screening and study on microorganisms degrading biopolymers in vietnam tt

Trinh Thi Van Anh SCREENING AND STUDY ON MICROORGANISMS DEGRADING BIOPOLYMERS IN VIETNAM MASTER THESIS MAJOR BIOTECHNOLOGY HANOI – 2010 UNIVERSITY OF LIEGE *** VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY, HANOI INSTITUTE OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY *** Trinh Thi Van Anh SCREENING AND STUDY ON MICROORGANISMS DEGRADING BIOPOLYMERS IN VIETNAM Speciality: Biotechnology Code: 60 42 80 MASTER THESIS MAJOR BIOTECHNOLOGY SUPERVISOR: Dr. NGUYEN QUANG HUY HANOI – 2010 LIEGE UNIVERSITY *** VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY, HANOI INSTITUTE OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY *** Table of contents INTRODUCTION 1 CHAPTER 1: LITERATURE REVIEW 4 1.1. PLASTIC WASTE POLLUTION 4 1.1.1. Plastic waste pollution in the world 4 1.1.2. Plastic waste pollution in Vietnam 5 1.1.3. Treatment of plastic waste 6 1.1.3.1. Landfill 6 1.1.3.2. Recycling 6 1.1.3.3. Incineration 7 1.2. BIODEGRADABLE PLASTICS 8 1.2.1. Biodegradable plastics 8 1.2.1.1. Poly(Lactic Acid) (PLA) 11 1.2.1.2. Poly(3-Hydroxybutyrate) (PHB) 12 1.2.1.3. Poly(ε-Caprolactone) (PCL) 13 1.2.2. Applications 13 1.2.2.1. Medicine and pharmacy 14 1.2.2.2. Packaging 15 1.2.2.3. Agriculture 15 1.2.2.4. Others fields 16 1.3. THE DEGRADATION OF BIOPOLYMERS 17 1.4. MICROORGANISMS DEGRADING BIODEGRADABLE POLYMERS . 19 1.4.1. Microorganisms degrading PLA 19 1.4.2. Microorganisms degrading PHB 22 1.4.3. Microorganisms degrading PCL 23 CHAPTER 2: MATERIALS AND METHODS 25 2.1. MATERIALS 25 2.2. CHEMICALS 25 2.3. EQUIPMENTS 26 2.4. METHODS 26 2.4.1. Isolation of biopolymer-degrading microorganisms 26 2.4.2. Screening biopolymer-degrading microorganisms 27 2.4.3. Identification of biopolymers-degrading strains 27 2.4.3.1. Gram staining method 27 2.4.3.2. Observation under scanning electron microscopy (SEM) 28 2.4.3.3. Extraction of genomic DNA from bacteria 29 2.4.3.4. Amplification of the 16S rDNA PCR reaction 29 2.4.3.5. Agarose gel electrophoresis 30 2.4.3.6. Sequencing 30 2.4.3.7. Effect of culture conditions 31 2.4.3.8. Utilization of of sugars 31 2.4.3.9. Activity of some extracellular enzymes 31 2.4.4. Study degradation of biodegradable polymers by isolated strains 32 2.4.4.1. Growth experiment in the PLA, PHB or PCL containing media 32 2.4.4.2. Measurement of the PLA, PHB or PCL residual weight 32 2.4.4.3. Determination of TOC in culture broth 32 2.4.4.4. Degradation experiment with biopolymer film 34 2.4.4.5. Statistical analysis 34 CHAPTER 3: RESULTS AND DISCUSSION 35 3.1. ISOLATION AND SCREENING PLA, PHB, PCL-DEGRADING ORGANISMS 35 3.2. PLA-DEGRADING MICROORGANISMS 37 3.2.1. Identification of strains G5 and Cz1 37 3.2.1.1 Morphology of strain G5 and Cz1 38 3.2.1.2. 16S rDNA sequencing of strain G5 39 3.2.1.3. Biochemical and physiological characteristics of strains G5 and Cz1 41 3.2.2. PLA degradation by S. thermoflavus G5 and P. citrinium Cz1 44 3.3. PHB-DEGRADING MICROORGANISM 47 3.3.1. Identification of strain B2 47 3.3.1.1. Morphology of strain B2 47 3.3.1.2. Sequencing 16S rDNA gene of strain B2 48 3.3.1.3. Biochemical and physiological characteristics of strain B2 49 3.3.2. PHB degradation by B. gelatini B2 52 3.4. PCL-DEGRADING MICROORGANISM 54 3.4.1. Identification of strain B1 55 3.4.1.1. Morphology of strain B1 55 3.4.1.2. Sequencing 16S rDNA gene of