LOI MO DAU
Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật ứng dụng, đặc biệt là các ngành công nghệ sinh học, y học và công nghiệp chế biến thực phẩm thì việc đánh giá chất lượng thực pham dang rất được quan tâm và chú ý Trong số các
chỉ tiêu đùng để đánh giá chất lượng thực phâm như hàm lượng đường, hàm lượng lipit, các chất khoáng, các chất Vitamin thì hàm lượng protein chứa trong thực phâm là chỉ tiêu quan trọng hơn cả
Trong những năm vừa qua, ở nước ta vấn đề vệ sinh và an toàn thực phâm đang trở thành một đề tài nóng bỏng, thu hút được sự chú ý của rất nhiều nhà khoa học Vì vậy, mục đích của khoá luận này là bước đầu xác định hàm lượng các axit
amin và protein trong thực phẩm
Nội dung nghiên cứu của bản khoá luận này bao gồm:
* Xây dựng một phương pháp cho phép xác định nhanh và tương đối chính
xác hàm lượng các axit amin và protein trong thực phẩm
* Ứng dụng phương pháp trên vào việc đánh giá sơ bộ chất lượng của một số
Trang 2CHUONG 1: TONG QUAN
1 PROTEIN VA CAC CHUC NANG [1,2,3] 1.1 Dinh nghia
Protein 1a polyme sinh học của L-ỏ-aminoaxIt kết hợp với nhau bằng liên kết
peptit
1.2 Phan loai
Dựa vào thành phần hoá học các protein được phân thành hai nhóm lớn:
* Protein don gian: - Các L-ỏ-aminoaxit
- Polypeptit gồm hai hay vài chục aminoaxit liên kết với nhau
- Protein gồm vài chục aminoaxit trở lên liên kết với nhau
* Protein phức tạp: Phân tử của nó bao gồm phần protein và phần không phải
protein gọi là " nhóm ngoại " Tuỳ theo bản chất hoá học của nhóm ngoại, có thể
phân thành các nhóm nhỏ như :
~ Metaloprotein (nhóm ngoại là 1on kim loại như Fe”, Zn”`)
- Lipoprotein (nhom ngoại là lipIt) - Glycoprotein (nhóm ngoại là gluxit)
- Phosphoprotein (nhóm ngoại là phosphat, ví dụ casein sữa) ~- Nueleoprotein (nhóm ngoại là axit nucleic)
- Cromoprotein(nhóm ngoại là các chất mang màu) 1.3 Hàm lượng
Ở động vật có hàm lượng cao hơn thực vật, ở người protein chiếm tới 45%
Trang 3Bảng 1: Hàm lượng protein trong một số nguyên liệu động vật và thực vật Nguyên liệu % Protein Nguyên liệu % Protein Gan 18-19 Moi 13-16 Tim 16-18 Oc 11-12
Thit gia suc 16-22 So 8-9
Trứng gia cam 13-15 Hên 4-5
Sữa bò 3-5 Đậu tương 34-40 Cá 17-21 Lạc 23-27 Tôm 19-23 Ngô 8-10 Muc 17-20 Gao 7-8 1.4 Chức năng
Protein là thành phần không thể thiếu được của tất cả các cơ thể sống
Protein là nền tảng về cấu trúc và chức năng của cơ thê sinh vật Dưới đây là một số chức năng quan trọng của protein:
1 Xúc tác
Cac protein có chức năng xúc tác các phản ứng sinh học gọi là enzim Hầu hết các phản ứng của cơ thể sống từ những phản ứng đơn giản nhất như phản ứng
hydrat hoá, phản ứng khử nhóm cacboxyl đến những phản ứng phức tạp như sao chép mã di truyền đều đo enzim xúc tác
2 Vận tải
Protein đóng vai trò như là các phương tiện vận tải chuyên chở các chất
Trang 4khắp các mô và cơ quan trong cơ thể Hemoglobin còn vận tải cả CO; và HỈ
Glubolin lại vận tải Fe
3 Vận động
Nhiều protein trực tiếp tham gia trong quá trình chuyển động như : co cơ, chuyển vị trí của nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào, di động của tỉnh trùng
Ở động vật có xương sống, sự co cơ được thực hiện nhờ chuyển động trượt trên nhau của hai loại sợi protein: sợi to chứa protein miozin và sợi mảnh chứa các
protein actin, troponiozin, troponin 4 Bao vé
Đó là các kháng thể trong máu động vật có xương sông Chúng có khả năng
nhận biết , "bắt" những chất lạ xâm nhập vào cơ thể như protein la, virut, vi khuẩn hoặc tế bào lạ và loại chúng ra khỏi cơ thể Ví dụ, các interferon là những protein do tế bào động vật có xương sống tổng hợp và tiết ra để chống lại sự nhiễm virut Tác dụng của cac interferon rất mạnh, chỉ cần ở nồng độ 10M đã có hiệu quả
kháng virut rõ rệt Interferon kết hợp vào màng nguyên sinh chất của các tế bào khác trong cơ thê và cảm ứng trạng thái kháng virut của chúng
Các protein tham gia trong quá trình đông máu có vai trò bảo vệ cho co thé
sống khỏi bị mất máu
Ở một sỐ thực vật có chứa các protein có tác dụng độc đối với động vật, ngay
cả ở liều lượng rất thấp chúng cũng có tác dụng bảo vệ thực vật khỏi sự phá hoại
của động vật
5 Điều hòa
Một số protein có chức năng điều hoà quá trình thông tin di truyền, điều hoà
quá trình trao đổi chất Protein điều hoà quá trình biểu hiện gen, như các protein reprexơ ở vi khuẩn có thể làm ngừng quá trình sinh tổng hợp enzim của các gen
tương ứng Ở cơ thể bậc cao sự điều hoà hoạt động biểu hiện gen theo một cơ chế
Trang 5Các protein có hoạt tính hormon, các protein ức chế đặc hiệu enzim đều có
chức năng điều hoà nhiều quá trình trao đổi chất khác nhau 6 Truyền xung thần kinh
Một số protein có vai trò trung gian cho phản ứng trả lời của tế bào thần kinh đối với các kích thích đặc hiệu Ví dụ vai trò của sắc tố thị giác rodopxin ở màng
lưới mắt
