dược điển Việt Nam 4, Phụ lục 17

13.6 THỬ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN Thử giới hạn nhiễm khuẩn nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm có khả năng sống lại được và phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm y tế có trong thuốc. Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn. Trong khi làm thí nghiệm, chú ý không đưa chất khử khuẩn vào mẫu thử. Thử nghiệm được áp dụng cho tất cả các dược phẩm gồm cả nguyên liệu và thành phẩm của các thuốc không tiệt khuẩn trong quá trình sản xuất. Thử nghiệm sơ bộ Tìm chất ức chế có trong thuốc Thử nghiệm giới hạn nhiễm khuẩn sẽ không có giá trị nếu chất ức chế có trong thuốc cản trở đến khả năng phát hiện các vi sinh vật. Vì vậy cần làm thí nghiệm kiểm tra trước bằng cách lấy dung dịch chế phẩm đã được pha ở nồng độ thích hợp vào môi trường chọn lọc cho Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa, rồi cấy vào đó 1 ml canh khuẩn 24 h tuổi đã pha loãng với dung dịch đệm phosphat pH 7,2 ít nhất tới độ pha loãng 10 -3 các vi khuẩn tương ứng. Nếu vi khuẩn không mọc, thí nghiệm cần thay đổi bằng cách: 1. Giữ nguyên lượng chất mang thử nhưng tăng thể tích môi trường. 2. Cho vào dung dịch pha loãng một lượng vừa đủ chất khử hoạt tính thích hợp. 3. Phối hợp cách làm (1) và (2) để vi khuẩn mang cấy có thể mọc được. Tuỳ theo thành phần và nồng độ của mẫu thử, có thể thêm vào môi trường để trung hòa chất ức chế các loại sau: lecithin đậu tương 0,5 %, polysorbat 20: 4,0 %. Làm lại thí nghiệm với điều kiện chất ức chế trong lượng mẫu mang kiểm tra đã được trung hòa. Môi trường Môi trường nuôi cấy có thể pha theo cách dưới đây hoặc có thể dùng môi trường khô do các hãng sản xuất môi trường vi sinh vật cung cấp. Các môi trường tự pha chế thường phải hấp tiệt khuẩn bằng nồi hấp ở nhiệt độ 121 °C trong 15 phút trừ khi có những chỉ dẫn riêng đối với loại môi trường đặc biệt. Thạch dùng cho pha chế môi trường có độ ẩm dưới 15 %. Nước dùng trong các công thức môi trường phải tinh khiết. Môi trường lỏng casein lecithin đậu tương polysorbat Casein thủy phân bởi pancreatin Lecithin đậu tương Polysorbat 20 Nước 20,0 g 5,0 g 40,0 ml 960 ml Hòa tan casein thủy phân bởi pancreatin và lecithin đậu tương vào 960 ml nước, đun cách thuỷ ở 48 °C đến 50 °C khoảng 30 phút cho tan hoàn toàn. Thêm 40 ml polysorbat 20, trộn đều, phân chia vào các dụng cụ thích hợp. Môi trường thạch casein đậu tương Casein thủy phân bởi pancreatin Natri clorid Thạch Bột đậu tương thủy phân bởi papain Nước pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 ± 0,2 15,0 g 5,0 g 15,0 g 5,0 g 1000 ml Môi trường lỏng casein đậu tương Casein thủy phân bởi pancreatin Dikali hydrophosphat Bột đậu tương thuỷ phân bởi papain Glucose Natri clorid Nước 17,0 g 2,5 g 3,0 g 2,5 g 5,0 g 1000 ml Hòa tan các chất rắn vào nước đun nóng nhẹ để tan hoàn toàn. Để nguội dung dịch ở nhiệt độ phòng, phân chia vào các bình thích hợp đã tiệt khuẩn. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 ± 0,2. Môi trường thạch muối - manitol Casein thủy phân bởi pancreatin Thạch Pepton Cao thịt bò Natri clorid D-Manitol Đỏ phenol Nước 5,0 g 15,0 g 5,0 g 1,0 g 75,0 g 10,0 g 0,025 g 1000 ml Trộn, đun nóng, khuấy đều, đun sôi khoảng 1 phút để tan hoàn toàn, pH sau khi tiệt khuẩn: 7,4 ± 0,2. Môi trường thạch Baird - Parker Casein thủy phân bởi pancreatin Cao thịt bò Cao nấm men Lithi clorid Thạch Glycin Natri pyruvat Nước 10,0 g 5,0 g 1,0 g 5,0 g 20,0 g 12,0 g 10,0 g 950 ml Đun nóng, khuấy đều sau đun sôi khoảng 1 phút, tiệt khuẩn, để nguội tới 45 °C đến 50 °C, thêm 10 ml dung dịch kali telurit 1 % vô khuẩn và 50 ml nhũ dịch lòng đỏ trứng. Trộn kỹ, nhẹ nhàng rót vào các hộp. Chế tạo nhũ dịch lòng đỏ trứng bằng cách: Sát khuẩn toàn bộ bề mặt quả trứng, đập vỡ quả trứng trong điều kiện vô khuẩn, lấy lòng đỏ trứng vào ống trụ chia vạch vô khuẩn. Thêm nước muối sinh lý vô khuẩn để có tỷ lệ lòng đỏ trứng so với nước muối sinh lý là 3/7. Bỏ vào một cốc khuấy vô khuẩn, trộn với tốc độ lớn trong 5 phút. pH sau khi tiệt khuẩn 6,8 ± 0,2. Môi trường thạch Vogel - Johnson Casein thủy phân bởi pancreatin Cao nấm men Manitol Natri pyruvat Thạch Glycin Lithi clorid Dikali hydrophosphat Đỏ phenol Nước 10,0 g 5,0 g 10,0 g 10,0 g 16,0 g 10,0 g 5,0 g 5,0 g 25,0 mg 1000 ml Đun sôi để hòa tan các chất rắn trong khoảng 1 phút. Tiệt khuẩn, để nguội đến 45 °C đến 50 °C. Thêm 20 ml dung dịch kali telurit 1 % vô khuẩn. pH sau khi tiệt khuẩn 7,2 ± 0,2. Môi trường thạch cetrimid Gelatin thủy phân bởi pancreatin Cetrimid (cetyl trimethylamoni bromid) Magnesi clorid Thạch Glycerin 20,0 g 0,3 g 1,4 g 13,6 g 10,0 ml Nước 1000 ml Hòa tan tất cả các chất rắn vào trong nước, thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun sôi 1 phút cho tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,2 ± 0,2 Môi trường thạch Pseudomonas để phát hiện Fluorescin Casein thủy phân bởi pancreatin Pepton Dikali hydrophosphat khan Magnesi sulfat (MgSO 4 .7H 2 O) Thạch Glycerin Nước 10,0 g 10,0 g 1,5 g 1,5 g 15,0 g 10,0 ml 1000 ml Hòa tan tất cả các chất rắn vào nước trước khi thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun sôi 1 phút cho tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,2 ± 0,2. Môi trường thạch Pseudomonas để phát hiện Pyocyanin Gelatin thủy phân bởi pancreatin Kali sunfat khan Thạch Magnesi clorid khan Glycerin Nước 20,0 g 10,0 g 15,0 g 1,4 g 10,0 ml 1000 ml Hòa tan các chất rắn trong nước trước khi thêm glycerin. Đun nóng, khuấy đều, đun sôi khoảng 1 phút để tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,2 ± 0,2. Môi trường lỏng lactose Cao thịt bò Lactose Gelatin thủy phân bởi pancreatin Nước 3,0 g 5,0 g 5,0 g 1000 ml Làm lạnh rất nhanh môi trường sau khi tiệt khuẩn. pH sau khi tiệt khuẩn: 6,9 ± 0,2 Môi trường lỏng selenit - cystin Casein thủy phân bởi pancreatin Natri selenit acid Natri phosphat Lactose 5,0 g 4,0 g 10,0 g 4,0 g L- Cystin Nước 10,0 mg 1000 ml Đun nóng để tan hoàn toàn. Đun tiếp 15 phút nữa. Không cần tiệt khuẩn tiếp theo. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,0 ± 0,2 Môi trường lỏng tetrathionat Casein thủy phân bởi pancreatin Calci carbonat Muối mật Pepton Natri thiosulfat Nước 2,5 g 10,0 g 1,0 g 2,5 g 30,0 g 1000 ml Đun nóng để hòa tan các chất rắn. Khi sử dụng thêm vào môi trường dung dịch gồm: 5,0 g kali iodid và 6,0 g iod trong 20 ml nước. Sau đó thêm 10 ml dung dịch xanh brilliant 0,1 % và trộn đều. Không đun nóng môi trường sau khi thêm dung dịch xanh brilliant. Môi trường thạch xanh brilliant Pepton Đường trắng Cao nấm men Casein thủy phân bởi pancreatin Lactose Natri clorid Thạch Đỏ phenol Xanh brilliant Nước 5,0 g 10,0 g 3,0 g 5,0 g 10,0 g 5,0 g 20,0 g 80,0 mg 12,5 mg 1000 ml Đun sôi để hòa tan tất cả các chất rắn trong 1 phút. Chỉ tiệt khuẩn trước khi dùng. Rót vào các hộp Petri và để nguội. pH sau khi tiệt khuẩn: 6,9 ± 0,2 Môi trường thạch xylose - lysin - desoxycholat Xylose Đỏ phenol L-Lysin Thạch Lactose Natri desoxycholat Đường trắng Natri thiosulfat Natri clorid Sắt (III) amoni citrat Cao nấm men Nước 3,5 g 0,08 g 5,0 g 13,5 g 7,5 g 2,5 g 7,5 g 6,8 g 5,0 g 0,8 g 3,0 g 1000 ml Đun nóng, lắc tròn để trộn đều chất rắn với nước. Chú ý không để nóng quá. Chuyển ngay vào bình cách thuỷ và giữ ở nhiệt độ 50 °C. Rót vào các đĩa ngay trước khi môi trường nguội hoàn toàn. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,4 ± 0,2 Môi trường thạch bismuth sulfit Cao thịt bò Sắt (II) sulfat Casein thủy phân bởi pancreatin Bismuth sulfit Pepton Thạch Glucose Xanh brilliant Natri phosphat Nước 5,0 g 0,3 g 5,0 g 8,0 g 5,0 g 20,0 g 5,0 g 25,0 mg 4,0 g 1000 ml Đun nóng, lắc tròn để hòa đều các chất rắn với nước, không để nóng quá. Chuyển ngay vào bình cách thuỷ và giữ ở nhiệt độ 50 °C. Rót vào các đĩa để nguội. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,6 ± 0,2 Môi trường thạch - sắt - ba đường Casein thủy phân bởi pancreatin Sắt (II) amoni sulfat Pepton Natri clorid Lactose Natri thiosulfat Đường trắng Thạch D-Glucose monohydrat Đỏ phenol Nước 10,0 g 0,2 g 20,0 g 5,0 g 10,0 g 0,3 g 10,0 g 13,0 g 1,0 g 0,025 g 1000 ml Hòa nóng các chất rắn với nước, đun sôi một phút cho tan hoàn toàn. Chuyển vào các dụng cụ thích hợp đã tiệt khuẩn. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3 ± 0,2 Môi trường Mac - Conkey Casein thủy phân bởi pancreatin 1,5 g Natri clorid Gelatin thủy phân bởi pancreatin Thạch Pepton Lactose Muối mật Đỏ trung tính Tím tinh thể Nước 5,0 g 17,0 g 13,5 g 1,5 g 10,0 g 1,5 g 30,0 mg 1,0 mg 1000 ml Hòa nóng các chất rắn với nước, đun sôi một phút cho tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 ± 0,2 Môi trường thạch Levine - eosin - xanh methylen Gelatin thủy phân bởi pancreatin Dikali hydrophosphat Thạnh Lactose Eosin Y Xanh methylen Nước 10,0 g 2,0 g 15,0 g 10,0 g 0,4 g 0,065 g 1000 ml Hòa tan nóng các thành phần gelatin pancreatic, dikali hydrophosphat và thạch trong nước, để lạnh. Các thành phần còn lại chỉ thêm vào khi sử dụng bằng cách đun chảy môi trường rồi thêm vào theo tỷ lệ: Cứ 100 ml môi trường thêm 5 ml dung dịch lactose (1 : 5), 2 ml dung dịch eosin Y (1 : 50) và 2 ml dung dịch xanh methylen (1 : 300). Môi trường sau khi hòa trộn có thể không trong suốt. pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 ± 0,2 Môi trường thạch Sabouraud Glucose monohydrat Casein thủy phân bởi pancreatin