k4544

Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 lời cảm ơn T rong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp này, em đã nhận đợc sự dẫn dắt tận tình của PGS TS Trịnh Đình Đạt. Em xin chân thành cám ơn thầy. Em cũng xin cám ơn các thầy cô trong bộ môn Di truyền đã chỉ bảo cho em trong thời gian qua. Trong thời gian đợc thực tập tại phòng Công nghệ phôi trực thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học - Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia, em đã đợc các chú, cô, anh, chị giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho em hoàn thành khoá luận này. Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Bùi Xuân Nguyên là ngời đã chỉ bảo cho em rất tận tình. Đồng thời em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn của mình đến TS Nguyễn Thị Uớc, cử nhân Nguyễn Văn Hạnh, kỹ s Lê Văn Ty, kỹ s Nguyễn Hữu Đức, chị Nguyễn thị Thuỳ Anh Cuối cùng, em xin cám ơn gia đình và bạn bè đã ủng hộ và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp này. 1 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Đặt vấn đề Công nghệ sinh học động vật hiện nay đang tạo ra một bớc chuyển biến lớn trong việc sản xuất giống các loài vật nuôi cho năng suất cao cũng nh trở thành một công cụ hiệu quả trong việc bảo vệ đa dạng sinh học vật nuôi và động vật hoang dã. Thành tựu nổi bật trong lĩnh vực này là tái tạo cá thể động vật từ tế bào phôi và đặc biệt là tế bào sinh dỡng (Wilmut, 1997), thành tựu này mở ra các khả năng tạo ra các bản sao động vật có tính trạng năng suất giống nh cá thể ban đầu, tạo ra một cuộc cách mạng trong tuyển chọn và sản xuất con giống. Từ tế bào sinh dỡng, nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã sử dụng kỹ thuật cấy nhân để tạo ra các động vật nhân bản. Bắt đầu từ cừu Dolly đợc tạo ra từ tế bào tuyến vú (Willmut), hàng loạt chuột nhiều thế hệ đợc tạo ra bằng phơng pháp t- ơng tự từ tế bào cận trứng (1998). Nhiều phòng thí nghiệm đã thành công trong việc tạo bò nhân bản với hy vọng tạo ra các đàn bò kỷ lục (Pháp 2001, Trung Quốc 2001, Thái Lan 2000). Từ tế bào da tai bò, phòng Công Nghệ Phôi - Viện Công Nghệ Sinh Học thuộc Trung Tâm Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia đã tạo ra phôi bò nhân bản đầu tiên tại Việt Nam. Tỉ lệ phát triển đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang đạt 20 - 25% (Bùi Xuân Nguyên và cs, 1998). Hớng nghiên cứu tạo phôi và động vật nhân bản trở thành hớng nghiên cứu trọng điểm nhằm nâng cao năng suất vật nuôi, bảo vệ đa dạng sinh học vật nuôi, bảo vệ đa dạng sinh học các động vật hoang dã. Đây cũng là hớng nghiên cứu đợc nhiều trờng đại học ở nớc ta quan tâm. Nhân nuôi tế bào động vật là một trong các bớc quan trọng của công nghệ nhân bản động vật. Cũng tại Viện Công Nghệ Sinh Học, các dòng tế bào vật nuôi và động vật hoang dã đợc nhân nuôi và bảo quản đông lạnh thành công nh tế bào bò sữa cao sản, tế bào Sao la (Pseudoryx nghetinhensis), tế bào bò Tót (Bos gaurus), Nhân nuôi tế bào một mặt gia tăng về số lợng từ một nguồn tế bào hữu hạn, mặt khác tạo ra một quần thể tế bào đồng nhất, thích hợp cho việc nhân bản. Do vậy chất lợng tế