Kỹ thuật nhân giống in vitro

Kỹ thuật nhân giống in vitro

Chuyên đề 3 Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro

o 0 o

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấynguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡngnhân tạo, trong điều kiện vô trùng

Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là mộtlĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật.Bao gồm:

+ Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành+ Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.+ Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành

+ Nuôi cấy mô sẹo (callus)+ Nuôi cấy tế bào đơn+ Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu khi

đã tách vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần

Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệmnên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm

(in vitro) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ốngnghiệm (in vivo)

Khác vối các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặcghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn cóthể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà cácphương pháp nhân giống khác không thể thay thế được Ngoài ra phương pháp nàykhông phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm Đây làhướng đang được ứng dụng rộng rãi Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thínghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất giống cây trồng hàng năm đã cungcấp một lượng đáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa,khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp

*Cơ sở khoa học

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân giống vôtính nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự phân hoá và phảnphân hoá

- Tính toàn năng của tế bào:

Haberland (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất kỳ của một

cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoànchỉnh Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào đã chuyên hoá đều chứamột lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông tin di truyềncủa một cơ thể trưởng thành Vì vậy, trong điều kiện nhất định một tế bào bất kỳ đều

có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh Đặc tính đó của tế bào gọi là tính toànnăng của tế bào Qua đó người ta có thể biến một tế bào bất kỳ (hoặc một mẩu mô)thành một cơ thể hoàn chỉnh khi được nuôi cấy trong một môi trường thích hợp cóđầy đủ các điều kiện cần thiết cho tế bào thực hiện các quá trình phân hoá, phảnphân hoá.

- Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào

+ Tính phân hoá của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tếbào của các mô chuyên hoá đảm nhiệm các chực năng khác nhau Trong cơ thể thựcvật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhiệm các chức năng khác nhau (mô dậu,

mô dẫn, mô bì, mô khuyết…) nhưng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào môi sinh đãtrải qua giai đoạn phân hoá tế bào để hình thành các mô riêng biệt

+ Tính phản phân hoá của tế bào: dó là các tế bào khi đã được phân hoá thànhcác mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong điều kiện nhất địnhchúng vẫn có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào

Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân…thì giai đoạn tạo

mô sẹo chính là khi tế bào quay trở về trạng thái phôi sinh có khả năng phân chialiên tục mà mất hẳn chức năng của các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân… trước đó

Sự phân hoá và phản phân hoá giữa tế bào phôi sinh và tế bào đã chuyên hoá đượcbiểu diễn theo sơ đồ sau:

Phân hoá tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá

Phản phân hoá tế bào

Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen, tại mộtthời điểm nào đó trong quá trình phát triển các thể thì một số gen được hoạt hoá vàmột số gen khác bị ức chế Điều này được xảy ra theo một chương trình đã được mãhoá trong cấu trúc phân tử ADN Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tếbào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi được tách rời và trong những điều kiện nhấtđịnh thì các gen được hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả cácgen để hình thành một các thể mới Đó chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôicấy mô tế bào

*Các ứng dụng

Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh tế tolớn thực sự Một trong những ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro là việc sửdụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ Ở kích thước nhỏ, sự tương tác giữa các tếbào trong mô sẽ đơn giản hơn Tác động của các phương pháp sẽ hiệu quả hơn Mônuôi cáy dễ phân hoá và sau đó dễ tái sinh hơn

Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác không cóđược đó là: có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối

tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), phương pháp có hệ số nhân rấtcao và cho ra các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền.

+ Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt

+ Duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống câyrau, cây hoa các loại cây trồng khác

+ Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus

+ Bảo quản các tạp đoàn gen, đặc biệt với loại cây dễ bị nhiếm bệnh trongđiều kiện tự nhiên, hoặccác cây dễ bị giao phấn

Với phương pháp này nhiều giống cây hoa (hoa lan, cẩm chướng, đồng tiền,cúc…), cây lương thực thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cọ dầu, mía, càphê…), cây ăn quả (chuối, dứa, dâu tây…), cây lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai, dứasợi…) đã được phổ biến nhanh vào trong sản xuất

*Các bước trong nhân giống in vitro

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trược khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây chonguồn mẫu nuôi cấy) Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giaiđoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợpvới chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả truớc khi lấy mẫu sẽ làm giảm

tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro

Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu

Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần đảm bảo cácyêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt

Kết quả giai đoạn này phụ thuộc vào rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vàomục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp Khi lấy mẫu cần chọnđúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnhchồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá

Ví dụ: Vật liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro

Măng tây: chồi ngọn (Kohter, 1975)

Khoai tây: mầm (Morel, 1952)

Dứa: chồi nách, chồi đỉnh (Paunethier, 1976)

Bắp cải: mảnh lá (Bimomilo, 1975)

Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978)

Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử trùng

để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy Chọn đúng phương pháp khửtrùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được

tốc độ sinh trưởng nhanh Thường dùng các chất: HgCl 0.1% xử lý trong 5-10 phút,NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br… Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến:

Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962)

Chất hữu cơ: đường sarcaroza

Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit

Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Xytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin(GA3)

Bước 3: nhân nhanh

Mục đích cảu giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng nhanh sốlượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các conđường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính

Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sungchất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành nhiều chồi

Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm Vấn đề làphải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả caonhất Chế độ nuôi cấy thường là 25-270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánhsáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím là thành phần quan trọng để kích thích phân hoáchồi (Weiss và Jaffe, 1969) Tuy nhiên với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độnuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhânphong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối…

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Kết thúc giai đoạn nhân nhanh cây chúng ta có được một số lượng chồi lớn nhưngchưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ Vì vậy, cần chuyển từ môi trườngnhân nhanh sang môi trường tạo rễ Tách các chồi riêng cấy chuyển vào môi trườngnuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin Mỗi chồi khi ra rễ làthành một cây hoàn chỉnh Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển

từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiếtsinh trưởng Đối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường không cóchất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp thì phôiphát triển thành cây hoàn chỉnh

Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởngtốt cần đảm bảo một số yêu cầu:

- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ,chiều cao cây…)

- Cần có thời gian huấn luyện cây con (từ 1-2 tuần tuỳ từng loại cây) để thích nghivới những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh bằng cách đặt bình cây ngoài điềukiênj tự nhiên, mở nắp bình nuôi…

- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoat nước Phảichủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sánh của vườn ươm cũng như có chế độdinh dưỡng thích hợp.

* Các phương pháp nhân giống in vitro

Tất cả các phương pháp nhân giống in vitro đều có các ưu, nhược điểm sau:

* Ưu điểm

- Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng câygiống từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0.1-10mm Trongkhi đó phương pháp nhân giống truyền thống thì để tạo thành cây giống, ít nhất phải

sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5-20cm

- Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo đựoc sẽ không bịnhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài

- Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng cây giống sạchvirus

- Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh củacây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều tiết sinh trưởng… theo

ý muốn

- Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng cây giống trong một thời gianngắn Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng 36-1012/năm, như vậykhông có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn

- Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu chi phối của điều kiện ngoại cảnhcủa thời vụ

- Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được trongthời gian dài ở điều kiện in vitro

Do đó khi trồng ra điều kiện tự nhiên cây thường bi mất cân bằng nước, gây hiệntượng cây bị héo và chết Vì vậy trước khi chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điềukiện in vivo cần phải trải qua giai đoạn huấn luyện để cây quen dần với điều kiệnbên ngoài có độ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh

- Cần trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao

- Những vấn đề tồn tại trong vi nhân giống

+ Tính bất định về mặt di truyền

+ Sự nhiễm mẫu

+ Việc sản sinh các hợp chất độc từ mô nuôi cấy

+ Hiện tượng thuỷ tinh hoá

Chuyên đề 4:

Vì sao có thể nuôi cấy mô phân sinh (meristem) để tạo ra cây sạch virus?

