Phương pháp phân tích hoá học nước biển

Ngày nay nghiên cứu hoá học biển không chỉ dựng lại ở việc xem xét hiện trạng

Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 PhÇn 1: Tỉng quan 1.1 Tỉng quan vỊ Tobramycin 1.1.1 C«ng thøc cấu tạo C18H37N5O9 PTL: 467.5 Tên khoa học: 4-O-(3-Amino-deoxy--D-glucopyranosyl)-2-deoxy-6-O-(2,6diamino-2,3,6-trideoxy--D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine [21] 1.1.2 Tính chất lý hóa Bột màu trắng trắng ngµ DƠ tan níc, rÊt khã tan ethanol, thực tế không tan cloroform ether Góc quay cực riêng []D20 : +1380 đến +1480[7] 1.1.3 Nguồn gốc ChiÕt xuÊt tõ m«i trêng nu«i cÊy Streptomyces tenebrarius, cã thể bán tổng hợp từ kanamycin B [7] 1.1.4 Dợc động học Tobramycin hầu nh không hấp thu qua đờng tiêu hoá nhng hấp thu tốt qua đờng tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch Thuốc liên kết với protein huyết t¬ng Do Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 phân tử phân cực mạnh nên khó vào mô kể nÃo Thuốc đạt nồng độ cao vá thËn Khi sư dơng cho phơ n÷ mang thai, thuốc tích lũy thai gây độc cho mẹ Tobramycin đào thải chủ yếu qua thận nên phải giảm liều suy thận, thờng dựa vào creatinin huyết để tránh độc tính Hiện nay, tobramycin đợc dùng với chế độ liều cao ngày Cách dùng cho thấy hiệu điều trị cao độc tính so với dùng liều nhỏ nhiều lần ngày nh trớc Đối với ca nặng (nhiễm Pseu aeruginosa ngời giảm neutrophile ca suy thận) cần khoảng cách liều dài 24 Thời gian bán thải tobramycin: - [6] 1.1.5 Tác dụng chế tác dụng Tobramycin kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng nhiều vi khuẩn Gr (-) hiÕu khÝ vµ mét sè vi khuÈn Gr (+) hiếu khí Thuốc tác dụng với Chlamydia, nấm, virus đa số vi khuẩn yếm khí Tobramycin rÊt gièng gentamycin vỊ tÝnh chÊt sinh häc vµ ®éc tÝnh: chóng cã cïng nưa ®êi th¶i trõ, nång ®é ®Ønh hut thanh, Ýt liªn kÕt víi protein, thể tích phân bố tiết chủ yếu qua lọc cầu thận Điểm quan trọng tobramycin có hoạt tính phần lớn chủng Pseudomonas aeruginose, mạnh gentamycin Cơ chế tác dụng: Tobramycin ức chế tổng hợp protein vi khuẩn nhậy cảm cách gắn không thuận nghịch với tiểu phân 30S ribosom [2], [11] 1.1.6 Chỉ định Đợc định bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tới tính mạng, đặc biệt với bệnh mà nguyên nhân cha rõ ràng bị nhiễm khuẩn huyết vi khuẩn Gr (-) Trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn nặng, bệnh nhiễm khuẩn nặng toàn thân Pseudomonas sp gây ra, tobramycin dùng phối hợp với kháng sinh nhóm beta-lactam Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Trong bệnh viêm nội tâm mạc Streptococcus faecalis alpha Streptococcus gây ra, dùng tobramycin phối hợp với ampicilin benzylpenicilin nhng phải tiêm riêng rẽ [2] 1.1.7 Chống định Ngời có tiền sử dị ứng với kháng sinh loại aminoglycosid, ngời nghe ngời có bệnh thận [2] 1.1.8 Dạng bào chế liều lợng Tobramycin sulphat: Dung dịch tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch 40 mg/ml (ngời lớn), 10 mg/ml (trẻ em) Bột pha tiªm 30 - 40 mg/lä Lä ml 0,3 % để nhỏ mắt Tuýp 3,5 g mỡ tra mắt 0,3 % Dạng thuốc hít qua đờng miệng máy dùng để điều trị nhiễm P aeruginosa đờng hô hấp bệnh nhân bị xơ nang hóa [11] 1.2 Một số phơng pháp định lợng Tobramycin 1.2.1 Định lợng tobramycin phơng pháp vi sinh 1.2.1.1 Phơng pháp [15] - Chñng vi khuÈn: Bacillus subtilis CMCC(B)63501 - Dung dịch đệm phosphat pH 7,8 0,1 Dikali hydrophosphat : 5,59 g Kali dihydrophosphat : 0,41 g - M«i trêng định lợng: Pepton : 5,0 g Cao thịt : 3,0 g Dikali hydrophosphat : 3,0 g Th¹ch : 15,0 - 20,0 g Níc cÊt : 1000 ml pH sau tiƯt trïng : 7,8 ± 0,2 - Chn bÞ dung dịch chuẩn thử sau tiến hành thử tÝnh kÕt qu¶ theo [15] Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 1.2.1.2 Phơng pháp [3] - Chđng vi khn: Bacillus pumilus NCTC 8241 - Dung dÞch ®Öm phosphat pH 8,0 ± 0,1 Dikali hydrophosphat : 16,75 g Kali dihydrophosphat : 0,523g - Môi trờng định lợng: Cao men bia : 3,0 g Pepton : 6,0 g Casein pancreatic : 4,0 g Glucose : 1,0 g Cao thịt : 1,5 g Thạch : 15,0 g Nớc cất : 100 ml pH sau tiÖt trïng : 8,2 0,2 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn thử Cân xác khoảng 25,0 mg tobramycin hòa tan dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để có nồng độ tobramycin xác khoảng 10 IU/ml; 20 IU/ml 40 IU/ml - Tiến hành thử tính toán kết theo phơng pháp hoạt lực kháng sinh - DĐVN III 1.2.1.3 Phơng pháp 3:[14], [20] - Xác định hoạt lực kháng sinh tobramycin phơng pháp vi sinh vật theo BP 2000 hay JP14 - Chñng vi khuÈn : Bacillus subtilis ATCC 6633 - M«i trêng nu«i cÊy : Môi trờng đặc - Dung dịch chuẩn Cân xác lợng tobramycin chuẩn, tơng đơng khoảng 25 mg (hiệu lực), hoà tan dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH thµnh chÝnh Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 xác 25 ml dung dịch chuẩn gốc Giữ dung dịch chuẩn gốc nhiệt độ từ 5C đến 15C sử dụng vòng 30 ngày Pha loÃng dung dịch dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH để đợc dung dịch có nồng độ 8àg/ml 2àg/ml (theo hiệu lực) - Dung dich thử: Cân xác lợng tobramycin, tơng đơng khoảng 25 mg (hiệu lực), hoà tan dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH thành xác 25ml Pha loÃng dung dịch dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH để đợc dung dịch có nồng độ 8àg/ml 2àg/ml (theo hiệu lực) 1.2.2 Định lợng tobramycin phơng pháp đo quang phổ hấp thụ UVVIS 1.2.2.1 Phơng pháp 1: [4] Cân lợng tobramycin sulfat tơng ứng với khoảng 0,3 g tobramycin nguyên liệu , cho vào bình định mức có dung tích 100 ml, bổ sung nớc cất lần vừa đủ đến vạch, trộn Lấy ml dung dịch cho vào bình định mức có dung tích 20 ml, thêm ml dung dịch NaOH 0,01N, ml dung dịch KMnO Dung dịch vừa pha đem đun cách thủ ë 400C 60 Song song tiÕn hµnh điều chế dung dịch chuẩn cách dùng chất đối chiếu tobramycin Mẫu trắng tiến hành nh mẫu thử nhng tobramycin Sau đun cách thuỷ 400C, thêi gian 60 phót, ®em ®o mËt ®é quang cđa dung dịch bớc sóng 425 nm, cuvet dày 1cm 1.2.2.2 Phơng pháp 2: [19] Dựa sở tạo sản phẩm mầu xanh với 3-methyl-2 benzothiazolinon hydrazon hydrochlorid FeCl3 Sản phẩm có độ hấp thụ lớn 645 nm Định luật Lambert-Beer đợc áp dụng khoảng nồng độ từ 50-500 mUI/ml 1.2.3 Định lợng tobramycin phơng pháp HPLC 1.2.2.1 Phơng pháp [14] Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 - Cét styren - divinylbenzen copolymer (4,6 x 250 mm, 8àm) - Nhiệt độ cột: 55 0C - Pha động: Hỗn hợp pha 1l nớc đà loại CO2 gồm: 52 g natri sulfat khan; 1,5 g natri octansulfonat; ml tetrahydrofuran 50 ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2 M đà đợc chỉnh pH 3,0 acid phosphoric - Tốc độ dòng: ml/phút - Dung dịch thêm vào sau cột: Dung dịch natri hydroxyd 2% pha nớc đà loại CO2 Tốc độ 0,3 ml/phút - Detector: Detector ampe kế thiết bị tơng tự - Thể tích tiêm: 20 àl - Nồng độ dung dịch chuẩn thử: 0,1 mg/ml 1.2.2.2 Phơng pháp [20], [23] - Cét RP 18 (3,9 mm x 30 cm) - Pha động: Hòa tan 2,0 g tris (hydroxymethyl) aminomethan khoảng 800 ml nớc, thêm vào dung dịch 20 ml dung dịch acid sulfuric 1N, sau pha loÃng acetonitril tới 2000 ml, lắc - Thuốc thư 2,4-dinitrofluorobenzen: Dung dÞch 2,4dinitrofluorobenzen 1% ethanol 96% - Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút - Detector UV: 365 nm - Thể tích tiêm: 20 àl - Nồng độ dung dịch chuẩn thử: Khoảng 0,22 mg/ml dung dịch acid sulfuric 0,004 N - Các dung dịch chuẩn thử đợc tạo dẫn xuất với thuốc thử 2,4dinitrofluorobenzen tris (hydroxymethyl) aminomethan trớc tiêm sắc ký 1.2.2.3 Phơng pháp [15] - Cột Purospherđ STARRP-18e (4 x 55 mm, àm, Merck) - Pha động: Acetonitril - níc (50:50) Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 - Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút - Detector UV: 230 nm - Nồng độ dung dịch chuẩn thử: Khoảng àg/ml nớc - Dung dịch chuẩn dung dịch thử đợc tạo dẫn xuất với dung dịch thc thư 1-naphthyl isothiocyanat pyridin ë 700C 1.2.2.4 Ph¬ng pháp [16] - Cột Xterrađ RP - 18 (2,1 x 250 mm, àm) - Nhiệt độ cột: 30 0C - Pha động A: Thêm 0,7 ml dung dịch amoni hydroxyd 28 - 30 % vµo lÝt níc Milli - Qđ Sử dụng dung dịch natri hydroxyd 2,5 N ®Ĩ chØnh pH pha ®éng A ®Õn 11,0 - Pha động B: Acetonitril - Tiến hành sắc ký theo chơng trình gradient dung môi nh sau: Thời gian (phút) 10 Pha ®éng A Pha ®éng B (%) 100 (%) 100 - Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút - Detector: Khối phổ - Thể tích tiêm: 4àl - Nồng độ dung dịch chuẩn thử: Khoảng 0,35 mg/ml dung dịch NaCl 0,9 % 1.2.2.5 Phơng pháp [15] - Cét Ultrasphera RP (4,6 x 250 mm, 5àm) - Pha động: Acetonitril - đệm phosphat 0,05 M pH 3,5 [62:38] - Tốc độ dòng: 2,5 ml/phút - Thc thư t¹o dÉn chÊt: Acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfomic Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 - Detector UV: 340 nm - Thể tích tiêm: 20 àl - Nồng độ dung dịch chuẩn thử: Khoảng 0,02 mg/ml đệm phosphat pH 7,4 - Dung dịch chuẩn thử đợc tạo dẫn xuất với thuốc thử acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfomic 70 0C 1.2.2.6 Phơng pháp [5] - Cột : RP -18 brava ODS (150 x 4,6 mm,5µm) - Detector huúnh quang : Ex/Em= 338 nm/ 455 nm - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Tốc độ thuốc thử: 0,7ml/phút - Thể tích tiêm: 20 àm - Pha động: Hoà tan 17,75 g natri sulfat khan ; 3,05g natri pentansulfonat 1ml acid acetic băng 1000 ml nớc, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45àm - Thuốc thử tạo dÉn xuÊt sau cét: Hoµ tan 0,5g o-phthalaldehyd 100 ml methanol, thêm 1,0 ml 2-mercaptoethanol, lắc phút Thêm 1,5 ml dung dịch polyoxyethylen lauryl ether 12% 350 ml dung dịch đệm borat pH 10,4 lắc - Dung dịch đệm borat pH 10,4: Hoà tan 24,64 g acid boric 900 ml nớc Điều chỉnh pH đến 10,4 dung dịch NaOH 40%, thêm nớc tới vừa đủ 1000 ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 àm (pha theo BP 2005) 1.2.2.7 Phơng pháp [9] ã Dung dịch thử Cân xác khoảng 20,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình định mức 20,0 ml Hòa tan pha loÃng nớc vừa đủ đến vạch Lấy xác 5,0 ml dung dịch cho vào bình định mức 20,0 ml Thêm 0,5 ml thuốc 10 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 thö X, đem đun cách thủy 80 0C 60 phút Thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 àm ã Dung dịch chuẩn (đối chiếu) Tiến hành tơng tự nh dung dịch thử nhng thay tobramycin nguyên liệu tobramycin chuẩn (đối chiếu) - Cét s¾c ký Nucleosil C18 (250 x mm, 5µm) - Detector UV : λ = 215 nm - Pha động: Methanol : Đệm phosphat 0,01 M pH = 20 : 80 - Thể tích tiêm: 10 àl - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút - Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm * Nhận xét: Qua phơng pháp định lợng nêu trên, nhận thấy: - Định lợng phơng pháp vi sinh: Rẻ, đơn giản, không cần trang thiết bị phức tạp nhng có nhợc điểm lớn nhiều thời gian dặc hiệu có mặt chất kháng vi sinh vật khác, tính