Luận án Tiến sĩ Y học Thực trạng lây nhiễm lao ở Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thái Bình, một số giải pháp can thiệp

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lao bệnh nhiều người mắc, tỷ lệ tử vong cao có tính chất dễ lây lan cộng đồng [02] Tiếp xúc trực tiếp với người bệnh nguy lây nhiễm bệnh cao [25], [38] Bệnh Lao xếp vào bệnh lây truyền theo đường thở cho nhân viên y tế [42], [129] Nguy bị nhiễm khuẩn liên quan đến nghề nghiệp phần tránh khỏi công tác tiếp xúc chăm sóc bệnh nhân hàng ngày Trong giai đoạn 1985 đến 1991, số nghiên cứu Đan mạch, Ý Thụy sỹ nguy nhiễm lao nhân viên y tế [37], [98], [57] Ở Mỹ, tình hình nhiễm lao nhân viên y tế báo cáo nhiều nghiên cứu [44], [110],[128] Kết điều tra số bệnh viện cho thấy từ 18 đến 35% nhân viên y tế có phản ứng Mantoux chuyển từ âm tính sang dương tính [103], [34], [63] Cho tới năm 1995, có 17 nhân viên y tế (trong có người nhiễm HIV) mắc lao chủng lao đa kháng thuốc (4 nhiễm HIV) chết [126] Tham khảo kết khám sức khỏe định kỳ nhân viên y tế Bệnh viện Lao Bệnh phổi Thái Bình năm 1998, có 58/65 người (89,2%) cho kết phản ứng Mantoux dương tính Một số nhân viên y tế bệnh viện có tiền sử điều trị bệnh lao Cơ quan An toàn Sức khỏe nghề nghiệp Mỹ (OSHA Occupational Safety Health Administration) công nhận bệnh lao bệnh liên quan đến nghề nghiệp [39] Ở Việt Nam, bệnh lao xếp vào nhóm bệnh nhiễm khuẩn nghề nghiệp nằm danh mục 25 bệnh nghề nghiệp bảo hiểm [9] 2 Những năm gần đây, vấn đề kiểm soát lây nhiễm Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) ưu tiên quan tâm cấu phần kiểm soát bệnh lao lao đa kháng siêu kháng thuốc, có vấn đề kiểm sốt phịng ngừa lây nhiễm lao cho nhân viên y tế [05] Kiểm soát lây nhiễm bệnh viện vấn đề ưu tiên Chương trình Chống lao Quốc gia Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu cụ thể vấn đề ô nhiễm vi khuẩn lao nguy lây nhiễm lao nhân viên y tế làm việc môi trường Bệnh viện Lao Bệnh phổi Việt Nam Đề tài luận án “Thực trạng lây nhiễm lao Bệnh viện Lao Bệnh phổi Thái Bình, số giải pháp can thiệp ” có mục tiêu sau: Xác định thực trạng nhiễm lao nhân viên y tế Bệnh viện Lao Bệnh phổi Thái Bình cộng đồng dân cư xung quanh bệnh viện trước can thiệp (năm 2002) Mô tả kết xét nghiệm vi khuẩn lao số vị trí Bệnh viện Lao Bệnh phổi Thái Bình trước can thiệp (năm 2002) Đánh giá hiệu số biện pháp can thiệp kiểm soát lây nhiễm lao mơi trường Bệnh viện Lao Bệnh phổi Thái Bình (năm 2006 2011) 3 CHƯƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH BỆNH LAO HIỆN NAY 1.1.1 Tình hình bệnh lao giới Bệnh lao bệnh có tỷ lệ mắc tử vong hàng đầu giới [131] Theo số liệu ước tính Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG), giới có khoảng 1/3 dân số (2,2 tỷ người) nhiễm lao số tăng 1% hàng năm [07] Theo báo cáo năm 2010 TCYTTG [133], ước tính năm 2009 có thêm khoảng 9,4 triệu người mắc lao (137/100.000 dân) Trong có