Nghiên cứu xây dựng hệ thống qui trình nuôi cấy phôi trong điều kiện Việt Nam

Nghiên cứu xây dựng hệ thống qui trình nuôi cấy phôi trong điều kiện Việt Nam

1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay trong lĩnh vực chăn nuôi, một thành tựu đánh dấu sự tiến bộ vượt bậc của kĩ thuật nuôi cấy tế bào sinh dục là khả năng tạo được hợp tử bên ngoài cơ thể mẹ thông qua sự kết hợp tinh trùng và noãn trong điều kiện in vitro. Ở động vật, nguồn phôi dồi dào có thể phục vụ cho các mục đích khác nhau như: tạo động vật chuyển gen, khai thác nguồn tế bào mầm, nhân bản động vật, tạo đàn thú có điều kiện thí nghiệm tương đương nhau phục vụ nghiên cứu khoa học… Nhưng dù với mục đích gì, cũng cần phải qua khâu tạo nguồn noãn chín đồng loạt. Đó là bước căn bản trong thao tác liên quan đến khoa học về sinh sản. Ngày 24/04/2005, các nhà khoa học của đại học quốc gia Seoul đã thành công khi cho sinh sản vô tính một giống chó săn Afganistan (trích báo tuổi trẻ số ra ngày 05/08/2005). Trên thế giới, công nghệ sinh học trong lĩnh vực sinh sản nói chung và việc tạo noãn chín in vitro nói riêng rất phổ biến, nhưng ở Việt Nam vẫn còn rất hạn hẹp. Noãn heo là nguồn noãn dồi dào và có thể giúp hoàn thiện thao tác lấy noãn và nuôi noãn. Trên chó có một số giống quý hiếm nhưng chu kỳ sinh sản của chúng rất dài và tỉ lệ nuôi thành công rất thấp, do đó chọn nuôi trứng trên chó rất có ý nghĩa. Vì những lý do trên, đề tài “Áp dụng qui trình nuôi chín noãn in vitro trên heo và chó” được tiến hành. 1.2. Mục tiêu và yêu cầu Mục tiêu Góp phần xây dựng hệ thống qui trình nuôi cấy phôi trong điều kiện Việt Nam. Yêu cầu Phân loại nang noãn trên buồng trứng heo và chó. Áp dụng phương pháp nuôi chín noãn heo và chó. Áp dụng phương pháp nhuộm nhiễm sắc thể và thể cực của noãn chín. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Buồng trứng 2.1.1. Cấu tạo [1] Buồng trứng phát triển từ miền vỏ của tuyến sinh dục, gồm một đơi được treo ở cạnh trước dây chằng rộng và nằm trong xoang chậu. Bên ngồi là lớp màng liên kết sợi chắc như màng bao dịch hồn. Bên trong buồng trứng chia làm hai miền: miền vỏ và miền tủy, hai miền được cấu tạo bằng lớp mơ liên kết sợi xốp, tạo một chất đệm cho buồng trứng. Miền tủy có mạch máu nhiều hơn và lớp mơ liên kết cũng dày hơn. Miền vỏ là nơi xảy ra sự chín nỗn và rụng nỗn. Bên dưới lớp màng là nỗn ngun thủy. Khi nang nỗn chín, tế bào nang bao quanh nỗn phân chia thành nhiều tầng tế bào hạt. Nang nỗn càng phát triển thì tế bào nang phân hủy tạo ra một xoang chứa dịch. Khi trở nên chín, nang nỗn được bao bọc bởi một lớp màng mỏng. Tổ chức liên kết ngồi buồng trứng lúc này dày lên để bảo vệ nang nỗn chín, giữa màng liên kết và màng nang nỗn là tổ chức mạch quản dày đặc. Lúc nang nỗn đã thành