Tổng quan về các mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm của thuốc

Tổng quan về các mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm của thuốc Tác giả: Lê Thị Nga Từ khóa Chủ đề: thuốc chống viêm dược lý Mô tả: tổng quan các mô hình nghiên cứu tác dụng chống viêm của thuốc, đánh giá các mô hình, bước đầu lựa chọn các mô hình phù hợp với điều kiện thực tế ở Việt Nam Nhà xuất bản: ĐHDHN Ngày tháng: 2008 Loại hình, kiểu: Khóa luận Mô tả vật lý: 56 Tr

Trang 1

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ NGA

TỔNG QUAN VỀ CÁC MƠ HÌNH NGHIÊN CỨU “TÁC DỤNG CHONG VIÊM CỦA THUỐC

(KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SŸ KHĨA 2003-2008)

Người hướng dẫn : TS Đào Thị Vui Nơi thực hiện : Bộ mĩn Được lý

Trường đại học Dược Hà Nội “Thời gian thực hign: 02/2008- 05/2008

HÀ NỘI, THÁI

Trang 2

LOY CATT OR

"Để cĩ hết quả bảo cáo như ngày hơm nay, tơi xin bay lỗ lịng biết ơn sâu sắc tới Yă Đào Thị Vui - Rgười tháy đã tận tinh diu dat va

hướng dẫn tơi hồn thành Rhĩa luận này

Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cơ giáo trong Hộ mơn Được lý đã tạo mọi điều hiện và nhiệt tình giúp đỡ tồi trong suốt thời gian học tập và làm khĩa luận

Tơi xin chan thành cảm ơn tập thể Yhư viện trường Đại ]ọc Được

Tha Roi đã giúp đỡ tơi rất nhiều trong quá trình làm hĩa luận này Tơi xin chân thành cảm on Tan giám hiệu trường Đại Tiọc Được Tià Rội đã luơn tạo mọi điều hign thuận lợi cho tơi hồn thành tốt khĩa luận

'Và cuối cùng tơi xin bày tổ lịng biết ơn vỏ hạn tới gia đình người

thân và bạn bè là những người luơn cổ vũ động viền là chỗ dựa tinh thần cho tơi những lúc kho hain Irong học tập và cuộc sống

Trang 3

MUC LUC

ĐẶT VẤN ĐỀ

1 VIÊM VÀ THUỐC CHONG VIEM 1.1 ĐẠI CƯỜNG VỀ VIÊM

1.1.1 Khái

1.1.2 Nguyên nhân gây viêm 1.1.4, Phân loại

1.1.4, Diễn biến phản ứng viêm 1.1.5 Các yếu tố tham gia vào

1.2 THUỐC CHỐNG VIÊM

12.1 Hĩa được chống viêm

1.2.2 Đơng được chống viêm a sone V4 2 MỘT SỐ MƠ HÌNH NGHIÊN CỨU TÁC DUNG CHONG VIÊM

CỦA THUỐC —-16

2.1 Mơ hình gây viêm cấp và bán cấp, 2.1.1 Mơ hình gây phù bàn chân chuột

2.1.2 Mơ hình gây phù tai chuột

2.1.3 Mơ hình gây tảng tính thấm thành mạch 2.1.4 Mơ hình gây viêm màng phí

2.1.5 Mơ hình gây ban đỏ 2.1.6, Mơ hình tạo túi u hạt

2.2 Mơ hình gây viêm mạn tính 26 2.2.1, Mo hinh gây u hạt thực nghiệm

2.2.2 Mơ hình gây viêm đa khớp thực nghiệm 2.3 Mo hình nghiên cứu cơ chế chống viêm

2.3.1 Gây kết tập bạch cầu da nhân

Trang 4

2.3.3 Thí nghiệm về các chất chuyển hĩa của acid arachidonic 2.3.4 Gay giải phĩng các cytokin từ tế bào bạch cầu

3 BAN LUAN

3.1, Ban lugn về mơ hình nghiên cứu tác dụng chống viêm của thuốc 3.1.1.Mơ hình gây viêm cấp và bán cấp, S08 E026 3.1.2 Mơ hình gây viêm mạn tính

39 3.1.3.Mơ hình nghiên cứu cơ chế chống viêm -. 40 3.2 Hướng lựa chọn mơ hình nghiên cứu thuốc chống viêm ở Việt Nam 42 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

4.1 Kết luận 4:2 Để xuấ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Trang 5

COX-1 COX-2 DMSO FMLP Lt 1-6 1-8 LOX LPS LTB, NSAIDs PAF

CHU THICH CAC TUVIET TAT Cyclooxygenase-1 Cyctooxygenase-2 Dimethyl Sulfoxid Formyl-L-methionyl-L-leucyl-Lphenylamin Interleukin-1 Interleukin-6 Interleukin-8 Lipooxygenase Lipopolysaccharid Leucotrien By

'Non-Seroidal Anti-Inflammatory Drugs-Thuốc chống viêm khơng steroid Platelet Acti Prostaglandin Prostaglandin E, Prostaglandin E, Prostaglandin Ey

ting Eactor- yếu tố hoạt hĩa tiểu cầu

Prostacyclin

Trang 6

DAT VAN DE

Viêm là một hiện tượng bệnh lý phổ biến theo thống kẻ cĩ 1/3 bệnh nhân đến khám hay nhập viện là cĩ tình trạng viêm Ngày nay nhờ sự phát triển của y dược học, con người đã cĩ những hiểu biết sảu hơn vế cơ chế phân tử của phần ứng viêm “Từ đĩ giúp tim ra các cơ chế tắc dụng của thuốc chống viêm đồng thời gợi ra những: hướng mới trong nghiên cứu phát triển thuốc chống viêm mới Hiện nay cĩ nhiều thuốc chống viêm được sit dung nhit NSAIDs glucocorticoid, enzym chống viêm cược liệu chống viêm trong đĩ NSAIDs và glucocoricoid là hai nhĩm thuốc chống viêm kinh điển cĩ tác dụng tốt trên nhiều loại viêm và được sử dụng phổ biến Nhung các thuốc này cũng cĩ nhiều tác dụng khơng mong muốn: gây viêm loét đường tiêu hĩa ảnh hưởng quá trình đơng mắu tạo máu, xốp xương gây nguy hiểm cho các bệnh nhân đặc biệt là với các bệnh nhân viêm mạn tính Vì vậy việc tìm kiếm nghiên cứu các thuốc chống viêm mới cĩ hiệu quả tối tác dạng khơng mong muốn là yêu cấu cấp thiết đối với các nhà khoa học Từ lúc phát hiện ra tiềm năng của một dược liệu cũng như hĩa được chống viêm đến lúc biến nĩ trở thành "một chế phẩm thuốc hồn chỉnh là cả một chặng dường dài trong đĩ giai đoạn tiến lâm sàng-thữ tác dụng được lý là khâu rấ quan trọng Và để thực hiện

khơng thể thiếu các mơ hình thực nghiệm phù hợp giúp chứng minh thuốc đĩ thực sự cĩ tác dụng hay khơng? liều lượng trong khoảng nào? cơ chế tác dụng ra sao?

Hiện nay tại Việt Nam các mơ hình nghiên cứu tác dụng chống viêm của thuốc cịn ít và hạn chế cũng như chưa được thống kế một cách đấy đủ Vì vậy chúng tơi tiến hành thực hiện để tài "Tổng quan về các mơ hình nghiên cứu tác dung chống viêm của thuốc” với mục tiêu

đồ thì

+ Téng quan về các mơ hình nghiên cứu tác đụng chống viêm của thuốc -® Đánh giá các mơ hình nghiên cứu tác dụng chống viêm của thuốc

Trang 7

1 VIÊM VÀ THUỐC CHỐNG VIÊM

11 ĐẠI CƯƠNG VỀ VIÊM

| Khái niệm

R “Theo từ điển Bách khoa Dược học: “Viem là phản ứng tại chỗ của cơ thé do

các mơ bị kích thích hoc tổn thương Đĩ là một phần ứng phức tạp của các mơ liên

kết và của tuần hồn mao mạch ở nơi bị tác động được biểu hiện bằng các triệu chứng sưng nĩng, đỏ đau và rối loạn chức phận” [23]

“Theo Vũ Triệu An: "Viêm là tập hợp các phần ứng tế bào, phản tử mơ và địch

thể mà cơ thể phát động để phản ứng với mọi khả năng gây tổn thương đến tính tồn vẹn của nĩ hay để chế ngự hạn chế, bất hoạt tiêu hủy nhân tố tấn cơng rồi don sạch

mơ đã bị ổn thương" 9]

1.1.2 Nguyên nhân gây viêm [21] % Nguyên nhân ngoại sinh

~ Đo vi sinh vật: xï khuẩn virus, một số loại nấm các vi sinh vật đơn bào ký

sinh tring và cơn trùng

~ Đo các chất hĩa học: do hĩa chất (acid bazø ) đo thuốc

~ Do yếu tổ vật lý: chấn thương đị vật nhiệt (bỏng nĩng bỏng lạnh) tia phĩng xa, bite xa

Nguyen nhan

ăn phẩm chuyển hĩa: như trẻ máu tăng gây viêm màng phối màng tim: aicd uric ting gây viêm khớp trong bệnh Gút

~ Hoại tử kín gây viêm v6 trùng: như hoại tử chịm xương đhi ~ Phản ứng tự miễn: như bệnh thấp khớp viêm cầu than ~ Viêm xung quanh té chive ung thu

1.1.3 Phân loại

= Theo nguyên nhân: viêm nhiễm trùng xà viêm vO tring

~ Theo vị trí: viêm nơng, viêm sâu hoặc viêm bên ngồi, viêm bên trong, ~ Theo địch rỉ viêm: viêm thanh địch viêm tơ huyết viêm mũ tùy theo dịch rỉ

viêm giống huyết thanh, huyết tương hay chứa nhiều bạch cầu thối hĩa

inh

Trang 8

~ Theo tiến triển của viêm gồm cĩ: viêm cấp và viêm mạn Viêm cấp cĩ 4 triệu chứng điển hình là sưng nĩng đỏ đau và cĩ đặc điểm là tăng mạnh số lượng bạch cấu đa nhân tại mơ bị tổn thương Viêm mạn cĩ đặc điểm là tăng số lượng các đại thực bào Iympho bào, tương bào và bạch cầu di toan

1.14 Diễn biến phản ứng viêm

: (Qué trình diễn biển của viêm cĩ thể chia thành năm giai đoạn các giai đoạn ít nhiều đan xen lần nhau hơn là xảy ra liền tiếp