7 Cấu trúc
Các protein này thường có dạng sợi như sclerotin trong lớp vỏ ngồi của cơn
trùng, fibroin của tơ tằm, tơ nhện, colagen, elastin của mô liên kết, mô Xương
8 Dự trữ dinh dưỡng
Protein còn là chất đinh dưỡng quan trọng cung cấp các axit amin cho phôi phát triển Ví dụ, albumin trong lòng trắng trứng, casein trong sữa, gliadin trong hạt lúa mì, zein của ngô
1.5 CAU TAO PHAN TU’ PROTEIN [1,2,3]
1.5.1 Thành phần các nguyên tố của protein
Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C, H, O,N Một số còn có chứa
Trang 6Ngoài các nguyên tố trên, một số protein còn chứa một lượng rất nhỏ các nguyên tố
khác như: P, Fe,Zn, Cu, Mn, Ca
1.5.2 Đơn vị cấu tạo cơ sở của protein: L-ơ-aminoaxit
Tuy protein rất đa dạng về cấu trúc và đảm nhận nhiều chức năng như vậy song hầu như đều xây dựng nên các đại phân tử của mình chủ yếu từ 20 L-œ-
aminoaxit bang lién két peptit Do vậy, cũng có thể xem các aminoaxit này là sản phẩm cuối cùng của sự thuỷ phân peptit và protein
Valin, một đại diện của a-aminoaxit ở dạng không ion
Trang 7ÑHạ ÑH 3 NHạ R($)—n HạC =)— H H m(C„)— CHạ ằ c oy “y “d Đ.:—=Ø o-'o Kì = Đi
Biểu diễn trên không gian 3 chiều Các đồng phân lập thể
Hình 2: Cấu trúc lập thể của œ-aminoaxit
Như vậy cấu tạo của chúng giống nhau ở chỗ cùng có nhóm cacboxyl - COOH và nhóm amin - NHạ đều gắn vào nguyên tử C ở vị trí œ, còn khác nhau bởi
cấu tạo của mạch bên R
Khi thiếu thậm chí chỉ một trong các axit amin cần thiết có thể làm cho protein được tổng hợp ít hơn protein bị phân giải, kết quả dẫn đến mắt cân bằng đối với nitơ Hàm lượng các axit amin không thay thế và tỉ lệ giữa chúng trong phân tử protein là một tiêu chuẩn quan trọng để đánh giá chất lượng protein
Trong dung dịch, các aminoaxit thường ở dạng ion lưỡng tính mang cùng một lúc điện tích đương (+) do nhóm -NH; ở dạng -NH;'` và điện tích âm (-) do
nhóm -COOH ở dạng -COO Chúng hấp thụ ánh sáng, đặc biệt là dung dịch của 3 aminoaxit chứa nhân thơm: Tryptophan, tyrozin và phenylalanin hấp thụ khá mạnh
Trang 8Trong dung dịch, tuỳ thuộc vào pH của môi trường nó có thể là ion lưỡng tính, hoặc mang điện (+) hoặc (-) Giá trị pH mà ở đó amino axit tồn tại đạng ion lưỡng cực được gọi là điểm đắng điện và pH dược gọi là pI Vì các mạch bên R
khác nhau giữa các aminoaxit nên mỗi aminoaxit có một điểm dang dién riéng Tai
điểm đắng điện, tông điện tích của aminoaxit bằng 0 Còn ở bất kỳ điểm pH nào
thấp hon pI hoac cao hon pl cac aminoaxit déu mang điện tích dương hoặc âm,
điều này tuỳ thuộc điện tích mạch bên R của chính nó Vì vậy, trong thực tế đặc
tính này được sử dụng đề phân tách và xác định các aminoaxit 1.5.3 Peptit
Peptit là những phân tử sinh học cấu tạo từ một vài cho tới hàng chục amino
axit
Trang 9Hình 3: Sự hình thành của một dipeptit
Trang 10
Ocbital
a-cacbon
Đặc trưng liên kết đôi của bộ khung peptit Các góc và độ dài liên kết Hình 5: Cấu trúc cúa bộ khung peptit
Cấu trúc của liên kết peptit cho thấy hầu hết các liên kết bất biến -C=Ovà -
N-H là song song hoặc gần song song và hơi bị xoắn xung quanh liên kết C-N
Chính sự lai tạo của ocbital 7 trong liên kết đôi C=O với đôi điện tử còn lại của N đã làm cho mặt phẳng liên kết trở nên vững chắc (xem hình 7) và nhờ các mặt phẳng này đã tạo ra liên kết bậc 2 (phiến gấp B) đối với cầu trúc của protein
Ngoài liên kết peptit, đôi khi giữa các aminoaxit còn có liên kết đisunfua nối 2
gốc xystein với nhau Liên kết này có vai trò quan trọng giúp hình thành cấu trúc
không gian của rất nhiều protein, đặc biệt protein ngoại bào có chức năng sinh học quan trọng như hocmon, immunoglobulin va khang thé
Peptit có tính chất lý hố khơng khác nhiều so với aminoaxit vì cùng chứa một
Trang 11Liên kết peptit còn bị thuỷ phân bởi enzim thuỷ phân protein gọi là proteazơ
Chúng có mặt ở tất cả các tế bào và mô tế bào đề thực hiện nhiệm vụ chủ yếu là
phân giải protein
1.5.4 Cấu trúc không gian của protein
Cấu trúc không gian của protein là tập hợp không gian của tất cả các nguyên tử trong phân tử Người ta phân biệt 4 bậc cấu trúc của protein như sau:
a Cấu trúc bậc 1 là trình tự sắp xếp các aminoaxit và vị trí liên kết đisunfua trong chuỗi polypeptit Cấu trúc bậc 1 không có cấu hình không gian đặc hiệu
b Cấu trúc bậc 2 phản ánh sự sắp xếp có quy luật trong không gian của các
aminoaxit trong chuỗi polypeptit, phổ biến hơn cả là cấu trúc xoắn œ và cấu trúc phiến gấp nếp j
c Cấu trúc bậc 3 phản ánh tương quan không gian của các aminoaxit trong chuỗi polypeptit Trong đó bao hàm sự xoắn hoặc uốn của các cấu trúc bậc 2 tạo nên cấu hình không gian đặc thù riêng cho từng loại protein
d Cấu trúc bậc 4 phản ánh tương quan không gian giữa các sợi polypeptit (hay
các phần dưới đơn vị) trong phức hợp phân tử protein
1.5.4.1 Cấu trúc bậc 1:
Các gốc aminoaxit trên chuỗi polypeptit được sắp xếp theo một trật tự nhất định và liên quan với chức năng sinh học của protein một cách hết sức chặt chẽ
Với sự tổ hợp khác nhau của 20 aminoaxit đã dẫn đến các loại protein khác nhau Các protein có chức năng sinh học giống nhau thường có cấu trúc bậc 1 khá giống nhau Như vậy có thể thấy trong bất kỳ cấu tric bac 1 nào của protein bao
giò cũng có những đoạn quan trọng bắt buộc phải có trình tự sắp xếp amino axit không thay đổi, ngoài ra ở một số vị trí nào đó có thể có sự thay đôi mà vẫn không
ảnh hưởng đến chức năng của protein
Trang 12a Cấu trúc xoắn œ : Đoạn mạch polypeptit xoắn chặt lại làm cho những
nhóm peptit(-CO-NH-), Cạ tạo thành phần bên trong của lõi xoắn, các mạch bên R
quay ra phía ngoài Cấu trúc này được giữ vững chủ yếu nhờ liên kết hiđro được tạo thành giữa nhóm cacbonyl của một liên kết peptit với nhóm -NH của liên kết tiếp sau cách nhau 3 gốc aminoaxit trên cùng một mạch polypeptit Tất cá các nhóm -CO và -NH có trong liên kết peptit của mạch polypeptit đều tạo thành liên
kết hiđro với nhau như vậy, nghĩa là cứ mỗi nhóm -CO-NH- đều có thé tao thành 2 liên kết hiđro với 2 nhóm -CO-NH- khác Các liên kết hiđro được tạo thành với số
lượng tối đa, bảo đảm độ bền vững cấu trúc xoắn œ Chiều xoắn có thể xoắn phải
(thuận chiều kim đông hồ) hoặc trái, nhưng xoắn œ trong phân tử protein thường là
dạng xoắn phải Chiều dài các đoạn xoắn ơœ trong phân tử protein thường không dài, ngắn hơn 40Ä
b Cấu trúc phiến gắp nếp ÿ : Xuất hiện trong fibroin của tơ tằm, nó khác
với xoắn œ ở một số điểm chủ yếu sau:
- Đoạn mạch polypeptit có cấu trúc phiến gấp nếp B thường duỗi dài ra chứ không cuộn chặt như xoắn ơœ Khoảng cách trên trục giữa 2 gốc aminoaxit kề nhau
là 3,5Â, còn ở xoắn ơœ là 1,5Ä
- Liên kết hiđro còn được tạo thành giữa 2 mạch polypeptit khác nhau, ở kề nhau, có thể cùng hướng hay ngược hướng với nhau Trong phân tử của nhiều
Trang 13
Hình 6a: Xoắn œ Hình 6b: Phiến gấp nếp B
c Cấu trúc xoắn colagen : Kiểu cấu trúc này xuất hiện trong phân tử colagen Thành phần aminoaxit của colagen rất đặc biệt so với các protein khác: glixin chiếm khoảng 35%, prolin chiếm khoảng 12% tổng số aminoaxit trong phân
tử Ngoài ra colagen còn chứa 2 aminoaxit ít gặp trong các protein khác là
Trang 14| = 64 nm (c) (d) Hình 7: Cấu trúc của sợi colagen
a Cấu trúc bậc] và 2 của phân tử tropocolagen
b Phân tử tropocolagen gồm 3 chuỗi polypeptit bện với nhau
c Sự sắp xếp của các phân tử tropocolagen trong sợi colagen
d Vết vằn ngang thê hiện các phân tử ở các dãy kể nhau xếp lệch nhau một khoảng cách 64 nm
e Hình ảnh thu được qua kính hiển vi điện tử
1.5.4.3 Cấu trúc bậc 3: Cấu trúc này phản ánh tương quan trên phạm vi toàn bộ sợi polypeptit Những aminoaxit nằm ở xa nhau và nằm trong những cấu trúc bậc 2
khác nhau lại thường hay tương tác tiếp cận với nhau trong cấu trúc bậc 3 Các liên
kết và tương tác yếu có vai trò quyết định giữ ổn định cấu trúc bậc 3 Với liên kết này các phân tử có xu thế cuộn chặt lại, các gốc ky nước quay vào trong, các gốc ưa nước ở trên bề mặt phân tử Khi biến tính phân tử protein bằng các tác nhân hoá
học hoặc vật lý tức là phá vỡ liên kết Van đe Van, liên kết hiđro, khử cầu sunfua,
Trang 15tính tan và hoạt tính sinh học Sự biến tính này có thể thuận nghịch nếu như chúng
có thể trở lại trạng thái cầu trúc ban đầu và không thuận nghịch nếu như vĩnh viễn không trở lại trạng thái cấu trúc ban đầu Với nhiệt độ cao thường phá vỡ tất cả các
liên kết làm cho phân tử protein bị biến tính hoàn toàn, ví dụ nấu riêu cua, canh
trứng Các dung môi hữu cơ, muối amoni, chất tây rửa thường tác động nhẹ nhàng hơn chỉ phá vỡ tương tác ky nước Độ pH cũng làm thay đổi tổng điện tích của phân tử protein và phá vỡ một phần liên kết hiđro nên cũng được xem là một yếu tố gây biến tính ty : 72 Se ra ; Z Biên tớnh nghịch nô (a) (b) Hình 8: Cấu trúc bậc 3 của phân tử protein tự nhiên (a) và biến tính (b) 1.5.4.4 Cấu trúc bậc 4:
Rất nhiều protein chứa 2 hoặc nhiều sợi polypeptit còn gọi là phần dưới đơn vị (subunit) giống nhau hoặc khác nhau Do vậy cấu trúc bậc 4 phản ánh tương tác
Trang 16Cấu trỳc bậc 4
Trang 171.6.1 Khối lượng và hình dạng phân tứ protein
Protein có khối lượng phân tử tương đối lớn, có dạng hình cầu hoặc dạng sợi Protein hình cầu tan trong nước hoặc dung dịch muối loãng, rất hoạt động về mặt hoá học Các protein hình sợi tương đối trơ về mặt hoá học, chủ yếu có chức năng cơ học Ví du, colagen của da, xương, sụn, gân, răng; keratin của tóc, lông, fibroin cua to, miozin của cơ [1,2,3]
1.6.2 Tính chất lưỡng tính của protein
Cũng như aminoaxit, protein cũng là chất điện ly lưỡng tính vì trong phân tử protein còn nhiều nhóm phân cực của mạch bên Có thể điều chỉnh pH để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng Khi pH = pI các protein đễ đàng kết tụ lại với nhau làm cho protein kết tủa [1,3,6]
