giáo trình cấy mô Lê Lý Thùy Trâm

Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 1 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ BÀI 1: M UỞĐẦ  ^ ! ^  1.CÁC THI T B C B N C A M T PHÒNG THÍ NGHI M NUÔI C Y MÔ VÀ T Ế Ị Ơ Ả Ủ Ộ Ệ Ấ Ế BÀO TH C V TỰ Ậ a. Phòng r a và c t n cử ấ ướ - Máy c t n c 1 l nấ ướ ầ - Máy c t n c 2 l nấ ướ ầ b. Phòng h p – s yấ ấ - Autoclave - T s y 60 – 200ủ ấ o C c. Phòng chu n b môi tr ngẩ ị ườ - Cân phân tích (chính xác n 0,0001 g)đế - Cân k thu t (chính xác n 0,01 g)ỹ ậ đế - pH kế - Máy khu y tấ ừ - T l nhủ ạ - Lò vi sóng (microwave) d. Phòng thao tác nuôi c yấ - T c y vô trùng (laminar)ủ ấ - Qu t thông gióạ - èn t ngo i treo t ngĐ ử ạ ườ e. Phòng nuôi cây - Các giàn k có g n èn hu nh quangệ ắ đ ỳ - Máy i u hòa nhi t đ ề ệ độ - Máy l c n m ngangắ ằ - T mủấ f. Phòng thí nghi mệ : (phòng này dùng ti n hành các phân tích sinh hóa, phân t và di truy n)để ế ử ề - Kính hi n vi 2 m t ( phóng i 1000 l n)ể ắ độ đạ ầ Công Ngh Sinh H c Vi t Namệ ọ ệ - 1 - Biotechnology Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 2 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ - Kính lúp 2 m t ( phóng i 75 l n)ắ độ đạ ầ - Microtome - Máy nh k thu t sả ỹ ậ ố - H th ng èn chi uệ ố đ ế - Quang ph k …ổ ế Công Ngh Sinh H c Vi t Namệ ọ ệ - 2 - Biotechnology Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 3 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ 2.CÁC NHÂN T M B O THÀNH CÔNG Ố ĐẢ Ả TRONG NUÔI C Y Ấ MÔ T BÀO TH CẾ Ự V TẬ Có 3 nhân t chính:ố - B o m i u ki n vô trùngả đả đ ề ệ - Ch n úng môi tr ng và chu n b môi tr ng úng cáchọ đ ườ ẩ ị ườ đ - Ch n mô c y và x lý mô c y thích h p tr c và sau khi c y.ọ ấ ử ấ ợ ướ ấ 2.1. Ý ngh a c a vô trùng ĩ ủ trong nuôi c yấ mô và t bào th c v tế ự ậ Môi tr ng nuôi c y mô và t bào th c v t có ch a ng, vitamin, mu i khoáng… r t ườ để ấ ế ự ậ ứ đườ ố ấ thích h p cho các lo i n m và vi khu n phát tri n. Do t c phân bào c a n m và vi khu n ợ ạ ấ ẩ ể ố độ ủ ấ ẩ l n h n r t nhi u so v i t bào th c v t, n u trong môi tr ng nuôi c y ch nhi m m t vài bào ớ ơ ấ ề ớ ế ự ậ ế ườ ấ ỉ ễ ộ t n m ho c vi khu n thì chử ấ ặ ẩ ỉ sau vài ngày n m t tu n, toàn b b m t môi tr ng và mô nuôi c y s ph y m t ho c đế ộ ầ ộ ề ặ ườ ấ ẽ ủđầ ộ ặ nhi u lo i n m và vi khu n. Thí nghi m ph i b i vì trong i u ki n này mô nuôi c y s ề ạ ấ ẩ ệ ả ỏđ đề ệ ấ ẽ không phát tri n và ch t d n.