thục thì màng bọc nang và màng bao liên kết của buồng trứng tách ra, nỗn rời buồng trứng cùng với dịch nang để đi vào vòi Fallop. Màng nang nỗn rách rồi liền lại ngay, các tế bào hạt trong xoang phân chia nhanh thành một khối tế bào lớn để lấp kín xoang nang nỗn và trở thành thể vàng. 2.1.2. Chức năng nội tiết của buồng trứng [1], [2] Hormon được tiết ra từ nang nỗn và thể vàng. Hormon từ nang nỗn là estrogen, từ thể vàng là progesteron. Hàm lượng hormon liên quan đến các giai đoạn trong chu kì động dục. Hàm lượng progesteron trong thể vàng tăng sau xuất nỗn và thấp khi thối triển. Có relaxin trong pha thể vàng của chu kì nhưng pha nang nỗn thì khơng có relaxin. Relaxin cũng khơng xuất hiện trong buồng trứng heo cái tơ. Nang nỗn thành thục thì tế bào hạt trong biểu mơ tiết ra nhiều estrogen. Estrogen làm gia súc biểu hiện động dục. Estrogen gồm estradiol và sản phẩm hóa học của nó là estrol và estriol. Estrogen liên quan đến đặc tính sinh dục thứ 3 cấp của gia súc cái, làm âm đạo tiết nhiều dịch nhầy, sừng tử cung và ống dẫn trứng được tăng cường dòng máu, tuyến vú phát triển, vỏ não hưng phấn. Hình 2.1: (a) Estradiol (b) Estriol Sau khi xuất noãn, nguyên sinh chất bên trong nang noãn tích tụ sắc tố thể vàng. Thể vàng tiết hormon progesteron. Progesteron vào máu, ức chế phân tiết gonadotropin từ tuyến yên và ức chế sự chín của nang noãn, kích thích sự hoạt động của niêm mạc tử cung để trứng được thụ tinh về nơi làm tổ và phát triển, ức chế co bóp của tử cung, giảm hormon thùy sau của tuyến yên trong thời gian gia súc có chửa và thúc đẩy tuyến vú phát triển. Hình 2.2: Progesteron 2.1.3. Buồng trứng heo và chó 2.1.3.1. Buồng trứng heo [6] Buồng trứng heo hình chùm dâu, có màu hồng vân, nằm hai bên hốc bụng. Trọng lượng buồng trứng tăng từ ngày thứ 3 đến ngày 12 sau động dục vì thể vàng phát triển. Đường kính thể vàng đạt tối đa 11 mm vào ngày 15 và giảm dần do thoái hóa. Màu và cấu trúc thể vàng thay đổi theo thời gian. Thể vàng có màu đỏ sậm vào ngày thứ 3, tím tái vào ngày 15 và màu kem hơi vàng và trắng dần vào ngày 15 – 18. Ngày thứ 3 có cục máu đỏ sậm ở giữa thể vàng, ngày thứ 6 cục máu được thay thế bởi mô liên kết hoặc bởi dịch hơi vàng, đến ngày 16 – 18 có nhiều mạch máu. Lúc bắt đầu động dục của chu kỳ tiếp theo thể vàng thoái hóa, đường kính của thể vàng chỉ còn 50 % và mất đi vào ngày 40. Số nang tối đa là 2.700.000, số nang lúc sinh 135.000, số nang mất trong quá trình phát triển là 95 %. Kích thước nang xoang là 8 – 10 mm, kích thước nang noãn thành thục là 8 – 12 mm. 4 2.1.3.2. Buồng trứng chó [6] Buồng trứng được bao bởi một túi. Khi lột bỏ túi, kích thước của buồng trứng là 1,7  0,9  0,4 cm ở chó beagle. Buồng trứng chó già tương tự như bề mặt bơng cải, có kẽ hở sâu để