k2031

Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Mục lục Trang ĐặT VấN Đề Đặt vấn đề .1 Tổng quan .4 1.1. Đại cơng về amylase và papain 4 1.1.1. Amylase 4 1.1.2. Papain .8 1.2. Một số sản phẩm thuốc có chứa papain và amylase .13 Thực nghiệm và kết quả 14 2.1. Nguyên liệu và phơng pháp thực nghiệm 14 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu .14 2.1.2. Hoá chất và thuốc thử 15 2.1.3. Dụng cụ máy móc .16 2.1.4. Phơng pháp nghiên cứu .17 2.2. Kết quả Thực nghiệm và nhận xét .25 2.2.1. Xây dựng biểu đồ mẫu định lợng protein bằng phản ứng Biuret .25 2.2.2. Xác định hoạt độ Papain trong hỗn hợp bằng PP1 26 2.2.3. Xác định hoạt độ papain trong các hỗn hợp bằng PP2 32 2.2.3.Xác định hoạt độ alpha amylase trong các hỗn hợp .35 2.3. BàN LUậN 42 Kết luận và đề xuất .45 3.1. Kết luận 45 3.2. Đề xuất .46 Tài liệu tham khảo 47 Đặt vấn đề Papain và Amylase là những enzym đã đợc sử dụng từ lâu ở nhiều nớc trên thế giới dới dạng các thực phẩm hoặc thuốc cổ truyền, thậm chí đã trở thành những huyền thoại về sự tuyệt diệu của chúng. Papain có trong nớc ép của quả đu đủ xanh đã cứu sống một em bé ngời ấn Độ bị ngạt thở do mắc nghẽn một miếng thịt to ở họng. Sự tuyệt diệu của amylase là ở chỗ chỉ cần một thìa nớc ép giá đỗ xanh đã làm loãng và giảm thể tích một bát bột đã nấu chín của trẻ em xuống còn một nửa, nhng giá trị dinh dỡng không hề thay đổi và hiệu quả hấp thu tăng lên [14]. Trong thời gian qua nhờ thành tựu phát triển của khoa học đặc biệt là dợc học, các nghiên cứu sâu về ứng dụng của các enzym cũng đợc phát triển. Ngoài tác dụng thuỷ phân tinh bột và protein, hai enzym này còn có tác dụng chống viêm, làm sạch da rất hiệu quả. Ngày nay, bên cạnh việc chiết tách, tinh chế, ngời ta đang phải đa các chế phẩm enzym này vào những dạng bào chế thích hợp nhằm phân liều chính xác, ổn định hoạt chất và hiện đại hoá sản phẩm. Papain và amylase đã đợc phối hợp thích hợp nhằm bổ trợ tiêu hoá các thành phần hoá học trong thức ăn ở mức tối u theo nhu cầu dinh dỡng của một số đối tợng bị rối loạn tiêu hoá, trẻ em suy dinh dỡng và những ngời lớn có bệnh đờng tiêu hoá. Hỗn hợp này đã trở thành những sản phẩm thuốc đợc sử dụng ở nhiều nớc trên thế giới, chiếm tỷ trọng lớn ở các nớc đang phát triển do có tỷ lệ trẻ em suy dinh dỡng cao. Việt Nam cũng là một nớc đang phát triển có tỷ lệ trẻ em SDD dới 5 tuổi cao, đến năm 2004 là 26,4% và số ngời có bệnh đ- ờng tiêu hoá cũng cao, chủ yếu do viêm dạ dày, ruột. Mặt khác nớc ta có khí hậu nhiệt đới, cây cối quanh năm xanh tốt, nguồn nguyên liệu để thu papain và amylase rất dồi dào. Nhng hàng năm chúng ta đang phải nhập hàng triệu sản phẩm thuốc là hỗn hợp papain và amylase từ các nớc Mỹ, Pháp, Hàn Quốc, Nhật Bản và ấn Độ. Đó là một thực tế, nhng điều đó là không thể chấp nhận đợc đối với ngời dợc sĩ trong điều kiện nguồn nguyên liệu để thu các sản phẩm này ở nớc ta thuộc loại dồi dào, sẵn có. Để góp phần nghiên cứu triển khai và biến các chế phẩm enzym papain và amylase thành những sản phẩm thuốc có giá trị, ổn định và hiện đại, sản xuất đ- -2- ợc ở Việt Nam, phục vụ số khá đông những ngời bệnh đang có nhu cầu, chúng tôi tiến hành đề tài: Đánh giá sự biến đổi hoạt độ enzym của hỗn hợp Papain và Amylase dạng bột và dạng dung dịch trong điều kiện lão hoá cấp tốc với mục tiêu: đánh giá đợc sự biến đổi hoạt tính của các enzym trong hỗn hợp ở điều kiện nhiệt độ cao, đồng