ể ế ầ 2.2 Ngu n t p nhi mồ ạ ễ Có 3 ngu n t p nhi m chính:ồ ạ ễ - D ng c thu tinh, môi tr ng nuôi c y và nút y không c vôụ ụ ỷ ườ ấ đậ đượ trùng tuy t iệ đố - Trên b m t ho c bên trong mô c y t n t i các s i n m, bào t n mề ặ ặ ấ ồ ạ ợ ấ ử ấ ho c vi khu nặ ẩ - Trong quá trình thao tác làm r i n m ho c vi khu n theo b i lên bơ ấ ặ ẩ ụ ề m t môi tr ngặ ườ 2.3 K thu t vô trùngỹ ậ 2.3.1 Vô trùng d ng c thu tinh, nút y và môi tr ngụ ụ ỷ đậ ườ a. D ng c thu tinhụ ụ ỷ Thông th ng các d ng c thu tinh dùng trong các thí nghi m th ng c x lý b ng ườ ụ ụ ỷ ệ ườ đượ ử ằ dung d ch sulfocromate m t l n u tr c khi a vào s d ng; v sau ch c n r a s ch b ng ị ộ ầ đầ ướ đư ử ụ ề ỉ ầ ử ạ ằ xà phòng, tráng s ch b ng n c c t và th t ráo tr c khi s d ng.ạ ằ ướ ấ để ậ ướ ử ụ Trong tr ng h p các d ng c thu tinh dùng trong các thí nghi m nuôi c y mô và t bào ườ ợ ụ ụ ỷ ệ ấ ế th c v t òi h i vô trùng, có th kh trùng trong t s y nhi t cao trong nhi u phút ho c ự ậ đ ỏ ể ử ủ ấ ở ệ độ ề ặ Công Ngh Sinh H c Vi t Namệ ọ ệ - 3 - Biotechnology Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 4 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ nhi u gi . Các d ng c này luôn c gói trong gi y nhôm ho c h p kim lo i tránh b ề ờ ụ ụ đượ ấ ặ ộ ạ để ị nhi m tr l i sau khi ã khễ ở ạ đ ử trùng. B ng 1.1ả : Th i gian kh trùng d ng c thu tinh b ng nhi t và nhi t khờ ử ụ ụ ỷ ằ ệ ệ độ ử trùng Nhi t (ệ độ oC) Th i gian kh trùng(phút)ờ ử 160 45 170 18 180 7,5 190 1,5 Công Ngh Sinh H c Vi t Namệ ọ ệ - 4 - Biotechnology Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 5 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ b. Nút yđậ Th ng dùng nh t là các nút y làm b ng bông gòn không th m n c.Nút ph i t ng i ườ ấ đậ ằ ấ ướ ả ươ đố ch t m b o b i không i qua c, ng th i n c t môi tr ng không b b c h i quá dặ đểđả ả ụ đ đượ đồ ờ ướ ừ ườ ị ố ơ ễ dàng trong quá trình nuôi c y. Bông không th m n c là lo i nút n gi n nh t nh ng có các ấ ấ ướ ạ đơ ả ấ ư nh c i m sau:ượ đ ể - N u khi h p nút bông b t ho c dính môi tr ng thì v sau s r t d b nhi m n m, nh t ế ấ ị ướ ặ ườ ề ẽ ấ ễ ị ễ ấ ấ là v i nh ng thí nghi m ti n hành trong m t th i gian dàiớ ữ ệ ế ộ ờ - Thao tác làm nút bông ch m, không thu n ti n khi nuôi c y trên quiậ ậ ệ ấ mô l nớ - Ch dùng c vài l n là ph i bỉ đượ ầ ả ỏ Hi n nay ng i ta s d ng nhi u lo i n p y khác thay th nút bông. Các hãng s n xu t ệ ườ ử ụ ề ạ ắ đậ ế ả ấ d ng c nuôi c y mô cung c p lo i n p ng nghi m và bình tam giác b ng nh a ch u nhi t có ụ ụ ấ ấ ạ ắ ố ệ ằ ự ị ệ th h p vô trùng nhi t 121ể ấ ở ệ độ 0C mà không b bi n d ng. M t s phòng thí nghi m dùng n p ị ế ạ ộ ố ệ ắ ng nghi m b ngố ệ ằ inox ho c cao su r t thu n ti n cho vi c vô trùng khô ho c t. C ng có th s d ng gi y ặ ấ ậ ệ ệ ặ ướ ũ ể ử ụ ấ nhôm làm n p y…để ắ đậ c. Môi tr ngườ Môi tr ng nuôi c y th ng c h p kh trùng trong n i h p (autoclave), kh trùng b ng ườ ấ ườ đượ ấ ử ồ ấ ử ằ áp su t h i n c bão hòa. Th i gian h p t 15-30 phút áp su t h i n c bão hòa là 103,4 kPaấ ơ ướ ờ ấ ừ ở ấ ơ ướ (1atm) t ng ng v i nhi t 121ươ đươ ớ ệ độ 0C. nhi t 121Ở ệ độ 0C, h u h t các sinh v t có trong môi ầ ế ậ tr ng u b tiêu di t, k c d ng bào t . Sau khi vô trùng c n ph i làm khô n p ng ườ đề ị ệ ể ảở ạ ử ầ ả ắ ố nghi m ho c nút bông tránh b nhi m tr l i.