Gluconic acid -
GVHD: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn
CHƯƠNG 1: NGUYÊN LIỆU
Glueose được sử dụng là nguồn carbon cho hầu hết các loài vi sinh vật sản xuất gluconic acid Tuy nhiên trong sản xuất hầu hết các nhà máy đều không sử
dung glucose tỉnh khiết, đa số đều sử dụng những nguyên liệu rẻ tiền khác như
mật rỉ hay sản phẩm từ sự thủy phân tỉnh bột Nguyên liệu sử dụng trong bài báo cáo là mật rỉ
1.1 Mat ri
Mật rỉ ( rỉ đường ): là phế liệu chứa đựng nhiều đường không kết tỉnh trong sản xuất đường từ mía hoặc củ cải đường Thông thường tỷ lệ rỉ đường trong sản xuất đường mía chiếm 3 - 3.5% trọng lượng mía, tùy thuộc vào giống múa, điều
kiện trồng trọt, công nghệ
Thành phần mật rỉ dao động như sau: nước: 15 - 20%, chất khô: 80 - 85%,
trong đó có 60% là đường (40% là đường saccharose, 20% 1a fructose va glucose, còn 40% còn lại là chất phi đường, thành phan cụ thể cho dưới bảng sau: Bảng 1: Thành phần các hợp chất trong mật rí Thành phần Tỷ lệ | Mậtri từ củ cái đường | Mậtri từ mía Đường tổng số % 48 - 52 48 - 56 Chất hữu cơ khác đường |_ % 12-17 9-12 Protein (N x 6.25) % 6-10 2-4 Kali % 2.0 - 7.0 1.5 - 5.0 Canxi % 0.1- 0.5 0.4 - 0.8 Magie % Khoang 0.09 Khoang 0.06 Photpho % 0.02 - 0.07 0.6 - 2.0 Biotin mg/kg 0.02 - 0.15 1.0 - 3.0 Acid pantotenic mg/kg 50 - 110 15 - 55 Inozitol mg/kg 5000 - 8000 2500 - 6000
Tiamin mg/kg Khoảng 1.3 Khoảng 1.8
Trong mật rỉ luôn có mặt vi sinh vật với mật độ rất lớn, thường gặp nhất là
những vi sinh vật gây màng và gây chua Vì vậy trong sản xuất người ta thường
dùng fluosilicate natri với nông độ 2 %o so với trọng lượng mật rỉ để dễ bảo quản
Trước khi đưa mật rỉ vào sản xuất cần phái qua giai đoạn xử lý mật rỉ để tách tạp chất, đồng thời ức chế hoặc tiêu diệt hệ vi sinh vật có trong mật rỉ Có nhiều quy
trình khác nhau để xử lý mật ri Ví đụ như theo Rehm và cộng sự (1996) thì đầu
tiên mat ri sẽ được pha loãng với nước, sau đó bố sung acid sulfuric và xử lí nhiệt
ở 90°C để ức chế vi sinh vat Tiếp theo, bễ sung phosphate với hàm lượng 1-2%
để tách cặn lắng rồi làm nguội Ở một qui trình xử lí khác, người ta sẽ pha loãng
mật rỉ, gia nhiệt rồi ly tâm để tách bỏ những chất không hòa tan
Trang 21.2 Các phụ liệu khác
1.2.1 Nước: được sử dụng đề pha loãng mật rỉ về giá trị nồng độ chất khô cho quá trình lên men Nước phải đạt các tiêu chuẩn như tiêu chuẩn nước uống
Bảng 2: Chỉ tiêu chất lượng đối với nước dùng để ăn uống, nước dùng cho các cơ sở dé chế biễn thực phẫm ( QCVN 01:2009/BYT ) Tên chỉ tiêu Đơn vị Giới hạn tối đa Màu sắc TCU 15 Mùi vị - Không có mùi, vị lạ Độ đục NTU 2 pH - 6,5 - 8,5
D6 cimg, tinh theo CaCO; mg/l 300
Ham lugng Clorua mg/l] 250 - 300
Hàm lượng sắt tổng số ( Fe”, Fe”) mg/l 0,3
Hàm lượng mangan tổng số mg/l 0,3
Ham lugng nitrat mg/l 50
Ham lugng nitrit mg/l 3
Ham lugng sunphat mg/l 250
Clo dư (trong khử tring) mg/l 0,3 - 0,5
Coliform ting sé vi khuẩn/100ml 0
E coli hoac Coliform chiu nhiét vi khuẩn /100ml 0
1.2.2 Chất chính pH và acid hóa
- Chỉnh pH của rỉ đường về pH lên men 6.5 dùng tác nhân là H;SO¿,
- Chỉnh pH trong quá trình lên men trong khoáng 4.5 - 6.5 dùng tác nhân trung hòa là CaCO3
Trang 3Gluconic acid -
GVHD: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn
1.2.3 Chất phá bọt
Sự hấp thu oxy của vi sinh vật là một quá trình rất phức tạp, con đường mà
oxy chứa trong một bọt khí phải đi qua đẻ tiếp xúc được với một enzyme chứa
trong tế bào vi sinh vật ở thể lơ lửng trong môi trường bị ngăn cản đo sự tồn tại
của những diện tích tiếp xúc có bề mặt từ vài micromct tới vài milimet, kích thước
của các bọt khí này phụ thuộc chặt chẽ vào tốc độ khuấy trộn của môi trường (tốc
độ khuấy cao đi đôi với kích thước bọt khí nhỏ) Chất phá bọt thực chất là làm giảm sức căng bề mặt của giao diện khí/ lỏng Như vậy, chất để phá bọt phải là một chất hoạt động bề mặt, phá hủy các bọt khí sinh ra góp phần tăng hàm lượng oxy hòa tan trong quá trình lên men
Trong môi trường lên men gluconic acid đo nồng độ glucose trong môi trường lên men lớn, dẫn đến môi trường có độ nhớt cao, khi đó các bọt không khí
dé tái hợp lại thành những bọt không khí lớn hơn (nắm mốc không thể hấp thu) Dé tránh hiện tượng này trong sản xuất thường dùng ancol amylic 1/80.000 hay
natri oleat 1/25.000 làm chất phá bọt
