để tảo lan đều. Hút tảo ở ống A 2ml cho vào ống nghiệm thứ 2 (gọi là ống B), lắc nhẹ ống B bằng máy lắc. Hút tảo ở ống B 2ml cho vào ống nghiệm thứ 3 (gọi là ống C), lắc nhẹ ống C để tảo lan đều. Mang cả 3 ống Dilution đặt trên giàn nuôi, cung cấp ánh sáng 2-3 ngày. Với từng bước của Dilution line (ống A, ống B, ống C) có thể sử dụng để nhân giống ở mức Production line * Cấy tảo ở mức Production line Làm hàng ngày và thời gian phát triển của tảo 2-3 ngày. Cho nước nuôi vào 8 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm cho 10ml. Hút tảo ở ống nghiệm A (Dilution line A) cho vào ống nghiệm vừa hút nước, mỗi ống nghiệm 1ml tảo, lần lượt từ 1-8 (gọi là Production line) Đặt trên giàn nuôi, cung cấp ánh sáng trong thời gian 2-3 ngày. Làm tương tự với ống B và ống C ở Dilution line. 3.2.2. Cấy tảo ở chai thủy tinh 250ml Lấy tảo ở Production line (mục 2.1.3) lắc đều, cho 2 ống nghiệm vào 1 chai 250ml ( chai 250ml đã vô trùng). Cho nước nuôi đã chuẩn bị sẵn vào chai 250ml (vừa cho tảo), mức nước 150ml, đậy nắp chai và đặt trên giàn nuôi, cung cấp ánh sáng 24h. Sau 24h thêm nước nuôi vào chai đến mức 250ml, đặt lên giàn và cung cấp ánh sáng thêm 1-2 ngày có thể đem nhân rộng ở mức tiếp theo. 3.2.3. Cấy tảo ở chai thủy tinh 1L(Starter) Làm mới hàng ngày. Nước nuôi tảo chai 1L đã diệt khuẩn chuẩn bị sẵn (750ml), bổ sung môi trường nuôi tảo theo công thức và tỷ lệ quy định. Đem tảo ở chai 250ml (mục 2.2) nhân tiếp ra chai 1L, cứ mỗi chai 250ml cho vào 1 chai nước nuôi 1L. Đậy nắp khoan lỗ, bỏ dây khí, sau đó đặt lên giàn, cung cấp khí và ánh sáng, sau 2-3 ngày thì có thể đem nhân ở mức tiếp theo. 3.2.4. Cấy tảo chai 1L(subculture) Làm tảo mới hằng ngày. Bổ sung môi trường nuôi cấy tảo theo công thức và tỷ lệ phù hợp vào nước mặn diệt khuẩn đã chuẩn bị sẵn. Mang tảo chai 1L (Starter) ở mục 2.3 để nhân vào chai 1L (mức nước trong chai là 700- 800ml), cứ 1 chai tảo Starter nhân ra 4-5 chai 1L ở subculture. Đậy nắp khoan lỗ và bỏ dây khí, đặt lên giàn nuôi, cung cấp khí và ánh sáng để tảo phát triển trong thời gian 2 ngày. Dùng chai thủy tinh 1L ở Starter có thể đem nhân tiếp ra chai 2L mà không phải nhân giống 1L ở subculture tùy thuộc vào chất lượng tảo và số lượng tảo làm. 3.2.5. Cấy tảo chai 2L Làm tảo mới hàng ngày. Thêm môi trường nuôi tảo theo tỷ lệ phù hợp vào chai nước mặn 2L đã diệt khuẩn chuẩn bị sẵn (mức nước 1800ml). Đem tảo chai 1L nhân vào chai 2L, cứ mỗi chai tảo 1L nhân cho 3 chai 2L. Đậy nắp khoan lỗ và bỏ dây khí. Đặt chai lên giàn, cung cấp khí và ánh sáng trong thời gian 2 ngày có thể đem nhân rộng ra 18L. 3.2.6. Cấy tảo bình 18L Làm tảo mới hàng ngày. Bổ sung môi trường nuôi tảo theo tỷ lệ phù hợp vào thùng nước mặn đã diệt khuẩn chuẩn bị sẵn và sục khí đều. Cho can đã diệt khuẩn lên giàn. Bơm nước vừa chuẩn bị vào bình 18L ( mức nước từ 15-16L). Thêm tảo chai 2L (mục 2.5) vào bình vừa bơm nước, mỗi chai tảo 2L thêm vào 1 bình 18L. Bỏ dây khí, cung cấp khí và ánh sáng cho tảo phát triển, sau 2 ngày có thể đem nhân rộng ở mức tiếp theo. 3.2.7. Cấy tảo bình 20L Nước mặn với khối lượng tùy thuộc vào lượng tảo làm chuyển cho tảo ống và tôm con. Thêm môi trường nuôi cấy tảo theo tỷ lệ phù hợp vào thùng nước mặn (1m 3 ) đã chuẩn bị sẵn và sục khí đều. Thêm tảo ở bình 18L (mục 2.6) vào thùng, số lượng 18 - 24 bình/thùng, sục khí mạnh. Đặt can lên giàn, mỗi giàn 56-60 can. Bơm tảo ở thùng vừa chuẩn bị vào can, mỗi thùng (1m 3 ) bơm cho 1 giàn (50-60 can). Cho sục khí, cung cấp ánh sáng cho tảo phát triển trong thời gian 2 ngày có thể chuyển cho tôm con và tảo ống. Nuôi tảo ở các mức độ cần phải được kiểm tra chất lượng tảo trước khi nuôi, nếu đạt chất lượng thì tiếp tục nhân rộng nếu không đạt chất lượng thì xả bỏ. 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1. Xác định được cách cấy trên đĩa agar để giữ giống tảo gốc và đưa ra phương pháp cấy tảo trên đĩa môi trường agar. 2. Xác định được các phương pháp, công đoạn cấy và sự phát triển của vi tảo gồm có phương pháp cấy tảo ở mức độ ống nghiệm, phương pháp làm tảo ở chai thủy tinh 250ml, phương pháp làm tảo ở chai thủy tinh 1l, phương pháp làm tảo chai 1l, phương pháp làm tảo chai 2l, phương pháp làm tảo bình 18l, phương pháp làm tảo bình 20l. Kiến nghị 1. Bước đầu đã nghiên cứu ứng dụng được công nghệ sinh học vào quy trình sản xuất vi tảo song cần nghiên cứu ở phạm vi rộng hơn như vùng biển, vị trí địa lý, nguồn nước, hóa chất và môi trường sử dụng trong công trình. 