bào nuôi quyết định trực tiếp đến khả năng tạo phôi, quá trình phát triển của phôi, quá trình phát triển của động vật cũng nh tính năng sản xuất của vật nuôi. Nhiễm sắc thể là đơn vị mang thông tin di truyền cơ bản, do đó sự ổn định số lợng, hình thái, cấu trúc nhiễm sắc thể trong quá trình nuôi tế bào có ý nghĩa quan trọng đối với sự phát triển của tế bào nuôi cũng nh khả năng tạo phôi, chất lợng phôi. Chính vì vậy trong khuôn khổ của khoá luận này, chúng tôi chỉ giới hạn nghiên cứu tìm hiểu ban đầu về bộ nhiễm sắc thể tế bào bò Hà - ấn trong quá trình nuôi cấy và bảo quản tế bào. Chơng1 : Tổng quan tài liệu 2 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 1.1 Sự hình thành nhiễm sắc thể trong điều kiện in vivo Ngời ta thờng nghiên cứu nhiễm sắc thể ở kỳ giữa của phân bào vì vào thời điểm đó nhiễm sắc thể co xoắn cực đại, bắt màu thuốc nhuộm mạnh nhất và có hình dạng điển hình nhất. Năm 1665, bằng chiếc kính hiển vi đơn giản Robert- Hooke đã có một số quan sát và rút ra nhận xét: "Các mô, các cơ quan của cây cối và động vật đều có nền tảng cấu trúc chung". Trong cùng một cơ thể sinh vật, tế bào ở các mô, các cơ quan tuy có khác nhau về chức năng, hình dạng nhng đều có cấu tạo chung tơng đối giống nhau: màng tế bào (Plasma membrane), bào tơng (Cytoplasma), nhân (Nucleus). Tế bào Eukaryota, nhân đợc bao bọc bởi màng nhân và mang vật chất di truyền là axit nucleic (ADN). Chúng đợc tập hợp trong các nhiễm sắc thể. Vậy nhiễm sắc thể là một phức hợp các đơn vị di truyền, là sản phẩm của sự tiến hoá mà ngay từ khi mới bắt đầu tồn tại đã có giá trị chọn lọc cao. Mỗi loài sinh vật có một bộ nhiễm sắc thể đặc trng cho loài đó về số lợng, hình thái, cấu trúc nhiễm sắc thể: ví dụ: bộ nhiễm sắc thể bò 2n = 60; bộ nhiễm sắc thể trâu 2n = 50; bộ nhiễm sắc thể ngời 2n = 46; bộ nhiễm sắc thể ruồi giấm 2n = 8 Trong tế bào soma, nhiễm sắc thể tồn tại thành từng cặp tạo nên bộ nhiễm sắc thể lỡng bội (2n). Trong các tế bào sinh dục (các giao tử), bộ nhiễm sắc thể có số l- ợng giảm đi một nữa (n). Trong một số trờng hợp sự tăng, giảm về số lợng nhiễm sắc thể là do thiếu hoặc thừa một số nhiễm sắc thể nào đó. Đơn bội hoá hoặc đa bội hoá đều tạo ra những nhiễm sắc thể bất thờng. Nhiễm sắc thể của Prokaryota thờng là những phân tử ADN trần không có màng nhân bao bọc. Trong khi ở tế bào Eukaryota, cấu trúc nhiễm sắc thể hoàn toàn khác. Bớc nhảy vọt về cấu trúc nhiễm sắc thể ở sinh vật bậc cao kèm theo sự xuất hiện của bộ máy nguyên phân và màng nhân đã gây ra sự thay đổi cơ bản về kích th- ớc, số lợng nhiễm sắc thể của chúng trong tế bào, về sự phức tạp của cấu tạo phân tử và cả trong những mối tơng quan của những yếu tố di truyền và các cấu thành khác nhau của nhân. 3 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Dới kính hiển vi quang học, nhiễm sắc thể có cấu tạo từ hai sợi nhiễm sắc đó là nhiễm sắc thể đơn (chromatide). Dới kính hiển vi điện tử các chromatide đợc cấu tạo từ nhiều sợi nhiễm sắc. Hai sợi nhiễm sắc đơn thể chạy dọc theo suốt chiều dài của nhiễm sắc thể và cuộn xoắn tạo nên sợi nhiễm sắc thể. Ta có thể nhìn thấy hầu hết các dấu hiệu đặc trng của các nhiễm sắc thể ở kỳ giữa