khoảng 3,3 triệu phụ nữ (chiếm 35%) số người mắc lao/HIV 1,1 triệu (chiếm 12%), số mắc lao/ HIV tập trung phần lớn Châu Phi (80%) Số liệu cụ thể khu vực tổng hợp sau: Bảng 1.1: Ước tính số mắc tử vong lao giới năm 2009 [133] Số mắc Số chết năm năm Khu vực Số lượng Tỷ lệ (1) Số lượng (2) Tỷ lệ (1) Đông Nam Á 3.300.000 185 480.000 27 Tây TBD 1.900.000 105 240.000 13 Châu Phi 2.800.000 339 430.000 52 Trung Cận Đông 660.000 110 99.000 17 Châu Mỹ 270.000 29 20.000 Châu Âu 420.000 47 62.000 9.400.000 137 1.300.000 19 Chung toàn cầu (1) Tỷ lệ 100.000 dân (2) Không bao gồm trường hợp lao/HIV dương tính Phần lớn bệnh nhân lao tập trung Châu Á (55%) Châu Phi (30%), Khu vực Trung Cận Đông, Châu Âu Châu Mỹ khu vực có tỷ lệ bệnh nhân lao thấp (7%, 4% 3%) [133] 81% số bệnh nhân lao nằm 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao tồn cầu Năm nước có số lượng bệnh nhân lao cao Ấn Độ (2.000.000), Trung Quốc (1.300.000), Nam Phi (490.000), Nigeria (460.000) Indonesia (430.000) 35% số bệnh nhân lao tập trung Ấn Độ Trung Quốc Hơn 33% số bệnh nhân lao tồn cầu khu vực Đơng-Nam Á [133] Tổ chức Y tế Thế giới ước tính năm 2008 có khoảng 440.000 bệnh nhân lao kháng thuốc, 86% thuộc 27 nước có gánh nặng bệnh nhân lao kháng thuốc cao (bao gồm 15 nước Châu Âu) Bốn nước ước tính có số lượng bệnh nhân lao kháng thuốc cao Trung Quốc, Ấn Độ, Liên bang Nga Nam Phi [133] Đến tháng 7.2010 có 58 nước vùng lãnh thổ báo cáo phát trường hợp lao kháng thuốc [133] Năm 2009, TCYTTG ước tính có 1,7 triệu người tử vong lao, có 400 nghìn bệnh nhân lao/HIV 380 nghìn phụ nữ Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công toàn cầu đạt 86%, tỷ lệ phát đạt 63% số bệnh nhân ước tính Như vậy, cịn nhiều bệnh nhân lao khơng chữa trị tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, theo ước tính TCYTTG, năm có thêm 1% dân số giới bị nhiễm lao [133] 1.1.2 Tình hình bệnh lao Việt Nam Ở nước ta, bệnh lao cịn phổ biến mức độ trung bình cao Theo báo cáo TCYTTG năm 2010, TCYTTG ước tính Việt Nam đứng thứ 12 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao toàn cầu [133] 5 Một số số liệu tình hình bệnh lao Việt Nam thể bảng sau: Bảng 1.2: Một vài số liệu tình hình bệnh lao Việt Nam Dân số (2009) Phân thứ tự gánh nặng bệnh lao toàn cầu Tỷ lệ tử vong lao (loại trừ HIV)/100.000 dân 88.000 12 36 (21 – 56) Tỷ lệ lao mắc thể / 100.000 dân 333 (143 – 577) Tỷ lệ lao mắc thể / 100.000 dân 200 (150 – 256) Tỷ lệ lao / HIV dương tính mắc 8,4 (5,3 – 12) Tỷ lệ phát hiện, thể (%) 54 (42 – 72) Tỷ lệ lao kháng đa thuốc bệnh nhân (%) 2,7 (2 – 4) Tỷ lệ lao kháng đa thuốc BN điều trị lại (%) 19 (15 – 25) % bệnh nhân lao xét nghiệm HIV 37% % HIV dương tính số bệnh nhân lao xét nghiệm HIV 17% Theo ước tính TCYTTG, tỷ lệ tử vong lao 36/100.000 dân, tương đương với khoảng 32.000 người tử vong lao Tỷ lệ lao mắc thể 333/100.000 dân, tương đương với khoảng 290.000 bệnh nhân Tỷ lệ lao