Pepton Thạch Nước 40,0 g 5,0 g 5,0 g 15,0 g 1000 ml Hòa tan, đun sôi cho tan hoàn toàn. pH sau khi tiệt khuẩn: 5,6 ± 0,2 Môi trường Sabouraud lỏng Glucose 20,0 g Pepton 5,0 g Casein thủy phân bởi pancreatin 5,0 g Nước 1000 ml pH sau khi tiệt khuẩn: 5,6 ± 0,2 Môi trường thạch - khoai tây - glucose Nấu 300 g khoai tây đã bóc vỏ và thái nhỏ trong 500 ml nước cất, lọc qua vải, thêm nước cất để được 1000 ml, rồi thêm vào các thành phần sau: thạch 15,0 g; glucose 20,0 g. Hòa tan nóng. Tiệt khuẩn. Khi dùng đun nóng chảy, để nguội đến 45 °C. Điều chỉnh môi trường bằng dung dịch acid tartric (1 : 10) đến pH 3,5 ± 0,1. Rót vào các đĩa. Chú ý: Không dùng môi trường đun nóng trở lại lần thứ 2. Để ức chế vi khuẩn thường gặp mọc trên môi trường phát hiện nấm mốc và nấm men (môi trường thạch Sabouraud hoặc môi trường thạch - khoai tây - glucose) thêm vào một lít môi trường 0,1 g tetracyclin hoặc 50 mg cloramphenicol, làm đều ngay trước khi dùng. Dung dịch đệm phosphat pH 7,2: Hòa 34 g kali dihydrophosphat (TT) vào khoảng 500 ml nước cất trong bình định mức 1000 ml. Điều chỉnh pH tới 7,2 ± 0,1 bằng cách thêm dung dịch natri hydroxyd 2 %. Thêm nước cất tới vạch. Trộn đều, phân chia vào các bình, tiệt khuẩn, bảo quản ở lạnh. Khi dùng, hòa loãng với nước cất theo tỷ lệ 1 : 800 và tiệt khuẩn. Môi trường nước thịt Cao thịt bò 5,0 g Nước 1000 ml Môi trường thạch thường Pepton Natri clorid Thạch Nước pH sau khi tiệt khuẩn 10,0 g 5,0 g 15 đến 20 g 1000 ml 7,4 ± 0,2 Môi trường pepton - natri clorid Pepton Natri clorid Nước pH sau khi tiệt khuẩn 10,0 g 5,0 g 1000 ml 7,0 ± 0,2 Môi trường tăng sinh cho Clostridia Cao thịt bò Pepton Cao nấm men Tinh bột dễ tan Glucose monohydrat Cystein hydroclorid Natri clorid Natri acetat Thạch Nước 10,0 g 10,0 g 3,0 g 1,0 g 5,0 g 0,5 g 5,0 g 3,0 g 0,5 g 1000 ml Hòa tan thạch bằng cách đun nóng tới sôi, khuấy đều liên tục. Hấp tiệt khuẩn 121 °C trong 15 phút. Nếu cần điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn khoảng 6,8. Môi trường thạch Columbia Casein thủy phân bởi pancreatin Cao thịt bò Tim thủy phân bởi pancreatin Cao nấm men Tinh bột ngô Natri clorid Thạch bột Nước cất 10,0 g 5,0 g 3,0 g 5,0 g 1,0 g 5,0 g 15,0 g 1000 ml Hòa tan thạch bằng cách đun nóng tới sôi, khuấy đều liên tục. Nếu cần điều chỉnh pH sao cho sau khi tiệt khuẩn khoảng 7,3 ± 0,2. Hấp tiệt khuẩn 121 °C trong 15 phút. Làm lạnh tới 45 °C đến 50 °C. Khi cần có thể thêm 20 mg gentamycin base và rót vào các hộp Petri. Môi trường sulfit - lactose Casein thủy phân bởi pancreatin 5,0 g 2,5 g Cao nấm men Cystein hydroclorid Natri clorid Lactose Nước cất 0,3 g 2,5 g 10,0 g 1000 ml Hòa tan tất cả các thành phần trong nước và điều chỉnh để có pH 7,1 ± 0,1. Đóng vào các ống nghiệm 16 mm × 160 mm mỗi ống 8 ml và một ống nhỏ Durham. Hấp tiệt khuẩn 121 °C trong 15 phút. Bảo quản ở 4 °C. Môi trường lỏng Enterobacteria - Mossel Genlatin thủy phân bởi pancreatin D-Glucose monohydrat Mật bò khô Kali dihydrophosphat Dinatri hydrophosphat dihydrat Xanh brilliant Nước 10,0 g 5,0 g 20,0 g 2,0 g 8,0 g 15 mg 1000 ml Điều chỉnh pH sao cho sau khi đun là 7,0 đến 7,4. Đun sôi