1.1.4.1 Giai đoạn cảm ứng

Khi yếu tố gây viêm xảm nhập vào cơ thể tại một điểm nào đĩ thì những tế bào bảo vệ ti chỗ và hệ thống dịch thể tiếp xúc (đơng máu, bổ thể) sẽ gây một phần ứng tức khắc, Những phản ứng ban đầu phĩng ra các tín hiệu hĩa học khuyếch tần tới mọi ế bào cĩ khả năng phân ứng lạ nhằm khoanh vùng tổn thương lại |9]

1.1.4.2 Giai đoạn phản ứng mạch mau

Phản ứng này xây ra rất sớm sau tổn thương và phát triển ở mức độ khác nhau phụ thuộc vào sự trim trong của tổn thương mơ Đầu tiên là sự co mạch chớp nhống xuất hiện ở các tiểu động mạch do hưng phấn thần kinh co mạch Sau đĩ là hiện tượng giãn các mạch máu theo thứ tự từ các tiểu động mach, mao mạch rồi đến tiểu tinh mạch Sự giãn mạch dẫn đến tăng tuần hồn tại chỗ gây nên các triệu chứng nĩng và đồ

Phản ứng tuần hồn quá mạnh dẫn tới các rối loạn nghiêm trọng như giãn ‘mach cực độ đồng máu chảy chậm hạ, gây tang tính thấm thành mạch làm thốt dịch rỉ viêm giàu protein vào các mơ quanh huyết quản Do sự chèn ép của địch rỉ viêm và đo một số yếu tổ mạch máu (liệt thắn kinh vận mạch tế bào nội mạc sưng , to, tang độ nhớt của máu ) gây ứ máu làm mất tuần hồn từ động mạch sang tinh : mạch thiểu oxy gáy rối loạn chuyển hĩa làm tổn thương tổ chức và viêm phát triển

tồn diện (biểu hiện lâm sing Ia phi va dau), (6, 15} 1.1.4.3 Giai đoạn phản ứng tế bào

Phin ứng tế bào là phản ứng cơ bản nhất phản ánh khả năng bảo vệ của cơ thể chống viêm, trong đĩ bạch cầu đĩng va trị quan trọng nhất Hoạt động của bạch cấu tại ổ viêm gồm

Trang 9

+ Bạch cầu thốt mạch

Bình thường bạch cầu chỉ dính với nội mơ ở mức thấp Khi cĩ viêm dưới tác ‘dong của các chất trung gian hĩa học (yếu tố hoại tử u (TNP) iuerleukin-l (L1) prostacyclin (PGI ) thi bach cu ting Khả năng bám dính với tế bào nội mo Sau khi đính vào các tế bào nội mơ, bạch cầu chuyển động nhẹ đọc theo bể mật nội mỏ uốn những chân giả vào kẽ hở giữa các tế bào nội mơ rồi xuyên qua vào khoảng gian bào ngồi mao mạch Tiếp theo bạch cầu dĩ chuyển ong mơ kế về phía mơ viêm do kích thích hĩa ứng động Các chất gây hĩa ứng động bạch cấu là: các sản phẩm của vi khuẩn (các p:púd cĩ các acid amin tân cùng là N-omyl-methionin): các sản phẩm của hệ thống bổ thể bị hoạt hĩa (C3a CSa): prostaglandin leucotrien: các cytokin:fbủn và các in phẩm phân hủy của ibdn 5.6

+ Hiện tượng thực bào và thốt hạt

Khi tới ổ viêm, bạch cầu nhận biết và dính với đối tượng bị thực bào Sau đĩ bào tương của thực bào kéo đà ra tạo thành giä tức tiến đến bao quanh lấy đối tượng (nuối), sập giả túc lại tao thành hốc thực bào Màng của hốc thực bào sát nhập với màng bào tương của hạt lysoxom rồi các thành phần của lyxosom đổ vào hổ thực bào để phản hủy đối tượng thực bào (bạch cầu mất bạ0 |7]

1-44 Giải đoạn tồn thân

Khi ổ viêm chiếm một thể tích mơ lớn thì nĩ phát án các yếu tố hoạt hĩa đỉ xa qua tuần hồn máu với số lượng đủ để làm các trung tâm thần kinh chuyên biệt tham gia Các trung tâm ấy gửi đi xung động thần kinh làm thay đổi bộ máy ổn nhiệt của cơ thể và kích thích vàng tiền yên là bộ phận điều hịa cơ chế đáp ứng đối với các tấn cơng Kết quả là cĩ các phần ứng tồn thân nhự sốt, tang bạch cấu ăng tốc độ máu lắng tối loạn chuyển hĩa (glucid lipid protein) 19}

1.1.4.5 Giai đoạn thành sẹo hay chuyển sang mạn tính

Sau một thời gian những hoại động thối hĩa ngừng thay vào đĩ là phản ứng tổng hợp Khi ấy nguyễn bào xơ giữ một vai trị chủ yếu Chúng hình thành sợi eollagen và những phân ti proteoglycan cin cho việc sửa chữa mơ bị viêm Khi viêm kéo dài nhiều ngày thì viêm chuyển sang mạn tính trong đĩ quá trình phá hủy và hàn gắn tổn thương mơ xây ra đồng thời Viêm u hại là một hình thái đặc biệt của

Trang 10

viêm mạn tính trong đĩ đại thực bào chiếm wu thé va chuyển thành các tế bào dạng biểu mơ (ephhsloid celD)- à ác tế bào khơng cĩ khả năng thực bào nhưng cĩ thể bắt giữ các mảnh nhỏ Các đại thực bào cũng cĩ thể hợp lại thành các tế bào khổng lồ Bip chúng cĩ khả năng thực bào những đối tượng lớn U hạt được bao bọc bởi vỏ bọc xơ gồm collagen, proteoglycan lim cho khối u hạt khơng đủ máu tưới (huốc khơng thâm nhập được vào trong nên viêm khĩ chữa và kéo đài [5 9]

1.1.5 Các yếu tố tham gia vào phản ứng viêm

‘Vier là một phản ứng phức tạp, cĩ sự tham gia của nhiều yếu tổ tế bào và thể địch

1-1-5,1 Các tế bào tham gia vào phản ứng viêm + _Bạch cầu đa nhân trung tính

Bạch cầu đa nhân trung tính chiếm khoảng 60-70% tổng số bạch cấu, cĩ chức càng chính là ìm kiếm phá hủy vi khuẩn là hàng rào bảo vệ đầu tiên của cơ thể với nhiễm trùng Các bạch cấu này chứa nhiều hạt bên trong tế bào Thành phần chính của các hạt này là các cazym cĩ khả năng tiêu hĩa các thành phần cấu trúc của vì khuẩn cũng như phân hủy mơ của vật chủ [7:21]

+ Bạch cầu ái kiếm và dưỡng bào

Là những tế bào quan trong trong phản ứng viêm Bạch cầu ái kiểm tuần hồn trong máu và được huy động khi cĩ dị ứng Dưỡng bào cư trú và (huần thục tại mơ “Các hạt ưa kiểm chứa các chất rung gian như hixtamin serin protease, sufatase, elyeosidase và carboxypepidase A.[13]

+ Bạch cầu ái toan

Bào tương chứa các hạt đạc hiệu ưa acid trong chứa nhiều protein cĩ hoạt tính xinh học, đặc biệt là protein EBP (eosinophilic basic protein) rất độc với ký sinh trùng Bạch cầu ái toan cịn cĩ tác động điều hịa và kiểm sốt quá trình viêm 5]

+ Bach ciiu dom nhân và đại thực bào

Trang 11

phần bổ thể đã bị hoạt hĩa phúc hợp kháng nguyên-khẩng thể, mảnh sợi collagen lêm, đại thực bào sản xuất các chất trung gian hĩa học gây viêm như lL-I IL-6, TNE-4, PG làm khuyếch đại phản ứng ra xa {9.13]

+ Lympho bào B, T và tế bào NK [7]

Lympho bao B: tham gia vào miễn dịch dịch thể Khi kháng nguyên vào cơ thể sẽ gắn với tế bào B cĩ kháng thể bể mặt tương ứng rồi kích thích biệt hĩa tế bào ' thành tương bào cĩ khả năng sản xuất kháng thể (IgE IgG IgA, IeD IgM)

Lympho bào T: là tế bào chịu trách nhiệm đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào Cĩ 2 dịng tế bào T:

~ Một dịng chứa kháng nguyên CD4: sinh ra các lymphokin tiêu diệt thể lạ bằng cách tuyển mộ, hoạt hĩa các tế bào Iympho khác, đồng thời kích thích tổng hợp globulin miễn địch và kích thích phản ứng viêm quá mắn chậm

= Mot dong chứa kháng nguyên CD8: nhận biết kháng nguyên, tấn cơng trực p các tế bào cĩ kháng nguyên lạ trên bể mạt (tế bào đích) điều hịa miễn dịch ức chế hoạt động của các Iympho khác

Tế bào NK: là những lympho bào khơng biệt hĩa thành Iympho B hay lympho ` và tham gia vào đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào do gây độc tế bào

% Tiểu cáu

“Tại vị trí

Tiểu cầu cĩ thể tham gia vào moi giai đoạn cia qu nhiều enzym và các thành phần hạt cĩ hoạt tính viêm mạnh '* Các thành phần của mỏ đệm

Gồm các tế bào nội mơ, nguyên bào xơ và các tế bào cơ trơn Chúng giữ vai ¡h viêm Chúng chứa

trị tích cực ong viêm do khơng chỉ đáp ứng với các ín hiệu phản tử của bạch cầu mà cịn điều hịa cả chức năng của bạch cầu Các tế bào nội mơ phủ mật trong tt cả các huyết quản và tạo thành hàng rào dầu tiên giữa các thành phần máu và mơ đệm đĩng vai trị là các tế bào viêm quan trọng [13]

1.1.5.2 Các chất trung gian hĩa học trong phản ứng viêm ` Các chất cĩ nguồn gĩc tế bào

Trang 12

+ Prostaglandin

Khi tế bào bị tổn thương, màng phospholipid của tế bào sẽ bị hoạt hĩa bởi phospholipase A; tgo thin acid arachidonic, Prostaglandin 1 sin phẩm chuyển hĩa của acid arachidonic theo con đường cyclooxygenase (COX) C6 hai loại enzym COX déng phan là COX-I và COX-2 COX-1 là enzym cĩ mặt ở hấu hết các mơ,

chịu trách nhiệm tổng hợp prostaglandin sinh lý tham gia vào các chức nàng bình

thường của một xố cơ quan trong cơ th (đặc biệt ở dường tiêu hĩa, iểu cầu và thận), ổn định nội mơ và bảo vệ tế bào COX-2 được xem là enzym tiền viêm, chỉ xuất hiện tại các tổ chức bị tổn thương và cĩ vai trị tạo ra các prostaglandin gay viem Bình thường nồng độ COX-2 trong tế bào rất thấp Trong các mơ viêm kích thích Viêm gây cảm ứng các tế bào tham gia vào phản ứng viêm (bạch cấu đơn nhân đại thực bào tế bào nội mạc ) từ đĩ hoạt hĩa mạnh COX-2 và nồng độ COX-2 cĩ thể tăng cao gấp 80 lần bình thường [13.20]