1.6.3 Tính chất dung dịch keo protein, sự kết tủa protein
Khi hoà tan, protein tạo thành dung dịch keo Các phần tử keo có kích thước
lớn, không đi qua màng bán thấm Người ta sử dụng tính chất này để tỉnh sạch protein khỏi các chất phân tử thấp bằng phương pháp thẩm tách Hai yếu tổ đảm bảo độ bền dung dịch keo protein là:
- Sự tích điện cùng đấu của các phân tử protein ở (pH # pl) - Lớp vỏ hyđrat bao quanh phân tử protein
Người ta thường dùng các muối vô cơ như (NH¿);SO¿ hay các dung môi hữu cơ
như axeton, etanol đề tạo kết tủa protein nhưng phải tiến hành ở nhiệt độ thấp Các yếu tô gây biến tính không thuận nghịch thường được sử dụng để loại bỏ protein ra
khỏi dung dịch: dùng nhiệt, các axit mạnh, các kim loại nặng [1,3,5,6]
1.6.4 Khả năng hấp thụ tia tử ngoại của protein
Trang 181.6.5 Khả năng thuỷ phân của protein
Các phân tử protein có thể bị thủy phân bằng axit, kiềm hay enzim cho các
polypeptit và cuối cùng là các aminoaxit [1,3,6]
2 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AMINOAXIT VÀ
PROTEIN
2.1 Các phản ứng màu của axit amin và protein
2.1.1 Phản ứng Biure
Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptit Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptit trở nên có thể phản ứng với CuSO¿ tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ tuỳ thuộc vào số lượng liên kết peptit nhiều
hay ít Các phản ứng xảy ra như sau: * Phản ứng tạo biure " | H 2H,N- r NH), + H;N- a N— c NH, === HN= Co NC C=NH 0 NH; O O0 OH OH Ure Biure (xeto) Biure (enol) * Phản ứng với protein
Trang 19Dạng phức hợp như trên (với bốn nguyên tử mơ tham gia tạo liên kết phối trí)
thường có màu đỏ (hấp thụ cực đại ở bước sóng 520-535nm) Trong trường hợp chỉ có hai hay ba nguyên tử N tham gia tạo liên kết thì phức sẽ có màu tím hoặc màu
xanh (hấp thụ cức đại ở những bước sóng tương ứng là 540-580 và 615-670nm) Vì vậy, thông thường sản phẩm phản ứng của các polypeptit khác nhau sẽ có màu thay đổi từ xanh tím đến đỏ tím Phản ứng biure thường được ứng dụng để định lượng protein [1,3,6,9]
2.1.2 Phản ứng với ninhiđrin
Các aminoaxit khi phán ứng với ninhiđrin ở nhiệt độ cao cho sản phẩm có màu xanh tím (hấp thụ cực đại ở khoảng bước sóng 570nm) Đây là phản ứng chung cho
tất cả các aminoaxit có chứa nhóm NH; ở vị trí Cạ Ngoài œ-aminoaxit, các peptit, protein, muối amoni và amoniac cũng cho phản ứng này Cơ chế phản ứng khá phức tạp như sau:
Đầu tiên do tác dụng của các aminoaxit với ninhiđrin sẽ xuất hiện phức chất dạng bazơ-schiff Sau đó xảy ra sự chuyển nhóm, tiếp theo là sự đề cacboxyl hoá
Trang 20Aminođixetohiđrinden lại ngưng tụ với một phân tử ninhiđrin khác và hình
thành nên một hợp chất mới, đồng thời bi enol hoá và chuyền thành dạng có màu t + ft H =CHR HO R-c=0 + H NH;ạ Í I O H O Aminoxetohidrinden O O O II H II II Hoe mid <T) Na Ì Í I O O O Phức màu xanh tím
Trang 21Sản phẩm của phản ứng này có chứa gốc R của aminoaxit ban đầu Gốc này
sẽ quyết định màu sắc khác nhau (xanh da trời, đỏ ) của các hợp chất khi phản ung voi ninhidrin
Đặc biệt phức chất được tạo thành giữa prolin (có chứa nhóm imin) va ninhiđrin có màu vàng tươi, khác biệt hắn với màu do các aminoaxit khác tạo nên
trong phản ứng Do vậy, ninhiđrin còn được sử dụng cho phản ứng màu đặc trưng để phát hiện prolin: ft ï Cte «mT = CO II sso O COOH Phức màu vàng Phản ứng với ninhiẩrin có độ nhạy cao, do đó thường được dùng để định tính và định lượng protein [1,3,6]
2.1.3 Phản ứng với axit HNO;
Dưới tác dụng của HNO;, aminoaxit bi deamin hoa tạo thành nơ ở dạng
Trang 22Khi tác dụng với axit điazobenzensunfonic (thuốc thử diazo), histidin tao thành phức chất màu mận chín, còn tirozin tạo thành phức chat mau da cam [6]
Các phản ứng xảy ra như sau:
Trang 23Phức màu da cam 2.1.5 Phản ứng Millon đặc trưng cho tyrozin
Thuốc thử Millon chính là muối thuỷ ngân nitrat trong HNO; đặc Khi cho
thuốc thử Millon tác dụng với nhân phenol của tirozin sẽ tạo nên hợp chất mfrotirozin-thuỷ ngân có màu đỏ
Phản ứng xảy ra như sau: H ? Z7VYAg OH O; Tà + HgNO; + HNO; —»> + H,0 CH,- Ce COOH CHạ— CH- COOH NH, NH,
Phản ứng Millon được sử dụng để phát hiện tyrozin và các hợp chất phenol
Chú ý không cho quá nhiều thuốc thử Millon vì HNO; có trong thuốc thử sẽ tác
dụng với protein cho màu vàng [6]
2.1.6 Phản ứng của các axit amin chứa lưu huỳnh (Phản ứng Folia)
Các axit amin chứa lưu huỳnh như xistin, xistein, methionin dưới tac dụng
của kiềm bị phân huỷ tạo thành natri sunfua (NazS):
RSH + 2NaOH — NazS + ROH + H30
Thêm chi axetat vao NaS sé phan tng tao thanh kết tủa nâu đen của chì sunfua (PbS) [6]
Trang 242.1.7 Phản ứng Sakaguchi đặc trưng cho acginin
Đây là phản ứng dùng để phát hiện acginin Khi cho acginin tác dụng với