thời tìm ra những quy luật thay đổi hoạt độ enzym. Từ đó có những biện pháp cụ thể ổn định hoạt chất và nâng cao độ ổn định của thuốc, sớm triển khai sản xuất thuốc này thành hiện thực. -3- Phần I Tổng quan 1.1. Đại cơng về amylase và papain 1.1.1. Amylase Amylase [EC.3.2.1] thuộc nhóm enzym hydrolase có vai trò quan trọng trong việc thuỷ phân tinh bột trong thức ăn thành các thành phần đơn giản hơn. Amylase xúc tác sự phân giải liên kết nội phân tử trong các polysaccarid với sự tham gia của nớc có trong dịch tiêu hoá nh nớc bọt, dịch dạ dày ., đợc mô phỏng theo phơng trình sau: R-R' + H-OH RH + R'OH Amylase có nguồn gốc ở cả động vật và thực vật. ở ngời amylase đợc sinh ra chủ yếu ở hai tuyến: tuỵ và nớc bọt. Hiện nay, ngời ta đã biết có 6 loại amylase, trong đó 3 loại: -amylase, -amylase, -amylase (glucoamylase) thuỷ phân các liên kết -1,4-glucosid của tinh bột, glycogen và các polysaccharid. Các amylase còn lại: dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6- glucanhydrolase và olygodextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinase) thuỷ phân liên kết -1,6-glucosid trong phân tử polysaccharid. Sáu enzym amylase này cũng có thể đợc chia thành hai nhóm: endoamylase và exoamylase [4]: - Endoamylase: gồm có -amylase và các enzym khử nhánh. Nhóm enzym khử nhánh đợc chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase (hay - dextrin 6-glucanohydrolase); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6- glucosidase) và amylo-1,6-glucosidase. Các endoamylase thuỷ phân các liên kết glucosid bên trong của chuỗi polysaccharid. -4- -amylase -amylase -amylase - Exoamylase:gồm -amylase và -amylase, là những enzym thuỷ phân tinh bột từ các đầu cuối không khử của chuỗi polysaccharid. Đặc điểm của một số amylase: -amylase ( 1,4 glucan 4 glucanohydrolase, EC.3.2.1.1) -amylase là enzym có khả năng thuỷ phân tinh bột, amylose amylopectin, glycogen, dextrin, là một endoenzym, có ở nớc bọt và dịch tuỵ và cả ở máu, tham gia thuỷ phân tiêu hoá tinh bột một phần ở miệng, phần lớn là tiêu hoá tinh bột ở ruột non. -amylase cũng đợc phân lập từ hầu hết các động vật, các hạt nảy mầm và một số loài nấm nh Aspergillus oryzae, hoặc từ một số loại vi khuẩn không gây bệnh nh Bacillus subtilis. Cơ chế tác dụng: -amylase có khả năng phân cắt các liên kết -1,4- glucosid của cơ chất một cách ngẫu nhiên, tạo nên hỗn hợp gồm 70 - 90% maltose, một lợng nhỏ D-glucose và các -dextrin giới hạn phân tử lợng thấp (gồm 4 - 8 phân tử glucose và chứa một hoặc hơn một liên kết -1,6- glucosid). Các liên kết -1,6-glucosid trong chuỗi polysaccharid không bị phá vỡ bởi enzym này. Các giai đoạn của quá trình thuỷ phân tinh bột của -amylase: - Giai đoạn dextrin hoá: Tinh bột dextrin phân tử lợng thấp (4-8 liên kết glucosid) - Giai đoạn đờng hoá: Dextrin tetra- và trimaltose di- và monosaccharid Tổng quát : -5- Amylose oligosaccharid polyglucose Maltose maltotriose maltotetrose Khả năng dextrin hoá của -amylase rất cao, do đó ngời ta còn gọi - amylase là amylase dextrin hoá hay amylase dịch hoá. Tính chất: -amylase là một protein phức tạp có chứa Ca 2+ . -amylase có nguồn gốc khác nhau, thờng có thành phần acid amin không hoàn toàn giống nhau và mỗi loại -amylase từ một nguồn gốc cũng thờng có một tổ hợp các acid amin đặc hiệu riêng. Thành phần chung của các -amylase có chứa nhiều tyrosin, trytophan, acid glutamic và acid