1.2.4 Các chất đinh dưỡng cho nắm mốc
- Nguồn N: (NH¿);ŠSO¿ hoặc (NH¿);HPO¿,
- Nguôn P: dung dịch H;POa 70% - Nguôn Mg: MgSO¿.7HO
Trang 4Chương 2: GIÓNG VI SINH VẬT 2.1 Giới thiệu về Aspergillus
Đây là loài nấm mốc hiếu khí Tế bào có vỏ, trong tế bào chất có nhân và
nhân con, có các tiểu thể Khi phát triển tế bảo nắm mốc thành hệ sợi: khuẩn ty ăn
sâu vào cơ chất — khuan ty khí sinh Giống mốc này có hệ khuẩn ty (hệ sợi) không
màu hoặc vàng nhạt Có hai loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh phát triển trên bề mặt
môi trường và khuẩn ty dinh đưỡng ăn sâu vào môi trường đặc (còn gọi là khuẩn
ty cơ chất) Khuẩn ty phân nhánh có nhiều vách ngăn tế bào Tế bào có hạch nhân
Cuống đính bào tử không phân nhánh dài và thẳng đầu, có nhiều cuống nhỏ Tùy loại có cuống nhỏ 1 tầng hoặc 2 tầng Tất cả cuống nhỏ có hình chai và gọi là tế bào hình chai, khi trưởng thành sinh ra các đính bào tử ở đầu cuống Các đính bào
tử xếp thành chuỗi đài và càng tận cùng càng lớn dần Những chuỗi đính bào tử
xếp đối xứng từng quả tròn trên chớp nang trông như đóa hoa cúc Đính bào tử
điên hình thường hình câu, đơn bào, đa hạch bê mặt xù xì Do cuông sinh bào tử
và đính bào tử có màu sắc nên màu của chúng trở thành màu của khuẩn lạc mốc Các khuẩn lạc của mốc Aspergilfus thường là: vàng, vàng lục, đen, tro, nâu
Dic diém cua giéng Aspergillus là giàu các enzyme thủy phân ngoại bào (amylase, protease, pectinase, lipase ) Hiện nay người ta sử dụng rộng rãi lồi Aspergilus vào cơng nghiệp thực phẩm và một số ngành khác đẻ thu acid hữu cơ và enzyme Một trong những chủng được nghiên cứu kỹ trong phòng thí nghiệm và các quá trình sản xuất là Aspergilus niger Chủng này trong quá trình phân hủy các glucid có khả năng tích lũy ở môi trường một lượng acid hữu cơ và enzyme khá lớn
2.2 Giới thigu vé Aspergillus niger < Nhom Aspergillus niger Gidng Aspergillus s* Họ Aspergiliaceae
s* Bộ Moniliales
s* Lớp Fưngi imperƒfecti
Vi tri phân loại của Aspergilus niger:
+* Thuộc bộ các khuẩn (Plectascales), họ Aspergillaceae, lop Ascomycetes * Hội nghị Utrecht năm 1952 công nhận như sau: Ở giai đoạn đỉnh bào tử -
giai đoạn phát triển chính của A miger người ta xác định chúng thuộc bộ Moniliales, lop nam bat toàn (Deuteromycetes) Ở giai đoạn hình thành túi bào tử thì chứng thuộc bộ Plecfascales, lớp nam tai Ascomycetes
Trang 5Gluconic acid x
GVHD: PGS TS Lé Van Viét Man
Hinh 1: Nam méc Aspergillus niger
Aspergillus niger phát triển mạnh trên môi trường thach malt va tao thành bào tử dài khoảng 7-10 micromet, khuẩn lạc màu đen, trên những cuống bào tử có vô số những bào tử Cuống bảo tử có hai phan: phan thứ nhất dài và to, khoảng 2-3
micromet có màu nâu nhạt hay hoàn toàn đen
Chủng nắm mốc này có thể chịu được pH thấp 2.1-2.2, nhiệt độ thích hợp là 30-33°C va dé phát triển trên môi trường tỉnh bột
Aspergillus niger được dùng rộng rãi trong công nghiệp thực phâm để thu
nhận các acid hữu cơ như citric acid, øluconic acid, fumaric acid Ngoài ra nó
còn ứng dụng để thu nhận các chế phẩm enzyme như: amylase, protease, pectinase, glucoseoxydase
2.3 Tiêu chẵn chọn giống
s* Là chủng nắm mốc thuần khiết, không lẫn các chung vi sinh vật khác s* Khả năng thích ứng cao, sinh sản mạnh
s* Lên men đường glucose với hiệu suất cao, thời gian lên men ngắn, sản
phẩm chính là gluconic acid chiếm tỷ lệ cao Sau khi lên men dễ tách sinh khối và sản phẩm
Kha nang bao quan dé dàng, các đặc tính di truyền được bảo tồn trong suốt thời gian bảo quản và sử dụng
2.4 Môi trường nuôi cấy
Trong sản xuất gluconic acid môi trường nuôi cấy cần đáp ứng các yêu cầu Sau:
s* Nông độ glucose ở mức cao: 150 — 250gL” s*' Hàm lượng nitơ thấp: khoảng 20 mM nitơ “+ Ham lượng phospho thấp
+* Bồ sung thêm các chất khoáng, theo Bern Haure (1928) cần thêm 0.7 — 13
mM mangan
% pH thích hợp cho nấm mốc phát triển: 4.5 — 6.5, dưới pH < 3 ức chế enzyme glucose oxydase
+» Tốc độ sục khí cao: có thể lên đến 4 bar
cà So % So
Trang 6Chương 3: QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ
Trong quá trình sản xuất gluconic acid tùy thuộc và tác nhân trung hòa là NaOH hay CaCO:, điều kiện lên men mà sản phẩm thu nhận có thê là các sản phẩm khác nhau như gluconic acid, calcium gluconate, sodium gluconate Vì mỗi sản phẩm đều có những vai trò hệt sức khác nhau trong lĩnh vực dược phầm hay trong lĩnh vực thực phâm
