bài giảng triacetyl hesperetin

TỔNG HỢP VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO VÀ GÂY APOPTOSIS TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ VÚ MCF-7 CỦA 3’,5,7- TRIACETYL-4’-METHOXYFLAVANON Hoàng Thị Kim Dung 1 , Nguyễn Cửu Khoa 1 , Nguyễn Ngọc Hạnh 1 Nguyễn Thụy Vy 2 , Hồ Huỳnh Thùy Dương 2 1 Viện Công nghệ Hóa học, Viện KH & CN Việt Nam 2 Phòng Sinh học phân tử, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên 1. Đặt vấn đề: Hesperetin (3’,5,7-trihydroxy-4’-methoxyflavanon) là một hợp chất bioflavonoid chống oxy hoá có mặt trong các cây họ cam chanh [5]. Hesperetin cũng được tìm thấy có khả năng giảm nguy cơ phát triển ung thư do ức chế một số loại enzyme kích hoạt các procarcinogen [4,6]. Vì vậy nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất từ hesperetin nhằm làm tăng hoạt tính sinh học là một nhiệm vụ đặt ra cho nhiều nhà khoa học. Ở nghiên cứu này, chúng tôi tổng hợp một dẫn xuất của hesperetin (3’,5,7- triacetyl-4’-methoxyflavanon) và thử hoạt tính chống ung thư bằng phương pháp gây độc tế bào và khả năng cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7. 2. Nguyên liệu và phương pháp: 2.1. Nguyên liệu: - Hesperetin được thủy phân từ hesperidin, làm sạch và đạt độ tinh khiết để tổng hợp tại Phòng Công nghệ hữu cơ – Viện Công nghệ Hoá học [2]. - Anhydric acetic, pyridine, các hoá chất khác – Merck, Sigma. - Acetone, CHCl 3 và các dung môi khác đạt tiêu chuẩn phân tích. 2.2. Phương pháp tổng hợp 3’,5,7-triacetyl-4’-methoxyflavanon: Hesperetin được acetyl hoá bằng anhydric acetic trong pyridine ở nhiệt độ thường trong 24h sẽ tạo thành 3’,5,7-triacetyl-4’-methoxyflavanon. Sản phẩm tạo thành được làm sạch bằng sắc ký cột và phân tích cấu trúc dựa trên các phổ IR, LC- MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR. 2.3. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào: [3] Phương pháp Sulforhodamine B (SRB): dùng để đánh giá khả năng gây độc tế bào của tác nhân nghiên cứu. Thử nghiệm dựa vào khả năng của SRB, là thuốc nhuộm aminoxanthene màu hồng sáng với hai nhóm sulfonic gắn tĩnh điện với protein của các tế bào sau khi được cố định bằng TCA (trichloroacetic acid). Tế bào được nuôi trong đĩa 96 giếng. Sau khi ủ 24 giờ, tế bào được xử lý với thuốc ở những nồng độ khác nhau trong 48 giờ. Sau đó, tế bào được cố định bằng TCA 50% và nhuộm với SRB 0.2%. Tổng lượng protein tế bào được nhuộm phản ánh số lượng tế bào sống sau khi xử lý với hoạt chất, và được đánh giá bằng phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 492 nm. 2.4. Phương pháp gây apoptosis (chết theo chương trình): [3] Thử nghiệm xác định hiện tượng DNA phân mảnh: 5 x 10 6 tế bào đã qua cảm ứng thuốc được ly giải trong 600 μl dung dịch ly giải (Tris-HCl 10 mM pH8, EDTA 5 mM, NaCl 100mM, Triton X-100 0.2%) trong 10 phút trên đá. Sau đó, dịch ly giải được ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 14.000 vòng/phút. Thu nhận dịch nổi, ủ với 1 mg/ml RNase A ở 37 o C trong 2 giờ. Mẫu được tách chiết hai lần với phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1) và một lần với chloroform: isoamyl alcohol (24:1). Sau khi tủa với ethanol, DNA được phân tích trên gel agarose 2% bằng phương pháp điện di ở 50 V trong 1 giờ. Trong quá trình apoptosis ở tế bào động vật có vú, endonuclease được hoạt hoá sẽ phân cắt cấu