phân chia các thùy với kích cỡ khác nhau. Khi ấy buồng trứng chứa các nang nỗn tịt, mơ liên kết dày đặc, vết sẹo của thể vàng, thành phần của sườn gian bào vùng tủy. Tế bào biểu mơ mầm trở nên hình trụ giả với mảng lồi giống như tiêm mao. Ở chó khơng mang thai thể vàng thối hóa vào ngày 20 sau động dục. Chó cái có khoảng 700.000 nang nỗn lúc mới sinh, còn 350.000 lúc thành thục, trong số này khoảng 1200 – 1300 nang xoang. Khả năng thụ tinh khơng giảm đến khi chó được 5 tuổi. 2.2. Nang nỗn 2.2.1. Đặc điểm hình thái [1] Nỗn là tế bào lớn nhất cơ thể, có dạng hình cầu. Thể tích tế bào trứng lớn hơn tinh trùng nhiều lần và dài gấp 2 lần. Cấu tạo nỗn gồm 3 phần:  Phần ngun sinh chất gồm các thành phần chủ yếu là nước, vật chất hữu cơ, muối khống và vật chất khác.  Nhân gồm lưới nhiễm sắc thể và nhiều hạt.  Màng bao gồm 3 lớp: lớp ngồi, lớp giữa và lớp trong. Màng ngồi gồm nhiều tế bào hình nang hay hình chóp. Những tế bào này được phân bổ khắp nỗn nên còn gọi là màng phóng xạ hay màng tia. Các tế bào này được gắn với nhau bởi acid hyaluronic. Khi tinh trùng gặp trứng, men hyaluronidase ở phần acrosom được tiết ra để phân giải acid hyaluronic làm màng phóng xạ tan ra và tạo điều kiện thụ tinh. Màng giữa gồm nhiều tế bào, được sinh ra từ tế bào nang, là lớp ni dưỡng nỗn. Màng giữa gọi là màng trong suốt. Màng này đảm bảo dinh dưỡng cho nỗn trong buồng trứng. Trong màng chứa enzym zonalizin – men đặc hiệu chủng lồi có tác dụng ngăn ngừa tinh trùng khác lồi đi vào nhân nỗn trong q trình thụ tinh. Màng trong là lớp màng mỏng bao quanh phần ngun sinh chất gọi là màng nỗn hồng hay màng ngun sinh chất. Màng này có tác dụng ni 5 dng noón ó th tinh. Gia mng trong sut v mng noón hong cú khong trng dy 14 25 àm, pH 3 5, cha dch cú nng ion cao. 2.2.2. Cỏc giai on phỏt trin ca nang noón v noón Quỏ trỡnh hỡnh thnh nang noón xy ra lp v bung trng, t nhng nang noón nguyờn thy phõn b vựng ngoi biờn. thi kỡ sau thai, nang noón khụng ngng c hỡnh thnh v phỏt trin t biu mụ phụi thai. Quỏ trỡnh hỡnh thnh noón gm 7 bc: sinh t bo mm nguyờn thy (PGC primordial germ cells); di chuyn PGC ti tuyn sinh dc; nh v PGC trong tuyn sinh dc; bit húa PGC thnh noón nguyờn bo; tng s lng noón nguyờn bo; bt u gim phõn; dng giai on nhõn ụi prophase I [26]. T PGC tr thnh nang noón c bc bng t bo dt, nú bin thnh nang quỏ . Song song vi quỏ trỡnh gim phõn, nang quỏ ni lờn t vựng v v cha mt noón c bao quanh bi mt lp t bo sinh dng, gi l tin t bo ht. T bo sinh dng min v cú ngun gc t t bo biu mụ b mt di chuyn ngc vo bung trng v t bo ht cú ngun gc t t bo trung thn di chuyn xuyờn qua bung trng (Sawyer v cs, 2002) [29]. cu, noón quỏ cú ng kớnh 25 53 àm, noón ang bit húa l 17 22 àm v noón nguyờn bo 13 17 àm, iu ú chng t t bo mm tng trng trc, trong v