“Trong viêm cấp các mơ và mạch máu tại chỗ sản xuất POE, và POI, Trong viêm mạn, các bạch cầu đơn nhân và đại thực bào giải phĩng POE; và TXA¿„

Prostaglandin c6 nhiéu tée dụng khác nhaư |9]

PGE: cĩ reccptor trên tế bào nội mơ, tế bào cơ trơn thành mạch tế bào trung tâm điều nhiệt vùng đưới đối Nĩ gây tăng tính thấm mạch sây sốt

PGEy: £6 receptor tren eae 18 bào cơ trơn Nĩ cĩ tác dụng giãn mạch gây ban đỏ và đau

GE,; cĩ rccsptor trên tế bào nội mơ mạch mà nĩ làm tảng tính thấm, trên các tế bào niềm mạc dạ dày và trong một xổ nơron

ĐGGI; cĩ reeeptor trên màng tế bào nội mơ mạch và tế bào cơ trơn Nĩ cĩ tác ‘dung giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch gây phù ban đỏ, tăng đau sốt

TXAy được giải phĩng xau khi tiểu cấu kết dính với nội mạch bị tổn thương “TXA; kích thích sự kết tập tiểu cầu và cĩ tác dụng co mạch

+ Leueotrien

Ngồi con đường COX acid arachidonic cĩ thể được chuyển hĩa theo con đường lipooxygenase (LOX) để tạo ra các leucotrien Các leucotrien được tổng hợp chủ yếu bởi các tế bào viêm như bạch cầu đa nhân, đại thực bào và dưỡng bào

Trang 13

Leucotrien By c6 tinh héa ứng động với bạch cấu da nhân trung tính, bạch cấu đơn nhân và một số tế bào Iympho: kích thích bẩm dính bạch cầu đa nhân trung tính vào ế bào nội mơ, kích thích đại thực bào và lympho bào tăng sinh và sản xuấi cytokin (9)

+ Các acid amin hoạt mạch Histamin

Neuén g6c: histamin cĩ nguồn gốc chủ yếu từ dưỡng bào ngồi ra cịn cĩ trong bạch cầu ái kiếm và tiểu cầu Nĩ được tạo thành và dự trữ trong các hạt của các tế bào này, Histamin được giải phĩng do quá trình mất hại của các tế bào khi đáp ứng với các kích thích 9, L3]

Vai tr trong viêm: hidamin gây giãn tiểu động mạch và được coi là chất trung gian chính trong giai đoạn khởi đầu tảng tính thấm thành mạch Nĩ gây co các tế "bào nội mạc của tiểu tĩnh mạch giãn rộng vùng nối giữa các tế bào này và cho huyết

ương thấm qua để vào nội mơ 5 13] Serotonin

Neuén g6c: serotonin cĩ nguồn gốc từ tiểu cầu và các tế bào ta crom ở ruột “Sự kết đính tiểu cầu sẽ giải phĩng serotonin|13]

`Vai trồ trong viêm: tương ty histamin, + Yếu tố hoạt hĩa tiểu cầu (PAE)

PA được hình thành trong màng các tiểu cấu tế bào nội mơ bạch cầu da “hân trung tính (sau khi bị kích thích), bạch cầu ái toan tế bào đơn nhân tế bào lõi và cấu thận từ một loại phospholipid nhờ phospholipsxe A,

Trang 14

+ Các thành phần của Iysosom

Các hạt lyeoxom chứa trong các bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cấu dơn nhân Trong phản ứng viêm các hạt này được giải phĩng Thành phần chính của các, hạt này là các enzym cĩ khả năng tiêu hủy các thành phần cấu trúc của vĩ khuẩn và mồ của vật chủ [2]

+ Các cyokin

Cytokin bản chất là những glycoprotein, do nhiều loại tế bào sản xuất nhưng chủ yếu từ lympho bào và đại thực bào đã bị hoạt hĩa Cytokin do tế bào lympho tao “gọi là các Iymphokia, do tế bào đơn nhân tạo ra gọi là monokin và được gọi dưới "một tên chung là các inledeulin (1L) Chúng điều hịa hoại động trên mọi hệ thống cơ quan và tham gia điều khiển mọi giai đoạn của đáp ứng viêm từ khởi đầu đến sửa chữa I9]

Tai vi tr t6n thuomg: IL-1 IL-6, TNE-4 tác động lên các nguyễn bào xơ tế bào nội mơ gây tổn (hương tế bào, giải phĩng nhiều chất cĩ hoạ tính sinh lý gây giản "mạch tảng tính thấm thành mạch, tập trung bạch cấu tại viêm IL-8 cĩ tác dụng "hĩa ứng động đặc biệt mạnh với bạch cầu đa nhân trung tính

“Tồn thin: IL-1, IL<6 TNE-4 tác động lên vùng dưới đối làm tăng thân nhi (gây số0, tàng tổng hợp ACTH, hydrocodison Các cytokin cịn kích thích tế bào gan xân xuất prolein phản ứng C (CRP) Các CRP này nhanh chĩng gắn vào vi khuẩn kéo thêm bổ thể vào tạo thành một phúc hợp hấp dẫn cho các thực bào vay bất xử lý [131

+ Các gốc oxy tự do

“Gốc oxy tự do hình thành rong t thể đại thực bào đã hoại hĩa Chúng tiêu hủy đối tượng thực bào Trong viêm khi đại thực bào bị ly giải sẽ gây trần gốc tự do ra "ngồi ạo điều kiện cho quá trình peroxyd hĩa lipid màng tế bào gây tăng tính thấm, "mạch tạo điều kiện thuận lợi cho việc giải phĩng acid arachidonic từ phospholipid "màng tế bào để tổng hợp các chất trung gian hĩa học [15]

+ Oxyd nita (NO)

[NO giin với nửa Hem trên guaniyl cyclasc và hoạt hĩa enzym này Dưới tác động của các kinas guanosin phosphat vịng được tảng sinh gây giãn cơ trơn của

Trang 15

huyết quân và gây giãn mạch tăng tính thấm thành mạch ting sin xuất các PG viêm Ngồi ra NO cịn làm giảm tụ tập và kết dính iểu cầu

"NĨ do đại thực bào sẵn xuất xẽ tác động như các gốc tự do là yếu tố độc với tế "bào vi khuẩn, nấm, virus, tế bào u Tuy nhiên nếu các đại thực bào bị hoạt hĩa sản xuất quá nhiều NO sẽ gây hại cho cơ thể như giãn mạch nặng và chống trong sốc nhiễm khuẩn [I3]

* Các chất trung gian cĩ nguồn gốc huyết tương /S, 7}

Bao gồm: hệ thống bổ thể, hệ thống dịng máu hệ thống tiêu tơ huyết, hệ thống kinin và các globulin miễn dịch Trong đĩ 4 hệ thống đầu tiên được tạo thành theo kiểu "dịng thác” và cĩ mối tương quan lẫn nhau

+ Hệ thống bổ thể

Vai rd: diet khuẩn nhờ các thành phần cuối của hệ thống bổ thể; gia tăng phản ứng viêm nhờ các sản phẩm phụ như Cầa, C5a khi hoạt hĩa từ CI đến C5 bao gốm xropsonin hĩa hĩa hướng động bạch cầu, thost hat t& bio mast

+ Hệ thống đơng máu

Vai trị: ngân sự phát tấn của vì khuẩn; giữ vi khuẩn và vật lạ ở nơi mà hoạt ‘dong thực bào mạnh nhất; tạo thành bộ khung tạo điều kiện cho sự sửa chữa và lành với thương

+ Hệ thống kinin inn can bain la bradyi

gây dau: gây co thất cơ trơn ngồi mạch máu: gây tảng tính thấm thành mạch do ‘cng tie động với PƠ nhĩm E trong giai đoạn sau của quá tình viêm: tảng hĩa ứng động bạch cầu

+ Hệ thống tiêu tơ huyết

Enzym gây tiêu tơ huyết điển hình là plawnin, nĩ được tạo thành do sự phân Lich plasminogen Plasmin o6 vai tr quan trong trong iêu cặn tơ huyết Trong phản Aing viêm, nĩ khởi động sự hoạt hĩa của hệ thống bổ thể do phản tách C3 thành các đoạn phân hiy fibrin và làm tăng tính thẩm thành mạch

ic globulin mign dich (khang thé) Bao g6m: IgG IgA IgM IgE IeD

cĩ vai tồ: gây giãn mạch: cùng tác động với PG

Trang 16

TRG: chiếm tu thế trong huyết thanh, vai trị là opsonin fda, hoat hoa bé thé gay độc tế bào phụ thuộc kháng thể, trung hịa ngoại độc tổ gây ngưng kết tế bào vỉ khuẩn trung hịa virus

TRÀ; chiếm ưu thế trong các dịch tiết phủ lên bế mật niêm mạc đường hơ hấp trên à dưới, đường tiêu hĩa đường tiết niệu, sữa Vai trị là trung hịa các tác nhân gây bệnh, hoạt hĩa bổ thể theo đường nhánh

RỒ tim thấy chủ yếu trong huyết thanh Nĩ cĩ khả năng hoạt hĩa bổ thể mạnh hơn IgG

IgE: néng độ rong huyết thanh thấp, tăng lên khi đị ứng nhiễm ký sinh trùng TE gắn với các thụ thể trên bề mật đưỡng bào và bạch cầu ái kiếm, kích thích các tế bào này giải phĩng các chất trung gian hĩa học như hivami

leucotien

IgD: c6 rất íL trong huyết thanh, Vị trí khu trú là trên bể mặt tế bào B Nĩ cùng ‘i IgM là những globulin miễn dịch xuyên màng lạD bể mặt cĩ:

thục tế bào B,

1.2, THUOC CHONG VIEM

1.2.1 Hĩa được chống viêm

1.2.1.1 Thuốc chống viêm khỏng steroid (NSAIDs) [4, 8]

Bao gồm một số thuốc: aspirin, phenylbula/on indomethacin, piroxicam, ibuprofen, cclecobxid,

Co ché chong viêm

NSAIDs gain vito vi trí hoạt động dành cho acid arachidonic trên COX gây ức chế enzym COX làm cho acid arachidonic khơng chuyển thành proxtaglandin- chất trung gian hĩa học gây viêm nên NSAIID% ức chế phản ứng viêm (hình 1),