strain B1 56 3.4.1.3. Biochemical and physiological characteristics of strain B1 57 3.4.2. PCL degradation by Br. agri B1 60 3.5. DEGRADATION OF POLYMERS BY ISOLATED STRAINS 61 CONCLUSIONS 64 FURTHER STUDY 65 REFERENCES 66 WEB REFERENCES Master thesis 2010 Trinh Thi Van Anh Abstract Nowaday, plastic waste is the most attrative issue in the world. Biodegradable polymers are seen as a promising solution to this problem because they are environmentally-friendly. Because of chemical and physical feature that are suitable for application in many fields and their degradable ability, they were used more and more for reducing the plastic waste pollution. Among many biodegradable polymers, poly(L-lactic acid) (PLA), poly(3-hydroxybutyrate) PHB, and poly(ε-caprolactone) (PCL) seem to be of the most attention. PHB and lactic acid (raw materials for PLA) can be produced in fermentative biotechnological processes using agricultural products and microorganisms, while PCL was a kind of polymer derived from petroleum, and all of them can be degraded by microorganisms. Several aerobic and anaerobic polymer-degrading microorganisms have been isolated from soil, activated and aerobic sludge, seawater and lake water. From 24 samples collected from different locations in Hanoi, Vietnam 5 strains degrading PLA, 8 strains degrading PHB and 6 strains degrading PCL were selected by clear zone formed method. Among them, strain G5 and strain Cz1 had the highest PLA-degrading activity, strain B2 and strain B1 presented the highest degrading activity on PHB and PCL, respectively. Based on morphological, 16S rDNA sequencing, biochemical and physiological characteristics, strain G5 was identified as Streptomyces thermoflavus, strain Cz1 was proposed as Penicillium citrinium, strain B2 was named as Bacillus gelatini, and strain B1 was Brevibacillus agri. All strains grew well at pH 6-7, and NaCl concentration from 1% to 3%. Among these strains, the optimum temperature of B. gelatini B2 and Br. agri B1 were around 50 o C, S. thermoflavus G5 was 37 o C, and P. citrinium was 30 o C. To study the polymer degradation of these strains, total organic carbon concentration (TOC) and polymer weight in the medium after culture were determined. After 30 days of cultivation in the optimum conditions, strain S. thermoflavus G5 degraded 46.8% and strain P. citrinum Cz1 degraded 55.5% of initial PLA residual in the medium, while strain B. gelatini B2 and Br. agri B1 degraded 58.5% and 84% of PHB and PCL initially added into the medium, respectively. Study on the degradation of polymers showed that these strains were capable of degradation PLA, PHB and PCL and these strains presented higher activity of degradation PCL than PLA and PHB. In the future, we also intend to study further about the enzymes that degrade PLA, PHB and PCL and apply them to biodegradation in the nature environment. Key words: biopolymer, poly(L-lactic acid), poly(3-hydroxybytyrate), poly(ε-caprolactone), biodegradable. Master thesis 2010 Trinh Thi Van Anh Luận văn thạc sỹ: Screening and study on microorganisms degrading of biopolymers in Vietnam Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Sinh viên: Trịnh Thị Vân Anh Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Quang Huy TÓM TẮT Trong những năm gần đây việc sử dụng một cách tràn lan các sản phẩm nhựa tổng hợp có nguồn gốc từ hoá dầu như polypropylen (PP), polyetylen (PE), polyvinylclorua (PVC)… làm gia tăng ô nhiễm môi trường trên thế giới. Để giảm thải ô nhiễm rác thải do việc sử dụng các loại nhựa tổng hợp này nhiều quốc gia đã và đang sử dụng thay thể chúng bằng các sản phẩm thân thiện môi trường là các loại polymer sinh học. Trong số các polymer sinh học poly(lactic acid) (PLA), poly(3- hydroxybutyrat) (PHB) và poly(ε-caprolactone) (PCL) là các polymer được chú ý nhiều nhất. Các polymer sinh học này tuy khác nhau về tính chất lý, hoá học nhưng chúng đều có ưu điểm chung là có thể phân huỷ thành các thành phần cơ bản như CO 2 và H 2 O, do đó không gây ô nhiễm môi trường. Các polymer sinh học trong điều kiện tự nhiên thường phân hủy chậm và phải mất một khoảng thời gian dài để quá trình tự phân hủy bắt đầu diễn ra. Việc phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy polymer sinh học mạnh tồn tại trong tự nhiên là việc cần thiết góp phần kiểm soát, thúc đẩy tốt hơn việc phân huỷ các polymer sinh học. Từ 24 mẫu đất lấy từ các địa điểm khác nhau trong Hà Nội, bằng phương pháp tạo vòng phân huỷ trên môi trường bổ sung polymer sinh học chúng tôi đã phân lập được 5 chủng vi sinh vật phân huỷ PLA, 8 chủng vi sinh vật phân huỷ PHB và 6 chủng vi sinh vật phân huỷ PCL. Trong số đó chủng G5 và Cz1 có hoạt tính phân huỷ PLA mạnh nhất, các chủng B2 và B1 là những chủng phân huỷ PHB, PCL mạnh nhất. Dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và trình tự gen 16S rADN, chủng G5 được định danh là Streptomyces thermoflavus, chủng Cz1 là Penicillium citrinium, chủng B2 là Bacillus gelatini và chủng B1 là Brevibacillus agri. Các chủng này đều phát triển tốt nhất ở pH 6-7, nồng độ muối NaCl từ 1-3%. Chủng B. gelatini B2 và Br. agri B1 là các chủng ưa nhiệt, phát triển tối ưu ở nhiệt Master thesis 2010 Trinh Thi Van Anh độ 50 o C, trong khi S. thermoflavus G5 và P. citrinium phát triển tốt nhất ở 37 o C và 30 o C. Khả năng phân hủy các polymer của các chủng được tiến hành trong môi trường chứa polymer là nguồn cácbon và năng lượng duy nhất và đánh giá qua hàm lượng các bon tổng số (TOC) trong dịch nuôi cấy sau khi ly tâm và lượng polymer còn lại. Sau 30 ngày, S. thermoflavus G5 phân hủy được 46.8% và P. citrinum Cz1 phân hủy được 55.5% lượng PLA bổ sung ban đầu, trong khi B. gelatini B2 và Br. agri B1 tương ứng phân hủy được 58.5% và 84% PHB và PCL. Các chủng vi sinh vật trên có khả năng phân huỷ cả 3 loại polymer sinh học dùng trong nghiên cứu, trong đó hoạt tính phân huỷ PCL cao hơn so với PLA và PHB. Các enzyme phân hủy polymer sinh học cũng như các điều kiện phát triển tối ưu của các chủng vi sinh vật này đang được nghiên cứu nhằm mục đích ứng dụng chúng trong việc xử lý ô nhiễm môi trường. Từ khóa: biopolymer, poly(L-lactic acid), poly(3-hydroxybytyrate), poly(ε- caprolactone), biodegradable. . Hanoi, Vietnam 5 strains degrading PLA, 8 strains degrading PHB and 6 strains degrading PCL were selected by clear zone formed method. Among them, strain G5 and strain Cz1 had the highest PLA -degrading. *** VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY, HANOI INSTITUTE OF MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY *** Trinh Thi Van Anh SCREENING AND STUDY ON MICROORGANISMS DEGRADING BIOPOLYMERS. cultivation in the optimum conditions, strain S. thermoflavus G5 degraded 46.8% and strain P. citrinum Cz1 degraded 55.5% of initial PLA residual in the medium, while strain B. gelatini B2 and Br.