sau quỏ trỡnh to nang noón (Mc Natty v cs, 2000) [20]. T nang quỏ phỏt trin thnh nang bc mt. Nang bc mt ch cha mt lp t bo ht bao quanh, giai on chuyn thnh nang bc mt chm hn so vi quỏ trỡnh tng trng ca nang. T nang bc mt phỏt trin thnh nang bc hai, cú t 2 lp t bo ht tr lờn. Khi noón tng trng, t bo ht tng sinh dy, lp t bo v hỡnh thnh xung quanh t bo ht. Giai on ny tng RNA, protein, ribosom, ti th v mt s cht hu c khỏc. T nang bc hai to nang xoang, cha nhiu dch v nhiu t bo ht bao quanh. Dch cú vai trũ iu hũa cỏc cht t mỏu hoc cht tit trong t bo nang nh: gonadotropin, steroid, yu t tng trng, enzym, proteoglycan, lipoprotein. Dch tng lờn nh s phỏt trin mao qun v dũng mỏu vn chuyn trong nang. Noón lỳc ny c bc bi t bo ht t (cumulus), to phc hp COC (cumulus oocyte complex). 6 Sau quá trình tăng trưởng, noãn tồn tại ở giai đoạn tiền kỳ. Sau đỉnh LH, để hoàn thành giảm phân, các noãn đã tăng trưởng đầy đủ này xuất hiện màng trong suốt tạo cầu nối giữa noãn và tế bào hạt tụ. Quá trình trưởng thành là khoảng thời gian sau đỉnh LH và xuất noãn. Quá trình này có hai biến đổi lớn: trưởng thành nhân và trưởng thành tế bào chất [3]. Trưởng thành nhân là thuật ngữ chỉ sự phục hồi quá trình phân bào giảm nhiễm và những chuyển biến đến giai đoạn MII (metaphase II). Trưởng thành tế bào chất là thuật ngữ liên quan đến các sự kiện khác: sự chuẩn bị cho trứng thụ tinh và phát triển trước làm tổ, định vị lại các tiểu thể của bào tương và các tế bào hạt. Trưởng thành nhân kéo dài 44 giờ trên heo, gồm 2 quá trình phân chia liên tục ở thời kì MI và MII, sau đó noãn dừng lại tại MII chờ thụ tinh. Ở giai đoạn này, noãn đáp ứng đỉnh LH tạo nhiều hormon steroid từ tế bào hạt, tạo nhiều hyaluronan từ tế bào hạt tụ, tiết dịch nhầy và tăng kích thước của tế bào hạt tụ. Hình 2.3 : Các giai đoạn phát triển của nang noãn [37] 2.2.3. Biến đổi đại thể của nang noãn 2.2.3.1. Nang noãn heo [6] Đường kính trung bình của nang noãn lớn tăng dần đến ngày thứ 18 của chu kì, đạt tối đa 9 mm. Nang noãn lớn có thể được thấy vào 18 giờ sau khi bắt đầu động dục nhưng sau đó sự thay đổi kích thước lại biến động. Kích thước của nang chưa đủ đánh giá vì đường kính nang khá biến động lúc xuất noãn. Nang noãn bậc 3 Nang bậc hai Nang bậc hai Nang bậc ba 7 Màu của nang noãn trưởng thành là màu hồng vỏ sò, do mạng mạch máu nằm dưới bề mặt nang noãn. Vùng trong suốt của đỉnh nang noãn là nơi xuất noãn. Khi xuất noãn, thành nang noãn vỡ và dịch hơi đỏ xuất hiện ở bề mặt nang noãn. Điểm vỡ vẫn có thể thấy được vào ngày 12 sau động dục. Động mạch xung huyết và tràn máu vào nang noãn dẫn tới noãn xuất huyết, hiện tượng này thường xuất hiện trên heo. Khi xuất noãn, nang nhuộm đỏ và đứt mạch máu, thành nang xẹp xuống và xuất hiện dịch đỏ trên bề mặt. Khoảng 