mắc thể hàng năm 200/100.000 dân, tương đương với khoảng 180.000 bệnh nhân Tuy nhiên, ước tính tỷ lệ phát bệnh lao thể Việt Nam đạt 54% (45-72) Năm 2009, có 34.907 bệnh nhân lao xét nghiệm HIV, chiếm tỷ lệ 37% tổng số bệnh nhân lao Tỷ lệ HIV dương tính số bệnh nhân lao xét nghiệm 17%, cao so với tỷ lệ nhiễm HIV ước tính số bệnh nhân lao báo cáo năm 2009 TCYTTG (8,1%) Đồng nhiễm lao/HIV không làm tăng số bệnh nhân lao, mà làm giảm hiệu điều trị CTCLQG tăng tỷ lệ tử vong lao.[133], [10] 6 Tỷ lệ lao kháng đa thuốc 2,7% số bệnh nhân lao 19% số bệnh nhân điều trị lại Theo ước tính CTCLQG, năm 2009 có khoảng 3.952 (95% CI: 2.944 – 5226) bệnh nhân lao kháng đa thuốc số bệnh nhân lao phổi khám phát Trong đó, có 307 bệnh nhân lao kháng đa thuốc điều trị Theo kết điều tra tình hình nhiễm mắc lao tồn quốc năm 2006-2007, nguy nhiễm lao hàng năm Việt Nam 1,67; tỷ lệ mắc lao phổi AFB dương tính thể Việt Nam 145/100.000 dân tỷ lệ mắc lao phổi AFB dương tính 114/100.000 dân Như vậy, số lượng lớn bệnh nhân lao phổi AFB dương tính cộng đồng chưa phát Chương trình chống lao cần có nỗ lực công tác phát hiện, quản lý để hạn chế nguồn lây giảm dịch tễ bệnh lao cộng đồng 1.1.3 Tình hình bệnh lao tỉnh Thái Bình Bảng 1.3: Tình hình phát bệnh nhân lao thể tỉnh Thái Bình từ năm 2007 - 2011: Năm 2007 2008 2009 2010 9th 2011 AFB (+) Mới AFB (+) TP AFB (+) TB ĐT lại* AFB (-) Ng Phổi AFB(-) &NgPh khác AFB (+) khác Tổng cộng 883 834 779 653 543 85 73 97 78 79 04 02 04 05 04 490 551 520 464 370 312 345 349 266 255 0 06 07 08 0 01 01 1774 1805 1756 1473 1260 Tỷ lệ phát bệnh nhân lao thể lao phổi dương tính có xu hướng giảm, năm 2007, tỷ lệ bệnh nhân lao phổi AFB(+)/100.000 dân 48,4; năm 2010 tỷ lệ 34,7 7 Bệnh viện Lao Bệnh phổi tỉnh xây dựng từ năm 1975 xã Vũ Chính xã ngoại thị (cách trung tâm thành phố 3-4 km) gồm 120 giường có nhiệm vụ phát điều trị bệnh nhân lao chung toàn tỉnh Trung bình năm bệnh viện khám 15.000 lượt người tiếp nhận điều trị 800 bệnh nhân lao chủ yếu bệnh nhân lao phổi dương tính tái phát Bảng 1.4: Số bệnh nhân lao phổi AFB dương tính số tiêu đờm xét nghiệm bệnh viện từ năm 1998 – 2011 Năm 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 9th 2011 Tiêu XN dương tính 621 681 612 739 602 517 565 721 901 739 759 847 713 645 Tiêu XN âm tính 7607 7340 7533 17245 8443 8736 9019 10504 10406 12925 13008 12836 12393 9862 Số BN lao phổi dương tính 349 338 299 340 280 239 264 325 404 348 328 376 306 294 1.2 VI KHUẨN LAO VÀ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN 1.2.1 Vi khuẩn lao [20], [23], [59], [70].