3.1 Sơ đỗ khối
Trong khuôn khổ bài báo cáo chúng tôi có đưa ra 3 quy trình công nghệ
Trang 8Chương 4: GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ
4.1 Xử lý mật rỉ
Mục đích:
s* Tiêu diệt hệ vi sinh vật gây bệnh ngoại trừ Bacillus, Clostridium s* Tiêu diệt / ức chê các vi sinh vật khác trong môi trường
s* Tách các chật không hòa tan trong mật rỉ
Các biến đổi: ¬
s* Vật lý: có sự thay đôi vê gradient nhiệt độ s* Sinh học: các vi sinh vật bị tiêu diệt Thiết bị: Nguyên liệu Nước lạnh N Hơi nóng —> Coro C45 —I bể N T
Hình 2: Thiết bị xử lý nhiệt mat ri
Cấu tạo: thiết bị hình trụ, đáy côn, làm bằng thép không rỉ Bên trong có hệ thống ống xoắn để gia nhiệt, bên ngoài có lớp vỏ áo để làm nguội Động cơ gắn
với cánh khuấy giúp cho quá trình đảo trộn nguyên liệu
Thông số công nghệ: thực hiện tuần tự theo các bước sau: s* Pha loãng mật rỉ với nước (45 — 50%)
4 Môi trường được đun nóng đến một nhiệt độ nhất định (90 - 100°C)
s* Giữ ở nhiệt độ đó trong khoảng thời gian 45 — 60 phút
s* Làm nguội đến nhiệt độ cần thiết (33-359C đối với đa số nắm mốc)
4% Sau khi làm nguội nguyên liệu được cho qua thiết bị ly tâm để tách các tạp
chất không tan
Trang 9Gluconic acid - GVHD: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn Nguyên liệu | E | - Hình 3: Thiết bị ly tâm làm sạch mật rỉ
Câu tạo: thiết bị có dạng hình trụ, bên trong có bô trí các thanh chặn Khi
động cơ truyền động cho rôto bên trong quay, dưới tác động của lực ly tâm các
cấu tử không tan sẽ bị văng ra, giữ lại trên các thanh chặn
Thông số công nghệ:
s* Đường kính trong của rôto: 1000 mm
s* Số vòng quay lớn nhất: 1500 vòng/phút 4.2 Phối trộn
Mục đích: chuẩn bị môi trường lên men cho nắm mốc sinh trưởng, phát triển và sinh tông hợp gluconic acid Thành phần môi trường Môi trường bao gồm: “ Glucose 110-150 gL" ¢ (NH4)2HPO4 0.388 gL" “ KH2P04 0.188 gL? $ MgSO47H2O 0.156g1” % CaCO3 26g1” s* Môi trường được chỉnh ở pH = 6.5 Các biến đổi: s* Vật lý: độ nhớt của dung dịch tăng lên do các cấu tử rắn hòa tan vào dung dịch glucose
s* Hóa lý: sự chuyển pha rắn sang lỏng của các muối vô cơ trong môi trường
hòa tan vào dung dịch khi khuấy trộn
Trang 10Thiết bị: chọn thiết bị trộn có cánh khuấy mái chèo
Hình 4: Thiết bị khuấy trộn
Cấu tạo thiết bị bao gồm 1 thùng khuấy, bên trong có gắn 2 cánh khuấy mái chèo được đặt lệch tâm, thành thùng khuấy đặt các thanh chặn Thiết bị nay ding cho chất lỏng có độ nhớt trung bình Thông số công nghệ: +* Tốc độ khuấy: 200 rpm * pH =6.5 (hiệu chỉnh bằng H;SO,) 4.3 Nhân giống
Mục ích: làm gia tăng lượng tế bào (tăng sinh khối), nhằm tích lũy đủ số lượng
bào tử cần thiết để cấy vào môi trường lên men
Phương pháp thực hiện: trong công nghiệp san xudt gluconic acid quá trình nhân giông vi sinh vật thường được thực hiện băng phương pháp nuôi cấy tĩnh (nuôi cấy theo từng mẻ - batch culture) Nhân giống trên môi trường lỏng rất ít được sử dụng, lý do thời gian nuôi kéo đài và hoạt tính enzyme thường không cao so với
nuôi cây bề mặt
Môi trường thường dùng để nuôi cấy nắm mốc thường là môi trường bán
rấn với thành phân: cám gạo, cám mì, bột ngô, hạt kê, hoặc một số loại hạt, bột
kém chất lượng khác Để làm tăng độ xốp của môi trường, thường trong sản xuất
có trộn thêm các phụ liệu khác như v6 trau (15 20%)
Quá trình nhân giống tiến hành qua nhiều cấp nhân giống trên các khay đựng canh trường đã phối trộn, thực hiện trong phòng muôi cấy
Các biến đổi:
$% Sinh học: trong suốt quá trình phát triển của nắm mốc theo thời gian nhân giống trong môi trường bán rắn, nấm mốc thường trải qua 3 giai đoạn: »> Giai đoạn 1: kéo đài 10—14h Bào tử bắt đầu trương nở và bắt đầu hô
hấp do đó nhiệt độ phòng nuôi phải được duy tri 28-30°C
> Giai đoạn 2: kéo đài 14-18h Hệ nắm bắt đầu phát triển, quá trình hô
hấp diễn ra mạnh, nhiệt độ phòng nuôi tăng nhanh Vì vậy phải thông gió và đuy trì độ ẩm môi trường khoảng 80 — 90% trong giai đoạn này
Trang 11Gluconic acid
GVHD: PGS TS Lé Van Viét Man > Giai đoạn 3: kéo đài 10-12h Cường độ hô hấp giảm, nhiệt độ môi
trường bán rấn giảm Nắm mốc bắt đầu sinh bào tử
** Vật lý: thành phần môi trường thay đổi, nông độ cơ chất tại mỗi điểm trên
khay nhân giông là khác nhau Thông số công nghệ:
s* Độ ẩm của môi trường bán ran: 58-60%