2 – 3 ngày trước động dục, nang noãn lớn nhanh, lúc này có sự triển dưỡng của lớp màng bao trong của nang noãn và hòa tan một phần tế bào hạt tụ nên noãn ở trạng thái tự do lơ lửng. Noãn tự trải qua giai đoạn giảm nhiễm đầu tiên, nhân di chuyển về phía ngoại vi của tế bào và thể cực thứ nhất được tạo ra. Lúc xuất noãn, thể cực thứ nhất được đẩy ra và trục của thể cực thứ nhì được tạo nên. 2.2.3.2. Nang noãn chó [6] Nang noãn bậc một có một lớp tế bào hình lập phương còn nang noãn bậc hai gia tăng kích thước do tăng tế bào hạt và tạo xoang nang. Thông thường nang noãn bậc hai có 2 noãn hoặc nhiều hơn. Nhiều báo cáo cho thấy nang noãn đa noãn có 11 noãn, thông thường là 3 – 5 noãn. Kích thước nang noãn gia tăng vào giai đoạn tiền động dục nên giai đoạn này được xem là giai đoạn nang noãn trưởng thành. Vì phần lớn nang noãn nhỏ thoái hóa, chỉ có một số nang noãn có kích thước > 2 mm. Những nang noãn 3 – 4 mm có khoảng 8 – 10 lớp tế bào hạt, lớp màng bao trong tăng mạch quản và mô liên kết. Nang noãn 4 – 6 mm hơi phồng lên trên bề mặt buồng trứng. Một đặc tính thống nhất của nang noãn trưởng thành ở chó là nếp gấp sâu của lớp tế bào hạt, trong đó có cuộn mao quản ăn sâu vào lớp màng bao trong và chuẩn bị tạo chất vàng. Vào đầu giai đoạn động dục, nhiều nang noãn xuất noãn. Lúc thú bắt đầu chịu đực, thể cực thứ nhất chưa được tạo. Noãn được phóng thích qua lỗ nhỏ như lỗ đinh kim mà không có hiện tượng vỡ bao noãn. Noãn được phóng thích có kính thước khoảng 77  99 μm, nếu kể cả vùng trong suốt thì khoảng 95  110 μm, chứa những hạt có tính khúc xạ cao và nhiều hạt mỡ. 8 2.2.4. Nội tiết của nang noãn Sự tăng trưởng, thành thục, xuất noãn và thể vàng hóa của nang phụ thuộc vào nhiều yếu tố: kiểu chế tiết thích hợp, hàm lượng đủ và tỉ lệ phù hợp của FSH (follicle stimulating hormone) và LH (luteinizing hormone) trong huyết thanh. FSH giữ vai trò chủ đạo cho việc khởi đầu sự hình thành xoang nang, kích thích quá trình nguyên phân của tế bào hạt và quá trình hình thành dịch nang. Ngoài ra, FSH tăng khả năng cảm ứng của tế bào hạt đối với LH bằng cách tăng số lượng các thụ thể LH. Ở heo, các thụ thể LH tăng từ 300 (trong các nang bé) và lên 10.000 (trong các nang lớn trước xuất noãn). Tăng LH chuẩn bị cho quá trình thể vàng hóa của tế bào hạt. Trong giai đoạn tạo nang bậc hai, sự tăng kích thước, tăng số tế bào hạt và số nang noãn tịt bị ảnh hưởng bởi lượng kích dục tố. FSH kích thích tạo cầu nối ở tế bào hạt. LH quan trọng hơn FSH trong phát triển nang bậc hai vì qua thụ thể LH ở tế bào bao nang, khởi động sinh tổng hợp androgen để kích thích tạo thụ thể FSH ở tế bào hạt, do đó tăng ảnh hưởng FSH lên nang bậc hai [34]. Ở giai đoạn này, người ta cũng phát hiện GH (growth hormone) làm tăng sự phát