hipobromua (NaBrO) và ỏ-naphtol sẽ tạo thành sản phẩm có màu đỏ cam [6] Phản ứng có thể được trình bày như sau: NH NH, _ | Banc 2 o_O NH + NaBrO + — NH + LỚN: + NaBr + H,0 a (CHNH, CỒ (pee CHNH, COOH COOH
2.1.8 Phản ứng Adamkievic đặc trưng cho tryptophan
Trong môi trường axit, tryptophan phản ứng với nhiều loại anđehit tạo thành những sản phẩm ngưng kết có màu đỏ tím đặc trưng [6]
Trang 25: ï Ch NH _ H H ‘ | N — H50, (OOH COOH H;N- cH pM CH — Ca se TỔ) cáo Bis-2-triptophanylmetal (OOH (OOH ((OOH COOH HạN-CH ENH; HạN-CH TEN ự Đụ CH Re CRED NH là N Bis-2-triptophanylmetal Bis-2-triptophanylcacbinol
2.2.Định lượng axit amin và protein
2.2.1 Xác định N-amin bằng phương pháp chuẩn độ foemol
Các aminoaxit có thể phản ứng với focmol trung tinh dé tạo thành metyl - aminoaxit Foemol đã khoá nhóm amin (NH;) mang tính kiềm nên có thể chuẩn độ nhóm cacboxyl trong phân tử aminoaxit bằng kiềm Dựa vào lượng kiềm đã dùng để chuẩn độ sẽ tính được lượng Nttơ của aminoaxit [6,9]
Trang 26NH) ữ N= = CH CHa
R- cH + ( Oo ——~ R- fH + HO
COOH H COOH
Aminoaxit Focmol Metyl-aminoaxit
2.2.2 Định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl
Lượng nitơ tổng số trong các phẩm vật có nguồn gốc sinh vật thường được
xác định bằng phương pháp Kjeldahl Đó là hàm lượng tổng của các dạng nitơ hữu cơ và vô cơ có trong phẩm vật nghiên cứu Đề định lượng nitơ protein, người ta
thường xác định nitơ tổng số và nitơ phi protein theo phương pháp Kjeldahl, sau đó lấy hiệu số giữa hai đạng nitơ này rồi nhân với hệ số tương ứng [6,9]
Lưu ý: Các protein thực vật có tỷ lệ nitơ protein khoảng 16.8%, do vậy trong
trường hợp này hệ số nhân sẽ là 5.05 (100 : 16.8) Các protein động vật có tỷ lệ ntơ protein khoảng 16%, do vậy trong trường hợp này hệ số nhân sẽ là 6.25 (100: 16)
[6]
2.2.2.1 Xác định nitơ tổng số theo phuong phap Kjeldahl
Dưới tác dụng của HạSO¿ đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất hữu cơ có chứa nito (N) bi phan huỷ và bi oxi hoa dén CO, va H,0, con nito chuyén thanh amoniac va tiép tuc két hợp với HaSO¿ tạo thành muối amoni sunfit
Quá trình được tiến hành qua các bước sau: * Vơ cơ hố ngun liệu
Trang 272.2.2.2 Xác định nitơ phi protein
Để xác định N-phi protein cần dùng các dung môi thích hợp để chiết rút tất
cả các dạng N-phi protein (ví dụ dung môi là etanol 70%) Tuy nhiên, trong dịch
chiết vẫn còn lẫn một vài loại protein, vì vậy cần dùng chất kết tủa dé tach phan protein hoà tan trong quá trình chiết rút
Kết tủa protein có thể tiến hành theo nhiều cách như: bằng etanol, axeton,
các muối kim loại nặng, axit hoặc đun ở nhiệt độ cao nhưng thông dụng nhất là
dùng các chất kết tủa sau đây: TCA 10-20%, poly nhôm clorua (PAC) với chất trợ
keo tu dang 4m A101, polyme C310H (keo tụ dương) Pb(CHạCOO); 10-15%, CuSO, 10% trong hén hop voi NaOH 10%, ty 1é 1 : 1 [5,6]
Sau khi đã loại bỏ kết tủa, dịch lọc chỉ còn chứa các dạng N-phi protein Dem v6 co hoa dich nay va tiép tục tiến hành xác định hàm lượng mitơ theo phương
phap Kjeldahl
2.2.2.3 Định lượng protein trong nguyên liệu
N-tông số bao gồm N-protein và N-phi protein Muốn xác định hàm lượng
protein trong nguyên liệu phải xác định N-tông số và N-phi protein Hàm lượng protein trong mẫu được tính theo công thức sau:
Protein (mg) = (Niéng sé - Nphi protein)-6,25 Hoặc Protein (mg) = (Nténg số ~ Noni protein)-5,95
2.2.3 Định lượng protein theo phương pháp Bradford
Các protein khi phản ứng với xanh Coomassle (Coomassie Brilliant Blue - CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595
nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch Phương pháp có độ
Trang 282.2.4 Định lượng protein theo phương pháp Lowry
Protein tác dụng với thuốc thử Folin-Ciocalteux tạo thành sản phẩm màu xanh Đây là sản phẩm khử của photphomolipđat-photphovolframat bởi phức chất
Đồng-Protein và có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750 nm Cường độ màu của
hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ Protein trong một phạm vi cho phép Dùng máy so màu quang điện đề xác định cường độ màu trong các mẫu và so sánh với dịch protein tiêu chuẩn
Phương pháp Lowry sử dụng kết hợp phản ứng Biure (tác dụng lên liên kết peptit, mục 2.1.1.) và phản ứng với thuốc thử Folin (tác dụng lên các gốc Tyrozin,
Tryptophan, Histiđin) để tạo phức có màu đặc trưng Phương pháp có độ nhạy tương đối cao, cho phép xác định được đến nồng độ vài chục #g protein, do vậy
được sử dụng rộng rãi để xác định nhiều loại protein ở dạng tương đối tinh khiết
Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là màu của phức chất bị ảnh hưởng
nếu trong dung dịch có chứa một số chất như EDTA, sacarozơ, đệm Tris hay một số chất khử như xistein, ditiotreitol [4,6,9]
2.2.5 Định tính và định lượng aminoaxit bằng phương pháp sắc ký giấy