[151], [07] Hình thể: Vi khuẩn lao hình que mảnh, khơng di động, có độ dài từ đến μm đường kính từ 0,3 đến 0,5μm, cong, hai đầu tròn Trong bệnh phẩm đứng riêng biệt thành đám nhỏ xoắn thừng thành dây [02] Đặc tính sinh hóa: Hoạt độ Catalaza 220C = (+++) Hoạt độ Catalaza đun nóng 700C 15 phút = Hoạt độ Peroxydaza 220C = (+++) Hoạt độ Peroxydaza đun nóng 700C 15 phút = Thạch cận Lebek: trực khuẩn hoàn toàn ưa khí, mọc bề mặt Test Niacin test Kono = (+++) Test khử Nitrat = (+++) Thành phần hóa học cấu trúc Thành phần hóa học: gồm nước chiếm 85,9% trọng lượng chất đạm, đường, mỡ chất khoáng Chất đạm (protid) gồm tuberculoprotein khác (chiếm 56% trọng lượng khô vi khuẩn) Các tuberculoprotein cấu tạo từ acid amin sở kháng nguyên vi khuẩn lao, đưa vào thể động vật gây tượng phản vệ Chất đường (glucid) chiếm khoảng 15% trọng lượng khô vi khuẩn Phần lớn chúng dạng Polysarcharid, liên kết với protein phophat Các Polysarcharid khơng độc, có tính kháng ngun, khơng gây tượng mẫn cảm, có hoạt tính phản ứng huyết tăng cường phản ứng liên kết Chất mỡ (lipid) chiếm 10 đến 40% trọng lượng khô vi khuẩn, chúng tan cồn, ether chloroform Các chất lipid vi khuẩn: mycozit C, cord-factor chất sáp nghiên cứu nhiều Theo nhiều tác giả, lipid vi khuẩn có liên quan đến độc tính khả gây bệnh chúng Cấu trúc hóa học vi khuẩn lao gồm: Vỏ vi khuẩn lao dầy từ 10-20 nm, gồm có lớp khác nhau: Lớp 1: Peptido-glycane Lớp 3: Mycolate arabino galactane Lớp 4: glycolipide với chất: sáp D, yếu tố thừng micoside Vỏ vi khuẩn lao chi phối đặc tính vi khuẩn lao: khả gây bệnh, tạo tính mẫn cảm, tạo tính kháng cồn, kháng toan Cấu trúc vỏ tế bào vi khuẩn lao tạo tính chất nhuộm Khi nhuộm Gram,vi khuẩn bắt mầu vi khuẩn Gram dương Cấu trúc mycolic acid tạo khả kháng lại chất tẩy aniline cồn acid Tính chất nuôi cấy khả đề kháng: Vi khuẩn lao hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ thích nghi 37oC, pH thích nghi 6,7 - 7.Vi khuẩn ni cấy môi trường giàu chất dinh dưỡng môi trường đặc Loeweinstein - Jensen, Ogawa Mark, môi trường lỏng Sauton Ở môi trường Loeweinstein- Jensen khuẩn lạc xuất khoảng sau tháng, khô nhăn nheo giống hoa súp lơ, màu trắng ngà Ở môi trường lỏng Sauton vi khuẩn mọc nhiều bề mặt chất lỏng thành mảng nhăn nheo, khơ dính vào thành ống Vi khuẩn lao phát triển chậm, thời gian nhân đôi 12-24 E.coli 20 phút Những chủng độc lực tạo thành khuẩn lạc R Những chủng độc lực tạo thành khuẩn lạc nhăn nheo phát triển có trật tự Khả gây bệnh Khả gây bệnh vi khuẩn lao phụ thuộc vào độc lực vi khuẩn sức đề kháng thể Sự bền vững vi khuẩn lao với mơi trường bên ngồi [02] Ở điều kiện tự nhiên, vi khuẩn tồn 3-4 tháng Trong phịng thí nghiệm người ta bảo quản vi khuẩn nhiều năm Dưới ánh nắng mặt trời, vi khuẩn bị chết sau 1,5 Khi chiếu tia cực tím chúng tồn 2-3 phút Ở 420C vi khuẩn ngừng phát triển chết sau 10 phút 800C 10 Đờm bệnh nhân lao phòng tối, ẩm sau tháng vi khuẩn tồn giữ độc lực; đun sôi đờm phút chúng bị chết Với cồn 900 vi khuẩn lao tồn phút, acid phenic 5% vi khuẩn chết sau phút Đặc điểm kháng thuốc vi khuẩn lao[25], [70] Vi khuẩn lao trình sinh sản xuất loại đột biến kháng thuốc Những vi khuẩn lao kháng thuốc loại kháng thuốc nhiễm sắc thể Cơ chế chọn lọc tự nhiên, từ quần thể vi khuẩn đa số