ệ ặ để ị ễ ở ạ B ng 2ả : Th i gian kh trùng dung d ch và các môi tr ng l ng b ngờ ử ị ườ ỏ ằ n i h p (autoclave) 121ồ ấ ở oC t i 103,4 kPaạ Th tích môi tr ng (mL)ể ườ Th i gian h p kh trùng(phút)ờ ấ ử <50 15 75 20 250-500 25 1000 30 Công Ngh Sinh H c Vi t Namệ ọ ệ - 5 - Biotechnology Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 6 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ Vi c h p kh trùng b ng n i h p thì không thích h p v i nhi u hoá ch t nh y c m v i nhi t ệ ấ ử ằ ồ ấ ợ ớ ề ấ ạ ả ớ ệ nh : các acid amin, các vitamin, các hormon t ng tr ng, và các ch t kháng sinh. Các ch t độ ư ă ưở ấ ấ nh v y th ng ph i c kh trùng b ng cách l c vô trùng. Màng l c c làm b ng màng ư ậ ườ ả đượ ử ằ ọ ọ đượ ằ polyethylen ho c s I cellulose. Các l trên màng siêu l c này c thi t k hi u qu cho vi c ặ ợ ỗ ọ đượ ế ế ệ ả ệ gi l i các vi sinh v t gây nhi m.ữ ạ ậ ễ d. L c vô trùngọ Ph ng pháp n gi n nh t là dùng các màng l c Millipore ho c dùng các ph u l c th y ươ đơ ả ấ ọ ặ ể ọ ủ tinh x p s 5. ố ố M t s lo i màng l c vô trùng c a hàng Millipore. ây là lo i màng l c ã c ộ ố ạ ọ ủ Đ ạ ọ đ đượ kh trùng b ng chi u x và ch dùng 1 l nử ằ ế ạ ỉ ầ Ph ng pháp s d ng màng l c Millipore: hãng Millipore cung c p màng l c và giá ươ ử ụ ọ ấ ọ đỡ b ng nh a h u nhi t. D i ây mô t màng l c lo i Millipore Swinex có ng kính 25mm. ằ ự ị ệ ướ đ ả ọ ạ đườ B l c g m có giá b ng lo i nh a ch u nhi t g m n p và , vòng cao su và màng l c. t ộ ọ ồ đỡ ằ ạ ự ị ệ ồ ắ đế ọ Đặ màng l c (có kích th c l 0,25µm) trên , t vòng cao su lên và v n ch t n p vào . Gói ọ ướ ỗ đế đặ ặ ặ ắ đế toàn b b l c vào trong m t t gi y nhôm và kh trùng trong autoclave 121ộ ộ ọ ộ ờ ấ ử ở o C trong 15-20 phút. ng th i c ng h p vô trùng m t bình hu tinh h ng d ch l c. Dùng ng tiêm hút Đồ ờ ũ ấ ộ ỷ để ứ ị ọ ố d ch l c và b m qua b l c.ị ọ ơ ộ ọ 2.3.2 Kh trùng mô th c v tử ự ậ Mô c y có th là h u h t các b ph n khác nhau c a th c v t nh h t gi ng, phôi, noãn, ấ ể ầ ế ộ ậ ủ ự ậ ư ạ ố đế hoa, lá, u r , thân c …tu theo s ti p xúc v i môi tr ng bên ngoài, các b ph n này ch a đầ ễ ủ ỳ ự ế ớ ườ ộ ậ ứ nhi u hay ít vi khu n và n m. òng lúa non khi còn trong b , mô th t bên trong qu … th ng ề ẩ ấ Đ ẹ ị ả ườ ít b nhi m vi sinh v t; ng c l i, lá, thân c bi t các b ph n n m sâu trong t nh r , ị ễ ậ ượ ạ đặ ệ ở ộ ậ ằ đấ ư ễ c … có l ng n m, khu n t p r t cao. H u nh không th vô trùng mô c y c n u n m, ủ ượ ấ ẩ ạ ấ ầ ư ể ấ đượ ế ấ khu n n m sâu các t bào bên trong mô ch không h n ch b m t. Lá khoai lang có th vôẩ ằ ở ế ứ ạ ếở ề ặ ể trùng d dàng trong mùa khô nh ng không th làm c trong mùa m a. Ph ng pháp