Phương pháp sắc ký phân bồ trên giấy dựa vào sự khác nhau về hệ số phân bố các chất tan giữa hai pha lỏng không trộn lẫn
Người ta mang lên một điểm ở đầu bản giấy sắc ký một giọt dung dịch nghiên cứu rồi nhúng đầu giấy có mang dung dịch nghiên cứu đó vào chậu dung môi hữu
cơ linh động bão hoà nước (như rượu butilic)
Trong quá trình di chuyên chậm của dung môi qua ống mao dẫn của giấy, các
cấu tử riêng biệt của hỗn hợp sẽ chuyển dịch theo với vận tốc khác nhau, nhờ vậy
mà hỗn hợp được phân chia ra thành các cấu tử thành phần
Sự chuyển dịch của các chất trong khi tiến hành sắc ký có thể giải thích như
Trang 29dung môi chảy qua phần giấy có chứa dung dịch nghiên cứu thì một phần các chất
chuyển vào dung môi ( pha động ) Khi dung môi tới phần giấy không có chứa các chất phân tích thì ở đó lại xảy ra quá trình phân bố các chất giữa pha tĩnh là nước và pha động là dung môi hữu cơ Lần này, các chất lại chuyển từ ( dung môi ) pha hữu cơ sang pha nước Như vậy, nếu cho dung môi chuyển dịch liên tục qua giấy, các chất phân tích sẽ được chuyên từ điểm mang ban đầu đến một điểm khác trên giấy theo hưướng chảy của dung môi do kết quả của quá trình tách phân bó liên tục giữa hai pha tĩnh và động
Quá trình phân tích này được tiến hành trong thiết bị kín bão hoà của dung
môi và nước Khi tuyến dung môi đã đi được đoạn đường 30 — 40 em, người ta lay
giấy ta say khô và phun thuốc nhuộm màu, nhờ đó xác định được vị trí của các cấu tử trên dải giấy Dải giấy sau khi hiện màu gọi là sắc ký đồ
Trong thực tiễn, hệ số vận tốc chuyền dịch (ký hiệu là Rf ) có ý nghĩa rất lớn Hệ số vận tốc chuyển dịch Rf là tỉ sỐ giữa quãng đường ởi được của chất so với
quãng đường chuyền dịch của dung mdi
Rf = Quãng đường dịch chuyên của chất / Quãng đường dịch chuyển của dung môi Rf: Là đại lượng đặc trưng và không đổi đối với mỗi chất trong những điều kiện xác định
Tuỳ thuộc vào hướng hoặc chiều chuyền dịch của dung môi, người ta phân biệt một
số dạng sắc ký như sau:
* Sắc ký nghịch: Khi dung môi chảy dịch từ dưới lên trên * Sắc ký thuận: Khi dung môi chảy từ trên xuống
* Sắc ký vòng tròn: Khi dung môi chuyên dịch từ tâm ra xung quanh
Ngoài ra, người ta còn phân biệt: Sắc ký một chiều khi cho dung môi chuyên dịch
theo một hướng nhất định Sắc ký hai chiều khi cho dung môi chuyên dịch theo một chiều nào đó, sau đấy sấy khô và cho dung môi chảy theo một chiều khác vuông góc
Trang 30Phương pháp sắc ký giấy một chiều ( có thể thuận hoặc nghịch ) là phương pháp đơn giản nhất, chỉ dùng một hệ dung môi nào đó Khả năng phân tích kém hơn
sắc ký hai chiều
Trong sắc ký thuận, hệ số vận tốc chuyền dịch Rf lớn, nhưng các vết màu thu được không gọn, còn trong sắc ký nghịch đại lượng Rf nhỏ hơn, nhưng vết màu lại
gọn hơn
Đề định lượng các axit amin người ta thường sử dụng các phương pháp sau:
* So sánh bằng mắt thường cường độ màu và diện tích các vết màu của hợp chất đã cho với cường độ màu và diện tích các vết màu của hỗn hợp đối chứng đã
biết rõ nồng độ
* Ðo chiết suất của dịch chiết chất màu từ sắc ký đồ bằng một dung môi thích hợp Sai số của phương pháp này khoảng 3 — 6 %
* Dùng densitomet đo mật độ màu của các vết trong khi cho ánh sáng xuyên
qua Độ chính xác của phép đo tăng lên đến 10 — 15% [8,9]
2.2.6 Xác định aminoaxit và peptit bằng sắc ký lỏng pha ngược và sắc ky long
khối phỗ ( thầy xem và sửa giúp em mục này) [10]
Phương pháp mới cho phép xác định nhạy các aminoaxit và peptit là sử dụng
thuốc thử 2-(9-carbazole)-ethyl chloroformate (CEOC) với máy dò huỳnh quang
(FL) đã được phát triển Sự phát hiện ra các dẫn xuất đã được tiến hành bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ Nhóm mang màu trong thuốc thử 2-(9- fluorenyl)-ethyl chloroformate (FMOC) đã được thay thế bằng carbazole,dẫn đến
một tác nhân dẫn xuất có tính nhạy quang là CEOC CEOC có thể phân loại các peptit va aminoaxit đễ dàng và nhanh chóng Chất dẫn xuất đủ bền để có khả năng
phân tích bởi phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Hiệu suất tạo dẫn xuất cực đại (gần 100%) được quan sát với số mol thuốc thử vượt quá 3-4 lần và
nằm trong khoảng pH = 8.8 + 10 Cac dan xuất có độ nhạy quang mạnh cho phép
Trang 312-(9-carbazole)-ethyl carbonate Thêm vào đó, quá trình phát hiện sự phản ứng với dẫn xuất CEOC được so sánh với quá trình phát hiện sự phản ứng thu dược bằng
FMOC Tỷ lệ ACczoc /ACrpwoc = 1.00 + 1.82 cho sự cảm ứng phát huỳnh quang
(FL) va AC'ceoc /AC'rmoc = 1.00 + 1.21 cho sự cảm ứng tử ngoại - cực tim (UV) Ở
đây AC và AC' là sự cảm ứng tương ứng giữa FL và UV Sự phân tách các chất dẫn
xuất của peptit va aminoaxit da duoc tối ưu hoá trên cột Hypersil BDS C18 Phuong pháp này được sử dụng thành công để phân tích protein thuỷ phân từ len và từ dẫn xuất trực tiếp của bia