triển in vitro của nang bậc hai trên chuột (Liu và cs, 1998) [14]. Trong giai đoạn tạo nang xoang, nang xoang giai đoạn sớm có thụ thể FSH ở tế bào hạt nhưng chưa phụ thuộc vào kích dục tố. Ở giai đoạn này tế bào bao nang tăng tiết steroid, trong khi tế bào hạt mất aromatase (loại enzyme biến đổi androgen thành estrogen). Điều này chứng tỏ rằng progesteron và androgen mà không phải estrogen là những hormon steroid được tạo bởi nang xoang giai đoạn sớm. Trong nang xoang giai đoạn sau, có hiện tượng giảm FSH, nang noãn tiết nhiều estradiol và inhibin và có khả năng xuất noãn. Những nang còn lại phát triển bất thường và trở thành nang tịt. Trong giai đoạn nang noãn trưởng thành, tuyến yên tiết LH tối đa và nang có khả năng xuất noãn. 9 Hình 2.4: Nội tiết nang [36] 2.2.5. Sự trƣởng thành của noãn 2.2.5.1. Quá trình trƣởng thành Trên heo, noãn nguyên bào bắt đầu giảm phân tạo noãn bậc hai, noãn bậc hai tiếp tục phát triển đến giai đoạn nhân đôi nhiễm sắc thể và dừng lại đến khi thú cái thành thục về tính. Khi heo cái xuất noãn, noãn tiếp tục phát triển đến MII và chờ thụ tinh. Trên chó, noãn rụng trước khi tạo thể cực thứ nhất. Sự tạo thể cực thứ nhất hoàn tất khoảng 48 – 60 giờ sau khi xuất noãn. Nếu được thụ tinh, noãn sẽ hoàn thành giảm phân và phát triển phôi. Quá trình noãn phát triển đến metaphase gọi là quá trình trưởng thành. Gồm 4 sự kiện xảy ra theo thứ tự như sau: nhiễm sắc thể (NST) cô đặc, nhân con biến mất, vỡ màng nhân, hình thành trục. (1) Cô đặc NST Đây là bước đầu tiên và quan trọng để phân phối đúng số NST vào noãn và thể cực. Hirano và cs (1994) phát hiện một protein gọi là condensin liên quan đến sự cô đặc NST [11]. Condensin làm tăng cấu trúc siêu xoắn của DNA. Sutani và cs (1999) khẳng định rằng condensin được phosphoryl hóa và được hoạt hóa bởi MPF (maturation promoting factor) [32]. Tuy nhiên, theo Hong Thuy Bui và cs (2004), giai đoạn này không liên quan đến MPF mà liên quan đến histon H3 (Ser 10) kinase [12]. Như ta biết, đơn vị cơ bản của NST là nucleosome tức một đoạn DNA khoảng 200 bp bao quanh protein histon; histon gồm 2 trong số 4 phân tử H2A, H2B, H3, H4. Đầu N của histon H3 liên quan đến khả năng giữ ổn định sợi NST, bị phosphoryl hóa ở vị trí serine 10, Pha nang noãn 10 sự kiện này cần thiết cho NST cô đặc lại (Wei và cs, 1999; de la Barre và cs, 2000) [35],[7]. (2) Nhân con biến mất Trong giai đoạn từ MI đến MII nhân không xuất hiện, nhưng xuất hiện vào giai đoạn tiền nhân ngay sau khi tinh trùng xâm nhập. Chất nhân dạng sợi được giải phóng vào dịch nhân lúc nhân con biến mất, sau đó vào dịch tế bào lúc vỡ màng nhân. Quá trình này được điều khiển bởi sự phosphoryl hóa và dephosphoryl hóa một protein trong nhân. Noãn heo lấy nhân vẫn có hiện tượng cô đặc