trúc nhiễm sắc chất tại liên kết giữa các nucleosome tạo thành những đoạn nhỏ có kích thước là bội số của 180 - 200 bp. Khi điện di trên gel agarose những đoạn này hình thành “thang DNA”. Nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy campthotecin có khả năng gây nên sự phân cắt đặc hiệu DNA bộ gene ở nhiều dòng tế bào ung thư như MCF-7, HCTT116, HL-60, U-937. Chúng tôi sử dụng tế bào MCF-7 cảm ứng với campthotecin ở nồng độ 0,02 μg/ml trong 0, 36 và 48 giờ và 3’,5,7-triacetyl-4’- methoxyflavanon ở nồng độ gây ức chế 50 % (IC 50 ) sự tăng trưởng của tế bào. 3. Kết quả và thảo luận: 3.1. Nhận dạng cấu trúc: Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Electrotherma – Viện Công nghệ Hoá học. IR được đo trên máy Bruker – Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, 1 H-NMR và 13 C-NMR được đo trên máy Bruker 500MHz, phổ khối MS và sắc ký lỏng LC đo trên máy Agilent – Viện Hoá học. Sản phẩm là dạng bột màu trắng có nhiệt độ nóng chảy 135-139 o C, độ sạch trên 97%. Phổ UV-Vis cho hai mũi cực đại tại 315nm và 261nm. Phổ IR (KBr, cm -1 ) cho các tín hiệu ở 2910, 1771, 1692, 1619, 1436, 1192, 862, 805, 639. Phổ 1 H-NMR δ (ppm): 2.264 (3H, s, -CH 3 ), 2.273 (3H, s, -CH 3 ), 2.295 (3H, s, -CH 3 ), 3.794 (3H, s, -OCH 3 ), 3.300-3.240 (H 3 , dd, J=13Hz và J= 16.5Hz), 2.736-2.697 (H 3 , dd, J=3Hz và J= 16.5Hz), 5.630-5.604 (H 2 , dd, J=13Hz và J= 3Hz), 6.691-6.687 (H 6 , d, J=2Hz), 6.875-6.871 (H 8 , d, J=2Hz), 7.186-7.169 (H 5’ , d, J=8.5Hz), 7.304-7.300 (H 2’ , d, J=2Hz), 7.422-7.401(H 6’ , dd, J=2Hz và J=8.5Hz). Phổ 13 C-NMR δ (ppm): 20.445 (- CH 3 ), 20.875 (-CH 3 ), 20.938 (-CH 3 ), 168.484 (C=O ester), 168.690 (C=O ester), 168.828 (C=O ester), 43.795 (C 3 ), 56.066 (-CH 3 ), 78.362 (C 2 ), 109.353 (C 8 ), 110.905 (C 6 ), 111.623 (C 10 ), 112.869 (C 5’ ), 121.641 (C 2’ ), 125.789 (C 6’ ), 130.722 (C 1’ ), 139.338 (C 3’ ), 150.821 (C 4’ ), 151.345 (C 9 ), 155.814 (C 5 ), 162.819 (C 7 ), 189.350 (C 4 ). MS (M+H + ) : 429 tương đương với trọng lượng phân tử M=428 3.2. Kết quả xác định hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp SRB: Thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7: Hesperetin (ppm) %I trung bình %I lần 1 %I lần 2 %I lần 3 STD (độ lệch chuẩn) 80 62.592 61.993 69.620 56.164 6.75 60 60.784 63.469 70.253 48.630 11.06 40 53.303 57.934 50.949 51.027 4.01 20 22.632 30.627 17.405 19.863 7.03 1 -6.533 -7.011 3.165 -15.753 9.47 0 0.000 0.000 0 0 0.00 IC50(ppm) 37.655 34.190 39.434 39.341 3.00 2036 bp 1636 bp 1018 bp 506 bp 1 2 3 4 5 3’,5,7-triacetyl-4’- methoxyflavanon (ppm) %I trung bình %I lần 1 %I lần 2 %I lần 3 STD 20 70.844 75.000 66.781 70.751 4.11 15 67.945 73.418 66.781 63.636 4.99 10 58.421 62.025 60.274 52.964 4.81 5 20.881 20.253 25.000 17.391 3.84 1 5.836 13.291 -1.712 5.929 7.50 0 0.000 0.000 0 0 0.00 IC50(ppm) 8.896 8.561 8.544 9.583 0.60 Kết quả thử nghiệm cho thấy khả năng gây độc tế bào của 3’,5,7-triacetyl-4’-methoxyflavanon (IC 50 = 8.9µg/ml) cao hơn hesperetin (IC 50 = 37.66µg/ml). 