+* Nhiệt độ môi trường: 28-30C
s* Thời gian nuôi: 36-72h, theo mỗi cấp nhân giống ‹* Chiều đây của lớp môi trường tốt nhất: 5—10cm
$* Thời gian kết thúc quá trình nhân giống khi thu được số lượng bảo tử cần thiết cho quá trình lên men (do nhà sản xuất đặt ra)
4.4 Lên men
Muc dich: chuyén héa glucose thanh gluconic acid
Các biển đổi:
“ Vat ly: quá trình lên men làm cho nhiệt độ trong thùng lên men tăng, cần phải bế trí thiết bị làm mát trong quá trình lên men
s* Sinh học: sinh trưởng và trao đổi chất của nấm mốc, sinh khối tăng trong
giai đoạn đầu, giai đoạn sau quá trình trao đối chất dién ra, hệ quả tạo ra
gluconic acid và các sản phẩm phụ khác
“ Hoa học và hóa sinh: chuyến hóa glucose thành gluconic acid xúc tác enzyme glucose oxydase
Các yếu tô ảnh hưởng: hai yếu tố ảnh hưởng lớn nhất là oxy và pH # Oxy: là chất nên của quá trình oxy hóa glucose
Gradient néng d6 va thé tich oxy van chuyén qua môi trường ảnh hưởng đến sự chuyển pha của oxy từ thể khí sang thể lỏng Trong quá trình sản xuất
gluconic acid đòi hỏi lượng oxy hòa tan cao, điều này là rất cần thiết cho nam mốc
chuyển hóa các hợp chất hữu cơ trong môi trường (hành năng lượng, sinh tông hợp gluconic acid Ví dụ, khi Sakurai et al tién hành sục oxy với áp suất cao lên xấp xỉ 6 bar kết quả đã duy trì được lượng oxy hỏa tan 150 ppm
Nghiên cứu cũng cho thấy rằng trong sản xuất gluconic acid A niger sử dụng oxy tỉnh khiết nhiều hơn so với khi chúng phát triển ngồi khơng khí Theo Kapat e: ai: khi khuấy trộn với tốc độ 420 rpm và tốc độ thông khí 0.25 vvm, nồng độ oxy hòa tan lúc nảy là tốt nhất cho sự sản sinh glucose oxidase Theo Lee et al: dé sin xuất đạt năng suất cao thì phái sử dụng áp, suất sục khí cao (2-6 bar) lúc nảy lượng oxy hỏa tan trong môi trường có thể đạt đến 150 ppm
Nói chung trong quá trình phát triển cia hé soi nam lugng oxy cung cấp không
đều, nguyên nhân đo kích thước của các bong bóng khí ảnh hưởng nhiều bởi độ
nhớt của môi trường nuôi cấy Nên cần theo đõi trong suốt quá trình sản xuất
“> pH: 14 yếu tổ quan trọng trong việc sản xuất glueonic acid vì ở những pH khác nhau A niger cho những sản phẩm khác nhau như: citric acid , gluconic acid va oxalic acid
Trang 12Việc tích lũy các sản phẩm này dựa vào các giá trị pH trung bình Ví dụ pH dưới
3,5 tạo điều kiện cho sự tích tụ citric acid, để sản xuất gluconic acid thi pH = 4,5- 7,0 (pH tối ưu là 5.5) Nghiên cứu của Franke khi thu thập dữ liệu về mức độ hoạt
Trang 13Gluconic acid
Thiết bị: thiết bị lên men bề sâu
GVHD: PGS 1S Lê Văn Việt Mẫn
Cấu tạo: thiết bị này có cấu tạo là một thùng hình trụ đứng được cầu tạo từ thép không rỉ hay lớp kim loại kép có đáy và nắp hình nón, trên nắp có gắn động cơ chuyển đảo và các ống nối cho môi trường và các tác nhân hỗ trợ quá trình lên men, van bảo hiểm và các khớp nối để gắn các dụng cụ kiểm tra Các bộ phận chính của thiết bị 1) Động cơ 2) Hộp giảm tốc 3) Khớp nối 4) Ôbi 5) Vòng bít kín 6) Trục 7) Thanh thiét bi
8) Máy khuấy trộn tuabin
9) Bộ trao đối nhiét dang ống xoắn 10)Khớp nối 11)Óng nạp không khí 12)Máy trộn kiểu cánh quạt 13)Bộ sủi bọt 14)Máy khuấy dạng vit 15)Ô đỡ 16)Khớp để tháo 17)Ao 18)Khớp nạp liệu 19)Khớp tháo không khí Xử lý thiết bị với H;SO¿ và HNO; lỗng, thơng khí trong 24h _
Tiệt trùng thiết bị băng hơi nước (0.2 bar), làm nguội bằng tác nhân lạnh thông qua vỏ áo Thông số công nghệ: % Nhiệt độ lên men 34°C s pH dao động 4.5 — 6.5 Lưu lượng khí 0.25 — 1 vvm ¢ Ap suất sục khí 1.5 — 2 kg/cmỸ s* Thời gian lên men 40h —L — =), 2 el 4 ww J | / =e ke 1 Oo , i \ , bị dự Í ; Ì Mt AZ B 7 ” ¥ 8 4 6
Hình 7: Thiết bị lên men bề sâu
s* Thời điểm kết thúc lên men khi nồng độ đường còn lại 0.1%
Trang 144.5 Lọc
Mục đích: loại bỏ sinh khối vì sinh vật trong dịch men
Các biến đối: „ „ „ „
s* Vật lý: thay đôi khôi lượng dịch lên men, màu sắc dung dịch chuyên từ đục sang trong, độ nhớt giảm
Thiết bị: chọn thiết bị lọc khung bản (lọc ép) -
Câu tạo: khung lọc và bản lọc đặt xen kẽ, ở giữa ta đặt vải lọc Ep chat lai ta được
máy lọc khung bản Khi bã lọc năm đây trong khung lọc ta tiên hành rửa bã đề tận