của tế bào soma. Trên sợi nhiễm sắc thể có tâm động (centromer), đây là tiểu bộ phận có chức năng chuyển động đặc trng cho nhiễm sắc thể ở các sinh vật bậc cao và nó còn là điểm trợt để kéo sợi nhiễm sắc về hai phía trong quá trình phân bào. Khi nhiễm sắc thể pha nghỉ đợc nhuộm và quan sát dới kính hiển vi ta thấy chất nhiễm sắc phân thành hai kiểu khác biệt rõ rệt về cấu tạo. Một kiểu đợc nhuộm rất nhạt gọi là chất nguyên nhiễm sắc (vùng sáng - euchromatin). Kiểu kia đợc nhuộm đậm gọi là chất dị nhiễm sắc (vùng tối- heterochromatin). Chất nguyên nhiễm sắc ở trạng thái dãn xoắn, còn chất dị nhiễm sắc ở trạng thái cuộn xoắn cao. Ngời ta cho rằng vùng sáng chứa gen hoạt động còn vùng tối chứa gen ở trạng thái không hoạt động. Những sinh vật khác nhau chất dị nhiễm sắc phân bố cũng khác nhau. Có tr- ờng hợp từng phần hoặc toàn bộ nhiễm sắc thể là chất dị nhiễm sắc nằm rải rác ở dạng những đoạn xoắn xen kẽ với chất nguyên nhiễm sắc và bọc quanh các tâm động. Về chức năng chất nguyên nhiễm sắc chứa ADN ở trạng thái hoạt động (có thể phiên mã đợc), còn chất dị nhiễm sắc thì mang ADN ở dạng không phiên mã đ- ợc. Chất dị nhiễm sắc sao chép muộn hơn chất nguyên nhiễm sắc trong chu kỳ tế bào. Cấu tạo hoá học của nhiễm sắc thể gồm có ADN và một loại protein đặc biệt đó là histon bao quanh ADN, ngoài ra còn có ARN và protit. ADN cùng với histon tạo thành một phức hợp Nucleoprotein chiếm 60 - 90% toàn bộ nhiễm sắc thể. Nhiễm sắc thể bao gồm hai nữa gọi là nhiễm sắc tử, mỗi nhiễm sắc tử đợc tạo thành từ chất Desoxyribonucleoprotein (DNP) và bao gồm khoảng 40% ADN, 60% protein, các nhiễm sắc tử đợc dính nối với nhau bởi những thể nhỏ dạng chấm hay hạt gọi là tâm động (centromer). Ngoài nhiễm sắc thể thờng, trong mỗi tế bào sinh dỡng còn mang hai nhiễm sắc thể giới tính là XX ở con cái và XY ở con đực. Một số trờng hợp đặc biệt ví dụ nh ở loài tằm cặp nhiễm sắc thể giới tính XX ở con đực và XY ở con cái, ở chim nhiễm sắc thể giới tính ở con cái là ZO và ở con đực là ZZ. 4 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Hình thái nhiễm sắc thể còn đợc Dhnuki (1965) đề cập đến trạng thái nhiễm sắc thể cuộn xoắn. Ferguson- Smith (1962), Palmer, Funderburk (1965) nghiên cứu về eo thứ hai, Engmanm (1979) nghiên cứu về thể sáp, thể sao kép, thể sao khổng lồ, thể sao liên hợp. Tuy nhiên dới ảnh hởng của các nhân tố khác nhau số lợng và hình dạng của các nhiễm sắc thể có thể thay đổi. Ví dụ: Dới tác dụng của nhiệt độ cao hoặc thấp các nhiễm sắc thể có thể kéo dài ra hoặc co ngắn lại, sự bức xạ ion hoá gây đứt nhiễm sắc thể thành những phần riêng (đứt mạch) và chúng thoát khỏi bộ nhiễm sắc thể. Theo Makino (1944), Kalicop (1968), Bhatacharya (1977) thì số lợng nhiễm sắc thể trong tế bào soma của các loài vật nuôi khác nhau thì khác nhau. Nh vậy, trong phạm vi loài số lợng nhiễm sắc thể là một hằng số ổn định. Bớc đầu Barnicot và Huseley (1961) đã xử lý và quan sát nhiễm sắc thể dới kính hiển vi địên tử thành công. Sau đó Dupraw (1965) đã dùng phơng pháp Gall xử lý quan sát nhiễm sắc thể đợc các sợi cuộn vòng trong nhiễm sắc thể có đờng kính 250 Angtron. Năm 1970 Dupraw đã xuất bản toàn bộ những