chịu thuốc trở thành quần thể vi khuẩn kháng thuốc hoàn toàn kháng nhiều loại thuốc Các chủng vi khuẩn chưa tiếp xúc với loại thuốc chống lao gọi “Chủng hoang dại” Một chủng kháng thuốc tự nhiên chủng hoang dại kháng với thuốc mà vi khuẩn chưa tiếp xúc Như vậy, vi khuẩn kháng thuốc tự nhiên bệnh nhân có vi khuẩn chưa tiếp xúc với thuốc chống lao Kháng thuốc tự nhiên xảy nơi thuốc chống lao chưa sử dụng Nguyên nhân kháng thuốc tự nhiên đột biến gien Tần xuất đột biến kháng thuốc tự nhiên phụ thuộc vào nguồn gốc chủng, loại thuốc, nồng độ thuốc tổng số vi khuẩn Số lượng vi khuẩn giảm giảm đột biến kháng thuốc 1.2.2 Một số phương pháp chẩn đoán vi khuẩn lao 1.2.2.1 Các phương pháp cổ điển Soi trực tiếp Nhuộm Ziehl – Neelsen soi kính phương pháp đơn giản, rẻ tiền cho kết nhanh Tuy nhiên, soi kính cho phép phát trực khuẩn lao nồng độ 105 trực khuẩn/ml trở lên, độ nhậy phương pháp thấp, từ 40% - 60% (bệnh phẩm bệnh nhân lao 11 người lớn) đạt từ 10% - 20% (bệnh phẩm bệnh nhân lao phổi) [25], [69], [83] Soi kính khơng cho phép định danh vi khuẩn lao mức độ loài, xác định hình thể, khơng phân biệt vi khuẩn sống hay chết khơng có hiệu việc xác định vi khuẩn lao kháng thuốc Hơn nữa, kết soi kính cần phải khẳng định ni cấy thử nghiệm chẩn đốn xác định có dấu hiệu nghi ngờ nhiễm khuẩn gây vi khuẩn lao thuộc nhóm khơng điển hình cần xác định độ nhạy cảm kháng sinh điều trị [83], [97] Tuy nhiên soi kính phương pháp để xác định nguồn lây chính: người có ho khạc nhiều vi khuẩn lao có kết soi AFB(+) Nuôi cấy Là phương pháp phát có mặt vi khuẩn lao mơi trường ni cấy in vitro Hiện có nhiều loại môi trường để nuôi cấy vi khuẩn lao, chia làm hai loại: môi trường đặc môi trường lỏng Cho đến nay, nuôi cấy môi trường đặc phương pháp kinh điển sử dụng rộng rãi hầu hết phịng thí nghiệm lâm sàng [119] Mơi trường rắn mơi trường trứng (Egg-Base Medium) LoeweinsteinJensen, American Trudeau Society (AST) môi trường agar (Agar-Base Medium) Middlebrook 7H10 Middlebrook 7H11 1.2.2.2 Một số kỹ thuật đại Sử dụng Hệ Bactec Nguyên lý: Người ta gắn cacbon phóng xạ vào acid palmitric acid formic môi trường nuôi cấy vi khuẩn lao Khi vi khuẩn chuyển hoá lấy acid béo giải phóng CO2 (chứa cacbon phóng xạ) đo máy Bactec 460 [30], [02] 12 Hệ thống đo phóng xạ BATEC đời cho phép phát sớm trình mọc vi khuẩn môi trường việc tự động phát lượng 14 CO2 vi khuẩn giải phóng q trình trao đổi chất carboxi hố chất có đánh dấu phóng xạ 14C Kỹ thuật có ưu điểm cho kết nhanh (5 - ngày) phát chủng vi khuẩn kháng thuốc [30], [02] Phương pháp MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tubes) Người ta sử dụng biện pháp đặc biệt để kích thích vi khuẩn lao sinh sản nhanh, vi khuẩn lao phát triển sử dụng oxy (O2) thải CO2 Bằng phận nhận cảm có phát quang nhận biết CO2 (chuyển môi trường từ màu xanh lục sang màu vàng) Phương pháp cho kết nhanh vòng từ 3-10 ngày [02] Nguyên lý: Một phức