trong 30 phút và làm lạnh ngay. Môi trường muối mật violet - red Cao nấm men Gelatin thủy phân bởi pancreatin Muối mật Lactose monohydrat Natri clorid D-Glucose monohydrat Đỏ trung tính Tím tinh thể Thạch Nước 3,0 g 7,0 g 1,5 g 10,0 g 5,0 g 10,0 g 30 mg 2 mg 15,0 g 1000 ml Điều chỉnh pH sao cho sau khi đun là 7,2 đến 7,6. Môi trường được đun sôi để tiệt trùng nhưng không được hấp tiệt trùng. Chuẩn bị thí nghiệm Lấy mẫu Đối với các thử nghiệm dưới đây, mỗi thử nghiệm lấy 10 ml hoặc 10 g chế phẩm. Cách thử nghiệm Một mẫu chế phẩm cần xác định giới hạn vi khuẩn phải thực hiện đầy đủ các thử nghiệm sau: Đếm tổng số vi sinh vật hiếu khí sống lại được, tính ra số lượng vi khuẩn, nấm có trong 1g hoặc 1 ml chế phẩm. Thử nghiệm tìm những vi khuẩn gây bệnh sau: Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Salmonella Escherichia coli Chuẩn bị mẫu Chế phẩm mang thử nghiệm trong quá trình hòa tan hoặc nhũ hóa phải đảm bảo không làm thay đổi chủng loại vi khuẩn, nấm có trong thuốc. Để có một dung dịch hoặc nhũ dịch thích hợp cho thử nghiệm, tiến hành như sau: Đối với chế phẩm rắn, hòa tan trực tiếp hoặc nghiền mịn chế phẩm trong bình với dung môi hoặc chất nhũ hóa thích hợp. Đối với chế phẩm ở dạng lỏng như dung dịch thực, nhũ dịch trong nước, chất rắn hòa tan dễ dàng và hoàn toàn trong nước , dùng dung dịch đệm phosphat pH 7,2 hoặc dung dịch natri clorid 0,9 % để hòa loãng. Những chế phẩm lỏng không thể hòa lẫn trong nước như dầu, kem hoặc sáp: Chế tạo nhũ dịch bằng cách thêm một lượng vừa đủ tác nhân nhũ hóa vô khuẩn thích hợp như các loại polysorbat. Dùng phương pháp khuấy trộn cơ học hoặc đồng thời làm ấm bằng nhiệt nhưng không được vượt quá 45 °C để có nhũ dịch chế phẩm đồng nhất. Các chế phẩm ở dạng khí dung - lỏng: Làm lạnh bình để các khí hóa lỏng rồi mở nắp để lấy một lượng thích hợp mang thử. Tiến hành Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí Đối với chế phẩm hòa tan tốt hoặc tạo thành dung dịch hơi đục, dùng phương pháp đĩa thạch. Còn các chế phẩm khác dùng phương pháp hòa loãng trong ống nghiệm. Hòa tan hoặc làm nhũ hóa 10 g hoặc 10 ml chế phẩm vừa đủ trong 100 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,2 hoặc trong 100 ml dung môi thích hợp với từng loại chế phẩm, để được dung dịch chế phẩm có độ pha loãng ở tỷ lệ 1/10. Đối với những chế phẩm dạng nhầy không thể lấy chính xác bằng pipet ở tỷ lệ 1/10, có thể pha loãng tiếp để lấy được chính xác, nghĩa là có thể pha loãng đến tỷ lệ 1/50 hoặc 1/100 v.v Thực hiện thử nghiệm phát hiện chất ức chế trước khi xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí. Chế phẩm đã pha loãng phải cho ngay vào môi trường nuôi cấy mà không được để quá 1 giờ. a) Phương pháp đĩa thạch Hòa loãng chế phẩm sao cho khi cấy 1 ml dịch chế phẩm vào môi trường trong một hộp Petri, số khuẩn lạc mọc khoảng 30 đến 300 khuẩn lạc. Lấy dung dịch có độ pha loãng cuối cùng cho vào 2 hộp Petri, mỗi hộp 1ml. Thêm vào mỗi hộp 15 ml đến 20 ml môi trường thạch casein đậu tương hoặc môi trường thạch thường đã đun chảy và để nguội đến 45 °C. Đậy hộp, trộn đều bằng cách xoay qua, xoay lại. Sau đó để