Ngồi ra NSAIDS ức chế hệ enzym phản hủy protein trong lysosom, làm vững bbén ming lysosom và đối kháng tác dụng của các chất trung gian hĩa học như bradykinin, histamin, serotonin ức chế hĩa hướng động bạch cấu ức chế sự di chuyển của bạch cầu tới ổ viêm

Trang 17

Phospholipid © | Gtucocorticoid màng Phospholipase Ay

Acid arachidonic €) NSAIDs

Lox COX Leucotrien Prostaglandin CDE By Viêm

Hình l: Sơ đỏ cơ chế chống viêm cia NSAIDs va glucocorticoid Tác dụng khơng mong muốn

NSAIDs gay loét dạ dày tá trăng kéo dài thời gian chảy máu gây viêm thận sấy cơn hen giả gây dị tật ở thai nhỉ nếu dịng thuốc trong 3 thắng đầu của thai kỳ

Chi din chung

“Chống viêm: cả viêm cấp và mạn (viêm khớp dạng thấp, thấp khớp viêm cột sống dính khớp, bệnh gút )

Ngồi ra thuốc cịn dùng giảm dau và hạ sốt, 1.2.1.2 Thuốc chống viêm steroid [4,8]

“Thuốc chống viêm seroid cịn gọi là các glucocorticoid, bao gốm một số thuốc: hydrocorison prednisolon methylprcdnixolon triamcinolon dexamethason, betamethason

Trang 18

Co ché ching viem

Glucoconticoid te che phospholipase Az thong qua kích thích tổng hợp lipocortin tim giim tng hyp acid arachidonic, do đĩ làm giảm tổng hợp leUcotrien ‘a prostaglandin, vì vậy ức chế phẫn ứng viêm

Ngồi ra nĩ cịn cĩ tác dụng ức chế dịng bạch cấu đơn nhân trung tính, ympho bào đi vào mơ để gây khởi phát phản ứng viêm,

Tác dụng khơng mong muốn

Gilucoconicoid gay nhigu tée dung khơng mong muốn như ph, loét dạ dày tá tràng, lỗng xương-xốp xương eo cơ, rối loạn phân bổ mỡ suy thượng thận cấp khi ngừng thuốc đột ngột

Chỉ định

Điều tr viêm khớp viêm da, viêm cơ

Ngồi ra cịn dùng điều t thay thế hormon trong suy thượng thận, diều bệnh tự miễn đị ứng sốc phản vệ

1.2.1.3 Enzym chống viêm

Bao gồm một số enzym: a-chymotrypsin trypsin, serratiopeptidase, amylase, papain, bromelain

Cơ chế chống viêm

“Thủy phân protein huyết tương tiêu hủy mảnh vụn xợi ạo keo các mảnh vế bio và cde fibrin ket tụ tại vùng bị tổn thương đồng thời kích thích hiện tượng thực bào Vì vậy chúng làm giảm phù viêm cải thiện khả năng lưu thơng của máu phục hồi tuần hồn mao mạch để đảm bảo cung cấp đù oxy và dinh dưỡng cho các vùng bị tổn thương

Điều hịa các chất trung gian hĩa học của viêm như các protein của pha cấp, các cyIokin các thụ thể gây kết đính trên màng bạch cầu

{Uc che ee protease cc protein thủ dọn gốc tự do

Giảm khả năng hoạt hĩa hệ thống bổ thể của phức hợp miễn địch màng tế bào làm giảm sự nguy hiểm của các phẫn ứng quá mắn [13]

Tác đụng khơng mong muốn

Một số cnzym cĩ thể gây dị ứng rối loạn tiêu hĩa (iêu chảy, chấn ân )

Trang 19

Chi dink

“Chống viêm chống phù nể sau phẫu thuật chấn thương trong tiết niệu sản phụ khoa, tai mũi họng

1.2.2 Đơng được chống viêm

“Theo quan điểm của đơng y, viêm là triệu chứng của cơ thể khi bị nhiễm độc Nguyên nhân nhiễm độc cĩ thể do bên trong (phủ tạng hoạt động yếu khơng đủ sức thanh thải chất độc) hoặc do bên ngồi (cơn trùng cắn, hơi hĩa chất ngộ độc thức ain ) Vì thế trong đơng y các vị thuốc chống viêm thường là các thuốc thanh tiêu và hoại như thuốc thanh nhiệt giải độc, thuốc trừ thấp thuốc hoạt huyết tiêu

“Cĩ rất nhiều được liệu và bài thuốc cổ truyển cĩ tác dụng chống viêm đã được sử dụng rộng rãi tong dân gian và hiện nay dang được nghiên cứu để tìm ra các hoạt chất cĩ khả năng chống viêm cũng như cơ chế chống viêm của các hoạt chất đĩ

Một số được liệu chống viêm [2, 3} Kim ngân

“Tên khoa học: Lonicera japonica Thunb Caprifoliaceae Bo phân dùng: hoa, phần trên mặt đất phơi hay xấy khơ

Cong dung: Kim ngân hoa được ding chủ yếu để chữa mụn nhi mẩn ngứa xối nồng sốt rất tả ly và viêm nhiễm trùng đường ho hấp trên, viêm da, viêm màng, Ket do siêu vi

Hoe hoa

Ten khoa hoc: Sophora japonica L Fabaceae Bo phận dùng: nụ hos hive

Cơng dụng: chủ yếu để phịng những biến cố của bệnh xơ vữa động mạch, điều trị các trường hợp suy yếu nh mạch các trường hợp xuất huyết như chảy máu cam ho ra máu từ cung xuất huyết các trường hợp tổn thương ngồi ra do bức xạ chống đi ứng, thấp khớp, làm vết thương chĩng lành so

Nae née

“Tên khoa học: Oroxylum indicum Bignoniaceae Bộ phân dùng: vỏ thân và hại phơi hay sấy khơ

Trang 20

Cong dụng: chữa ho, viêm phế quản đau gan đau đạ dầy

Ngồi ra cịn cĩ các vị dược liệu cĩ tác đụng chống viêm khác như: Hồng cấm, Ngưu tất, Cam thảo Tam thất, Khương hoạt, Cốt tối bổ, Dây đau xương Bạch “hoa xà, Lão quan thảo di thực

# Một số bài thuốc chống viêm [13]

Ngân Kiểu tán

“Thành phần: _ Kim ngânhoa "Trúc điệp Liên kiểu Kinh giới

| Dam dau xi ‘Thing ma

Ngưu bằng từ Cát cánh

Bạc hà ‘Cam thio

Chủ tị: cảm cúm, viêm nhiễm và các chứng mụn nhọt Cao tiếu viêm

“Thành phần: TO moe Ngài cứu Lá mĩng tay Nghệ vàng Huyết giác

Chủ tị: cảm cúm, mụn nhọt "Độc hoạt tang kí sinh thang

“Thành phần: Độchoạt — Tếtan Thue dia Phụclinh Tang ki DB trong Camthảo Tíngiao Thượcdược New tit — Quếiâm Phịng phong Xuyênkhung — Nhân sâm

“Chủ tị: đạu đầu gối đau lưng, tẻ lạnh, thấp khớp lâu ngày co dudi khé khan,

Trang 21

2, MỘT SỐ MƠ HÌNH NGHIÊN CỨU TÁC DUNG CHONG VIEM CUA THUỐC

Tựa trên những hiểu biết Về nguyên nhân gây viêm tiến triển của phần ứng xiêm, triệu chứng lãm sàng của viêm, người ta ạo ra các mơ hình viêm thực nghiệm, dũng để nghiên cứu tác dụng chống viêm của thuốc Các mơ hình này cĩ thể chỉa thành 3 loại

Mơ hình gây viêm cấp và bán cấp ~Mơ hình gây viêm mạn tính -Mơ hình nghí

2.1 MO HINH GAY VIEM CAP VA BAN CAP cứu cơ chế chống viêm

Viêm cĩ thể do nhiều nguyên nhân gây ra như nhiễm khuẩn, thiếu máu cục bộ tương tác kháng nguyên-kháng thể, tổn thương do hĩa chát, nhiệt độ cơ học Tuy nhiên dồ do nguyên nhân nào thì ở pha cấp tính của phản ứng viêm cũng xuất hiện

4 triệu chứng điển hình là sưng, nĩng đỏ, đau Trong thực nghiệm người ta dùng các chất hĩa học tạ ra các triệu chứng viêm tương tự trên lâm sàng để nghiên cứu ác dụng của thuốc, Thuốc làm giảm được các tiệu chứng này được coi là cĩ tác dạng chống viêm cấp Trong các phương pháp tì gây phù (sưng) là phương pháp hay được sử dụng nhất

2.1.1 Mo hình gây phù bàn chân chuột “Nguyên tác

Mơ hình này cĩ thể dùng nhiều chất gây viêm khác nhau như carrageenin,

dextran, kaolin, formaldehyd men bia, albumin trứng Khi tiêm các chất này vào ban chân chuột xẽ kích thích giải phĩng các chất trung gian hĩa học nhur histami prostaglan

n serotonin và kết quả là gây phù Thuốc cĩ khả năng ức chế phù bàn “chân chuột được coi là cĩ tác dụng chống viêm

'Gây phù chân chuột bằng carrageenin [29] Tiến hành

Trang 22

Lơ chứng: đồng dung mơi pha thuốc Lị đối chiếu: đùng thuốc chống viêm đã biết

Lo thir ding thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm

“Chuột được để đổi qua đêm Cho chuột uống thuốc hoặc dung mơi Sau 30 phút tiêm 0.05ml dung dich carrageenin 1% vio gan bàn chân trái xau của chuột 'Đo thể tích chân chuột tại các thời điểm: trước khi gây viêm: 1 2, 3,4, 5, 6, 7 và 24

giờ sau khi gây viêm, Đánh giá

“Tỉ lệ % tăng thể tích bàn chân của mỗi chuột biểu thị mức độ viêm cấp được theo cơng thức (1): X% “Trong đĩ:

Xi: lệ % tăng thể tích chân chuột ‘Vo: thể ích chân chuột trước khi gây viêm `V¿ thể tích chân chuột sau khi gây viêm t giờ

Sau đĩ tính trung bình tỉ lẻ % độ tảng thể tích chân của các chuột trong mỗi lơ “Tỉ lệ % ức chế phù của lồ thử so với lơ chứng được tính theo cơng thức (2):

@

“rong đĩ:

1%: tỉ lệ % giảm mức độ phù bàn chân chuột

“X, "6: trừng bình t lệ % độ tâng th tích chân chuột ở lơ chứng,

TY %: trăng bình tỉ lệ % độ tăng thể tích chân chuột ở lơ thử

“Các mỏ hình tương te

“Tương tự với cách tiến hành và cách đánh

thư mơ hình gây phù bàn chan chuột bằng caragecnin, nhiều nhà nghiền cứu đã cải sử dụng các chất gây viêm \ ACL G84.)

hd IỆN

a ay Hes

Trang 23

khác như: hỗn địch kaofin 56: dụng địch lịng trắng trứng 1%: formalin 1% (Tumer 1969): dewnan 1É đến 3 (Tumer 196%): deuran 6/6 (Winter 1963): dụng dich cavageenin 1% thêm 100 ng POE, hoặc PGI;: hỗn dịch bật men bia 2.5%: 0.1 ml dung dich œxpsin 0%: dụng dịch collagenase: dung dich serotonin 0.02%: bradykinin 0,005!