Các bước và điều kiện cần thiết của một hệ thống sản xuất giống sạch bệnh?

o 0 o

* Tác hại của virus:

Trong thế giới các loài sinh vật thì thế giới của các loài vi sinh vật vô cùng đa dạng

và phức tạp mà đến nay vẫn còn rất nhiều loài mà con người vẫn chưa biết đến.Người ta thường phân vi sinh vật thành 2 loại là vi sinh vật có tác dụng tốt cho conngười và vi sinh vật có hại cho con người Trong thế giới vi sinh vật ấy thì virus làmột loại rất nguy hiểm Đối với cả con người và các loài động thực vật khác khi đãnhiễm bệnh virus thì không có một loại thuốc nào có thể chữa được, mà chỉ phụthuộc vào khả năng đề kháng của cơ thể Vì vậy, để đề phòng và chống lại tác hạicủa virus người ta đã tạo ra các loại vacxin và thuốc kháng sinh nhằm tăng cườngsức đề kháng cho cơ thể

Phổ tác động của virus là rất lớn Nó không những tác động đến con người, độngthực vật, thậm chí cả những loài vi sinh vật khác Trong nông học, chúng ta quantâm chủ yếu đến thực vật vì đây là đối tượng chủ yếu trong sản xuất nông nghiệp Theo thống kê, có khoảng 600 loài virus trên thực vật mà con người đã biết đến,trong đó có ít nhất 80 loại có thể truyền qua hạt giống Bệnh virus hại thực vật làmột loại bệnh nguy hiểm, dễ lan truyền qua nhân giống vô tính (do tồn tại trong các

mô sống), qua mô giới truyền bệnh (các loại côn trùng như rệp, bọ phấn, nhện, v.v.),qua tiếp xúc cơ giới (vết cắt, xây xát, v.v.)

Tác hại của virus là vô cùng lớn Nó ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất và phẩmchất của nông sản

Côn trùng Biểu hiện một số bệnh virus

truyền bệnh

* Cơ sở lý luận của phương pháp:

Virus tồn tại ở mọi cơ thể sống Theo White (1934), Limasset & Cornuet (1950),Morel & Martin (1952): nồng độ virus ở mô phân sinh đỉnh rễ, đỉnh chồi và lá baothứ nhất là bằng không sau đó tăng dần ở các lá xa với mô phân sinh ở phía dưới.Như vậy, có thể sử dụng mô phân sinh đỉnh để tạo ra cây sạch virus hoàn toàn từ cây

đã nhiễm bệnh

Gần đây, vào năm 1987 bằng những nghiên cứu của mình, ông Meyer cho thấyphương pháp nuôi cấy meristem để loại virus là hoàn toàn đúng đắn Sự loại virusphụ thuộc rất nhiều sự có mặt của một hay nhiều loại virus xâm nhiễm Ví dụ có thể

sử dụng đỉnh sinh trưởng với kích thước 1-2mm để loại virus chủ yếu hại khoai tây(trừ virus X đòi hỏi kích thước 0,2mm)

Theo nghiên cứu của Mathews (1970) & Wang et Hu (1980) thì hoàn toàn có cơ sởkhẳng định mô phân sinh đỉnh không có virus Theo các ông có thể do các lý do sau:

- Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ mô dẫn, hệ thống này không có trong môphân sinh đỉnh

- Trong sự phân chia, các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sao chép cácthông tin di truyền của virus

- Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng mô phân sinh đỉnh mạnh hơn các vùng kháctrong cây

- Nồng độ auxin cao ở mô phân sinh đỉnh có thể ngăn cản quá trình sao chépvirus

* Kỹ thuật làm sạch virus in vitro:

- Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh: tách chính xác mô phân sinh đỉnh có kích thước