thu, sau đó làm vệ sinh rôi lọc tiệp Bán /—Khng Ngyyệc bệ vào LY yy ⁄ J\ 2s 24 2% 2 2Ý \ \ \ ⁄ | ma | “Thiết bị lọc ép Hình 8: Thiết bị lọc khung bản Thông số công nghệ: s* Kích thước màng lọc: 50 um s* Độ ẩm nguyên liệu ~ 90%, độ âm bã ~ 30% 4.6 Acid hóa Mục đích: thu hồi gluconic acid Các biến đổi: s* Vật lý: dung địch đổi màu đục, độ nhớt tăng s* Hóa học: xảy ra phản ứng
Calcium gluconate + H,SO, = gluconic acid + CaSO,
“ Hoa ly: sy tach lam hai pha rắn và lỏng, kết tủa sinh ra lắng xuống Thiết bị: chọn thiết bị phản ứng có cánh khuấy
Thiết bị gồm: vỏ thép hàn có đáy hình nón và nắp phẳng làm bằng thép chịu acid đậy kín bằng mặt lát gỗ Bề mặt trong của thiết bị được chống gỉ bằng lớp chịu acid Bề mặt ngoài được phủ lớp cách nhiệt Trong nắp thiết bị đặt máy trộn bằng thép chịu acid, cửa nối để thoát khí ra khỏi thiết bị Trong phần nối phía dưới của thiết bị có khớp nối để nhận sản phẩm Khớp nối bên trong đùng để nạp acid H;SO¿ Ở nắp và phần nón bên dưới có các cửa - khe nhìn để sửa chữa, làm
sạch và khảo sát thiết bị
Trang 15Gluconic acid - GVHD: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn ; | + ' " ; 1 Cửa nạp H:SO, 4 2 Cira nap calcium gluconate : ] 3 Cửa tháo sản phẩm 4 Cánh khuấy 5 Bộ đảo đạng khung 6 Bộ cào 4 5 7 Motor ole ¬3 Hình 9: Thiết bị phản ứng Thông số công nghệ:
* Lượng H;SOa dùng để acid hóa môi trường tương đương với lượng CaCO;
cho vào theo phương trình phản ứng:
Calcium gluconate + H,SO, = gluconic acid + CaSO,
s* Dung dịch sau acid hóa có pH ~ 3.7
4.7 Ly tâm
Mục đích: tách kết tủa CaSO¿, huyền phù trong dung dich
Các biến đổi:
s* Vật lý: độ nhớt giảm, tỷ trọng giảm
“> Hoa ly: sy tach lam hai pha rắn và lỏng riêng biệt
Thiét bi: chon thiét bi ly tam ling
Cấu tạo máy gồm có hai rôto Rôto ngoài có đạng hình nón hoặc trụ-nón, Trôto trong có dạng hình trụ mà mặt ngoài của nó có gắn vít tải Rôto trong và rôto
ngoài quay cùng chiều nhưng rôto trong quay chậm hơn rơto ngồi 1,5-2 % (khoảng 20-100vg/ph) nhờ hộp giảm tốc vi sai Rôto trong có đục các lỗ dé dẫn huyền phù nhập liệu Góc nghiêng phần hình nón của rôto khoảng 9-1 0Œ
Quá trình lắng xảy ra trong khống khơng gian giữa hai rôto, bã bám vào
mặt trong của rơto ngồi và được vít tái đây về phía cửa tháo bã Nước trong đi về
phía ngược lại, chảy qua các cửa ở trên đáy rồi đi ra ngoài Trong phần rôto không
bị ngập nước, bã vừa được đưa ra khỏi rôto vừa được làm khô
Trang 16LAW i wv a # 4 7 6 a
1- Cơ cấu ngưng máy khi quá tải; 2- Cửa tháo; 3-Vỏ có các vách bên trong, 4- Cống nạp liệu; 5, 10- Bệ ta rôio; 6- Khoang để tháo chất léng "nguyên
chat"; 7- Vit tai; 8- Réto xilanh- non; 9- Khoang dé thao cặn; 11- Bộ truyền
động
Hình 10: Máy ly tâm lắng nằm ngang Thông số công nghệ:
Đường kính trong của roto: 325 mm + Số vòng quay của roto: 3500 vòng/phút
4.8 Trao đổi ion
Mục đích:
$% Khai thác: thu nhận acid gluconic
s* Hoàn thiện : tách các tạp chất ra khỏi acid
Các biến đổi : sự tương tác tĩnh điện giữa các cầu tử mang điện trong dung dịch lên men với các hạt nhựa mang điện tích trái dâu
Phương pháp thực hiện :
Do acid gluconic tích điện âm nên sẽ bị hấp phụ bởi anionit có các nhóm
điện tích là base Khi đó các ion âm chủ yếu là acid gluconic (ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác như citric acid .) hấp phụ trên hạt nhựa (pha tĩnh) giữ lại trên
cột còn các phần tử khác (ion dương và tạp chất không tích điện ) do không bị giữ
lại bởi pha tĩnh nên bị loại khỏi cột Do ái lực khác nhau giữa các ion với nhựa
anionit va sự phán hấp phụ do đung dịch rửa giải, ion trao đổi khuếch tán vào dung dịch rửa giải Ta dùng dung dịch giải hấp phụ là HCI lỗng để lơi cuốn
gluconic acid ra khỏi cột
Thông số công nghệ :
+» Nhựa trao đôi anionit sử dụng là anionit có nhóm điện tích -CH¿NTRạ ( có
khoảng pH hoạt động rộng với dung lượng trao đồi ion là 4mM OH7g )
Trang 17Gluconic acid GVHD: PGS 1S Lê Văn Việt Mẫn 4.9 Cô đặc Mục đích: nâng cao nồng độ gluconic acid trong sản phẩm Các biến đổi: s% Vật lý:
> Hệ số truyền nhiệt giảm
> Độ nhớt tăng, khối lượng riêng tăng > Thể tích dung dịch giảm
s* Hóa lý: sự bốc hơi nước
Thiết bị: sử dụng thiết bị cô đặc chân không
Cấu tạo: máy gồm 3 bộ phận chính: buồng đốt ngoài, buồng bốc và thiết bị ngưng tụ
> Buồng đốt ngoài: thiết bị thường đùng các loại ống có đường kính d25, va
d38, chiều dài của ống truyền nhiệt là bội số của 0.5m (tối thiêu là 0.5m, tối