Trang 321 HÓA CHÁT VÀ DỤNG CỤ
1.1 Chuẩn bị hoá chất
1.1.1 Pha thuốc thử
* Thuốc thứ Biure (còn gọi là tác nhân Gornal)
Can 5g CuSO4.5H20 hoa tan trong 495ml H2O ta dugc dung dich A (dung dich 5g
CuSO4.5H20 1%)
Can 10g KNaC4H40¢.4H20 (Kali Natri tactrat) hoà tan trong 490ml HO ta được
dung dịch B (dung dich KNaC4H,0¢.4H20 2%)
Cân 20.5g Na;CO; và 4g NaOH hoà tan trong 1000ml H;O ta được dung dịch C
(dung dịch Na;CO; 2% trong NaOH 0.IN)
Pha thuốc thử Biure (chỉ pha trước khi dùng):
Lấy Iml đung dịch A + 1ml dung dịch B + 98ml dung địch C
Thuốc thử Biure có màu xanh nhạt Thuốc thử Biure không dùng được trong môi
trường có NH,’ vi NH,’ tao phức với Cu?” không màu, bền nên không tạo phức
sinh màu được với polypeptit
* Thuốc thử Folin-Ciocalteux
Hoà tan 100g Na;VO¿.2H;O và 25g Na;MoO¿.2H;O vào 800ml nước cất
Thêm 50 ml dung dich H3PO,4 80% và 100 ml HCI đậm đặc Ðun sôi hỗn hợp trong bình cầu đáy tròn dung tích 2000 ml với ống sinh hàn ngược trong vòng 10 giờ Có
thể đun ngắt quãng, không cần phải đun liên tục, nhưng phải đun sôi đủ 10 giờ Sau khi đun xong thêm vào hỗn hợp 150g Li;SOx, 50 ml nước cất và 5 giọt nước
Br; ÐĐun sôi I5 phút không có ống sinh hàn ngược để loại trừ lượng Br; dư Dung dịch thuốc thử phải có màu vàng, không được có màu xanh Nếu thuốc thử có màu xanh thì phải xử lí với Brôm lần thứ hai Sau khi làm nguội dung dịch, thêm nước cất cho tới vạch mức trong bình định mức dung tích 1000 ml
Trang 33Bảo quản thuốc thử Folin trong bình thuỷ tính màu, dé trong tủ lạnh Sau 2-3 thang dung dịch ngả màu xanh thì thêm vài giọt Brôm và lai đun sôi IŠ phút, dung
dịch có màu vàng trở lại Trước khi dùng, pha loãng thuốc thử bằng nước cất sao cho nồng độ thuốc thử bằng 1N
Protein hiện màu tím - xanh trong môi trường kiềm do sự oxy hoá của
volframat và molipđat các gốc tirozin va triptophan trong protein
Cac chat ure (0.5%), guanidin (0.5%), vonphramat natri (0.5%), sunfat natri (1%), nitrat natri (1%), clorat (0.5%), tricloaxetat (0.5%), rượu etylic (5%), ete
(5%), axeton (0.5%), sunfat kém (0.1%), hydroxit bari (0.5%), sunfatamon (0.15%) - không làm giảm màu của phân ứng Glixin (0.5%) làm giảm đến 50% màu của phản ứng Đệm phosphat từ 0.1M trở lên gây kết tủa phản ứng màu
* Pha dung dịch đệm phosphat có pH=8
Cân I1.8660g Na;HPO¿ hoà tan trong 1000ml H;O ta được dung dịch E Cân
9.0780g KH;PO¿ hoà tan trong 1000ml HạO ta được dung dịch F Tiếp theo, ding pipet lấy chính xác 5.5ml dung dịch F cho vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch E vào bình cho tới vạch mức ta được dung dịch đệm phosphat có pH=8
1.1.2 Pha dung dịch casein chuẩn
Cân 0.6250g casein (chứa 80% là protein) chuyên vào bình định mức 500ml, thêm dung dịch đệm phosphat có pH=8 vào bình Đặt bình trên máy khuấy từ và
giữ nhiệt độ trong khoảng 50-60°C Sau khi casein đã tan hết, dùng nước cất định
mức tới vạch ta được dung dich casein chuẩn có nồng độ l mgprotein/ml
Pha dung dịch casein chuẩn có nồng độ protein là 50ug/ml từ dung dịch
casein chuẩn ở trên bằng cách dùng pipet hút chính xác 5ml dung dịch casein chuẩn 1 mg/ml cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cất vào bình, lắc đều, sau đó
định mức đến vạch bằng nước cắt
Bằng cách tương tự ta sẽ pha được các dung địch casein chuẩn có nồng độ
Trang 34Các dung dịch casein chuẩn trên được dùng để lập đường chuẩn xác định hàm lượng các aminoaxit và protein trong thực phâm
1.1.3 Các hoá chất khác
Ngồi các hố cha trên, trong quá trình làm thực nghiệm còn dùng các loại
hóa chất khác như: HCI đậm đặc, H;POx 85%, Na;VOu.2H;O, Na;MoO¿.2H;O,
Li;SOa, NaOH 0.1N, nước Brôm
1.2 Dụng cụ và thiết bị
* 10 ống nghiệm sạch, khô trong 1 giá gỗ * | pipet 10 ml co chia vach
* | pipet 5 ml co chia vach * 2 pipet 2 ml có chia vạch * 4 pipet 1 ml co chia vach
* 2 binh dinh mirc 100 ml
* | binh dinh mirc 500 ml
* | binh dinh mirc 1000 ml
* 2 ống đong 100 ml * 2 bình tam giác 250 ml
* 2 cốc dung tích 1000 ml
* | buret 25 ml
* | binh cau 3 cé + 1 bộ giá đỡ
* 1 sinh hàn hồi lưu * | bếp điện
* Máy khuấy từ có điều chỉnh nhiệt độ * 2 cuvet day | cm
* May do quang MC - 752
2 Xác định hàm lượng axit amin và protein trong một số thực phẩm
Trang 35quang ở bước sóng 750 nm Phương pháp này đã được hoàn thiện từ lâu, các điều kiện tối ưu đã được xác lập, vì vậy chúng tôi chọn phương pháp này đề xác định hàm lượng của các aminoaxit và protein trong một số loại thực phẩm
2.1 Quy trình phân tích chung
Mẫu thật: Lấy chính xác vào ống nghiệm sạch, khô 0.5 ml dung dịch nghiên cứu, thêm vào 0.5 ml H;O và 2.5 ml thuốc thử Biure, lắc đều và giữ ở nhiệt độ
phòng 10 phút Sau đó thêm chính xác 0.25 ml dung dịch Folin-Ciocalteux nồng
độ 1N, lắc đều, sau 30 phút đem so màu trên máy ở bước sóng 750 nm