ảnh chụp nhiễm sắc thể qua kính hiển vi điện tử. Ris và Cubai (1976) cũng đã xử lý bằng các tác nhân phụ, tách sợi 250 Angtron thành hai sợi khoảng 100 Angtron, nh vậy nhiễm sắc thể ở kỳ giữa, đờng kính các sợi có thể từ 230 - 250 Angtron thậm chí lên quá 300 Angtron. Barh và Golomh (1971) đã sử dụng và nghiên cứu nhận dạng nhiễm sắc thể. Từ đó cấu trúc các sợi cuộn của Dupraw đã trở thành cấu trúc nhiễm sắc thể hiện đại. Tế bào là đơn vị cơ bản cấu tạo nên mọi cơ thể sống do đó muốn bảo tồn và phát triển thì mọi cơ thể sống đều phải tiến hành sinh sản. Trong sinh vật tuỳ theo mức độ tiến hoá mà có các hình thức sinh sản khác nhau. Động vật có vú phát triển cao thì tế bào có hai hình thức phân chia đó là hình thức phân chia nguyên phân xảy ra ở hầu hết các tế bào trong cơ thể và hình thức giảm phân để tạo ra tế bào sinh dục. Sự sinh sản của tế bào là quá trình sinh trởng phân chia có tính chất chu kỳ gọi là chu kỳ tế bào. Trong quá trình phân bào này, số nhiễm sắc thể tăng lên gấp đôi sau đó các nhiễm sắc thể phân phối đều cho 2 tế bào con. Kết quả số nhiễm sắc thể ở mỗi tế bào con giống hệt tế bào mẹ. Phân bào nguyên phân là một quá trình liên tục, nhng để tiện cho nghiên cứu có thể chia làm bốn thời kỳ liên tiếp nhau: kỳ đầu, kỳ giữa, kỳ sau, kỳ cuối. Giữa hai lần phân chia gọi là gian kỳ. Nguời ta gọi các biến đổi của tế bào từ lúc bắt đầu lần phân chia thứ nhất cho tới khi bắt đầu lần phân chia thứ hai là một chu kỳ tế bào. Gian kỳ chiếm phần lớn thời gian còn các thời kỳ phân bào chỉ chiếm phần nhỏ. 5 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Trong quá trình phân bào (nguyên phân hay giảm phân) chúng ta thấy nhiễm sắc thể luôn thay đổi, nhng về mặt cấu trúc thì cơ sở của nó là phức hợp ADN - histon đảm bảo cho tính nguyên vẹn của nhiễm sắc thể. Tế bào soma trong trung kỳ hình thái nhiễm sắc thể là ổn định, sự chênh lệch trong các tế bào thuộc phạm vi một cá thể hoặc những cơ thể của một loài là không đáng kể. Vì vậy nghiên cứu cấu tạo nhân của các loài khác nhau tốt nhất là vào kỳ giữa lúc đó mỗi loài đợc đặc trng bởi một bộ nhiễm sắc thể về hình thái và số lợng. Phân bào giảm phân là quá trình sinh ra các giao tử đơn bội từ một tế bào lỡng bội sau hai lần phân chia. Nguyên phân là quá trình truyền lại cho tế bào con toàn bộ thông tin di truyền của tế bào mẹ đảm bảo cho sự ổn định về số lợng, hình thái của bộ nhiễm sắc thể trong các tế bào của cơ thể. Gian kỳ là khoảng thời gian giữa hai lần phân chia, trong gian kỳ khi tế bào không phân chia xảy ra quá trình chuyển hoá mạnh mẽ, tổng hợp các chất khác nhau, cần thiết cho hoạt động đặc biệt của tế bào cũng nh sự phân chia của nó. Gian kỳ (interphase) chia làm ba giai đoạn là G1 - S - G2, tiếp sau G tế bào phân chia cho hai tế bào con, sau đó mỗi tế bào con lại bắt đầu một chu trình tế bào. Gian kỳ gồm 3 giai đoạn: _ Giai đoạn thứ nhất bắt đầu ngay sau khi kết thúc phân chia của tế bào gọi là giai đoạn G1. Trong giai đoạn G1 tế bào không chỉ lớn lên và tạo lập hình dáng vốn có cho mình mà còn tích luỹ những chất giàu năng lợng khác nhau, các nucleotid, axitamin, enzym. Trong thời kỳ này tế bào chuẩn bị tăng gấp đôi