vô ễ ư ể đượ ư ươ trùng mô c y thông d ng nh t hi n nay là dùng các ch t hoá h c có ho t tính di t n m khu n. ấ ụ ấ ệ ấ ọ ạ ệ ấ ẩ Hi u l c di t n m khu n c a các ch t này ph thu c vào th i gian x lý, n ng và kh n ng ệ ự ệ ấ ẩ ủ ấ ụ ộ ờ ử ồ độ ả ă xâm nh p c a chúng vào các k ngách l i lõm trên b m t mô c y, kh n ng y h t các b t ậ ủ ẽ ồ ề ặ ấ ả ă đẩ ế ọ khí bám trên b m t mô c y. t ng tính linh ng và kh n ng xâm nh p c a ch t di t ề ặ ấ Để ă độ ả ă ậ ủ ấ ệ khu n, thông th ng ng i ta x lý mô c y trong vòng 30s trong r u ethylic 70% sau ó m i ẩ ườ ườ ử ấ ượ đ ớ x lý dung d ch di t khu n. ng th i ng i ta thêm các ch t gi m s c c ng b m t nh ử ị ệ ẩ Đồ ờ ườ ấ ả ứ ă ề ặ ư Công Ngh Sinh H c Vi t Namệ ọ ệ - 6 - Biotechnology Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 7 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ Tween 80, Fotoflo, Teepol vào dung d ch di t n m khu n. có khái ni m v n ng và th iị ệ ấ ẩ Để ệ ề ồ độ ờ gian s d ng các ch t di t n m khu n x lý mô c y, xin d n tài li u nghiên c u c a Street ử ụ ấ ệ ấ ẩ để ử ấ ẫ ệ ứ ủ (1974) b ng sau:ở ả Tác nhân vô trùng N ng %ồ độ Th i gian x lýờ ử Hi u quệ ả ( phút) Calci hypochlorit 9 – 10 5 – 30 R t t tấ ố Natri hypochlorit 2 5 – 30 R t t tấ ố Hydro peroxid 10 – 12 5 – 15 T tố N c Bromướ 1-2 2 – 10 R t t tấ ố HgCl 2 0.1 – 1 2 – 10 Trung bình Ch t kháng sinhấ 4 – 50 mg/l 30 – 60 Khá t tố Trong th i gian x lý, mô c y ph i ng p hoàn toàn trong dung d ch di t khu n. i v i các ờ ử ấ ả ậ ị ệ ẩ Đố ớ b ph n có nhi u b i cát, tr c khi x lý nên r a c n th n b ng n c xà phòng b t và r a s ch ộ ậ ề ụ ướ ử ử ẩ ậ ằ ướ ộ ử ạ l i b ng n c máy. Khi x lý xong, mô c y c r a nhi u l n b ng n c c t vô trùng (t i ạ ằ ướ ử ấ đượ ử ề ầ ằ ướ ấ ố thi u là 3 l n). Nh ng ph n trên mô c y b tác nhân vô trùng làm cho tr ng ra c n ph i c ể ầ ữ ầ ấ ị ắ ầ ả đượ c t b tr c khi t mô c y lên môi tr ng. tránh nh h ng c a tác nhân vô trùng lên mô ắ ỏ ướ đặ ấ ườ Để ả ưở ủ c y, nên ấ chú ý l i m t l p b c ngoài khi ngâm mô vào dung d ch di t khu n. L p ngoài để ạ ộ ớ ọ ị ệ ẩ ớ cùng này s c l t b i tr c khi t mô c y lên môi tr ng. Vô trùng mô c y là m t thao ẽđượ ộ ỏđ ướ đặ ấ ườ ấ ộ tác khó, ít khi thành công ngay t l n u tiên. Tuy v y, n u kiên trì tìm c n ng và th i ừ ầ đầ ậ ế đượ ồ độ ờ gian vô trùng thích h p thì sau vài l n th ch c ch n s t k t qu . Có th dùng kháng sinh ợ ầ ử ắ ă ẽđạ ế ả ể để ki m soát ho c lo i b s nhi m n m trên mô c y. H u h t các kháng sinh nh y c m v i nhi t ể ặ ạ ỏ ự ễ ấ ấ ầ ế ạ ả ớ ệ do ó không th h p vô trùng. Chúng hoà tan c trong n c ho c dung môi thích h p khác, đ ể ấ đượ ướ ặ ợ l c vô trùng và thêm vào môi tr ng vô trùng khi môi tr ng này ã c làm ngu i còn 45-ọ ườ ườ đ đượ ộ 50 o C. Không ph i t t c các kháng sinh u thích h p cho s d ng ả ấ ả đề ợ ử ụ trong nuôi c yấ mô th c v t.