Từ số đọc của mẫu thí nghiệm, đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính ra hàm lượng protein trong I ml dich nghiên cứu, từ đó tính ra hàm lượng % protein trong nguyên liệu
Mẫu trắng: Song song với mẫu thí nghiệm, làm ống đối chứng trong đó thay dung dịch protein bằng nước cất và tiếp tục làm như đối với mau that
2.2 Dựng đường chuẩn xác định hàm lượng aminoaxit và protein
Để xác định được hàm lượng của các aminoaxit và protein trong thực phâm
ta phải xây dựng đường chuẩn
Dùng pipet lấy chính xác I1 ml các dung dịch casein chuẩn có nồng độ
protein lần lượt là 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 tig/ml cho vào 7 ống nghiệm sạch khô Thêm vào 2.5 ml dung dich thuốc thử Biure, lắc đều và giữ ở nhiệt độ
phòng 10 phút Sau đó thêm chính xác 0.25 ml dung dịch Folin-Ciocalteux nồng độ 1N, lắc đều, sau 30 phút đem so màu trên máy ở bước sóng 750 nm được kết quả ở
bảng được kết quả ở bảng 2
Trang 36Protein | 0.05 0.10 0.15 0.20 0.30 0.40 0.50 mg/ml A750 0.124 0.136 0.147 0.159 0.178 0.209 0.231
So với mẫu trang A759 = 0.106, ta được kết quả hiệu chỉnh như ở bảng 3
Trang 370.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 y = 0.2381x + 0.0053 0.02 R? = 0.9967 0 0.2 0.4 0.6 [Protein]
Hình 11: Đường chuẩn xác định hàm lượng aminoaxit và protein
Khi xử lý trên máy tính theo phương trình hồi quy tuyến tính ta tìm được phương trình liên quan
A750 = 0.2381C protein + 0.0053 (1)
Đường chuẩn thực tế khá thắng nên phương trình (1) có thê sử dụng để tính nhanh kết quả khi phân tích các mẫu
2.3 Phân tích nước mắm
2.3.1 Quy trình phân tích nước mắm
Dùng pipet lấy chính xác 2 ml dung dịch nước mắm cần phân tích cho vào
Trang 38sóng 750 nm Hàm lượng aminoaxit và protein trong nước mắm được tính theo công thức sau:
Ham luong Protein trong mau = Ham luong Protein tinh theo PTDC 100
Ghi chú: Hàm lượng protein tính theo phương trình đường chuẩn là số mg protein/ml và được tính như sau:
(Gi 4 trị A đo được - 0.106) - 0.0053 Hàm lượng protein tính theo PTĐC = ————————
(mg/ml) 0.2381
2.3.2 Két qua phan tich
Kết quả phân tích hàm lượng axit amin và protein trong nước mắm được thể hiện trong bảng 4: Bảng 4: Hàm lượng các axit amin và protein trong nước mắm STT Mẫu Mật độ quang | Hàm lượng Protein A (mg/ml)
1 | Nuéc mam Knorr 0.201 37.67
2 | Nước măm Nhĩ cao câp Nha Trang 0.186 31.37 3 | Nước mắm Nhĩ đặc biệt Nha Trang 0.184 30.53
4_ | Nước măm cao đạm Cát Hải 0.180 28.85
5 | Xi dau Trung Quoc 0.176 27.17
(nước chấm đậu nắm)
6_ | Nước tương Bibom Việt Tiên 0.171 25.07
Trang 39Bình luận:
Qua bảng số liệu phân tích và kết quả tính được ta thấy hàm lượng aminoaxit
và protein trong nước mắm là rất cao (khoảng 20-40 mg/ml) Hơn nữa, các loại nước mắm đều có màu khá đậm, đo đó khi tiến hành phân tích ta cần pha loãng mẫu bằng nước cất để hạn chế sai số của phép đo
Cũng qua bảng số liệu phân tích ta thấy các loại nước mắm khác nhau thì hàm lượng aminoaxit và protein chứa trong nó là khác nhau và giá thành cũng khác nhau
2.4 Phan tich bia
2.4.1 Quy trinh phan tich bia
Dung pipet lấy chính xác 0.1 ml mẫu bia cần phân tích cho vào 1 ống nghiệm sạch, khô Tiếp theo, thêm vào ống nghiệm 0.9 mi H;O và 2.5 ml dung
dịch thuốc thử Biure, lắc đều và giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút Sau đó thêm chính
xác 0.25 ml dung dịch Folin-Ciocalteux nồng độ 1N, lắc đều, sau 30 phút đem so màu trên máy ở bước sóng 750 nm Hàm lượng aminoaxit và protein trong bia được tính theo công thức sau:
Ham luong Protein trong mau = Ham luong Protein tinh theo PTDC 10
Ghi chú: Hàm lượng protein tính theo phương trình đường chuẩn là số mg
protein/ml và được tính như sau:
(Gi á trị A đo được - 0.106) - 0.0053
Hàm lượng protein tính theo PTĐC = ————
(mg/ml) 0.2381
Trang 40Kết quả phân tích hàm lượng các axit amin và protein trong bia được thể hiện trong bảng §: Bảng 5: Hàm lượng các axit amin và protein trong bia STT Mẫu Mật độ quang A Hàm lượng Protein (mg/ml)
1 Bia lon Heliken 0.208 4.06
2 Bia lon Carberg 0.203 3.85
3 Bia lon Tiger 0.190 3.31
4 Bia lon Halida 0.180 2.84
5 Bia lon Ha N6i 0.174 2.63
6 Bia chai Hà Nội 0.171 2.51
7 Bia hoi Hà Nội 0.169 2.42
8 Bia thủ công Trung Hoà 0.151 1.67
Bình luận:
Qua bảng số liệu phân tích và kết quả tính được ta thấy hàm lượng aminoaxit và protein trong bia là không cao (dưới 5 mg/ml) Tuy vậy, các loại bia vốn đã trở
thành thương hiệu nổi tiếng như Heliken, Carberg .thì lượng đạm hoà tan chứa trong nó là cao hơn hắn so với các loại bia khác Đó cũng là một cơ sở dé giải thích tại sao các loại bia trên có hương vị đậm đà, lôi cuốn và giá thành cao như vậy
2.5 Phân tích sữa uống
2.5.1 Quy trình phân tích sữa
Dùng pipet lấy chính xác 2 ml dung dịch sữa cần phân tích cho vào bình định
mức 100 ml, thêm nước cất vào bình, lắc đều, sau đó định mức đến vạch bằng nước