3.2. Kết quả xác định khả năng gây apoptosis: Từ kết quả IC 50 = 8.9µg/ml, chúng tôi chọn nồng độ mẫu thử của 3’,5,7-triacetyl-4’-methoxyflavanon là 9 µg/ml. Giếng 1: thang 100 bp Giếng 2: tế bào MCF-7 xử lý với mẫu ở nồng độ 9 µg/ml trong 36 giờ Giếng 3: tế bào MCF-7 xử lý với mẫu ở nồng độ 9 µg/ml trong 48 giờ Giếng 4: tế bào MCF-7 xử lý với camptothecin ở nồng độ 0.02 µg/ml trong 48 giờ Giếng 5: tế bào MCF-7 không xử lý Ở mẫu 36 và 48 giờ sau cảm ứng (giếng 2, 3), sự phân mảnh rất rõ nét với hình thái đặc trưng của “thang DNA”, chứng tỏ lúc này DNA đã bị phân cắt mạnh. Như vậy tại thời điểm này, quần thể tế bào đang ở giai đoạn muộn của quá trình apoptosis. Điều này cho thấy 3’,5,7-triacetyl-4’-methoxyflavanon đã cảm ứng quá trình apoptosis trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 ở các điều kiện khảo sát. 4. Kết luận: Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy 3’,5,7-triacetyl-4’-methoxyflavanon là một dẫn xuất có khả năng chống sự tăng sinh mạnh hơn hesperetin thể hiện ở khả năng gây độc và gây apoptotic trên dòng tế bào MCF-7. Kết quả này góp phần đáng kể nâng cao khả năng sử dụng của hesperetin. Summary SYNTHESIS AND DETERMINE ANTIPROLIFERATIVE ACTIVITY AND APOPTOSIS INDUCTION ON MCF-7 LINE OF 3’,5,7-TRIACETYL-4’- METHOXYFLAVANON The present study was synthesised 3’,5,7-triacetyl-4’-methoxyflavanon by acetylation of hesperetin . The cell proliferation assay of MCF-7 tumor cell was determined by the Sulforhodamine B (SRB) test. Apoptosis of 3’,5,7-triacetyl-4’- methoxyflavanon treated cells was determined by agarose gel DNA electrophoresis. Our results showed that this derivative is a more powerful antiproliferative derivative than hesperetin, with cytostatic and apoptotic effects on MCF-7 tumor cell. Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Hương Thảo, Võ Văn Lẹo, Ngô Thu Vân, Trần Hùng, Khảo sát Flavonoid từ vỏ quít, Tạp chí Dược học - số 5/2001. 2. Hoàng Thị Kim Dung, Nguyễn Cửu Khoa, Nguyễn Ngọc Hạnh, Nguyễn Thị Thu Hương, Hồ Việt Anh, So sánh hoạt tính chống oxy hóa của một số flavonoid (dạng glucosid và dạng genin) chiết từ hoa hòe và vỏ quýt, Tạp chí Dược liệu, Tập 11, số 5, trang 185-188 (2006). 3. Hồ Huỳnh Thùy Dương, Báo cáo tổng kết đề tài Xây dựng và hoàn chỉnh các quy trình dùng trong sàng lọc tính kháng phân bào của cây thuốc ở mức độ tế bào và phân tử, Chương trình Nghiên cứu cơ bản, Sở Khoa học và Công nghệ Tp.HCM 2007. 4. Davicco Marie-Jeanne (FR); Horcajada Marie Noelle (FR); Morad Christine (FR); Coxam Veronique (FR), Use of Hesperidin or one of its derivatives for Making a madicine for bone formation stimulation, Agronomique Inst. Nat. Rech. (FR), 2004-01-08. 5. Ji Young Kim, Kyung Jin Jung, Jae Sue Choi, Hae Young Chung, Hesperetin : a Potent Antioxidant Againt Peroxynitrite, Taylor & Francis, Volume 38, Number 7 July, 2004. 6. Yanling Li, Hao Fang, Wenfang Xu, Recent advance in the research of flavonoids as anticancer agents, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2007, 7, 663-678. . các dẫn xuất từ hesperetin nhằm làm tăng hoạt tính sinh học là một nhiệm vụ đặt ra cho nhiều nhà khoa học. Ở nghiên cứu này, chúng tôi tổng hợp một dẫn xuất của hesperetin (3’,5,7- triacetyl- 4’-methoxyflavanon). Phương pháp tổng hợp 3’,5,7 -triacetyl- 4’-methoxyflavanon: Hesperetin được acetyl hoá bằng anhydric acetic trong pyridine ở nhiệt độ thường trong 24h sẽ tạo thành 3’,5,7 -triacetyl- 4’-methoxyflavanon AND APOPTOSIS INDUCTION ON MCF-7 LINE OF 3’,5,7 -TRIACETYL- 4’- METHOXYFLAVANON The present study was synthesised 3’,5,7 -triacetyl- 4’-methoxyflavanon by acetylation of hesperetin . The cell proliferation assay