đa là 9m), ống thường bố trí ở đỉnh tam giác đều với bước ống s khoảng (1.3-1.5)dạ Mục đích: gia nhiệt cho hỗn hợp dung dịch lỏng tới nhiệt độ sôi tai áp suất làm việc
> Budng bic: thiết bị có dạng hình trụ với đường kính lớn Nhiệm vụ chủ yếu
của bường bốc là tách hỗn hợp lỏng — hơi thành những giọt lỏng rơi trở lại
> Thiết bị ngưng tụ: đưa đòng nước lạnh tiếp xúc với dòng hơi 1 1 Cửa nạp nguyên liệ› 2 Cửa tháo sản phẩm 3 Bộ phận gia nhiệt 4 Buồng tách sản phẩm và hơi thứ 5 Cửa nạp nước lạnh 6 Cửa tháo nước ngưng
Trang 18Chuong 5: SAN PHAM 5.1 Sản phẩm O .OH CTPT : CoH20; )ể + Tên gọi đầy đủ: 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoic acid H—-L—OH “ pKa: 3.7 HO H
“ Nhiét d6 nóng chảy (dung dịch 50%) : trên 12°C
“> Nhiệt độ hóa hơi (dung địch 50%) : hơn 100°C H——OH
¢ Khéi long riéng: 1.24 g/ml H OH
+* Màu sắc: không màu tới nâu
Giluconic acid: là acid hữu cơ nhẹ, không ăn mòn, không độc, phố biến
trong các loài thực vật, hoa quả và các thực phẩm khác như gạo, thịt, sản phẩm
sữa, rượu (lên đến 0,25%), mật ong (lên đến 1%), và đấm ăn Gluconic acid được ứng dụng làm chất tạo vị chua (E574) trong một số thực phẩm nhự rượu vang, nước hoa quả Nó còn làm chất tẩy rửa các thiết bị của dây chuyền chế biến hay
thiết bị lên men trong công nghiệp thực phẩm Chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm:
* Trạng thái: dung dịch lỏng, min 50% w/v “> Mau sac: sáng ánh màu vàng
Trang 19Gluconic acid
5.2 Sơ đồ chuyển hóa
GVHD: PGS 1S Lê Văn Việt Mẫn
Có nhiều phương pháp sản xuất gluconic acid: hóa học, điện hóa, hóa sinh,
bioelectrochemical, tại đó sử dụng các tác nhân oxy hóa khác nhau Tuy nhiên
Trang 205.2.1 San xuat tir Aspergillus niger và Penicillium luteum B-p-glucose H;O; Glucose É FAD catalase SN oxidase FADH ; R— 402 Glucono-8-lactone ⁄O› Lactonase/ 5 spontaneous Hạ0 Gluconic acid glucose + 4 O2 — gluconic acid
Hinh 13: So dé chuyén héa glucose thanh gluconic acid béi A niger
Sự có mặt của ion Ca” làm cho A niger sinh téng hgp déng thoi 2 enzyme d6 14 glucose oxidase va catalase, làm thay đổi quá trình chuyển hóa glucose từ con đường EMP sang con đường oxy hóa trực tiếp dưới xúc tác của các enzyme
Gluconic acid (pentahydroxycaproic acid) được sản xuất từ glucose bằng phản ứng loại bỏ hydrogen, xúc tác bởi emzyme glucose oxydase, khi đó nhóm aldedyde trên C-I của J-D-glucose sẽ chuyên hóa thành nhóm carbonxyl, bên cạnh đó còn có glucono-ð-lactone (CøH;¡oOs) và hydrogen peroxide Ngoài ra glucono-8-lactone cting thủy phân thành gluconic acid, giai đoạn này có thé say ra một cách tự nhiên hoặc có enzyme gluconolactonase xúc tác, trong khi hydrogen peroxide phân hủy thành nước và oxy dưới tác dụng của enzyme peroxidase
A niger sản xuất tất cả các enzym cần thiết cho các chuyên đổi của glucose thành axid gluconic, trong đó bao gôm glucose oxidase, catalase, lactonase và
mutarotase (phục vụ để tăng tốc độ phản ứng)
Trong quá trình sản xuất sự tích tụ của lactone (Glucono-8-lactone) trong môi trường gây hiệu ứng xấu đến glucose oxidase, và việc sản xuất acid
gluconic bị gián đoạn Tuy nhiên sự có mặt của lactonase (A rniger tiết ra)
làm cho sự thủy phân Glucono-õ-lactone sẽ điển ra nhanh hơn, điều kiện phản ứng này gần như trung tính, điều này có thể giải quyết bằng cách bổ
sung NaOH hay CaCOs3,
“ Catalase xtc tac cho phan tmg phan hiy H,O, thanh O, va H,O
Quá trình lên men làm cho pH môi trường giảm xuống làm ức chế enzyme ølucose oxidase dân đên sản suât bị đừng lại, đê kiêm soát pH biện pháp đã được đưa ra là sử dụng CaCO; với lượng vừa đú (thừa CaCO; sẽ làm chậm sự lên men
Trang 21Gluconic acid -
GVHD: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn do CaCO; ngin cản sự tiếp xúc tự do giữa môi trường và hệ sợi nắm) Nhưng vấn đề quan trọng là tính khó tan của Calcium gluconate trong nước (4 % tại 30 °C), tại nơi tập trung glucose cao lên đến 15 %, xảy ra sự quá bão hòa, và nếu nó vượt quá giới hạn calcium gluconate sẽ bị kết tủa trong hệ sợi nắm, điều này làm ngăn cản vận chuyển oxy