xác không cao - Định lợng phơng pháp đo độ hấp thụ UV-VIS: Có độ xác cao, tiến hành đơn giản, không yêu cầu máy móc phức tạp, hoá chất thông dụng áp dụng định lợng sở kiểm nghiệm nớc Tuy nhiên, nhợc điểm phơng pháp là: Tính đặc hiệu cha cao (sự có mặt chất khác có khả hấp thụ tử ngoại khả kiến nh benzalkonium clorid, chÊt b¶o qu¶n hay dïng, sÏ ¶nh hëng kÕt qu¶ định lợng), phải dùng thuốc thử nhập ngoại để tạo dẫn chất - Định lợng phơng pháp HPLC : u điểm: Nói chung có tính đặc hiệu cao, tách riêng đợc hoạt chất Nhợc điểm: Tiến hành phức tạp, đòi hỏi có trang thiết bị thuốc thử đắt tiền detector UV thờng không dùng đợc mà thờng phải tạo dẫn chất 11 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Phơng pháp HPLC pha đảo với detector UV hay sử dụng để phân tích hợp chất phân cực hấp thụ UV Nhng với hợp chất hấp thụ UV yếu nh tobramycin thờng phải tạo dẫn chất, phải sử dụng detector loại đặc biệt đắt tiền Vì vậy, với trang thiết bị sẵn có phòng thí nghiệm, đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng quy trình định lợng tobramycin phơng pháp HPLC đơn giản, dễ thực kinh phí thấp hơn, không sử dụng thuốc thử tạo dẫn xuất nh phơng pháp với hi vọng đa vào sử dụng công tác kiểm nghiệm - góp phần quản lý chất lợng sản phẩm chứa tobramycin 1.3 Tổng quan phơng pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) 1.3.1 Nguyên tắc Phơng pháp HPLC phơng pháp phân tích hóa lý, dùng để tách định lợng thành phần hỗn hợp dựa ¸i lùc kh¸c gi÷a c¸c chÊt víi pha tiếp xúc nhng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu cao) pha động (dung môi rửa giải) Khi dung dịch hỗn hợp chất cần phân tích đa vào cột, chúng đợc hấp phụ phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào chất cột chất cần phân tích Khi ta bơm dung môi pha động vào cột tùy thuộc vào lực chất với hai pha, chóng sÏ di chun qua cét víi vËn tốc khác dẫn đến phân tách Các chất sau khỏi cột đợc phát phận phát gọi detector đợc chuyển qua bé xư lý kÕt qu¶ KÕt qu¶ ci cïng đợc hiển thị hình đa máy in [8] 1.3.2 Cơ sở lý thuyết Quá trình phân tách kỹ thuật HPLC trình vận chuyển phân bố chất tan pha khác Khi pha động di chuyển với tốc độ định qua cột sắc ký đẩy chất tan bị pha tĩnh lu giữ khỏi cét 12 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 1.3.5.3 Chọn đệm pH Trong sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính acid hay base thờng phải thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho trình sắc ký Giá trị pH thích hợp làm tăng hiệu lực tách sắc ký [12], [18] 1.3.5.4 Tốc độ dòng Sau có pha tĩnh, pha động, pH thích hợp yếu tố cần lựa chọn để trình tách tốt tốc độ dòng [12], [18] 1.3.6 Cách đánh giá pic * Đánh giá diƯn tÝch pic: DiƯn tÝch cđa mét chÊt t¬ng øng với tổng lợng chất Để tính diện tích pic, ngời ta thờng dùng máy tích phân điện tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) máy phân tích học (sai số 1,3 %) Phơng pháp dùng cho pic không bị trôi đờng pic có đờng bị trôi Phơng pháp cần điểm đầu điểm cuối pic đợc nhận xác cho cho kết tốt với nồng độ vừa, trung bình cao * Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi chiều cao pic (khoảng cách đờng đỉnh pic) đại lợng tỷ lệ với diện tích pic dùng để đánh giá phổ Phơng pháp áp dụng số k' định 1.3.7 ứng dụng HPLC Sắc ký nói chung HPLC nói riêng có ba ứng dụng chính: 1.3.7.1 Định tính thử độ tinh khiết: Thời gian lu chất thử sắc đồ phải tơng ứng với thời gian lu chất chuẩn đối chiếu sắc ký đồ 1.3.7.2 Sắc ký điều chế: Qua qúa trình sắc ký chất đợc tách dịch rửa giải đợc hứng riêng cho bốc dung môi thu lấy chất 1.3.7.1 Định lợng: 19 