hợp huỳnh quang gắn đáy týp nuôi cấy Phức hợp nhậy cảm với có mặt O2 hồ tan mơi trường Đầu tiên, lượng O2 hồ tan lớn nên kìm chế phát quang từ phức hợp, lượng nhỏ ánh sáng huỳnh quang phát Sau đó, có mặt vi khuẩn mơi trường, hoạt động vi khuẩn trình trao đổi chất, tiêu thụ bớt O2 dẫn đến việc phát sáng chất huỳnh quang, phát bước sóng 365 nm Sự phát triển vi khuẩn phát xuất độ đục không đồng hạt nhỏ hay mảnh vụn môi trường nuôi cấy [25],[20] Phản ứng chuỗi polymeraza (PCR) Một phát minh quan trọng sinh học phân tử năm gần kỹ thuật khuyếch đại acid nucleic (ADN ARN) Kỹ thuật sử dụng nhiều nước phản ứng chuỗi polymeraza (PCR) Ra đời vào năm 1986, kỹ thuật PCR nhanh chóng cung cấp ứng dụng mạnh mẽ nhiều lĩnh vực công nghệ sinh, y học [81] Việc áp dụng PCR chẩn đoán bệnh truyền nhiễm, đặc biệt bệnh lao cung cấp công cụ 13 đầy triển vọng, đáp ứng với nhu cầu cấp thiết, cho đời phương pháp chẩn đốn nhanh, hiệu an tồn mà đa số phương pháp chẩn đoán bệnh lao cổ điển nhiều bất cập Kỹ thuật PCR cho phép xác định vi khuẩn lao trực tiếp bệnh phẩm nhờ khả chép để khuyếch đại mặt số lượng đoạn trình tự đặc hiệu gienom vi khuẩn [81], [84], [86] Cũng giống phương pháp soi kính, phương pháp PCR cho kết nhanh vòng ngày độ nhạy độ đặc hiệu lại cao nhiều Trong số nghiên cứu nuôi cấy coi tiêu chuẩn vàng, độ nhạy PCR đạt tới 71% đến 91%, độ đặc hiệu từ 95% - 100% [83] Cho tới hầu hết phịng thí nghiệm giới sử dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh lao phát thường quy riêng Đoạn khuôn mẫu sử dụng nhiều đoạn trình tự acid nucleic nằm gien nhảy IS 6110 IS 6110 có mặt nhóm Mycobacterium tuberculosis Mycobacteria khác thuộc nhóm M.complex thường có độ lặp lại cao hệ gien vi khuẩn lao trình tự lý tưởng để đóng vai trị đoạn ADN đích Sự phân biệt M tuberculosis M Bovis đoạn IS 6110 M Bovis có đoạn IS 6110 [123] Người ta sử dụng nhiều trình tự khác IS 986, P36 (đây gien nhảy có đặc điểm tương tự IS 6110), rARN 16S, gien mã hoá cho protein 65 kD 38 Kd [82] Ngồi khác trình tự acid nucleic đích, phương pháp tách chiết ADN, số chu kỳ nhân gien phương pháp phát sản phẩm chép PCR khác phịng thí nghiệm Kỹ thuật điện di gel agarose lai ghép với đoạn mồi đặc hiệu có đánh dấu phóng xạ kỹ thuật phổ biến để phát sản phẩm chép, nhiên số tác giả sử dụng đoạn mồi đánh dấu với chất khơng phóng xạ [82] Bên cạnh ưu điểm, kỹ thuật PCR có mặt hạn chế: 14 - Do phân tử ADN phát vi khuẩn bị chết nên kỹ thuật PCR không cho biết vi khuẩn lao sống hay chết mà điều cần thiết cho việc theo dõi kết điều trị - Có thể có dương tính giả, âm tính giả Chống nhiễm: Do PCR có độ nhạy cao, khả dương tính giả xảy q trình thực hiện, bệnh phẩm vật liệu sử dụng bị nhiễm lượng nhỏ ADN vi khuẩn lao có mơi trường, từ bệnh phẩm có chứa vi khuẩn, bị nhiễm đoạn ADN sản phẩm chép lần chạy PCR trước Sản phẩm chép PCR trở thành mối đe doạ khơng có biện pháp xử lý hiệu Một ống phản ứng sau 40 chu