Sản xuất gluconic acid đã được nghiên cứa tổng quát bởi May e al, Moyer, Wells et al, va Stubbs et al sit dung A niger , Currie et al st: dung Penicillium luteum va A niger cho hiệu suất tạo gluconic acid t6i 90 % trong 48-60 h Sau đó Moyer et al trong quá trình nghiên cứu sử dụng A miger đã cho hiệu suất tạo giuconic acid lên đến 95% trong điều kiện lý thuyết (dung dịch glucose: 150 - 200 g/L trong 24 h) Porges et al thay rang qua trình có thể gián đoạn do sử dụng khuẩn ty chín lần liên tục tại nơi cấy được phục hồi bằng lọc hay tách ly tâm Những phát hién cua Moyer et al cho thấy: hiệu quả hơn 95% có thể đạt được nếu thêm vào dung dịch bao gồm glucose 250 g / L và hợp chất cua Bo 1% sau giai đoạn phát triển của nắm, với sự tái sử dụng khuẩn ty trong vòng 24 h mỗi lần 5.2.2 Sản xuất gluconic acid tie enzyme glucose oxidase
Dựa trên phản ứng chuyển đổi glucose bằng tác nhân nấm sợi (tiết ra
enzyme glucose oxidase, enzyme lan đầu được cô lap tir Penicillium glaucum boi Miiler Emzyme được bảo quản trong đường (crystallised) boi Kusai et al, từ loài P amagasakiense Glucose oxidase trước đây được biết như notatin Glucose
oxiđase như là flavoprotein: một hợp chất gồm protein kết hợp hoặc với nhóm
ngoại FAD hoặc với FMN (gọi là các Flavin) Glucose oxidase la enzyme có nhóm ngoại FAD, khi oxy hóa glucose, dưới tác dụng của enzyme này sẽ tạo thành sản phẩm trung gian là Glucono-8-lactone, chất này kết hợp với nước và chuyển thành gluconic acid Giai đoạn sau có thể xảy ra một cách tự nhiên hoặc có thể do enzyme glucono-lactonase xúc tác Glucose oxidase 1a glycoprotein
Phuong pháp sử dung enzyme trong sản suất gluconic acid có tiềm năng phát triển vì không phải qua giai đoạn tỉnh sạch sản phẩm Nếu enzyme được cô định trong màng polymer (có thể trao đổi anion) được tao ra bằng cách ghép polyethylene với 4-vinylpyridine Tuy nhiên phương pháp này không được dùng
trong công nghiệp và sẽ không được cân nhắc xem xét lại vì lý do kinh tế 5.2.3 Sản xuất gluconic acid từ vi khuẩn
“ Vi khuẩn acetic va Pseudomonas savastanoi là những vi khuẩn đầu tiên
được ứng đụng vào sản xuất gluconic acid Không giống như nắm mốc
trong quá trình chuyển hóa vi khuẩn tiét ra glucose dehydrogenase dé oxy hóa glucose thành gluconic acid, tiếp đến bị oxy hóa thành 2-ketogluconate , cuỗi cùng bị oxy hóa thành 2,5-diketogluconate
Trang 22D-glucose | Glucose dehydrogenase Gluconic acid | Gluconate dehydrogenase 2-ketogluconic acid | 2-ketogluconic acid dehydrogenase 2,5-diketogluconic acid
Hinh 14: So dé chuyén héa glucose thanh gluconic acid béi Acetobacter va Pseudomonas
“ Gluconobacter oxydans: vi khuan hiéu khi bat buộc, oxy hóa glucose qua hai con đường: đâu tiên đòi hỏi sự photphoryl hóa, băng cách oxy hóa theo con đường pentose phosphate
Sản xuất gluconic có hạn chế ở quy mô công nghiệp vì do sự oxy hóa tới các oxogluconic acid, kha nang cla Pseudomonas va Gluconobacter spp trong sản xuất gluconolactone và glucomc acid đã được khai thác trong việc sản xuất trên quy mô thương mại chủ yếu trong sản xuất lactone
Trang 23Gluconic acid -
GVHD: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn
Chương 6: THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ
6.1 Nguyên liệu
Giucose được sử dụng là nguồn carbon cho hầu hết các loài vi sinh vat san
xuất gluconic acid
“ Kundu va Das thu duge một lượng lớn gluconic acid từ môi trường glucose hay nguyên liệu từ sự thủy phân tỉnh bột (starch hydrolysatc)
s* Vassilev eí ai sử dụng hydrol (nguyên liệu từ sự thủy phân tỉnh bột ngô) làm chất thay thế glucose để sản xuất gluconic acid bằng A miger được giữ có định
“ Mukhopadhyay et al sir dung protein whey trong sữa như là môi trường bổ sung chất dinh dưỡng cho sản xuất Gluconic acid, lactose được sử dụng
như một chất nền, 92g gluconic acid được sản xuất từ 1 lít whey chứa 0,5%
glucose va 9,5% lactose bang A niger dugc giữ cố định trong bọc nhựa Ikeda et al sit dụng nguyên liệu là giấy thải, sau khi đường hóa thu được đung dịch có nồng độ glucose lên tới 50—100 g/L Sản lượng thu được là 92 % trong bình cất Erlenmeycr và 60% trong bình phản ứng có turbine lá cánh quạt với 800 mL mỗi mẻ Một điểm đáng lưu ý trong nghiên cứu này là khi sử dụng xylose (loại đường pentose) và cellobiose (dẫn xuất của
cellulose) làm nguồn carbon đuy nhất thì thu được sản lượng tương ứng là
83 và 56%
6.2 Vi sinh vật tông hợp gluconic acid
“ Acetobacter methanolicus: duge st dyng lam xic tac trong su chuyén déi
glucose thanh gluconic acid, không giống như những vỉ khuẩn khác, trong quá trình lên men A me(wanolicus sử dụng methanol, nguồn nguyên liệu rẻ tiền, như là chất nền Ngồi ra q trình khơng sử dụng glucose trong quá