ự ậ Các kháng sinh nh Streptomycin, Kanamycin và Neomycin th ng c cho mô th c v t và ư ườ độ ự ậ không ho t ng t t trong m t ph m vi pH nh t nh. Tetracylin c ng là c t th c v t, có ạ độ ố ộ ạ ấ đị ũ độ ố ự ậ khuynh h ng c ch s t ng tr ng c a mô th c v t sau khi b x lý trong m t th i giandài. ướ ứ ế ự ă ưở ủ ự ậ ị ử ộ ờ Chloramphenicol có ph ho t ng r ng nh ng c cho th c v t (và ng i) n ng th p. ổ ạ độ ộ ư độ ự ậ ườ ở ồ độ ấ Công Ngh Sinh H c Vi t Namệ ọ ệ - 7 - Biotechnology Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 8 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ Các kháng sinh th ng c dùng ườ đượ trong nuôi c yấ mô th c v t g m Rifampicin (th ng c ự ậ ồ ườ đượ dùng k t h p v i các kháng sinh khác), các polymicin và vancomycin.ế ợ ớ Công Ngh Sinh H c Vi t Namệ ọ ệ - 8 - Biotechnology Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 9 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ Các lo i kháng sinhạ Aminoglycoside - Streptomycin - Kanamycin - Neomycin Quinolone - Nalidixic acid - Ofloxacin - Norfloxacin -Lactamβ - Penicillin - Ampicillin - Carbenicillin Tetracyclin Trimehtoprim và sulphonamide Chloramphenicol Macrolide và lincosamide - Erythromycin -Lincomycin Glycopeptide - Vancomycin Polymixin - Polymixin B - PolymicinE Rifampicin Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 9 - Biotechnology Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 10 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ Kh n ng ho t ngả ă ạ độ c ch s sinh t ng h p protein b ng cáchỨ ế ự ổ ợ ằ tác ng lên các ribosome 30S ho c 50Sđộ ặ Gây tr ng i cho quá trình sao chép DNA ở ạ b ng cách c ch enzym DNA gyraseằ ứ ế c ch s t ng h p vách t bào vi khu nỨ ế ự ổ ợ ế ẩ c ch sinh t ng h p protein b ng cách Ứ ế ổ ợ ằ tác ng lên ribosome 30Sđộ c ch s sinh t ng h ptetrahydrofolateỨ ế ự ổ ợ c ch s sinh t ng h p protein b ng cáchỨ ế ự ổ ợ ằ tác ng lên Rbx 50Sđộ c ch s sinh t ng h p protein b ng cáchỨ ế ự ổ ợ ằ tác ng lên Rbx 50Sđộ Tác ng lên s sinh t ng h p vách t bào độ ự ổ ợ ế vi khu n.ẩ G n lên màng t bào làm thay i dòng ắ ế đổ ion d n n s phá v t bàoẫ đế ự ỡ ế Tác ng lên RNA b ng cách g n vào độ ằ ắ RNA polymerase 2.3.3 K thu t c y vô trùngỹ ậ ấ tránh b nhi m trong su t thao tác c y mô th c v t, các nhà khoa h c làm vi c trong t c y Để ị ễ ố ấ ự ậ ọ ệ ủ ấ vô trùng (laminar). ó là các t c y có thi t b th i không khí ã l c vô trùng vào ch thao tác Đ ủ ấ ế ị ổ đ ọ ỗ c y. T c y vô trùng lo i tr m t cách hi u qu ngu n t p nhi m t bên ngoài và t o i u ki n ấ ủ ấ ạ ừ ộ ệ ả ồ ạ ễ ừ ạ đề ệ tho i mái chong i c y, nên hi n nay c s d ng r t ph bi ân trong các phòng thí nghi m. ả ườ ấ ệ đượ ử ụ ấ ổ ế ệ Không khí t bên