các cấu trúc di truyền của nó. _ Giai đoạn S (Synthese = tổng hợp) xãy ra sự nhân đôi vật chất di truyền, sự tái sinh của các phân tử ADN. Các protein và ARN đợc tổng hợp mạnh mẽ. _ Giai đoạn G2 là giai đoạn sau tổng hợp, sự tổng hợp ARN vẫn tiếp tục các nhiễm sắc thể đã chứa hai bản sao của mình tức là các nhiễm sắc tử mang một phân tử ADN, hai sợi tế bào tích luỹ năng lợng và chuẩn bị cho sự phân chia tới, các nhiễm sắc thể xoắn lại và chia làm hai. Dới kính hiển vi quang học không quan sát thấy nhiễm sắc thể trong gian kỳ, nhng theo các dấu hiệu thu đợc khi quan sát dới kính hiển vi điện tử thì thấy đa số nhân trong gian kỳ vẫn có hình dạng nhiễm sắc thể, tuy nhiên các nhiễm sắc thể rất mảnh nên dới kính hiển vi quang học không thấy dợc toàn bộ cấu trúc và hình dạng 6 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 của nhiễm sắc thể mà chỉ thấy đợc chỗ vặn xoắn của chúng tạo nên các khối chất nhiễm sắc. Các thời kỳ phân chia: Kỳ đầu (Prophase): ở kỳ đầu nhân xuất hiện các sợi lúc đầu mảnh và dài, càng về sau mảnh hơn và ngắn hơn. Trứơc kia ngời ta cho rằng từ các hạt chất nhiễm sắc tập hợp lại thành sợi dài, về sau sợi đó bị đứt đoạn tạo thành các nhiễm sắc thể, ngày nay ngời ta đã khẳng định rằng các sợi trong kỳ đầu ngắn hơn và dày hơn các nhiễm sắc thể ở gian kỳ. Vào cuối kỳ đầu, màng nhân và hạch nhân biến mất. Số trung thể tăng lên gấp đôi, mỗi nửa số trung thể di chuyển tới các cực đối lập của tế bào. Xung quanh trung thể xuất hiện các tia nên trông các trung thể giống nh những ngôi sao. Từ nguyên liệu của bào tơng hình thành nên các sợi của thoi vô sắc. Thoi gồm các sợi không bắt màu đi từ sao nọ sang sao kia. Thoi này có chứa protein giàu lu huỳnh, ARN, lipoprotein và ATP. Kỳ giữa (Metaphase): Tại kỳ giữa nhiễm sắc thể có hình dạng đặc trng xuất hiện các sợi thoi toả ra từ hai cực đối diện của tế bào dính với trung tử nằm ở hai cực. Các sợi thoi lần lợt dính với các tâm động của nhiễm sắc thể. Các nhiễm sắc thể tập trung ở mặt phẳng xích đạo của tế bào, mỗi cặp sợi nhiễm sắc. Nghĩa là mỗi nhiễm sắc thể con kết xoắn cực đại. Kỳ sau (Anaphase): ở kỳ sau các đôi nhiễm sắc thể tách ra thành các nhiễm sắc thể đơn thể quay ngợc đầu rời xa đờng xích đạo tiến về hai cực của tế bào, đó là vai của nhiễm sắc thể đơn. Thoi vô sắc biến đi, bào tơng ở xung quanh dày và co thắt mạnh hơn. Càng về sau vai của nhiễm sắc thể càng mờ đi không thấy rõ nữa vì các sợi nhiễm sắc đã cởi xoắn. Kỳ cuối (Telophase): Sự vận chuyển của các nhiễm sắc thể con về hai cực của tế bào kết thúc. Nh vậy 2 nhóm nhiễm sắc thể ở hai cực có số lợng và thành phần giống nhau. Màng nhân hình thành bao bọc bởi mỗi nhóm nhiễm sắc thể. Các nhiễm sắc thể dãn xoắn, hình thành nhân con. Các sợi thoi biến mất, tế bào chất đợc phân chia bao lấy nhân ở hai cực tế bào. Trong thời kỳ phân bào, các bào quan phân phối từng đôi đều cho các tế bào con. Ty thể thờng phân ra thành các hạt bé hơn đôi khi lại kéo dài ra, bộ máy golgi cắt ra từng đoạn phân bào nguyên phân trải qua hai quá trình chia nhân và chia bào tơng. Trong quá trình phân chia nhân mỗi nhiễm sắc thể tạo ra hai nhiễm sắc thể con từ gian kỳ song chúng cha