trình phát triển, vì vậy sản lượng lý thuyết có thê đạt lớn nhất
% Nghiên cứu của Currie va Carter: st dụng trung bình 200 g/L dung dich chứa glucose và những chất dinh dưỡng và trung hòa khác chảy qua tháp chứa đầy đăm bào gỗ (hay than cốc), sử dụng Acetobacter suboxydans, trong khi không khí đi lên xuyên qua lớp dăm bào gỗ (hay than cốc) “+ Tsao va Kempe, làm việc với Pseudomonas Ovalis và đã fìm ra một chủng
đặc biệt có thể chuyển hóa glucose thành gluconic acid với hiệu suất lên
đến 99%, tuy nhiên tỷ lệ này phụ thuộc rất nhiều vào việc thông khi
% Nấm men (Yeast) : nghiên cứu của một số tác giả sử dụng Aureobasidium
pullulans 46 sản xuất gluconic acid Các yếu tố được nghiên cứu cho quá trình sản xuất liên tục như: độ pH, oxy , nhiệt độ, thành phần trung bình của môi trường, độ bão hòa không khí, sự chuyển hóa glucose cao nhất đến
94% và sản lượng đạt 87.I % tại pH trung bình là 6.5 Tại pH = 4 hay pH = 5 sản lượng nghẻo nàn, tương ứng là 67.8% và 20.7% Nhiệt độ thích hợp
là 29°C tới 31 °C, nếu tăng nhiệt độ lên 1°C cụ thể là 32°C thì sinh khối và
năng suất giảm
Trang 24fe
% Nghiên cứu của Berhauer cho thấy A niger cho san lượng cao khi lượng acid tạo thành được trung hòa bởi CaCOa, và quá trình này phụ thuộc chặt chẽ vào pH Tuy nhiên khi sử dung Penicillium sp su phy thudc vao pH
không còn bị giới hạn như khi str dung A niger, khi déi chiếu về số lượng, thời gian xuất hiện của các acid hữu cơ như: gluconic acid, citric acid, oxalic acid trong những điều kiện khác nhau
6.3 Cố định (Immobilisation)
Kỹ thuât cô định (Immobilisation) là kỹ thuật khá phức tạp, noi vi sinh vat được cô định trên màng bao hay được cô định tại những khu vực riêng Trong một số trường hợp enzyme được có định Phương pháp này cho phép tái sử dụng vi sinh vật trong sản xuất, và là một phương pháp hiệu quả trong việc chuyển hóa nhanh chóng carbonhydrat thành acid hữu cơ
oe
s Trong quá khứ cũng có một vài nghiên cứu về việc sử dụng tế bảo A miger
được cô định trong sản xuất gluconic acid, trong đó tế bào A niger dugc
vo viên với các chất có khối lượng phân tử cao (polyclcctrolyte), calcium alginate, glycidyl ester copolymers tao thanh hé keo két đính A niger duge đưa vào sản xuất gluconic acid bởi Heinrich va Rehm, Sakurai et al dua ra phương pháp cố định A niger, Vassilev et al va Mukhopadhyay et al nghiên cứu cách cố định sợi khuẩn ty trong bọt polyurethane
Bằng cách cố định Œ oxyđzns trong điều kiện thông khí, nuôi cấy tối thiểu
6 tháng, sẽ cho năng suất 5 g/(L.h) trên 100 g/L glucose, nồng độ gluconic acid sinh ra trong trường hợp này khoảng 80 g/L Trong một nghiên cứu khác khi cho bào tử nắm mốc được giữ cố định trong kính mờ (sintered glass), dé bot (pumice stone) va bọt polyurethane, lúc này hệ sợi nâm phát triển trong đá bọt sẽ sản sinh enzyme ngoai bao glucose oxidase cao (80 %
khi đối chiếu với hoạt tính của enzyme trong các tế bào tự do)
Nghiên cứu của Sankpal ef zi trong việc sử dung A miger được cố định trong mạng lưới cellulose (cellulosic fabric) như là chiếc khung lưới (support matrix) trong sản xuất gluconic acid Dung dịch glucose (100 g/L) được thiết kế chảy qua ống mao mạch, như là kết cấu lưới thẳng đứng Hệ
thống được chạy liên tiếp trong 61 ngày, chuyển hóa toàn bộ glucose, sinh
ra sản lượng gluconic acid là 20-140 g/L Sankpal and Kulkarni tìm ra được giá trị trung bình mật độ sinh khối sinh vi sinh vật trong khung cellulose 1a 0.234 mg/cm? là phù hợp cho lên men Nếu nhiều quá sẽ gây ức
chế vi sinh vật ngoài ra, sự gia tăng nhanh về tế bảo vi sinh vật làm cho
hiệu suất chuyển hóa giảm
Trang 25Gluconic acid -
GVHD: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Lê Ngọc Tú, Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà
Nội, , Hà Nội 1997
2 Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ sinh học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia
Thành phố Hồ Chí Minh, Tp HCM, 2001, 345 trang
3 Lê Văn Việt Mẫn và cộng sự, Công nghệ chế biến thực phẩm, Nhà xuất bản
Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Tp HCM, 2009, 1020 trang
4 Rehm H.J.,.Reed G Biotechnology (11 volumes) volumes 6: Primary
metabolites VCH publish, Weinheim, 1996