ngoài c qu t hút vào qua m t màng l c thô. 99% b i trong không khí c ừ đượ ạ ộ ọ ụ đượ gi l i màng l c thô. Sau ó không khí c th i qua màng l c tinh và phân ph i u ra kh p ữ ạ ở ọ đ đượ ổ ọ ố đề ắ b m t c a t c y, không t o nh ng xoáy không khí a b i vào ch c y. Màng l c tinh ng n c n ề ặ ủ ủ ấ ạ ữ đư ụ ỗ ấ ọ ă ả các ph n t l n h n 0.3micron v i hi u qu 99,99% và do các hãng chuyên s n xu t màng l c ầ ử ớ ơ ớ ệ ả ả ấ ọ cung c p. Tu i th c a màng l c thô tu theo s l ng b i n i làm vi c, th ng t 6 tháng n 1 ấ ổ ọ ủ ọ ỳ ố ượ ụ ơ ệ ườ ừ đế n m và c a màng l c tinh t 2 n 3 n m. Khi th y hi u qu vô trùng c a t c y laminar kém i ă ủ ọ ừ đế ă ấ ệ ả ủ ủ ấ đ Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 10 - Biotechnology [...]... II và III của môi trường MS - Pha stock vitamin Morel, glycin và inosytol - Pha các stock chất điều hoà sinh trưởng như đã hướng dẫn phần trên Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 18 - Biotechnology Thí nghiệm Sinh học phân tử - 19 - Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm BÀI 3: GIEO H ẠT IN- VITRO ^!^ I.CHỌN MÔ CẤY VÀ XỬ LÝ MÔ CẤY 1.1 Chọn lựa mô cấy Không có những hướng dẫn cụ thể trong việc chọn mô cấy Về nguyên... 5: NUÔI C ẤY MÔ S ẸO ^!^ 1 GIỚI THIỆU Nuôi cấy mô sẹo là khâu rất quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào Mô sẹo là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô và tế bào, chọn dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô và các cơ... protocorm Môi trường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tương đối đơngiản và rất giống môi trường gieo hạt cho nhiều giống lan káhc nhau Cymbidium thường được nuôi cấy trên môi trường khoáng Knudson C hoặc Vacin & Went Đỉnh sinh trưởng thường được cấy trên môi trường đặc (ngoại trừ Cattleya)nhưng protocorm thường được nhân lên trong môi trường lỏng, và protocorm chỉ tăng trưởng thành chồi con khi được cấy trên môi... vào môi trường Nhưng đối với những cây dinh dưỡng NH4+ mạnh như cây lúa, việc thêm vào môi trường nuôi cấy một tỉ lệ NH4+ thích hợp chắc chắn sẽ có lợi Việc sử dụng mang tính kinh nghiệm chủ nghĩa đối với một số môi trường đã cản trở khá nhiều sự tiến bộ của công tác ở một số phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật Thuốc lá và carốt là 2 loại cây kinh điển của nuôi cấy mô thực vật Môi trường nuôi cấy. .. trưởng ngọn Khi cấy đỉnh sinh trưởng của Cattleya, các mô thường nhanh chóng hoá nâu Vì lý do đó mà đỉnh sinh trưởng được cắt trong môi trường lỏng hoặc nước cất vô trùng và được vấy trong môi trường lỏng, nhờ đó các chất nâu dễ khuyếch tán vào trong môi trường và ít gây ảnh hưởng đến mô cấy (Fast, 1980) ỞCattleya, người ta thường tách một chồi (3-5mm) với nhiều tiến phát khởi lá Môi trường