<0,3mm, nuôi cấy chúng trong môi trường dinh dưỡng phù hợp để tái sinh thành câynguyên vẹn Sau đó kiểm tra độ sạch virus ở cây tái sinh bằng các phương pháp khácnhau để thu nhận cây sạch bệnh

- Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý nhiệt độ cao: ở nhiệt độ cao 36-370Cthì một số loài virus không còn khả năng nhân lên Lợi dụng đặc tính này có thể kếthợp phương pháp nuôi cấy mô phân sinh đỉnh với xử lý nhiệt để tẩy sạch virus khỏimẫu Biện pháp này cho phép có thể tách meristem ở kích thước lớn hơn (0,5-

1,0mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lợi hơn so với phương pháp tách ởkích thước 0,1-0,2mm.

Có thể xử lý nhiệt độ cao 35-370C một thời gian dài cho cây mẹ trước khi tách môphân sinh đỉnh (5-10 tuần) Hoặc có thể xử lý các mẫu sau khi đưa vào nuôi cấy invitro ở nhiệt độ 39-400C trong 1-2 tuần Ở nhiệt độ này, thường các mARN của virus

sẽ bị phân giải và cây tái sinh sẽ có độ sạch virus cao

- Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý hóa chất: Khi nuôi cấy mô phân sinh

đỉnh có kích thước 0,5-1,0mm có thể kết hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy các

chất kháng virus để tạo cây sạch bệnh Các chất kháng virus như 2-thiouracil, ribavirin, vidarabin làm tăng kháng của tế bào, mô thực vật và ức chế sự nhân bản

của virus

- Vi ghép: Là kỹ thuật ghép các mô phân sinh đỉnh lên gốc cây sạch và kháng bệnh

trong điều kiện in vitro để sản xuất cây sạch virus Kỹ thuật này thường sử dụng vớicây thân gỗ, đặc biệt họ cam chanh

Một số ứng dụng kỹ thuật làm sạch virus:

 Kỹ thuật tạo củ khoai tây bằng phương pháp in vitro: Một hiện trạng sản xuất

khoai tây là rất dễ bị nhiễm virus do quá trình nhân giống vô tính Vì vậy cần tạo racác giống khoai tây sạch bệnh virus Đó là lý do mà ngày nay khoai tây được nhângiống bằng phương pháp in vitro khá phổ biến Để nhân giống in vitro khoai tây cầnthực hiện các bước sau đây:

+ Bước 1: Chọn cây giống đủ tiêu chuẩn Cây đủ tiêu chuẩn lấy mẫu cso chiềucao 7-10cm, có từ 8-10 lá, cây phải sinh trưởng khỏe, thân mập Thông thường nuôicấy 8-10 cây trong bình 250ml

+ Bước 2: Rót môi trường tạo củ vào các bình 250ml đã chọn Môi trường tạo củgồm MS và 12% saccarose Lượng môi trường cho mỗi bình là 50-70ml

+ Bước 3: Tiến hành nuôi cây giống trong điếu kiện tối hoàn toàn ở nhiệt độ 20-220C

+ Bước 4: Sau 2 tháng cây đã hình thành củ Lúc này tiến hành thu hoạch củ invitrro Như vậy, đã tạo được củ sạch bệnh virus

Cây sau khi nuôi cấy Cây khi hình thành củ

 Nhân giống in vitro hoa đồng tiền: Các bước thực hiện như sau:

+ Bước 1: Khử trùng mẫu Mẫu lấy là các nụ hoa bình thường Nụ hoa được lấy

về sau đó khử trùng bằng HgCl 2 nồng độ 0,1% trong 7 phút

+ Bước 2: Cắt nụ hoa thành các lát mỏng Dùng các lát mỏng này để tạo thể tiềnchồi bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo (MS, 1ppmBA, 0,2ppm Ki,0,2pp IAA)

+ Bước 3: Nhân nhanh chồi mầm Tách thể tiền chồi và nuôi cấy trong môitrường nhân tạo (MS, 1ppm Ki)