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Sắc ký lỏng hiệu cao có ứng lớn định lợng chất hỗn hợp xác định giới hạn tạp chất Các phơng pháp định lợng sắc ký dựa nguyên tắc: nồng độ chất tỷ lệ với chiỊu cao hc diƯn tÝch pic cđa nã Mét sè phơng pháp định lợng hay áp dụng HPLC: Phơng pháp chuẩn ngoại (external standard method) Đây phơng pháp định lợng hai mẫu chuẩn mẫu thử đợc tiến hành sắc ký điều kiện Sau đem so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic thu đợc từ mẫu thử víi pic cđa mÉu chn ®· biÕt nång ®é  Phơng pháp chuẩn nội (internal standard method) Là phơng pháp cho thêm lợng giống chất chuẩn thứ hai có thời gian lu đáp ứng gần giống mẫu thử vào mẫu chuẩn mẫu thử tiến hành sắc ký Chất chuẩn thứ hai gọi chất chuẩn nội Phơng pháp chuẩn hóa diện tích pic (area normalisation) + Nguyên tắc: Hàm lợng phần trăm chất hỗn hợp nhiều thành phần đợc tính tỷ lệ phần trăm diện tích pic so với tổng diện tích tất pic thành phần sắc đồ Phơng pháp yêu cầu tất thành phần đợc rửa giải đợc phát hiện, tất thành phần ®Ịu cã ®¸p øng detector nh + Áp dơng: dùng để định lợng, dùng xác định hàm lợng tạp chất coi đáp ứng chÊt lµ nh [12], [18] 20 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Phần 2: thực nghiệm kết 2.1 Nguyên vật liệu phơng pháp thực nghiệm 2.1.1 nguyên vật liệu : 2.1.1.1 nguyên liệu hoá chất: - Nguyên liệu: Tobramycin công ty CPDP Hà Tây - Chất đối chiếu: Tobramycin viện kiểm nghiệm trung ơng, hàm lợng 94,96% - KH2PO4 (PA) - H3PO4 (PA) - Methanol dïng cho HPLC (Meck) - Níc cất tinh khiết lần - Một vài hoá chất khác 2.1.1.2 Dụng cụ: - Máy sắc ký lỏng hiệu cao: DIONEX - detector UV Diode array PDA 100 - M¸y quang phỉ UV- VIS Lambda EZ210 - M¸y siêu âm SONOREX - Cân phân tích Mettler AB 204 có độ xác 0,1mg - Máy lọc chân không Satorius - Bình định mức loại - Cốc có mỏ - Pipet xác, pipet thờng - Lọ đựng mẫu, màng lọc 0,45 àm 2.1.2 Nội dung phơng pháp nghiên cứu 2.1.2.1 Phơng pháp nghiên cứu - Tham khảo phơng pháp định lợng tobramycin đà công bố 21 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 - Tham khảo phơng pháp định lợng tobramycin HPLC - Dựa vào cấu tạo phân tử, tính chất hoá lý cđa tobramycin cịng nh ®iỊu kiƯn thùc nghiƯm cđa nớc ta để xây dựng quy trình kỹ thuật định lợng tobramycin HPLC 2.1.2.2 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu điều kiện tiến hành để xây dựng phơng pháp: Chọn cột, pha động, bớc sóng phát tốc độ dòng, thể tích tiêm thích hợp để định lợng Xây dựng, đánh giá phơng pháp định lợng tobramycin nguyên liệu - Khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký - Đánh giá phụ thuộc tuyến tính nồng độ tobramycin diện tích pic sắc ký đồ - Đánh giá tính xác phơng pháp - Đánh giá tính phơng pháp - Đánh giá tính đặc hiệu phơng pháp Một số công thức tính toán xử lý thống kê kết x= - Giá trị trung bình: n n i =1 x i ∑ (x − x) n S= - §é lƯch chuÈn: - Sai sè chuÈn: s x = n −1 x = (2.2) S ×100 x (2.3) S n (2.4) ( %) = - Sai số tơng đối: - Kho¶ng tin cËy x 22 i i =1 s - Độ lệch chuẩn tơng đối (RSD): (2.1) t ( n −1) ± tαSx × sx × 100 x (2.5) (2.6) Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 2.2 thực nghiệm kết 2.2.1 Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lợng tobramycin phơng pháp HPLC 2.2.1.1 Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký Chọn phơng pháp sắc ký: Tobramycin sulfat chất hữu phân cực, tan nhiều nớc Vì vậy, để phân tích định lợng tốt, chọn phơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo Chọn cột sắc ký: Trong phơng pháp định lợng HPLC pha đảo, cột sắc ký thông dụng Nucleosil C8, C18, Với điều kiện