15000 đơn vị; adriamycin 0.56 (gây phù chân chuột nhất) 2.1.1.2 Gay phù chân chuột do chấn thương [12, 25, 37] Nguyên tác

Khi tác động lực cơ học mạnh lên bàn chân chuột sẽ gây tổn thương mơ và tế bào chân chuột, làm hoat ha phospholipase A, gay giải phĩng acid arachidonic ti phospholipid mang Acid arachidonic sé chuyén héa thanh prostaglandin nhờ cnzym COX va ket qui la gay ph Mo hinh này đã mỏ phỏng tình trạng tương tự trên lâm sàng khi cơ thể bị chấn thương như bong ga nga va dap

ẩn hành

“Sử dụng chuột cổng trắng chuột được chia ngẫu nhiên thành các lơ; Lơ chứng: uống dung dịch nước muối sinh lý

L6 đối chiếu: uống thuốc chống viêm đã biết

Lơ thử: uống thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm

(Cho chuột uống thuốc hoặc nước muổi sinh lý vào mỗi buổi sing trong 4 ngày liên tục Đến ngày thứ 5 sau khi cho chuột uống thuốc hoặc nước muối lần cuối Ì giờ thì gây viêm bằng cách thả 1 quả nặng 100 g từ độ cao 50 cm xuống bàn chuột Đo thể tích bàn chân chuột tại các thời điểm: trước khi gây viêm sau khi viêm 1, 3.5 giờ [I8]

Đánh giá

“Tính tử lệ % độ tăng thể tích chân chu rồi tính t lệ: ức chế phù của lơ thử xo với lơ chứng theo cơng thức (1) và (2) tương tự như mục 2.1.1.1

3.1.3 Mơ hình gây phù tai chuột

2.1.2.1 Gay phù tai chuột bằng oxazolon [29]

prostaglandin E 0.1 mg/ml: gel bemoni: 0.1 mÌ Ngươfin

Trang 24

Nguyen tde

Mơ hình gây phù tại chuột bằng oxazolon do Evans giới thiệu lần đầu tiên năm 1971 Day là mơ hình đựa trên phản ứng quá mẫn chậm của cơ thể với oxazolon kết cquả là kích thích làm vỡ hạt tế bào masl, giải phĩng các chất trung gian gây phù

Tiến hành

“Sử dụng chuột nhất cả 2 gi nhiên thành các lơ:

Lơ chúng: bơi 0.01 mÏ oxazolon 2% trong aceton

Lơ đối chiếu: bơi 0.01 ml oxazolon 2% trong aceton đã hịa tan thuốc “chống viêm da biét ( hydrocortison 0.03% hoặc indomethacin 1%)

Lơ thử: boi 0,01 ml oxazolon 2% trong aceton đã hịa tan thuốc đang

8 trọng lượng trung bình khoảng 25 g chia ngẫu

nghiên cứu

“Gây mê chuột bằng halothan Boi 0.1 ml oxazolon len vùng da bung đã cạo lơng hoặc bơi 0.01 ml oxazolon lên phần trong của cả 2 tai chuột để làm chuột nhạy cảm với chất kích thich oxazolon Sau d 8 ngày, gây mê chuột rồi kích thích gây viêm bằng cách bơi lên phía trong tai phải chuột dung địch tương ứng của các lơ (chứng đối chiếu th) Tất cả các tai trái đều được giữ nguyên Sau 24 gi, gi chuột rồi bấm 1 vịng trịn đường kính 8em ở vùng bơi thuốc của cả 2 tai, cân ngay ập tức, trọng lượng khác nhau thể hiện mức độ phù trong viêm

Bailey va cộng sự (1995) cũng mơ tả mơ hình gây quá mắn do tiếp xúc ở chuột nhất Bội 20 0l oxazolon 276 vào mát trong và mật ngồi của mỗi tái (mỗi mật I0 qH) để chuột nhạy cảm với oxazolon Sau đĩ 7 ngày kích thích chuột bằng cách bởi dung dich oxazolon 2% trong aceton và đầu ðliu (aceton:dáu ưliu = 4:1) vào cả 2 mặt của tai phải Ngay xau đĩ, lị đối chiếu và lơ thử được bơi thuốc Tại tái giữ nguyên Sau 24 gi, giết chuột, bấm 1 vịng trịn đường kính 6mm ở mỗi tai rồi đem đi cân ngay

Đánh giá

Trang 25

2.1.2.2 Gay phù tai chuột bằng đầu ba đậu [29] Nguyên tác

Mơ hình gây phù tai chuột bằng đầu ba đậu đo Tonelli và cộng sw để xuất (1965) đùng để đánh giá đồng thời tác dụng chống viêm và tác dụng (eo tuyến ức của cde steroid Theo kết quả nghiên cứu được lý hiện đại dầu ba đậu đùng tại chỗ ‘sty giải phĩng histamin là chất gây giãn mach, ting tinh thấm thành mạch và kết cquả là gây ph

Tiến hành

“Thí nghiệm cĩ thể thực hiện trên chuột nhất đục trọng lượng 22 œ hoặc chuột cống đực trọng lượng 70g chuột được chia ngẫu nhiên thành các lơ:

Lơ chứng: đùng dung mơi pha thuốc Lõ đối chiếu: đùng thuốc chống viêm đã biế

Lị thử: đồng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm

“Chuẩn bị hỗn hợp đụng mơi gồm cĩ dầu ba đậu: cthanol: pyridine: ethyl ether (đi lệ I:10:20:69 ở chuột nhát và 4:10:20.66 ở chuột cống) Thuốc đối

thử được hịa tan trong dung mơi này với nĩng độ 0,03 đến 1 mg/ml nếu thí nghiệm trên chuột nhất và nồng độ cao hơn từ 3 đến 10 lần nếu thí nghiệm trên chuột cống

Gay mê chuột tồi bơi lên cả 2 mặt của tai phải các dung dich tương ứng cho mỗi lơ (0/01 ml với chuột nhất và 0.02 mÌ với chuột cống) Tất cả các tai trái được sit nguyen Sau đĩ 4 gi, giết chuột bằng thuốc mè, cất 2 ti và bấm 1 vịng trịn đường kính 8mm ở mỗi tai rồi đem cân ngay trọng lượng khác nhau thể hiện mức độ phù rong viêm Để đánh giá ảnh hưởng trên tuyến ức thì 48 giờ sau khi bơi thuốc sẽ giết chuột rối cất tuyến ức và dem can, tính ra số mẹ tuyến ức/100 g thể trọng chuột

"Đánh giá

"Tính lệ % tảng khối lượng của tai phải so với ti trái và lệ % ức chế phù “của lơ thử xo với lơ chứng theo cơng thức tương tự như mục 2.1.1.1

“Tính tỉ lệ% giảm trọng lượng tuyến ức của lơ thử so với lị chứng để đánh giá lếu và thuốc

tác dụng làm teo tuyến ức của thuốc

Trang 26

“Tương tự với cách tiến hành trên ta cũng cĩ thể dùng các mơ hình gay phd tai chuột bằng acid arachidonic phorbol myristate acetat, tetradecanoyl phorboI acctat capsaicin, xylene,

2.1.3 Mé hin gây tăng tính thẩm thành mạch “Nguyên tắc

“Các chất gây viêm kích thích giải phĩng các chất trung gian như hivamin, prostaglandin, leucotricn s& lam giãn các tiểu động mạch và tiểu tỉnh mạch tăng tính thấm thành mạch Kết quả là địch và protein huyết tương bị thốt ra gây phù Các thuốc cĩ khả năng ức chế tăng tính thấm thành mạch sẽ cĩ tắc dụng giảm phù “chống viêm

2.1.3.1 Gay tăng tính thấm bằng phenethylamin [29] Tiến hành

Sử dụng chuột cổng đực, trọng lượng 160.200 ạ, chuột được chỉa ngẫu nhiên thành các

Lơ chứng: ding dung mơi pha thuốc LLư đổi chiếu: dùng thuốc chống viêm đã biết

Lo thie ding thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm,

“Cáo lơng vùng bung chuột tiêm tĩnh mạch dung dịch xanh Evan 1% với liều S mg/kg, Sau d6 1 giờ, cho chuột uống thuốc hoặc dung mơi Sau 30 phút, gây mẻ chuột bằng ether rồi tiêm trong da 0.05 ml dang dịch phenelhylamin 0.0% ở cả 3 vị trí phải, trái và trên bụng Sau 90 phút, giết chuột bằng ether rồi tiến hành do đường kính vùng da bị nhuộm xanh hoặc cắt vùng da bị nhuộm xanh dem ngâm vào dung địch nati clorid 0.9%, sau khoảng 24 giờ lọc lấy dịch rồi đem đo quang

Đánh giá

'Đo đường kính để ính diện tích vùng da bị nhuộm mầu xanh hoặc tính nĩng độ dung địch xanh Evan đã thốt mạch Tính giá trị trung bình cho từng lơ Sau đĩ tinh ti lệ % ức chế sự thốt mạch xanh Evan của lơ thử xo với lơ chứng theo cơng thức tương tự cơng thức (2) mục 2.1.1

Trang 27

2.1.3.2 Gay tang tính thẩm thành mạch bằng acid acetic (17] Tiển hành

Sử đụng chuột nhất trắng trọng lượng 18-22 ạ, chuột được chia ngẫu nhiên thành các lơ:

Lơ chứng: dùng nước muối sinh lý

1.2 đổi chiếu: đùng thuốc chống viêm đã biết

Lơ thử: dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm

“Cho chuột uống thuốc hoặc nước muối sinh lý Sau đĩ 30 phút tiêm tỉnh mạch đuơi chuột 0.2 ml dung dịch xanh methylen 0.5% pha trong nước muối sinh lý Sau 3 phút

6 bung được hút riêng vào từng ống nghiệm, ly tâm, khử đục và đo mật độ quang trên máy đo quang để định lượng chất mầu thốt ra khỏi lịng mạch [24]