tách rời nhau. 7 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Đến cuối kỳ đầu hai nhiễm sắc thể con mới bắt đầu tách rời nhau. Nh vậy số lợng nhiễm sắc thể là 2n đi về mỗi cực của tế bào cho nên kết thúc kỳ phân chia, mỗi tế bào con có đủ bộ lỡng bội 2n giống tế bào mẹ về cả số lợng, hình thái, kích thớc. Theo Ford (1973) khi nuôi cấy tế bào trong chu kỳ phân chia tế bào, thời kỳ G1 chiếm khoảng 12 - 24 giờ, thời kỳ S chiếm khoảng 7 giờ, thời kỳ G2 chiếm khoảng 4 - 6 giờ. Thời gian phân chia nguyên phân rất ngắn khoảng 1 giờ 30 phút trong đó: Kỳ đầu 30 phút Kỳ giữa15 phút Kỳ sau 15 phút Kỳ cuối 30 phút Nghiên cứu nhiễm sắc thể là dựa vào việc xác định rõ các giai đoạn phân chia của tế bào để có thể thu đợc kết quả tốt nh kỳ giữa của quá trình nguyên phân. Tuy nhiên trong quá trình sinh sản và phát triển cá thể không phải lúc nào tế bào cũng duy trì đợc hoàn toàn chính xác về số lợng và hình dạng nhiễm sắc thể mà sẽ có những biến động. Những biến đổi của nhiễm sắc thể chia thành hai loại: _ Biến đổi về số lợng nhiễm sắc thể _ Biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể 1.2 Những nghiên cứu nhiễm sắc thể trong điều kiện in vitro 1.2.1 Lợc sử nghiên cứu chung về nhiễm sắc thể Nghiên cứu nhiễm sắc thể ngời và động vật đã đợc nhiều nhà khoa học chú ý tới, đặc biệt là vật nuôi. Nghiên cứu nhiễm sắc thể động vật nói chung và động vật nông nghiệp nói riêng đợc tiến hành từ đầu thế kỷ XIX. _ Năm 1665 Robert - Hooke nhà nghiên cứu ngời Anh đã tạo ra kính hiển vi quang học đầu tiên trên thế giới. Bằng chiếc kính hiển vi đơn giản ông đã có một số quan sát làm cho ngời ta hiểu rằng các mô, các cơ quan của cây cối và động vật đều có nền tảng và cấu trúc chung. _ Năm 1838 - 1839 nhà thực vật học Slayden và nhà động vật học Schwan ở Đức đã phát hiện ra cơ thể sinh vật đều đợc cấu tạo từ các tế bào, học thuyết tế bào 8 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 ra đời. Theo Enghen đây là một trong ba phát minh vĩ đại nhất của khoa học tự nhiên ở thế kỹ 19. _ Năm 1831 Robert Braum tìm thấy thể nhiễm sắc trong nhân _ Từ năm 1862 - 1915 Beveri (Đức) và Wilsen (Mỹ) cho rằng nhiễm sắc thể khác nhau mang trong nó tính di truyền khác nhau. _ Năm 1869 lần đầu tiên nhà sinh vật học ngời Thuỵ Sỹ F.Misher đã phát hiện ra axit nucleic trong nhân tế bào. _ Từ năm 1887 - 1902 Beveri phát triển lý luận về nhiễm sắc thể. _ Năm 1927 Kalinte công bố số lợng nhiễm sắc thể ở bò là 2n = 60 _ Năm 1956 Tjo và Levan dùng kỹ thuật nuôi cấy tế bào của bào thai và dùng sốc nhợc trơng đã đếm chính xác số lợng nhiễm sắc thể của ngời là 2n = 46. Trong thời gian này với phơng pháp nghiên cứu nhiễm sắc thể khác nh: nuôi cấy bạch cầu máu ngoại vi, nuôi cấy tuỷ xơng, .