sẵn có phòng thí nghiệm chóng t«i sư dơng cét Nucleosil C18 (250 x mm, àm) Chọn pha động: Trong phơng pháp HPLC pha đảo, pha động thông dụng acetonitril, methanol, nớc hay hỗn hợp methanol, acetonitril với nớc Do tobramycin sulfat tan nhiều nớc, để rút ngắn thời gian lu thích hợp chất cần phân tích, pha động cần phải có nớc, để chuyển tobramycin sang hết dạng ion cần sử dụng đệm pH acid Chọn bớc sãng: cÊu tróc tobramycin cã nhãm amin (-NH2), nhiên khả hấp thụ UV tobramycin không cao bớc sóng nghiên cứu dự kiến bớc sóng thấp 2.2.1.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc kí: a Khảo sát chọn bớc sóng thích hợp Để xác định bớc sóng thích hợp phát tobramycin, tiến hành quét phổ UV dung dịch tobramycin 0,2 mg/ml máy quang phổ UVVIS Lambda EZ210 Tiến hành: Cân xác khoảng 20 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình định mức 100,0 ml, thêm nớc vừa đủ đến vạch lắc Quét phổ hấp thụ tử ngoại dung dịch Kết ghi hình 23 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Tobra 0,02% A b s 200 250 300 nm H×nh 1: Phỉ hÊp thơ cđa dung dÞch tobramycin 0,02% NhËn xÐt: Tõ phỉ hÊp thụ dung dịch tobramycin thấy: Cực đại hấp thụ dung dịch chất khoảng 194 nm Để giảm ảnh hởng dung môi tạp chất nhng đảm bảo định lợng đợc tobramycin chọn bớc sóng đo 195 nm b Lựa chọn cét: Sư dơng cét Nucleosil C18 (250x4 mm), cì h¹t àm sẵn có môn Hoá dợc, trờng đại học Dợc Hà Nội c Lựa chọn đệm: Chúng tiến hành khảo sát pha động dung dịch đệm phosphat 0,01M pH khác nhau, kết cho thấy: Với pH=3,5 hệ số bất đối pic tobramycin 2,95 Với pH=3,0 hệ số bất đối pic tobramycin 1,53 Với pH=2,5 hệ số bất đối pic tobramycin 1,49 Nhận xét: Khi pH giảm, hệ số bất đối giảm, pic tobramycin tách tốt cân xứng Tuy nhiên, dễ thấy hệ số bất đối pic tobramycin pH 3,0 pH 2,5 24 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 khác biệt không đáng kể Trong đó, sử dụng pH 2,5 làm giảm tuổi thọ cột ®· lùa chän ®Ưm phosphat 0,01 M, pH 3,0 ®Ĩ khảo sát tiếp d Lựa chọn pha động: Để chọn đợc hệ pha động phù hợp đà tiến hành khảo sát điều kiện sắc kí: Tốc độ dòng 1,0 ml/phút, nồng độ chất chuẩn tobramycin 3,0 mg/ml, thể tích tiêm 20àl hệ pha động với thành phần gồm acetonitril đệm phosphat pH 3,0 víi c¸c tØ lƯ kh¸c Theo dâi sù thay đổi hệ số bất đối pic tobramycin, kết thu đợc ghi bảng 1: Bảng 1: Giá trị hệ số bất đối pic tobramycin khảo sát lựa chọn pha động Acetonitril 20 10 §Ưm pH 3,0 80 90 95 100 HƯ sè bÊt ®èi 2,43 2,02 1,75 1,52 NhËn xÐt: Víi pha động 100% đệm phosphat 0,01 M pH 3,0 cho pic gọn, cân xứng, hệ số bất đối thấp Kết luận: Pha động đợc chọn để nghiên cứu định lợng tobramycin 100% đệm phosphat 0,01 M pH 3,0 e Lựa chọn tốc độ dòng Tiến hành sắc kí với điều kiện đà chọn nhng với tốc độ dòng thay đổi 1,0 ml/phút; 0,8 ml/phút: 0,6 ml/phút Kết nh sau: Với tốc độ dòng 0,6 ml/phót thêi gian lu cđa tobramycin lµ 2,95 Với tốc độ dòng 0,8 ml/phút thời gian lu tobramycin 2,32 phút Với tốc độ dòng 1,0 ml/phót thêi gian lu cđa tobramycin lµ 1,86 25 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 NhËn xét: Với tốc độ dòng 1,0 ml/phút thời gian lu ngắn nên chất cần tách bị rửa giải thời gian gần với thời gian chết, tách không tốt Với tốc độ dòng 0,8 ml/phút pic tobramycin pic tạp bị chồng phủ phần, hiệu lực tách Với tốc độ dòng 0,6 ml/phút kết tách tốt, pic cân đối, thời gian phân tích tR= 2,95 phút thời gian chạy sắc ký phù hợp Kết luận: Chọn tốc độ dòng 0,6 ml/phút để nghiên cứu định lợng tobramycin đ Điều kiện sắc ký lựa chọn Từ kết khảo sát, đà xây dựng quy trình sắc kí có khả phân tích tốt tobramycin nguyên liệu nh sau: - Cột