"Đánh giá

Tinh nồng độ xanh methylen thốt mạch trên mỗi chuột Tính giá trị trung bình cho từng lơ Tính ti lệ % ức chế thốt mạch của lơ thử so với lơ chứng theo “cơng thức tương tự cơng thức (2) mục 2.1

2.1.3.3 Gay tang tính thẩm thành mạch bằng oxazolon [29]

Zentel và Topert (1994) ding oxazolon gay thốt mạch xanh Evan để đánh giá tác dụng chống viêm tại chỗ của glucocoricoid

Tiến hành:

“Sử dụng chuột nhất đực chuột được chỉa ngẫu nhiên thành các lố: Lơ chứng: dịng dung mơi pha thuốc

Lơ đối chiếu: đùng thuốc chống viêm đã biết

Lơ thử: dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm

“Cao lơng sườn trấi chuột rồi bơi vào đĩ 50 gl dung dich oxazolon 40% trong ethanol (diện tích bơi khoảng 4 cm) để chuột nhạy cảm với chất kích thích Sau đĩ 13 ngày, tiêm tĩnh mạch chuột 0.2 ml dung dịch xanh Evan 0.5% Ngay sau đĩ, bơi 20 il oxazolon 4% trong ethanol vio sum phải chuột đã cạo lịng (diện tích bỏi khoảng 6 cm) Sau 3 giờ bởi thuốc hoặc dung mơi vào vùng da bị kích thích Sau

sm màng bụng 4 ml dung dịch acid acetic 0.3 Sau 1 giờ, giết chuột, dịch

Trang 28

24 gid gict chuot và cắt vùng da bị kích thích ngâm trong dung dich NaCl 0.9% khoảng 24 git loc lấy dịch đem đi đo quang ở bước sĩng 623 am

"Đánh giá

“Tính nồng độ dung dịch xanh Evan thốt mạch Tính t lẻ %: ức chế sự thốt ‘mach xanh Evan của lơ thử so với lơ chứng theo cịng thức tương tự cơng thức (2) mục 2.1.1.1

2.1.4 Mơ hình gây viêm màng phổi [29] Nguyên tắc

Viêm màng phổi là một hiện tượng vẻ viêm rỉ dịch phổ biến ở người Trong các thí nghiệm trên động vật cĩ thể gây viêm màng phối bằng các chất kích thích như histamin, bradykinin, prostaglandin yếu tổ gây mất bại tế bào mad, dextran, kháng nguyên, vi khuẩn và các chất kích thích khơng đặc hiệu như turpentin hay carageenin Viêm màng phi gây ra bởi catragecnin ở chuột được xem là một mơ hình gay viêm cấp rất tốt mà trong đĩ sự thốt dịch sự đi chuyển của bạch cầu và các chỉ số sinh hĩa khác liên quan tới phin ứng viêm cĩ thể được đo dễ dàng trong địch rỉ

Tin hank

Sử dạng chuột cổng đục trọng lượng 220260 g Lơ chứng: dùng dung mơi pha thuốc Lơ đối chiếu: dùng thuốc chống viêm đã biết

Lơ thứ: dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm

Gây mê chuột bằng ether co lơng bên sườn phi rồi lau cồn, rạch một vết nhỏ ào trong da ở đưới chân phải trước giữa xương sườn 7 và 8 mở rộng vết rạch bộc lộ cơ liên sườn rồi rạch một vết nơng hơn trên đĩ, thơng qua vết rạch tiêm vào khoang màng phổi 0.1 ml dung dịch carrageenin 2% việc tiêm phải được thực hiện nhanh để tránh gây tổn thương phổi vết thương được đĩng kín lại bằng một kẹp

Sau đồ cho chuột dùng thuốc hoặc dung mơi vào các thời điểm 1, 24, 48 giờ xau khi tiêm carrageenin

2 giờ sau khi tiêm carragecnin tiến hành giết chuột bằng ether hút hết địch rỉ

màng phổi vào trong một ống cĩ chia vạch để xác định thể tích dịch ri

“ngẫu nhiền thành các lơ:

Trang 29

Ngồi mơ hình trên cĩ thể gây viêm màng phổi chuột cong bing tính dấu thơng với cách tiến hành và đánh giá kết quả tương tự [19]

.Đánh giá

“Tính giá tr trung bình của thể tích dịch rỉ viêm ở mỗi lị và so sánh lơ thử với lơ chứng Dàng các liều khác nhau cĩ thể xác định được ED

Một số thơng số cĩ thể xác định:

+ Xác định số lượng bạch cầu trong dich rỉ bằng một máy đếm, + Xác định hoại ính của các ehzym tong lysosom

+ Xée dinh fibronectin + Xi dinh PGE

2.1.5 Mo hinh gay ban 46 [29] “Nguyên tắc

Mơ hình gây ban đỏ bằng tia UV được Wilhclrmi mơ tả lần đầu tiên (1949), ơng đã nhận thấy khả nảng làm chậm sự phát triển ban đỏ do tủa UV của phenylbutazon và các thuốc chống viêm khơng xteroid Sau đồ các nhà khoa học khác đã mở rộng và cải tiến phương pháp này bằng các cách kích thích khác

Tiến hành

Sử dụng chuột lang trắng cả 2 gi chia ngẫu nhiên thành các lơ:

Lơ chứng: dùng dung mơi pha thuốc

Lơ đối chiếu: dùng thuốc chống viêm da bit (indomethacin ligu 1.5 mg/kg: phenylbutazon ligu 4 mg/kg: acid acetylsalicyltligu 60 mg/kg),

Lo thir: dong thuốc đang nghiên cứu tác đụng chống viêm

5 “Trước khi iến hành thí nghiệm 18 giờ chuột được cạo lơng 2 bèn sườn và trên lưng Cho chuột uống 1/2 lượng thuốc nghiên cứu hoặc dung mơi Sau đĩ chuột được đặt vào trong 1 túi da đã được đục lỗ (kích thước 1.5 x 2.5 cm) cho phép tỉa UV chỉ chiếu vào vùng này Sử dụng đền tử ngoại nguyên bản Hanau 600W, làm nĩng đền 30 phút trước khi dùng và đặt đền cố định cách các con vật 20cm Chiếu tia UV trong 2 phút rồi cho chuột uống nốt 1/2 lượng thuốc hoặc dung mơi cịn l Bán đỏ được ghi lạ tại thời điểm 2 giờ và 4 giờ sau khi chiếu tỉa UV,

lạ, trọng lượng khoảng 350 ø chuột được

Trang 30

[Ngodi tia UV tia X cũng được sử dụng là yếu tố kích thích gây bạn đỗ (mơ ình do Hiribayashi và Graham để xuất, 1969) [39]

"Đánh giá

Dựa vào phương pháp tính điểm để đánh giá mức độ ban đỏ trên mỗi chuột: 0= khơng ban đỏ

1= bạn đồ yếu 2= ban đỗ mạnh -4= bạn đỗ rất mạnh

“Tính điểm trung bình của mỗi lơ Sau đĩ tính tỉ lệ % ức chế ban đỗ của lơ thử xo với lơ chứng theo cơng thức tương tư cơng thức (2) mục 2.1.L.1

Những chuột với kết quả là Ø và 1 được xem là đã được bảo về Các kết quả thủ được sau 2 và 4 giờ cĩ thể sơ bộ cho biết khoảng thời gian tác dụng và cĩ thể tính được EDu„

2.1.6, M6 hinh tao túi w hat (29, 39) “Nguyên tắc

Mơ hình tạo tối u hạt do Selye phát minh (1953) va duge Robert va Nezamis cải tiến (1957) Mơ hình sử dụng dầu ba đậu là chất kích thích gây ra một viêm bin cấp tương tựtình rang viêm vơ khuẩn đo tăng một thể tích lớn dịch thốt mạch

Tiến hành

“Sử dụng chuột cống cả 2 giống trọng lượng 150-200 g chuột được chia ngẫu nhiên thành các lơ;

Lơ chứng: dùng dung mơi pha thuốc

Lơ đối chiếu: dùng thuốc chống viêm đã biết (indomethacin) ‘Lo thi: dng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm

Lưng chuột được cạo lơng và sit tring Gay me chugs, ding mot kim rất mỗng tiêm 20 ml khơng khí vào vùng da giữa lưng Sau đĩ tiêm 0.5 ml dung dịch dầu ba ‘dau 1% trong đầu vừng vào trong túi khơng khí tránh để lọt khí Sau 48 gi, rút khơng khí trong túi Sau đĩ, hàng ngày cho chuột dùng thuốc hoặc dung mối Để inh giá tác dụng tại chỗ thuốc được tiêm trực tiếp vào túi khơng khí cùng thời

Trang 31

điểm kích ilanh thủy tính

Mo hình trên cĩ thể dùng các chất kích thích khác như carrageenin (Borix và Stevenson.1965) D-a-tocopherol (Glenn va cong sự 1963)

Đánh giá

“Tính thể tích trung bình địch thu được của các lơ Tính t lẻ #% ức chế viêm của 16 thử so với lơ chứng theo cơng thức tương tự cơng thức (2) mục 2.L.1.l

2.2 MO HINH GAY VIEM MAN TINH

2.2.1, Mé hinh gây u hat thy nghiém “Nguyên tắc

Khi đưa vào cơ thể một vật lạ khơng cĩ khả năng hấp thụ được như ammian, bơng thì cơ thể sẽ phản ứng bằng cách tập trung nhiều loại tế bào tạo ra mơ bào Mới và nguyễn bào sợi bao quanh vật lạ tạo thành một khối u gọi là u hạt thực nghiệm Quá trình tiến triển tạo u hạt thực nghiệm tương tự với tiến triển của một viêm mạn tính Một thuốc cĩ khả năng ức chế sự hình thành u hạt sẽ gĩp phần điều trị các bệnh viêm mạn tính Với các chất kích thích khác nhau ta cĩ các mơ hình gây

hạt thực nghiệm khác nhau

3.3.1.1 Gây u hạt thực nghiệm bang amian (18, 11]

Mơ hình tiến hành theo phương pháp của Ducrot ulou và cộng sự (1963) Tiến hành

Sử dụng chuột cống trắng cả 2 giống trọng lượng 100-140 g chuột dược chia ngẫu nhiên thành các lơ

Lơ chứng: dùng nước muối sinh lý

Lị đối chứng: đùng thuốc chống viêm đã biết

Lơ thử: dùng thuốc dang nghiên cứu tác dụng chống viêm

Dang 1 miu soi amian duimg kính khoảng 2 mrn trọng lượng 30 + Ì mạ được vê rồn và vấy tiệt khuẩn trong 2 giờ ở 160C