cấy Cattleya... học phân tử - 30 - Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo dẫn đến những phản ứng khác nhau của mẫu cấy Với một số cây thì vấn đềnày không quan trọng nhưng cũng có một số cây ch ịu ảnh hưởng rất lớn 2 THỰC HÀNH 2.1 Mục đích: Khảo sát sự phát sinh mô sẹo từ các bộ phận khác nhau ở cây thuốc lá 2 2 Vật liệu 2.2.1 Môi trường nuôi cấy MS (20g/l đường) có bổ sung... Vật liệu 2.2.1 Môi trường MS (20g/l đường) có bổ sung 10µM BA 2.2.2 Nguyên liệu thực vật Cây con thuốc lá invitro 2.2.3 Hoá chất và dụng cụ - Nước cất vô trùng - Dao cấy, kẹp, đĩa cấy và giấy cấy vô trùng… 2 3 Các bước tiến hành Xử lý mẫu cấy tương tự bài 5 và cấy vào các đĩa petri có chứa môi trường đã chuẩn bị (Rễ, Lóng thân, Phiến lá) 4.Yêu cầu - Thực hiện tốt thao tác xử lý mẫu cấy - Lát cắt lóng... mô sẹo cũng có ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cơ quan của khối mô Khả năng tái sinh chồi sớm mất đi ở mô sẹo xốp nhưng vẫn duy trì ở mô sẹo cứng Nguyên nhân có thể do các tế bào mô sẹo sẽ mất đi khả năng tổng hợp một số chất thiết yếu cho sự tái sinh của nó khi số lần cấy chuyền tăng lên ( Gautht, 1962) Vì vậy khi nuôi cấy mô sẹo nhằm mục đích tái sinh chồi, nhất thiết phải cố gắng tìm điểu kiện môi... thành các khối mô sẹo cứng, chắc; các mô sẹo xốp cần được loại bỏ trong các lần cấy chuyền vì đôi khi dạng mô sẹo này phát triển rất nhanh và lấn át cả các mô sẹo cứng có khả năng tái sinh phôi 2.THỰC HÀNH 2.1 Mục đích: Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 34 - Biotechnology Thí nghiệm Sinh học phân tử - 35 - Biên soạn : Lê Lý Thuỳ Trâm Chứng minh khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo 2.2 Vật liệu: 2.2.1 Môi trường... 2.2.2 Nguyên liệu thực vật Mô sẹo từ lóng thân, lá và rễ của bài 3 sau 4 tuần nuôi cấy 2.2.3 Hoá chất và dụng cụ - Nước cất vô trùng - Dao cấy, kẹp, đĩa cấy và giấy cấy vô trùng… 2 3 Các bước thực hiện - Dùng kẹp gắp mô sẹo từ bình mẫu cho vào đĩa petri - Dùng dao cấy lấy sạch phần agar còn bám vào mẫu - Nếu mô sẹo quá lớn thì cắt nhỏ thành từng mẫu khoảng ½ lóng tay - Cấy vào môi trường tái sinh chồi . mg/L ZnSO4.7H2O 8,6 mg/L SKOOG III KI 0,83 mg/L Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/L CuSO4.5H2O 0,025 mg/L CoCl2.6H2O 0,025 mg/L THÀNHPH N VITAMIN C A MORELẦ Ủ Morel’sVitamin Pirydox ine (B6) 1 mg/L Biotin (H) 0,01. (83mg/mL) Cân 8300 mg KI hoà tan v i n c c t cho 100mLớ ướ ấ đủ Dung d ch Naị 2MoO4.2H2O: (25mg/mL) Cân 2500mg Na2MoO4.2H2O hoà tan v i n c c t cho 100mLớ ướ ấ đủ Dung d ch CuSOị 4.5H2O (2,5mg/mL) Cân. c v tị ấ đ ề ưở ự ậ (tính b ng mol/l)ằ BAP có tr ng l ng phân t (MW) là 225.26ọ ượ ử - Hoà tan 225.26gr BAP trong 1l n c c t t c ta có 1l dung d ch BAP1M hay 1mol/lướ ấ ứ ị - Cân 225.26 mg BAP