aspartic. Các acid amin có tính acid là glutamic và aspartic chiếm khoảng 1/4 lợng acid amin của phân tử enzym, nhng ngợc lại, -amylase có rất ít methionin và chỉ có 7 10 gốc cystein. Các - amylase có nguồn gốc khác nhau cũng có KLPT rất khác nhau: -amylase từ tuỵ động vật có KLPT là 4500 Da, trong khi đó -amylase từ Bacillus subtilis có tác dụng giống -amylase từ tuỵ động vật mà KLPT lại gấp đến 2 lần là 9900 Da [4], [6]. Nhìn chung, -amylase có một số đặc tính nh: + Protein của -amylase có tính acid yếu; dễ tan trong nớc, trong các dung dịch muối và cồn thấp độ. + Điểm đẳng điện của -amylase nằm trong vùng pH 4,2 - 5,7 [3]. + -amylase là một metaloenzym, mỗi phân tử -amylase đều có chứa 1- 30 nguyên tử gam Ca/mol, nhng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam Ca/mol. Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc ba của enzym, duy trì hoạt động của enzym [4]. + Hoạt động của -amylase đợc hoạt hoá bởi ion Cl - , bị kìm hãm bởi các kim loại nặng nh Cu 2+ , Ag + , Hg 2+ . pH tối thích là 6,9 (-amylase động vật); 4,7 -6- (di và monosaccharid) - 5,4 (-amylase thực vật mầm lúa); 5,0 - 6,0 (-amylase vi khuẩn Bacillus subtilis) [3]. + Độ bền nhiệt của các -amylase nguồn gốc khác nhau cũng không giống nhau, các -amylase nấm men và vi khuẩn bền với nhiệt hơn các -amylase động vật và thực vật [4]. -amylase ( 1,4 glucan maltohydrolase, EC.3.2.1.2 ) -amylase là enzym thuỷ phân tinh bột, hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là ở hạt nảy mầm. -amylase xúc tác sự thuỷ phân cắt từng phân tử maltose khỏi đầu không khử của chuỗi polysaccarid bằng cách phân cắt liên kết -1,4- glucosid. KLPT của -amylase là 152.000 Da và 215.000 Da, bị ức chế bởi iodoazobenzoat, iodoacetamid, ascorbat, các kim loại nặng nh Ag + , Hg 2+ , Cu 2+ , các thuốc thử có chứa nhóm SH. pH tối thích 4,0 5,0 [4]. -amylase chịu nhiệt kém hơn -amylase nhng bền với acid hơn, bị bất hoạt ở nhiệt độ 70 o C [4]. -amylase (glucoamylase, 1,4 glucan 4 glucanohydrolase, EC.3.2.1.3) -amylase là enzym này có khả năng thuỷ phân liên kết -1,4 lẫn -1,6 glucosid. Khi thuỷ phân liên kết -1,4-glucosid trong chuỗi polysaccharid, glucoamylase tách lần lợt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch polysaccharid. Ngoài các liên kết -1,4 và -1,6 glucosid, glucoamylase còn có khả năng thuỷ phân các liên kết -1,2 và -1,3 glucosid. Do đó, glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin, dextrin, maltose . thành glucose mà không cần có sự tham gia của các loại amylase khác [4]. -7- pH tối thích của glucoamylase nằm trong vùng acid nhẹ là 4,0-5,0 và cũng có loại glucoamylase có pH tối thích nằm trong vùng trung tính khoảng 6,0-7,5 [4]. ứ ng dụng: Với vai trò là enzym có tác dụng thuỷ phân polysaccharid, amylase đã đợc ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt may, y tế và nhiều lĩnh vực kinh tế khác. Trong công nghiệp thực phẩm để làm lỏng tinh bột, nấu rợu bia, chế tạo bánh kẹo. Trong Y Dợc, dùng để chế tạo glucose, dextrin uống và tiêm truyền, dùng làm thuốc chữa rối loạn tiêu hoá, bổ trợ tiêu hoá cho nhiều đối tợng khác nhau. Đặc biệt, gần đây ngời ta dùng amylase để hoá lỏng thức ăn nhằm tăng đậm độ dinh dỡng trên một thể tích thức ăn cho trẻ em SDD. Ngoài ra, cũng đã có những ý tởng sử dụng amylase nhằm mục đích chống viêm và phù nề mặc dù những ý tởng đó vẫn còn phải đ- ợc chứng minh trong thực tế. 