“Chuột được gây mê, cạo sạch lơng vùng lưng phía trên Dùng mỗi kéo bấm một lỗ nhỏ ở da rồi luồn mũi kéo vào để tách da lưng ra khơi cơ, cấy sợi amian vào

'Vào ngày thứ 4 hoặc thứ S giết chuột mở túi va thu dich vào trong:

Trang 32

nơi đã bĩc tách Đặt kẹp hoặc khâu nối liền chỗ mổ trên lưng Phẫu thuật tiến hành trong điều kiện vị khuẩn

'Cho chuột uống hoặc tim dưới da thuốc hoặc nước muối sinh lý vào mỗi buổi xáng trong 5 ngày liên tục, lần đầu cho thuốc ngay sau khi cấy sợi amian Chiều ngày thứ 5 kể từ ngày cấy amian, giết chuột bằng clorofomn bĩc tách khối u và cân tươi ngay

Đánh giá

“Tính trọng lượng thực của u hạt bằng trọng lượng cản được trừ đi trọng lượng của sợi amian cấy vào Tính trọng lượng trung bình của u hạt ở các lơ Tĩnh ti lệ % ức chế u hạt của lơ thử so với lơ chứng

2.2.1.2 Gây u hại thực nghiệm bằng bơng [29]

Day là mơ hình gây u hạt thực nghiệm đầu tiên do Meier và cộng sự (1950) tiến hành,

Tiến hành:

“Sử dụng chuột cống đực trọng lượng trung bình khoảng 200g chỉa ngẫu nhiên thành các lơ

Lơ chứng: dùng nước muối sinh lý

12 đối chiếu: đùng thuốc chống viêm đã biết

Lơ thử: đùng thuốc dang nghiên cứu tác dụng chống viêm

Gay mê chuột, cạo lơng ở lưng và sát trùng bảng cthanol 70" Rạch 1 vết ở thắt lung, ding một kìm tạo những đường dưới da và đặt một viên gạc bơng đã được tiệt trùng vào cả 2 bên xương bả vai Cho chuột uống thuốc hoặc dung mơi liên tục trong 7 ngày Ngày thứ 8 giết chuột, bĩc tách u hạt và sấy khơ đến khối lượng khơng đổi rồi cân

“Theo kinh nghiệm của các nhà nghiên cứu thì sự tạo thành u hạt xẽ mạnh hơn khi gac bơng được tẩm carrageenin

"Đánh giá

“Tính trọng lượng khơ thực của u hạt rồi nh giá trị trung bình của mỗi lơ Tính tỉ lệ % ức chế u hạt của lơ thử so với lơ chứng

Trang 33

`Với cách tiến hành và đánh giá tương tự các mơ hình trên, các nhà nghiền cứu đã để xuất, cải tiến thêm nhiều mơ hình gây u hạt thực nghiệm khác như gây áp xe bằng tỉnh dầu thơng (Lexy 1968): gây u hạt bằng mảnh kính (Vogel 1970): gây u hạt bằng bọt biển (Savena 1960); gây u hại bằng carraggeenin trên chuột lang (Robertson và Schwartz,1953) trên thỏ (MeCandlexs.1960) chuột cống (Pxodi và Romeo.1967): gay u hat bing polyvinyleorid (Rudas, 1960)

3.3.2 Mơ hình gây viêm da khớp thực nghiệm

2.3.2 Gây viêm đa khớp thực nghiệm bằng chất bổ trợ Ereund [19, 39] Mơ hình tiến hành theo phương pháp của Newbould B B (1963) Chất bổ trợ Freund 1a hdn hop cis cée vi khudin Mycobacterium (M buiyricum, M tuberculosis, M phlei) đã chết được pha trong parafin lỏng hoặc dấu khống hoặc dầu thực v Khi iêm chất này vào trong cơ thể chuột cống sẽ gây hội chứng giống viêm khớp

Tiến hành

Sử dụng chuột cống đực trắng trọng lượng trung bình khoảng 200 g chuột được chia ngẫu nhiên thành các lơ:

Lơ chứng: ding nước muối sinh lý

Lơ đối chiếu: dùng thuốc chống viêm đã biết

Lơ thứ: dùng thuốc đang nghiên cứu tác dụng chống viêm

“Cho chuột uống thuốc hoặc nước muối sinh lý Sau 1 ngày đo độ dày bàn chân phải sau của chuột Tiêm vào gan bàn chân phải xau 0.05 mÏ chất bổ trợ Cho chuột tuống thuốc 13 ngày liên tục kể từ khi tiêm chất bổ trợ Đến ngày thứ 13, đo độ dày "bần chân phải sau của chuột

`Ward và cộng sự (1962) đã tiến hành gây viêm đa khớp bằng chất sáp D phân lập từ trực khuẩn lao với cách làm tương tự trên

Đánh giá

Tinh ti lệ %€ tăng độ dày chân chuột trước khi tiêm và 13 ngày sau khi tiêm chất bổ trợ Sau đồ tính trung bình lệ % tăng độ dày chân của các chuột trong mỗi lơ Từ đĩ tính tỉ lệ % ức chế tăng độ dày của lị thử so với lư chứng Các cơng thức tính tương tự mục 2.1.1.1

Trang 34

gol ra cĩ thể đánh giá các tổn thương thứ phát (như xưng bàn chân trấ xau, xung các bàn chân trước sưng các tai và sưng đuơi) dựa vào mức độ nghiêm trong,

tổn thương: bình thường nh nặng vừa và nặng

2.2.2.3 Gay viêm đa khớp thực nghiệm bằng Mycoplasma arthritis [19] ‘Mo hình tiến hành theo phương phip cia Ward va Russel (1962), Wiesinger (1961

Tiến hành

Sir dung chuột cổng trắng trọng lượng 120-150 g chuột được chỉa ngẫu nhiên thành các lơ

Lơ chứng: dùng dung mơi pha thuốc L6 đối chiếu: dùng thuốc chống viêm đã biết

Lơ thử: đùng thuốc dang nghiên cứu tác dụng chống viêm

“Chuẩn bị Mycoplasma arthritis: nghién mot minh sarcom lympho Murphy cĩ chia Mycoplasma arthritis Sau a6 pha thành hỗn địch tong NaCl 0.9% và cho thêm 400.000 đơn vi penicillin vi 1.000.000 dom vi colistin methansulfonat Hồn dịch được ly im trong, 30 phút giữ lại dịch nổi phía trên,

“Tạo dịch rỉ gây viêm khớp: Tiêm 30 ml khơng khí vơ khuẩn vào dưới da lưng chuột để tạo tối khí rồi tiêm 2 ml dich chita Mycoplasma arthritis thu duge tren ào túi khí Sau 6-0 ngày, hút dịch từ trong túi, dịch này cĩ chứa nhiều vi khuẩn Mycoplasma arthritis bi nghiệm tiến hành trong điều kiện vơ khuẩn

(Gây viêm khớp: tiêm màng bụng chuột Irnl hồn hợp đồng thể tích thuốc hoặc dung mơi và dung dich dextran 6% Sau đĩ cho chuột uống hoặc tiêm dưới da thuốc hoặc dung mơi hàng ngày trong 8 ngày liên tục Hàng ngày quan sất và ghỉ li các

chỉ số viêm Đánh giá

Quan sát hàng ngày các nhĩm khớp: khớp chày-cỞ chân trước và sau: khớp xương cổ chân trước và sau; khớp giữa các đốt ngĩn chân trước và sau Từ đĩ xác, định chỉ số viêm khớp dựa vào phương pháp tính điểm:

.0: bình thường 1: bạn đồ nhệ

Trang 35

vữa bạn đỗ vừa xưng 3: sume ti

“Cơng số điểm của các ngày ta được một chỉ sổ viêm khớp

“Tính tỉ lệ % ức chế viêm khớp của lị thử so với lị chứng theo cơng thức tương tự cơng thức (2) mụe 2.1.1.1

2.3 MƠ HÌNH NGHIÊN CỨU CƠ CHE CHONG VIEM

3.3.1 Gây kết tập bạch cầu đa nhân [29] Nguyên tác

Khi cĩ tác nhân gây viêm tấn cơng vào cơ thể, chúng sẽ tạo ra các chất hĩa ứng động thu hút và tập trung bạch cấu tới nơi cĩ các chất hĩa ứng động đĩ Sự cĩ mật quá nhiều bạch cầu sẽ làm khuếch đại phản ứng viêm gây ra những tổn thương trấm trọng cho mơ và cơ thể Vì vậy một trong những cơ chế chống viêm là ức chế hĩa ứng động bạch cấu Trong mơ hình thí nghiệm này sử dụng chất gây hĩa ứng ‘dong bach cfu li formyl-L-methionyl-L-leueyl-L-phenylamin (FMLP)

Tiến hành

,Chuẩn bị tế bào bạch cầu đa nhân: Tiêm vào màng bụng chuột cống 10 ml ‘dung dich casein natri 6%, Sau đĩ 17 gi thu dich rỉ màng bụng để tạo hỗn dịch các tế bào bạch cầu đa nhân Các tế bào được rửa 2 lần trong dung địch nước muối đẳng

trương rồi pha thành hồn dịch với nồng độ 15 x 0° tế bào/ml

“Gây kết tập bach cầu đa nhân: Thuốc thử và thuốc đối chiếu (pemtoxiphyllin) được hịa tan trong dung dịch nước muối đẳng trương Hồn dịch tế bào được ủ với thuốc trong 10 phat 6i them FMLP pha trong dimethyl sulfoxid (DMSO) &é gay kết tập bạch cầu Sự kết tập bạch cầu đa nhân được thực hiện trong máy tập trung Born

"Đánh giá

So sánh sự kết tập bạch cầu đa nhân giữa nhĩm thử và nhĩm chứng dựa trên kết quả do từ máy

3.3.2 Gây hĩa ứng động đại thực bào [30] “Nguyên tắc

Mơ hình sử dụng một chất gây hĩa ứng động đại thực bào và qua đĩ đánh giá khả năng ức chế hĩa ứng động đại thực bào của thuốc

Trang 36

Tiến hành

Sir dung chuột cổng dục, trọng lượng 200-220 ø Dùng thioglycollat là chất cây hĩa ứng động đại thực bào

Chuẩn bị các tế bào đại thực bào: tiêm màng bụng chuột 5 ml canh thioglycollat 3% 3 ngày liên tiếp xau khi tiêm thioglycollat cho chuột uống thuốc hoặc nước muối Vào ngày thứ 4 thu lấy các tế bào trong dịch rỉ màng bụng bằng cách rửa khoang màng bụng với dung dịch nước muối đẳng trương Các tế bào được nửa 2 lấn với nước muối rồi pha thành hỗn dịch nồng độ 1x 10° tế bào/ml trong mơi trường lạnh RPMI-1640 khơng cĩ phenol đỏ và được bổ sung huyết thanh be 10, penicilin 100 U/ml và steptomycin 100 ng/ml