kỳ nhân gien chứa tới 1012 sao, cần lọt vào ống đủ để phản ứng cho kết dương tính giả ống [84] Tuy nhiên ngày người ta loại bỏ khả dương tính giả nhiễm đoạn ADN việc sử dụng ezyme uracil DNA glycosylase (UNG) kết hợp với dUTP thay dTTP hỗn dịch phản ứng UNG hoạt hoá 400C trước phản ứng xảy phá huỷ toàn sơ xuất bị nhiễm vào hỗn dịch phản ứng UNG phá huỷ cách cắt vị trí Uraxin trình tự phân tử loại bỏ chúng có chứa Uraxin trình tự ADN đích tách chiết từ vi khuẩn bảo vệ UNG bị bất hoạt nhiệt độ cao q trình nhân gien xảy khơng ảnh hưởng đến sản phẩm phản ứng [87] Ngoài để chống nhiễm chéo, nguyên tắc ngặt nghèo vơ trùng phải tn thủ suốt q trình thực Phịng thí nghiệm phải xếp cho bước thực kỹ thuật tiến hành khu vực riêng biệt, dụng cụ, hoá chất phải tuyệt đối vô khuẩn 15 Chất ức chế PCR: Bên cạnh dương tính giả, PCR cho âm tính giả có can thiệp chất ức chế kìm hãm phản ứng Các chất thường thành phần có bệnh phẩm có khả ức chế làm giảm hoạt tính enzyme ADN polymeraza, khiến cho phản ứng khuyếch đại gien xảy không xảy [82] Tỷ lệ chất ức chế phản ứng PCR số nghiên cứu dao động từ 3% đến 52% bệnh phẩm đường hơ hấp [86] Người ta tìm cách phát có mặt chất ức chế cách khuyếch đại ADN tách chiết từ bệnh phẩm ống phản ứng lượng nhỏ ADN vi khuẩn lao thêm vào ống Kết âm tính ống cho phép khẳng định có mặt chất ức chế bệnh phẩm Tuy nhiên phương pháp đòi hỏi số ống phản ứng tăng lên đáng kể làm với số lượng mẫu lớn Để khắc phục người ta sử dụng ADN M smegmatis thay cho ADN M tuberculosis Do trình tự nhận biết IS 6110 M smegmatis bị sửa đổi cách thêm vào 56 đôi bazơ Sản phẩm PCR nhân từ trình tự M smegmatis phân biệt với sản phẩm nhân từ trình tự vi khuẩn lao nhờ khác độ dài phân tử chúng M smegmatis sử dụng nội chứng bệnh phẩm Một lượng xác định vi khuẩn M smegmatis cho vào bệnh phẩm trước tiến hành xử lý mẫu tách chiết ADN kiểm tra hiệu tách chiết ADN đồng thời đánh giá có mặt chất ức chế có bệnh phẩm định lượng cách tương đối vi khuẩn vi khuẩn lao có bệnh phẩm [82] Các kỹ thuật tách chiết ADN từ bệnh phẩm nhiều cố gắng để loại bỏ chất ức chế Tuy so sánh phương pháp Boom cộng với 16 phương pháp truyền thống dùng phenol để xử lý bệnh phẩm có chất ức chế PCR, kết nghiên cứu A.Kolk cho thấy phương pháp Boom sử dụng đơn giản hiệu lúc vừa tách chiết, vừa tinh ADN lại không sử dụng phenol [82] Phát vi khuẩn lao sống phương pháp RT – PCR, ELISA Bằng kỹ thuật sinh học phân tử, người ta chứng minh có mặt ARN dấu hiệu để đánh giá mức độ sống vi khuẩn Chỉ vi khuẩn sống phát cách sử dụng mARN làm khuôn phản ứng RT – PCR (Reverse transcriptase PCR) Hầu hết phân tử mARN dễ bị phân huỷ có vịng đời ngắn Do có mặt mARN thường biểu thị q trình chép liên tục gien Patel cộng sử dụng phản ứng RT – PCR để xác định khả sống sót M leprae bị giết nhiệt ông phát dnaK mARN tồn tế bào sống Gần đây, Hellyer cộng nhận thấy lượng fobB ( 85B, entigien) mARN vi khuẩn lao giảm từ