đã có nhiều tác giả công bố số lợng và hình thái nhiễm sắc thể ở gia súc và gia cầm. Dựa vào sự phân tích nhiễm sắc thể trong nguyên phân và phân tích nhiễm sắc thể khổng lồ ở loài Anopheles sundaicus, S. Sukowati và V. Baimai (1996) đã kết luận rằng: loài Anopheles sundaicus gồm ba dạng, ba dạng này đều có kiểu nhân trong nguyên phân là giống nhau là 2n = 6. Thành tựu đầu tiên về nghiên cứu nhiễm sắc thể ngời do Chrustchoft và Berlin dùng tế bào bạch cầu, tế bào máu ngoại vi nuôi cấy môi trờng tổng hợp. Năm 1935 Chrustchoft và cộng sự đã công bố phơng pháp nuôi cấy tế bào bạch cầu đa nhân. Nghiên cứu nhiễm sắc thể trên ngời đã đợc phát triển sớm ở nhiều phòng thí nghiệm ở nhiều nớc. Một số lợng lớn các mẫu đã đợc nghiên cứu, phân tích, sự phát hiện dị dạng nhiễm sắc thể và mối liên quan của nó tới quá trình sống đã giúp cho sự phát triển ngành tế bào học và di truyền ngời thu đợc những thành tựu đáng kể nh ngày nay. Bên cạnh đó các nhà khoa học Nhật Bản và Tây Âu đặc biệt quan tâm nghiên cứu tới nhiễm sắc thể ở vật nuôi. Nuôi cấy tế bào trong môi trờng thử nghiệm từ năm 1880 từ khi Roux giữ đĩa phôi gà trong nớc muối sinh lý ấm vài ngày. 9 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 Anold (1887) đã ghép một mảnh mô vào ếch, sau một thời gian có tế bào bạch cầu đa nhân vây quanh. Ông đã lấy mảnh mô và giữ trong đĩa nớc muối sinh lý ấm rồi quan sát sự chuyển động và sống của nó trong thời gian ngắn. Năm 1903 Folly đã giữ tế bào bạch cầu bằng những giọt treo lơ lửng trong n- ớc muối sinh lý ấm với thời gian một tháng. Becbe và Swing (1906) đã miêu tả việc cấy tế bào bạch cầu đơn nhân trong máu động vật có sức đề kháng và mẫn cảm. Năm 1907 Rossnarisian đã tách mảnh mô từ những ống vùng giữa rốn phôi và đám tế bào lympho ếch. Các mảnh mô này có thể sống vài tuần lễ và có nhiều sợi thần kinh xuất hiện ở các tế bào. Thời gian sau Carell đã phát hiện chất chiết xuất từ phôi thai có khả năng kích thích và tăng cờng ảnh hởng tới sự phát triển của một số tế bào nhất định. Waren và Leweis (1911 - 1912) đã bắt đầu tìm hiểu những nhân tố khi cho vào môi trờng cần thiết cho sự sinh trởng và quá trình sống của tế bào. Công việc này đợc Fisher tiếp tục nghiên cứu và trong những năm tiếp theo những nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu nh: Sanhevtecly, Morgan, White, Waymouth và Eagle đã giúp cho sự phát triển những môi trờng tổng hợp dùng để nuôi cấy tế bào ngày càng hoàn thiện (Paul, 1960). Có thể nói rằng tất cả các nghiên cứu nhiễm sắc thể ngời và động vật trớc năm 1940 chỉ đợc tiến hành bằng việc cắt các mảnh mô. Nói chung là các mảnh mô này đựợc cố định trong dung dịch osurium hoặc chronium bao gồm cả dung dịch cố định, thuốc nhuộm với các chất kết tinh màu tím hoặc là thuốc nhuộm hematocylin. Makino (1944) đã dùng mô dịch hoàn để nghiên cứu nhiễm sắc thể bò trong môi trờng hổn hợp Champy và Fleming. Hỗn dịch không có axit axetic đặc trong dung dịch cố định mẫu đợc tiến hành nhuộm trong Haidenhai- sắt- Hematocylin. Slizinsky (1945) đã thử nghiệm sử dụng thuốc nhuộm carmin axetic cố định để nghiên cứu nhiễm sắc thể ở tuỷ ngời. Nhng tất cả các kết quả đều không mỹ mãn khi sử dụng những nguyên liệu này cho tới năm 1950 kỹ thuật nuôi cấy nhiễm sắc thể đã đợc tiến hành những năm 1950 nh sau: Phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào trong môi trờng tổng hợp dùng chất kích thích phân bào phytohaemaglutinin (PHA) có khả năng kích thích bạch cầu đơn nhân. _ Sử dụng Colchicin để cố định quá trình phân bào ở trung kỳ giai đoạn tốt nhất để đếm và quan sát hình dạng nhiễm sắc thể. 10