NST, màng nhân biến mất và hình thành trục (Fulka và cs, 2003) [10]. Do đó, có thể nhân trong noãn không quan trọng lắm, ít nhất vào giai đoạn trưởng thành. (3) Vỡ màng nhân GVBD (germinal vesical breakdown) Màng nhân là màng đôi gồm 2 lớp lipid, lớp trong tạo bởi 3 mảnh A,B,C, có ở động vật có xương sống, là vị trí kết hợp của MPF. GVBD xảy ra khi 3 mảnh này biến mất; MPF hoạt hóa sẽ phosphoryl hóa các phân tử của mảnh, phá vỡ trạng thái polymer thành dimer. Màng nhân bị vỡ, mạng lưới nội chất gắn với màng nhân ngoài cũng vỡ. (4) Tạo trục metaphase Trong quá trình trưởng thành, trục được tạo hai lần, MI và MII. Trục MI xuất hiện sau tác dụng của MPF và hoàn thành khi MAP kinase được hoạt hóa. MPF phosphoryl hóa protein liên kết với vi ống, gồm α và β tubulin, do đó tăng biến đổi của chúng. Trong nguyên phân, hai trung thể nhân đôi và đi về hai cực tế bào. Vi sợi tỏa ra từ hai cực và tìm bắt cặp NST chị em. Cyclin B gắn với vi ống, MAP kinase gắn với cực. Giảm phân ở noãn khác với nguyên phân ở tế bào sinh dưỡng: không có trung thể, giống tế bào thực vật. Trên heo, sau GVBD, NST tạo dạng đám bụi, theo Motlik và Fulka mô tả đây là giai đoạn hướng cực muộn. Vi ống bị cắt và tỏa xung quanh đám bụi này. 2.2.5.2. Các chất liên quan (1) MPF Theo Masui và Markert (1971), progesteron gây trưởng thành noãn khi được cung cấp bên ngoài noãn, nhưng thất bại khi tiêm vào noãn [19]. Do đó, [...]... giữa số noãn nuôi và môi trường nuôi tối ưu là 1:10 Trên chó tỉ lệ giảm phân là 16,2 % nếu nuôi 10 noãn /100 µl, và 4,6 % nếu 5 noãn/100 µl [25] Hệ thống tế bào đơn lớp tức là noãn được nuôi với tế bào ống dẫn trứng đơn lớp Bogliolo và cs (2002) nuôi noãn chó đạt 23,2 % sau 72 giờ [4] Hệ thống nuôi với ống dẫn trứng, rất tốt vì gần giống điều kiện in vivo, có nhiều tế bào hơn so với hệ thống tế bào... 13,5 ml: orcein 0,3 g) 28 3.4.9.2 Qui trình nhuộm Rửa noãn lần trong PBS-PVA Rửa noãn 3 3 lần trongPBS-PVA để rửa trôi môi trường nuôi cấy rửa trôi môi trường nuôi cấy Chuyển noãn qua lame với một ít PBS-PVA Đậy lamel lên thật nhẹ Ngâm trong dung dịch ethanol: acetic acid tỉ lệ 3:1 trong 48 giờ Ngâm trong acetol trong 15 phút Acetol được thay bằng acetol orcein màu tím trong 10 phút Lặp lại 3 lần Acetol... trùng trong các qui trình thụ tinh in vitro (4) Muối Đây là thành phần rất quan trọng trong môi trường nuôi noãn và phôi nhằm bảo đảm áp suất thẩm thấu Có nhiều ion chịu trách nhiệm cho sự điều hòa này, nhưng chủ yếu là Na+, K+ Hàm lượng ion trong môi trường dựa trên thành phần các chất khoáng trong huyết tương của máu (5) Hệ đệm Hệ đệm thông dụng nhất là bicarbonate dưới 5 % CO2 Cơ chế đệm của hệ này... cũng được ghi nhận trên noãn bò, chuột và thỏ Qua đó cho thấy, trong FCS hiện diện một số yếu tố có khả năng