2. Nghiên cứu chỉ được thực hiện ở vùng biển Trung Trung Bộ cần có các nghiên cứu sâu hơn nữa để có thể ứng dụng để nuôi thu sinh khối và sử dụng rộng rãi trong trại sản xuất giống. 3. Cần tổ chức nghiên cứu với các loài tảo mới để công trình có ý nghĩa to lớn và thực tiễn hơn. TÀI LIỆU THAM KHẢO A – TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Trương Ngọc An (1993), Phân loại tảo silic phù du biển Việt Nam, Nhà xuất Bản Khoa Học – Kỹ Thuật Hà Nội, 315 tr. 2. Tôn Nữ Mỹ Nga (2008), “Nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn lên sự sinh trưởng của quần thể tảo Chaetoceros gracilis (Pantocsek 1892)”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thủy sản, Số 2- 2008, Trường Đại học Nha Trang. 3. Nguyễn Thị Thảo (2007), Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển của quần thể tảo Thalassiosira pseudonana tại Trại tôm giống CP Việt Nam – Ninh Phước – Ninh Thuận, Luận văn thạc sỹ, Trường Đại Học Thủy Sản Nha Trang. 4. Nguyễn Thị Xuân Thu, Nguyễn Thị Bích Ngọc và Nguyễn Thị Hương, 2004. “Tảo đơn bào cơ sở thức ăn của động vật thủy sản”. Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học công nghệ, Trung tâm nghiên cứu Thủy sản III, tr. 424 - 434. B – TÀI LIỆU TIẾNG ANH 5. Thinh.LV (1999) Microalgae for aquaculture. Education Northerm Cerritory University (NTU), Darwin, NT 0909, Australia. 6. Coutteau. P. (1996) . Manual on the production and use of live food for aquaculture: Micro-algae .FAO . Belgium pp 9-44. 7. Wendy Fluks, Kevan L.Mai 1991 Rotifer and Microalgae culture system. The Oceanic Institute - Makapuu Point, pp 17, pp 176-189. 8. Brown. M. (1991) The amino acid and sugar composition of 16 species of microalgae used in mariculture. J. Exp. Mar. Biol. Ecol., CSIRO. Australia Vol. 145. pp. 79 – 99. 9. Brown, M. R., Jeffrey, S. W., Volkman, J. K. and Dunstan, G. A. (1997) Nutritional properties of microalgae for mariculture. Aquaculture, 154: 315-334. 10. Flynn. K. J., Davidson. K. and Leftley. J. W. (1993) Carbon – nitrogen relation during batch growth of Nannochloropsis oculata (Eustimatophyceae) under alternating light and dark.Journal Applied Phycology. Kluwer Academic Publishers. Belgium, 5: 465-475. 11. Guillard. R. R. L. (1975) Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. Plemm Publishing Corporation. Massachutsetts, pp. 29-60. 12. Harrison. P. J., Thomson. P. A. and Calderwood.G. S. (1990) Effects of nutrient and light limitation on the biochemical composition of phytoplankton. Journal of Applied Phycology. Kluwer Academic Publishers. Belgium. 2:45-56. APPLICATION OF BIOTECHNOLOGY IN THE PRODUCTION PROCESS SUMMARY Identified by culture on agar discs to keep original varieties of algae preparation tools and chemicals out of algae culture methods on agar disk. Research and come up with the method, the implants and the growth of microscopic algae that is composed of transplant levels of algae in tube, methods of algae in 250ml glass bottles, methods of algae in 1l bottles, 1l bottle method algae, 2l bottle method algae, methods of algae per 18l, methods of algae per 20l. Keyword: microalgae, single cell . ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀO QUY TRÌNH SẢN XUẤT VI TẢO Nguyễn Văn Công Học vi n cao học K19 – Khoa sau đại học – Trường Đại học Vinh Email: htc48ts.dhv@gmail.com.vn . công của trại sản xuất tôm giống. Nhận thấy giá trị to lớn và tiềm năng kinh tế từ vi c nghiên cứu vi tảo nên Tôi tiến hành công trình: Ứng dụng công nghệ sinh học vào quy trình sản xuất vi. cứu ứng dụng được công nghệ sinh học vào quy trình sản xuất vi tảo song cần nghiên cứu ở phạm vi rộng hơn như vùng biển, vị trí địa lý, nguồn nước, hóa chất và môi trường sử dụng trong công trình. 2.