1.1.2. Papain Papain [EC.3.4.1.21] là một trong các enzym thuỷ phân protein có nguồn gốc thực vật đợc nghiên cứu nhiều về tính chất và cơ chế hoạt động. Papain chủ yếu đợc tách chiết từ nhựa quả đu đủ xanh của cây đu đủ Carica papaya L. (Caricaceae). a- Cấu tạo hoá học: Papain là một endoprotease có chứa 16,1%N và 1,2%S [4]. Phân tử enzym có 212 acid amin trong đó không chứa methionin, khối lợng phân tử 23400 Da. Mạch polypeptid của Papain có đầu tận amin là isoleucin, đầu tận carboxyl là asparagin, phân tử có 3 liên kết disulfua (SS) đợc tạo bởi 6 gốc cystein và một -8- iminothiazolidin nhóm SH (sulfhydryl) tự do ở vị trí 25, các liên kết này không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc [4]. Thành phần chính của papain cha hoạt hoá là hỗn hợp protein cystein disulfid. Khi hoạt hoá papain bằng KCN sẽ giải phóng ra nhóm thiol của phân tử enzym và -thiocyanatalanin do sự tơng tác giữa cyanid và cystein. Sau đó, -thiocyanatalanin khép vòng tạo thành -iminothiazolidin. Khi có không khí, cơ chế trên xảy ra theo chiều ngợc lại tạo thành sản phẩm không hoạt hoá. Quá trình hoạt hoá papain không làm thay đổi cấu trúc không gian của nó [4]. SSCH 2 CH SH + S HCNH 2 S NH H 2 C CH Hình1: Sơ đồ cơ chế hoạt hoá papain bằng cyanid b- Cấu trúc không gian của papain: Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thớc của các trục chính trong cấu trúc không gian 3 chiều là: 36ì48ì36 o A , mạch polypeptid chính bị gấp khúc thành hai phần riêng biệt tạo nên một hốc đặc biệt. Trung tâm hoạt động nằm -9- COO thiocyanatalanin CN hoạt hoá O 2 N + H 3 COO CH 2 CH CN COO papa in papa in N + H 3 Papain hoạt động R R R R R R R R tại bề mặt của khe này, nhóm sulfhydryl hoạt động của cystein 25 nằm bên trái khe và nhóm histidin 159 nằm bên phải khe. Phần có cấu trúc xoắn chiếm khoảng 20% toàn bộ acid amin có trong phân tử [4]. c- Hoạt tính enzym và cơ chế tác dụng: Đặc điểm quan trọng nhất của papain là khả năng thuỷ phân protein đến tận acid amin. Papain thuỷ phân protein thành các polypeptid và các acid amin, đóng vai trò vừa nh một endopetidase vừa nh một exopeptidase [4]. Các endopeptidase thuỷ phân proein chủ yếu thành peptid: (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-) n + (HOH) (-NH-CH-COOH) i + (H 2 N-CH-CO-) k i + k = n Các exopeptidase thuỷ phân các peptid thành amino acid: (-NH-CH-CO-NH-CH-CO-) n + (HOH) (NH 2 -CH-COOH) n' + (H 2 N-CH-CO-) k' n' + k' = n So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác, papain có khả năng thuỷ phân sâu hơn, vì vậy nó đợc dùng để thuỷ phân tiếp các liên kết peptid còn lại sau khi đã thuỷ phân bằng pepsin, trypsin hay chymotrysin. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng, papain có khả năng phân huỷ hầu hết các liên kết peptid trừ các liên kết với prolin và với các acid glutamic có nhóm carboxyl tự do. d- Sự hoạt hoá papain: Papain cần có nhóm sulfhydryl tự do để thể hiện hoạt tính xúc tác. Do trung tâm hoạt động của papain có nhóm cystein 25 và nitrogen bậc 3 của histidin 159 có tính khử nên các chất đóng vai trò hoạt hoá papain là các chất có tính khử yếu nh: cystein, glutathion acid, hydrocyanid, hydrosulfid, natrithiosulfat . trong đó cystein thờng đợc dùng nhiều nhất. Khi có mặt của một trong các chất hoạt hoá này thì nhóm -SH ở trung tâm hoạt động của papain đợc phục hồi và làm tăng hoạt tính của papain. Sự hoạt hoá càng đợc tăng cờng -10-