tái lập lại quá trình phân bào giảm nhiễm và cung cấp khả năng chín của trứng ở điều kiện in vitro Theo nghiên cứu trên chuột, nếu bổ sung huyết thanh trong môi trường nuôi noãn sẽ ngăn cản màng trong suốt khỏi sự cứng hóa Ngược lại, trong môi trường có bổ sung BSA, sự cứng hóa màng xảy ra và sự... giai đoạn sớm và 11,5 % ở nang xoang Điều đó cho thấy rằng, nếu sự trao đổi các yếu tố trong buồng trứng bị gián đoạn, khả năng giảm phân bị giảm [5] 12 Hệ thống giọt là hệ thống phổ biến nhất, noãn được nuôi trong giọt môi trường phủ dầu khoáng Cần quan tâm đến tỉ lệ giữa số noãn nuôi và thể tích môi trường nuôi cấy Nếu noãn quá nhiều, giảm phân bị ức chế do tế bào hạt tụ tiết nhiều yếu tố ảnh hưởng... 48 giờ Trên chó còn nhiều tranh cãi, noãn chó nuôi trong hệ thống giọt sau 72 giờ thoái hóa 74,3 % và sau 96 giờ thoái hóa 94,8 % [16] 2.3.3.2 Nồng độ oxi và nhiệt độ Oxi ảnh hưởng lớn đến trưởng thành nhân trên chuột và bò, mức oxi 5 % tốt hơn 20 % trong không khí [9] Nhiệt độ nuôi cấy dao động 37 – 39oC 2.3.2.2 Môi trƣờng nuôi Có hai loại môi trường nuôi cấy, môi trường đơn giản và môi trường phức... nang Trên heo mỗi đĩa chứa khoảng 30 – 50 noãn, chuyển thành từng nhóm tránh phân tán, nuôi ở điều kiện 38,5oC, 5 % CO2, 40 – 44 giờ Trên chó mỗi đĩa chứa khoảng 10 noãn, nuôi ở điều kiện 37oC, 5 % CO2, 72 giờ 25 3.4.7 Thu nhận noãn sau khi nuôi Chuyển noãn sau khi nuôi vào đĩa chứa DPBS Thêm hyaluronidase 0,1 % vào để trong 15 phút Dùng pipette Pasteur làm bong lớp tế bào hạt tụ xung quanh noãn Đánh... in vitro và chuyển phôi vào tử cung chuột mẹ 2.3.2 Hệ thống IVM Hệ thống nang noãn giữ cấu trúc không gian 3 chiều của nang, bảo đảm hình thái và chức năng của nang để giữ noãn tăng trưởng và trưởng thành Bolamba và cs (1998) nuôi noãn chó trong đĩa phủ 0,6 % agar để tránh mất tế bào hạt Kết quả là noãn chó đạt MII khoảng 8,7 % ở nang xoang giai đoạn sớm và 11,5 % ở nang xoang Điều đó cho thấy rằng,... nhất ở noãn khi noãn bên trong nang vào trước giai đoạn xuất noãn (điều kiện in vivo) hay trong các môi trường nuôi noãn chín (điều kiện in vitro) Đây là chỉ tiêu đánh giá quan trọng nhất Riêng sự trưởng thành tế bào chất chỉ có thể xác định qua khả năng hình thành tiền nhân sau khi tinh trùng xâm nhập và sự phát triển bình thường của tiền phôi Trên cơ sở đó có hai chỉ tiêu để đánh giá phân loại noãn:... pháp Qui trình chung cho quá trình nuôi noãn chín Thu nhận buồng trứng Cắt nang noãn Tìm và rửa noãn Nuôi noãn Thu nhận noãn sau khi nuôi Đánh giá bước 1 Nhuộm và đánh giá bước 2 22 3.4.1 Thu nhận buồng trứng tại lò mổ Tiến hành thu nhận trực tiếp bộ phận sinh dục của thú cái ngay sau khi vừa được mổ Dùng kéo cắt 2 buồng trứng ở 2 bên sừng tử cung Rửa bằng cồn 90o Rửa bằng nước muối 0.9 % Trữ trong