Nucleosil C18 (250x4,6 mm, 5àm) - Pha động: Đệm phosphat 0,01M pH - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút - Thể tích tiêm: 30 àl - Detector UV: Bớc sóng đo 195 nm - Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng 2.2.2 Qui trình định lợng 2.2.2.1 Khảo sát tính thích hợp hệ thống Cân xác khoảng 30,0 mg tobramycin đối chiếu cho vào bình định møc 10,0ml Hoµ tan vµ pha lo·ng b»ng níc võa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 àm, dùng dịch lọc tiêm sắc ký Tiêm lần mẫu đối chiếu vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký theo điều kiện đà chọn Ghi kết quả: thời gian lu, diện tích hệ số bất đối pic tobramycin Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký đợc trình bày nh b¶ng 26 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Bảng 2: Kết khảo sát tính thích hợp cđa hƯ thèng STT RSD(%) NhËn xÐt: Thêi gian lu (phót) 2,94 2,95 2,96 2,96 2,96 0,30 Pic cđa tobramycin DiƯn tÝch pic (mAU) 12,2985 12,3001 12,2805 12,2230 12,1916 0,40 HƯ sè bÊt ®èi (AF) 1,52 1,53 1,51 1,52 1,52 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống HPLC cho thấy: Độ lệch chuẩn tơng đối (RSD %) thời gian lu diện tích pic phép thử 0,30 0,40 nhỏ 2% Các giá trị cđa hƯ sè bÊt ®èi giao ®éng tõ 1,51 ®Õn 1,53 Kết luận: Hệ thống HPLC mà sử dụng thích hợp để định lợng tobramycin nguyên liệu 2.2.2.2 Xây dựng phơng pháp định lợng a Dung dịch thử Cân xác khoảng 30,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình định mức 10,0 ml Hoà tan pha loÃng nớc vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 àm b Dung dịch chuẩn (đối chiếu) Cân xác khoảng 30,0 mg tobramycin đối chiếu, cho vào bình định mức 10,0 ml Hoà tan pha loÃng nớc vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 àm c Mẫu trắng: Nớc cất lần, lọc qua màng lọc 0,45 àm, siêu âm đuổi khí 15 phút d Pha động: Dung dịch đệm phosphat 0,01 M, pH 3,0 27 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Cách pha: Hoà tan 0,68g KH2PO4 níc vµ pha lo·ng b»ng níc vừa đủ 500 ml Điều chỉnh pH 3,0 H3PO4 đặc Lọc qua màng lọc 0,45àm, siêu âm đuổi khí 15 phút 2.2.2.3 Điều kiện sắc ký - Cột Nucleosil C18 (250 x 4,6 mm; 5àm) - Pha động: Đệm phosphat 0,01 M pH 3,0 - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút - Thể tích tiêm: 30 àl - Detector UV 195 nm - Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng 2.2.2.4 Tính kết Ghi diện tích pic thu đợc sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử tơng ứng Tính hàm lợng % tobramycin có mẫu thử theo công thức sau: A ìm ìP A ×m Trong ®ã: t c c %X = t At, Ac diện tích pic tơng ứng mẫu thử mẫu chuẩn mt, mc lợng cân tơng ứng cđa mÉu thư vµ mÉu chn (mg) P lµ hµm lợng % ghi nhÃn tobramycin chuẩn 2.2.3 Định lợng tobramycin nguyên liệu phơng pháp xây dựng Chuẩn bị cho hệ thống HPLC chạy ổn định với pha động 30 phút Tiêm lần lợt 30 àl dung dịch đà chuẩn bị vào hệ thống sắc ký Tiến hành định lợng mẫu thử mẫu chuẩn tobramycin theo điều kiện đà chọn Ghi giá trị diện tích pic thu đợc sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử tơng ứng Kết định lợng đợc trình bày bảng Bảng : Kết định lợng tobramycin nguyên liệu Khối lợng cân (mg) 29,6 Diện tích pic(mAU.min) 11,9207 28 Hàm lợng % 90,97 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 29,7 29,9 30,1 30,3 m( chuÈn) =29,0 90,95 90,02 90,03 90,17 94,96 11,9585 11,9165 11,9975 12,0954 12,1916 Số liệu thống kê: X = 90, 43 Giá trị trung bình Độ lệch chuẩn : S = 0,46 Độ lệch chuẩn tơng đối : RSD = 0,51% Sai số chuÈn : Sx= 0,21 ∆X = tα ( n −1) × S x = 0,5962 Kho¶ng tin cËy = 90,43 0,59 Kết luận: Kết trình bày bảng