yên cho thạch đông cứng ở nhiệt độ phòng. Lật ngược hộp, mang ủ ở 30 - 35 °C từ 48 giờ đến 72 giờ. Sau thời gian ủ, kiểm tra vi khuẩn mọc ở đĩa, đếm số lượng khuẩn lạc. Lấy giá trị của đĩa có số lượng khuẩn lạc lớn nhất mà số khuẩn lạc trong đĩa không lớn hơn 300 và tính ra số lượng vi khuẩn trong 1 g hoặc 1 ml chế phẩm. Nếu thấy không có khuẩn lạc mọc ở đĩa có độ pha loãng 1/10 thì kết luận chế phẩm có ít hơn 10 vi khuẩn trong 1 g hoặc 1 ml. b) Phương pháp pha loãng trong ống nghiệm Cho vào 14 ống nghiệm cỡ thông thường, mỗi ống 9,0 ml môi trường lỏng casein đậu tương. Lấy một dãy 12 ống chia thành 4 lô, mỗi lô 3 ống. Dùng một lô 3 ống để kiểm tra. Thêm vào lô 1 gồm 3 ống và một ống thứ 4 (ống A) 1 g (hoặc 1 ml) chế phẩm và trộn đều. Thêm vào lô 2 gồm 3 ống và một ống thứ 4 (ống B) 1 ml dung dịch lấy từ ống A và trộn đều. Thêm vào lô 3 gồm 3 ống, mỗi ống 1 ml dung dịch lấy từ ống B và trộn đều. Bỏ lượng (hoặc phần) không sử dụng của ống A và ống B. Theo cách pha trên có lô 1, lô 2, lô 3, tương ứng với lượng chế phẩm là: 100; 10; và 1 mg hoặc µl trong mỗi ống. Đậy kín các ống mang ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 48 đến 72 giờ, quan sát vi khuẩn mọc ở các ống chứa chế phẩm, mang đối chiếu với Bảng 13.6.1 để biết số lượng vi khuẩn có trong 1 g hoặc 1 ml chế phẩm. Bảng 13.6.1 Số lượng vi khuẩn lớn nhất có thể có trong chế phẩm Số mg (µl) chế phẩm cho mỗi ống Số lượng vi khuẩn lớn nhất có thể có trong 1 g hoặc 1 ml 100 10 1 Số ống có vi 0 0 0 1 0 0 < 3 3 khuẩn mọc 1 1 0 0 0 1 3 7 1 1 2 2 1 2 0 0 0 0 0 1 7 11 9 14 2 2 2 3 1 1 2 0 0 1 0 0 15 20 21 23 3 3 3 3 0 1 1 2 1 0 1 0 38 43 75 93 3 3 3 3 2 2 3 3 1 2 0 1 150 210 240 460 3 3 3 3 2 3 1100 > 1100 c) Phương pháp màng lọc: Dùng các màng lọc có kích thước lỗ lọc không lớn hơn 0,45 µm, có khả năng giữ lại các vi khuẩn cần kiểm tra. Chọn loại màng lọc làm bằng nguyên liệu giữ lại vi khuẩn nhưng không ảnh hưởng đến mẫu thử. Thí dụ có thể dùng màng celulose nitrat để lọc các dung dịch nước, dầu và cồn thấp độ. Dùng màng celulose acetat để lọc dung dịch cồn cao độ. Dùng hệ thống lọc có thiết kế cho phép chuyển được màng lọc vào môi trường nuôi cấy. Chuyển một lượng thích hợp dung dịch mẫu thử đó pha theo mục “Chuẩn bị mẫu” (tốt nhất là lấy một lượng dung dịch mẫu tương đương với 1 g hoặc 1 ml mẫu cần thử; nếu lượng vi khuẩn có nhiều trong mẫu thử, có thể lấy lượng dung dịch mẫu ít hơn). Mỗi mẫu thử cần 2 màng lọc, dung dịch mẫu thử sau khi chuẩn bị phải được lọc ngay qua màng lọc. Rửa màng lọc 3 lần, mỗi lần khoảng 100 ml dung dịch thích hợp như dung dịch đệm phosphat pH 7,2. Khi cần có thể thêm chất hoạt động bề mặt như polysorbat 80 hoặc các chất khử hoạt tính của các chất kháng khuẩn vào dung dịch dùng để rửa. Cũng có thể rửa màng lọc với số lần ít hơn, nếu thấy đủ loại hết thuốc và tác nhân ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm khỏi màng lọc. Chuyển một màng lọc lên môi trường thạch dùng phát hiện vi khuẩn. Ủ ở 30 °C đến 35 °C, theo dõi trong 48 đến 72 giờ, đếm số khuẩn lạc mọc trên màng lọc. Chuyển màng lọc còn lại lên mặt môi trường phát hiện nấm. Ủ ở 20 °C đến 25 °C, theo dõi trong 5 ngày, đếm số khuẩn lạc mọc trên màng lọc. Nếu chắc chắn về thời gian mọc của nấm cần phát hiện thì có thể theo dõi, đếm trong khoảng thời gian ngắn hơn. Chọn đếm các đĩa có số khuẩn lạc cao nhất ít hơn 100 khuẩn lạc trên màng. Tính số vi khuẩn hoặc nấm có trong 1 gam hoặc 1 ml mẫu thử. Mẫu thử là thuốc dạng miếng đắp thấm qua da: Chuyển vô trùng 10 miếng dán vào bình đã có sẵn 500 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,2, Lắc đều trong 30 phút. Lọc qua 2 màng lọc để tìm vi khuẩn và nấm mỗi màng 50 ml dung dịch. Tiếp tục ủ, theo dõi, đếm vi khuẩn và nấm như ở trên. Thử nghiệm tìm các vi khuẩn gây bệnh a) Tìm Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa Cho một lượng chế phẩm đã pha loãng tương ứng với 1 g hoặc 1 ml chế phẩm vào 100 ml môi trường lỏng casein đậu tương, ủ ở 30 °C đến 35 °C trong 18 đến 72 giờ, kiểm tra vi khuẩn mọc ở môi trường. Nếu thấy mọc, dùng que cấy lấy môi trường, cấy lên đĩa thạch Vogel - Johnson (hoặc thạch Baird - Parker hoặc thạch manitol - muối) và môi trường thạch cetrimid. Đậy đĩa, lật ngược hộp Petri, mang ủ 30 °C đến 35 °C trong 18 đến 72 giờ. Sau khi ủ kiểm tra nếu không thấy có những khuẩn lạc với đặc tính như ghi trong Bảng 13.6.2 và Bảng 13.6.3 (nêu ở phần sau) đối với từng môi trường đã sử dụng thì chế phẩm không có Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa. Nếu thấy có khuẩn lạc nghi ngờ thì tiếp tục làm các phản ứng sinh hóa của Staphylococcus aureus hoặc Pseudomonas aeruginosa như sau: *Phản ứng coagulase (đối với Staphylococcus aureus): Dùng que cấy chuyển khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng từ mặt thạch Vogel-Johnson (hoặc thạch Baird - Parker, hoặc thạch manitol - muối) thêm vào từng ống nghiệm, mỗi ống 0,5 ml huyết tương thỏ hoặc ngựa. Đem ủ 37 °C, kiểm tra các ống sau 3 giờ ủ rồi tiếp tục ủ thêm 24 giờ. Nếu thấy có đông huyết tương (ở bất kỳ mức độ nào), chế phẩm có Staphylococcus aureus. Bảng 13.6.2 - Đặc điểm hình thái của Staphylococcus aureus trên các môi trường lựa chọn Môi trườn g Thạch Vogel - Johnson Thạch manitol - muối Thạch Baird - Parker Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Màu đen được bao bọc bằng một vùng vàng Khuẩn lạc màu vàng cùng với một vùng vàng xung quanh Khuẩn lạc màu đen bóng, viền quanh bằng một vùng sáng rõ 2 mm đến 5 mm *Phản ứng oxydase và sinh sắc tố (đối với Pseudomonas aeruginosa): Lấy những khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng từ mặt môi trường thạch cetrimid cấy ria trên mặt môi trường thạch Pseudomonas phát hiện Fluorescin và môi trường Pseudomonas phát hiện Pyocyanin trong hộp Petri. Nếu nhiều khuẩn lạc cần được cấy truyền, có thể chia bề mặt hộp thành bốn phần, mỗi phần cấy một loại khuẩn lạc lựa chọn. Đậy và lật ngược hộp môi trường đã cấy truyền và ủ ở (35 + 2) °C ít nhất 3 ngày kiểm tra đường cấy dưới ánh sáng đèn tử ngoại. Kiểm tra các đĩa để xác định có khuẩn lạc đặc trưng theo Bảng 13.6.3 hay không. Xác nhận bất kỳ khuẩn lạc nghi ngờ nào mọc trên một hoặc nhiều môi trường. Phát hiện Pseudomonas aeruginosa bằng phản ứng oxydase: Nhỏ ngay lên khuẩn lạc hoặc chuyển khuẩn lạc lên một mẩu (hoặc một khoanh) giấy đã tẩm trước dung dịch N,N-dimethyl-phenylen diamin dihydroclorid 1 %. Nếu thấy hiện màu đỏ hồng chuyển sang màu tím, chế phẩm có Pseudomonas aeruginosa. Có thể xác định Pseudomonas aeruginosa bằng các phép thử sinh hóa và nuôi cấy thích hợp khác. Bảng 13.6.3 - Đặc điểm hình thái của Pseudomonas aeruginosa trên các môi trường lựa chọn Môi trường Thạch cetrimid Thạch Pseudomonas để phát hiện Fluorescin Thạch Pseudomonas để phát hiện Pyocyanin Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Màu lục nhạt thông thường Không màu đến màu vàng nhạt Màu vàng nhạt [...]...Huỳnh Màu lục Màu hơi vàng quang ở ánh sáng tia cực tím Phản Dương Dương tính ứng tính oxydase Trực Trực khuẩn Nhuộm khuẩn Gram âm Gram Gram âm Màu xanh nước biển Dương tính Trực khuẩn Gram âm b) Tìm Salmonella... xylose-lysin-deoxycholat, môi trường thạch bismuth sulfit trong các đĩa Petri Đậy đĩa, lật ngược, ủ ở 35 °C đến 37 °C trong 18 đến 72 giờ Kiểm tra, nếu không thấy khuẩn lạc có dạng như mô tả ở Bảng 13.6 .4, chế phẩm không chứa Salmonella Bảng 13.6.4 - Đặc điểm hình thái của Salmonella trên môi trường lựa chọn Mô tả khuẩn lạc Khuẩn lạc không màu hoặc màu hồng nhạt tới trắng Thạch xanh brilliant đục, nhỏ,... tới đỏ) Khuẩn lạc màu đỏ, Thạch xylose - lysin có thể chấm đen ở desoxycholat trung tâm Môi trường Thạch bismuth sulfit Khuẩn lạc màu đen hoặc màu xanh Nếu thấy khuẩn lạc có dạng như mô tả ở Bảng 13.6 .4, đem nhuộm soi thấy gồm những trực khuẩn hình gậy, Gram âm, thực hiện tiếp bằng cách chuyển khuẩn lạc nghi ngờ riêng biệt sang ống môi trường thạch - sắt - ba đường (nghiêng) Trước tiên cấy ria trên... bằng cách xử lý một l ượng thích hợp như đã mô tả ở phần chuẩn bị mẫu và ủ ở 35 °C đến 37 °C trong một thời gian thích hợp (th ường từ 2 giờ đến không quá 5 giờ) trong môi trường canh thang lactose để phục hồi lại vi khuẩn mà không làm tăng số lượng vi khuẩn Lắc bình chứa và chuyển một lượng đã đồng nhất của chế phẩm tương đương khoảng 1 g hoặc 1 ml chế phẩm vào 100 ml môi trường lỏng Enterobacteria-... môi trường thạch Columbia đã thêm gentamycin và tiếp tục ủ ở điều kiện kỵ khí ở 35 °C đến 37 °C trong 48 giờ Nếu không thấy có vi khuẩn mọc, mẫu thử đạt yêu cầu Khi thấy vi khuẩn mọc, chọn một khuẩn lạc điển hình cấy chuyển sang môi trường thạch Columbia không có gentamycin và ủ ở hai điều kiện kỵ khí và hiếu khí Khi chỉ thấy vi khuẩn mọc ở điều kiện kỵ khí, trực khuẩn Gram dương (có hoặc không có nội . cystin Casein thủy phân bởi pancreatin Natri selenit acid Natri phosphat Lactose 5,0 g 4,0 g 10,0 g 4,0 g L- Cystin Nước 10,0 mg 1000 ml Đun nóng để tan hoàn toàn. Đun tiếp 15 phút nữa. Không. Pyocyanin Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Màu lục nhạt thông thường Không màu đến màu vàng nhạt Màu vàng nhạt Huỳnh quang ở ánh sáng tia cực tím Màu lục Màu hơi vàng Màu xanh nước biển Phản. pancreatin Dikali hydrophosphat Bột đậu tương thuỷ phân bởi papain Glucose Natri clorid Nước 17, 0 g 2,5 g 3,0 g 2,5 g 5,0 g 1000 ml Hòa tan các chất rắn vào nước đun nóng nhẹ để tan hoàn toàn.