“Gây hĩa ứng động đại thực bào: các tế bào được ủ ở 37'C và 5% CO, trong 2 giờ để cho các đại thực bào bám vào bề mật đĩa nuơi cấy Các tế bào Khơng bám sẽ bị loi bỏ bằng cách cửa mạnh với nước muối đẳng trương ấm 90% các tế bào bám ào đĩa là các đại thực bào

Đánh giá

Số lượng đại thực bào được đếm bằng máy huyết tốc kế So sánh kết quả giữa mẫu thử và mẫu chứng

2.3.3 Thí nghiệm về các chất chuyển hĩa của aci

2.3.3.1 Thí nghiệm oxy hĩa acid arachidonic bởi COX-1 Tiến hành

Lấy 50 l enzym COX-I tái tổ hợp tỉnh khiết nĩng độ 1 wg/ml pha vào trong Tris-HCI 100 mM, EDTA 0.5 mM pH 8.0, phenol | mM hematin 1 yM rồi ủ với 2 til dung dich chat ức chế hoặc DMSO (mẫu chứng) tron 15 phút Sau đĩ phản ứng được bắt đầu bằng cách thêm 5 Í ['“CỊ- acid arachidonie 1 uM (0.005 C) để thụ cđược nồng độ cuối cùng là 0.1 uM ư ở nhiệt độ phịng Sau 7 phút phần ứng được đăng lại bằng cách thêm 5 il HCL M và 50 gi acetonitil Lấy 50 ul mẫu phản ứng cho lên cột sắc ký HPLC để tách các chất Các chất chuyển hĩa của acid arachidonic và acid arachidonic được tách ra và được định lượng bằng máy phát hiện sắc phổ phống xạ

Trang 37

"Đánh giá

“Tính tỉ lệ % acid arachidonic chuyển hĩa thành prostaglandin So sánh tỉ lệ đĩ giữa mẫu thử cĩ chất ức chế và mẫu chứng khơng cĩ chất ức chế

2.3.32 Tao cic eicosanoid tir “C-acid arachidonie ở tế bào tiểu cầu Eieosnoid là tên gọi chung cho các sản phẩm chuyển hĩa của acid arachidonic bao gồm prostaglandin, leucotrien,thromboxan Prostaglandin gay ting tính thấm thành mạch gây phù ban đỏ gây đau Lucotricn cĩ tính hĩa ứng động bạch cấu, kích thích bám đính tế bào bạch cầu vào tế bào nội mơ Thromboxan kích thích sự kết tập tiểu cầu Do đĩ, ức chế sự hình thành các chất này là một cơ chế chống viêm quan trọng

Tiến hành

Chuẩn bị các tế bào tiếu cấu: lấy máu tinh mach cánh tay của người tỉnh nguyện khỏe mạnh và tập trung trong các ống nghiệm chất đẻo cĩ sắn nati ciưat (nồng độ cuối cùng 1a 0.38%) Khong quá 1 giờ trước khi làm thí nghiệm ly tâm máu ở 100 g trong L5 phút thủ được huyết tương giàu tiểu cầu (khoảng 2.5 x 10" tiêu cấu/), bảo quản ở 20C

“Tạo các eieosanoid: huyết tương giàu tiểu cầu được trộn đồng thể tích với dung dich citrat rong glucose (27.35 g trinari citrat.2H,0, 1.47 g acid citric va 27.74 g elueose.2H,O và 1 lít nước) và được ly tâm ở 1000 g trong 20 phút (4'C) Cận được pha thành hỗn địch trong dung dịch nước muối bằng thể tích ban đầu Lấy 0.495 mt "hỗn dịch tiểu cầu này ủ với thuốc thử ở 37°C trong 15 phút Sau đĩ bắt dầu tạo các sieosanoid bằng cách thêm 5 gl dung dịch 1-''C-acid arichidoaic (50 Cưmol 9 x 10* Cif) Sau 5 phat, dimg phin ứng bằng cách thêm 0.5 ml aceton đã làm lạnh/0,I ‘ml HCL IN, fam lanh t6i 0°C và chiết 2 lần với 3 ml cthylaccta/lần Dịch chiết được lầm bay hơi dung mơi sau đĩ hịa tan cận trong 02 ml methanol rồi đưa lên cột sắc ky HPLC để tách các chất Xác định các 'C-cicosanoid tạo thành bằng máy phát hiện nhấp nháy

Đánh giá

“So sánh sự tạo thành TXB, và PG; giữa mẫu thử và mẫu chứng

Trang 38

23

3 Tạo prostaglandin 6 bach cầu da nhân trung tính Ngun tác

Mơ hình sử dụng lipopolysaecharide (LPS) để kích thích xinh POE, Cách tiến hành do Herrmana và cộng sự để xuất lần đầu (1990) sau đĩ Weithmann và cộng xự cải tiến (1999)

Tiến hành

Nuơi cấy các tế bào bạch cầu đa nhân trung tính với mật độ 2.5 x 107 tế bào/T trong mơi trường RPMI 1640 cĩ bổ sung nati pyruvat Ì mol huyết thanh bể 5%, ‘glutamin 2 mmoV/ va 100 Ul/ml penieilin/treptomycin Tiến hành ủ bạch cầu da nhân trung tính trong mơi trường RPMI 1640 với acid acetyl xalicylic 100 mol trong 60 phút (37C 5% CO,) và sau đĩ rửa 4 án với mơi trường Lấy 0.25 mÌ mẫu (2.5 x 10” bạch cầu đa nhân/ mơi trường) ù với LPS 0,1 mẹ/ml cùng với thuốc thử trong 18 gid (dia 96-well, 37°C, 5% CO,) Tạo các eicosanoid bằng cách thêm 7 x

10° mol/l chất mang ion calci A 23 187 U 30 phút ở 37°C Sau đĩ các đĩa được ly

tâm 6 400 g trong 15 phút PGE, tạo thành nằm trong phần dịch nổi phía trên, được xác định bằng kit ELISA

Đánh giá

So sinh nồng độ PGE, tạo thành giữa mẫu cĩ thuốc thử và mẫu chứng khơng cĩ thuốc

3.3.3.4 Tao leucotrien By lên hành

“Chuẩn bị các tế bào bạch cầu: lấy 40 mÌ máu tươi đã citrat hĩa được trộn lắn với 8 ml đệm PMI6 gồm cĩ deutran 6 (trọng lượng phân tử là 480 000) và được ư ở nhiệt độ phịng trong 1 giờ Dịch nổi phía trên gồm cĩ các tế bào bạch cấu, lấy địch ra và pha lộng 1:1 với PMI6 rồi ly tâm ở 300 g trong 1Š phút Phần cắn được hịa tong PM16 và điều chỉnh để cĩ I0” tế bào/1

“Tạo leueoien: lấy 0.3 ml hén dịch tế bào ở trên để tiến hành thí nghiệm tế bào bạch cầu

chuyển hĩa acid arachidonie nội sinh thành LTB, (ở 37) Ống nghiệm phản ứng ‘26m cĩ 2 mmolJ CaCI, 0.5 mmol/ MạCT, và thuốc nghiên cứu Sau khi ủ 15 phút, phản ứng được bắt đầu bằng cách thêm 12.5 jg chit mang ion calci 23 187 và 2 ng

Trang 39

slutathione, Sau 5 phét, phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 30 yl HCL 0.1 M& ỨC: Sau đồ ly tảm 2 phút ở ỨC, phần dịch nổi phía trên được đem đi sắc ký HPLC để tách leueoien Bị Dùng các thuốc chuẩn đã biết để xác định các đồng phân cỉx-, tưanx- và cpi-LTB, Việc phân biệt 3 đồng phân cĩ thể theo đối bằng phép do quang ở bước sĩng 278 am

Đánh giá

So sánh kết quả giữa mẫu cĩ thuốc thử với mẫu chứng khơng cĩ thuốc và mẫu cĩ thuốc đã biết tác dụng

3⁄34 Gây giải phĩng các cytokin từ tế bào bạch cầu [29] “Nguyên tắc

Các eytokin đại diện cho một nhĩm các pepid cĩ hoạt tính sinh học cao “Chúng liên quan tới nhiều quá trình tế bào như phản ứng viêm miễn dịch và nhiều đáp ứng khác Việc khĩa các IL-1 và TNE-« đã giúp điều tr thành cơng bước đầu trên các bệnh nhân viêm khớp dạng thấp viêm ruột hoặc các bệnh thải mảnh ghép, Mơ hình gây giải phĩng cytokin được dùng để phát hiện các thuốc mà tác động với lipopolysaccharid trong quá trình giải phĩng cytokin từ tế bào bạch cầu đơn nhân,

Tiến hành:

“Chuẩn bị tế bào bạch cấu: lấy 10 ml máu tươi đã ciưat hĩa pha lộng 1:1 voi đệm PM 16 va được lớt với 15 ml dung dịch L.ymphoprep”" sau đĩ ly tâm ở 400 trong 30 phút ở 20 °C Phần tế bào là một vịng trắng xuất hiện ở giữa 2 pha và được ấy ra cẩn thân bằng 1 ống tiêm, pha lỗng I:1 với PM 16 rối ly tam lại trong 15 phút Củn được rửa sạch với 10 mơi trường RPMI 1640 cĩ thêm L-glutamin 300 mg/l Phần tế bào đã rửa được cho vào trong 1 mÏ mơi trường RPMI 1640 cĩ thêm L-gluamin 300 mại HEPES 25 mmol huyét thanh bề 5% và penicilivtreptomyein 100 IU/ml Điều chỉnh hồn dịch tế bào tới khoảng 5 x 10” tế bào/ml

“Tạo các cytokin: tiến hành trong các đĩa 96-well rất nhỏ Lấy 0.23 mÌ hỗn dịch tế bào, 500 ng LPS thuốc nghiên cứu hịa vào trong 0.01 ml DMSO/nước (1:10)

tế bào được ủ trong tủ thường ở 37'C/5% CO, thời gian ủ thường 20 giờ (xác định IL‹6 thì 4 giờ IL-8 thì ủ 1 giờ) Phản ứng đừng lại bằng cách đặt đĩa vào

Trang 40

trong bat nude đá Sau đĩ ly tâm đĩa tại 2000 rpm trong 2 phat, Ding kit E thích hợp để xác định nồng độ cytokin

Đánh giá

XXác định nồng độ cytokin và so sánh giữa mẫu dùng thuốc với mẫu chứng khơng dùng thuốc