cho thấy nguyên liệu tobramycin đem định lợng có hàm lợng là: 90,43% 0,59 % 2.2.4 Đánh giá phơng pháp định lợng Chúng tiến hành đánh giá phơng pháp định lợng tobramycin nguyên liệu HPLC xây dựng dựa vào tiêu sau - Đánh giá tính tuyến tính - Đánh giá tính xác - Đánh giá tính - Đánh giá tính đặc hiệu 2.2.4.1 Tính tuyến tính Tiến hành khảo sát phụ thuộc tuyến tính nồng độ với diện tích pic dẫn chất tobramycin (tính theo lợng tobramycin đa vào) chất chuẩn tobramycin Cách pha: Cân xác khoảng 375 mg tobramycin chuẩn cho vào bình định mức 50,0 ml Hoµ tan vµ pha lo·ng b»ng níc võa đủ đến vạch Dung dịch 29 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 thu đợc có nồng độ 7,5 mg/ml Tiến hành pha loÃng theo bảng để thu đợc dung dịch có nồng độ lần lợt 2,4; 2,7; 3,0; 3,3; 3,6 mg/ml Läc qua mµng läc 0,45àm Bảng : Cách pha dung dịch để khảo sát khoảng tuyến tính Bình Tobramycin (mg) 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 Níc cÊt võa ®đ (ml) 25 25 25 25 25 Nång ®é (mg/ml) 2,4 2,7 3,0 3,3 3,6 Tiêm lần lợt 30 àl dung dịch đà chuẩn bị vào hệ thống sắc ký Tiến hành sắc ký theo điều kiện đà chọn Ghi gía trị diện tích pic đo đợc ứng với nồng độ dung dịch Kết khảo sát khoảng tuyến tính đợc trình bày bảng Bảng : Kết khảo sát khoảng tuyến tính Nồng độ (mg/ml) Diện tích pic (mAU.min) 2,4 9,6023 2,7 3,0 3,3 3,6 10.7959 12,0322 13,1989 14,3825 Từ kết thu đợc bảng thiết lập mối tơng quan diện tích pic thu đợc sắc ký đồ nồng độ dung dịch (tính theo lợng tobramycin đa vào) Phơng trình hồi quy biểu thị mối tơng quan là: y= 3,9878 x + 0,039 víi hƯ sè t¬ng quan r= 0,9999 Độ lệch chuẩn y_intercept: Sb= 0,064 Khoảng tin cậy 95% cña y_intercept: 0,039 ± 0,204 hay -0,165 ≤ y_intercept 0,243 chứa gốc toạ độ Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ dung dịch diện tích pic tobramycin đợc ghi hình 30 Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel : 0918.775.368 Hình : Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ dung dịch diện tích pic tobramycin Từ kết thu đợc hình cho thấy: ã Tất giá trị thu đợc nằm đờng hồi quy phân bố đồng phía đờng hồi quy ã Hệ số tơng quan r= 0,9999 ã Khoảng tin cậy y_intercept chứa gốc toạ độ Nhận xét: Phơng pháp tuyến tính khoảng nồng độ khảo sát từ 2,4 đến 3,6 mg/ml (tính theo lợng tobramycin đa vào) hay tuyến tính khoảng nồng độ từ 80 % đến 120% nồng độ làm việc 2.2.4.2 Tính xác Nguyên tắc: Tính xác phơng pháp đợc đánh giá ®é lƯch chn t¬ng ®èi cđa phÐp thư song song Cách tiến hành kết đợc trình bày nh phần 2.2.3 Kết thử độ xác phơng pháp cho thấy điều kiện sắc ký đà chọn độ lệch chuẩn tơng đối kết qu¶ rÊt nhá (RSD = 0,51% sai số định) Kết luận: Qua kết ta thấy phơng pháp khoảng khảo sát 2.2.4.4 Tính đặc hiệu Để khảo sát tính đặc hiệu phơng pháp tiến hành nh sau: Chuẩn bị mẫu trắng (nớc cất hai lần) mẫu thử Tiến hành sắc ký mẫu trắng mẫu thử theo quy trình đà chọn Sắc ký đồ mẫu trắng mẫu thử đợc trình bày nh hình 33 ... giá diện tích pic: Diện tích chất tơng ứng với tổng lợng chất Để tÝnh diÖn tÝch pic, hiÖn ngêi ta thêng dïng máy tích phân điện tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) máy phân tích học (sai... tobramycin phơng pháp HPLC 2.2.1.1 Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký Chọn phơng pháp sắc ký: Tobramycin sulfat chất hữu phân cực, tan nhiều nớc Vì vậy, để phân tích định lợng tốt, chọn phơng pháp sắc... (dung môi rửa giải) Khi dung dịch hỗn hợp chất cần phân tích đa vào cột, chúng đợc hấp phụ phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào chất cột chất cần phân tích Khi ta bơm dung môi pha động vào cột tùy thuộc