+ Bước 4: Tạo cây hoàn chỉnh Sau nhân nhanh tách cây và nuôi trong môitrường nhân tạo (MS, 0,1ppm α-NAA)

+ Bước 5: Sau tạo cây hoàn chỉnh thì đưa cây con ra vườn thích nghi Cây conđược trồng trong giá thể (1 trấu hun + 1 mùn) và đảm bảo những điều kiện tốt nhấtcho cây con phát triển Sau đó cây con được đưa ra vườn sản xuất Tiến hành chămsóc bình thường

Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp

Nụ hoa Tạo thể tiền chồi Nhân nhanh

Vườn ươm Cây giống Vườn sản xuất

* Các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus: Sau khi đã nuôi cấy thành công cây

sạch bệnh thì việc nhân nhanh và duy trì nguồn giống sạch bệnh là vô cùng quantrọng Chính vì vậy, ở giai đoạn này việc chuẩn đoán bệnh virus tái nhiễm là khôngviệc không thể thiếu, để từ đó phát hiện ra các cá thể nhiễm bệnh và loại ra khỏinguồn giống Có một số phương pháp chuẩn đoán bệnh virus như sau:

- Phương pháp chuẩn đoán bằng mắt (thông qua triệu chứng bệnh): Đây là

phương pháp đơn giản nhất cho phép có thể xác định bệnh virus thông qua biểu hiệncủa cây trồng Phương pháp này đòi hỏi phải có kinh nghiệm quan sát và so sánh do

có thể nhầm lẫn với một số loại bệnh không phải virus gây ra Phương pháp nàycũng không thể cho phép xác định chính xác loại bệnh virus đang nhiễm

- Phương pháp chuẩn đoán bằng cây chỉ thị: Vào những năm 1940, phương pháp

này được coi là phương pháp nhạy và chính xác nhất để xác định bệnh virus Nhờphương pháp này đã xác định được 2 virus phổ biến là X và A (Leviel 1986).Phương pháp này dựa trên những biểu hiện đặc trưng của cây chỉ thị khi nhiễmbệnh Người ta đã tìm ra khoảng 200 cây chỉ thị chủ yếu thuộc họ cà (Solanaceae),

họ rau dền (Amaranthaceae), họ rau muối (Chenopodaceae), họ đậu (Fabaceae), họcúc (Asteraceae), trong đó họ cà chiếm ưu thế Tuy nhiên phương pháp này vẫn bộc

lộ một số nhược điểm như:

+ Thời gian chuẩn đoán kéo dài do phải qua một quá trình ủ bệnh mới xuất hiệntriệu chứng

+ Việc xuất hiện các triệu chứng đặc trưng còn phụ thuộc vào điều kiện thínghiệm như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, v.v

+ Phương pháp lây nhiễm cho cây chỉ thị khá phức tạp, có loại phải truyền quacôn trùng truyền bệnh (các vecto truyền bệnh) rất phức tạp

+ Tốn khá nhiều công để trồng trọt, chăm sóc cây chỉ thị, nuôi dưỡng côn trùngtruyền bệnh Cần có nhà nuôi cấy cách ly Kinh phí đầu tư lớn

+ Việc chuẩn đoán bệnh cuốn lá bằng phương pháp này khó tiến hành

+ Phương pháp này chỉ sử dụng khi số lượng cá thể ít

Ví dụ như bệnh hoa lá dưa leo (Cucumic Mosaic Virus) sử dụng cây chỉ thị là cây

Chenopodium quinoa.

- Phương pháp huyết thanh: Phương pháp này được đánh giá là nhanh và hiệu quả.

Có thể cho kết quả sau 48 giờ Do đó chi phí cho xét nghiệm là ít Muốn xem phảnứng huyết thanh người ta trộng lẫn huyết thanh đặc hiệu cho mỗi loại virus với dịchcây cần chuẩn đoán bệnh Kết quả thu được kết tủa ở dạng bông hay dạng mây mờ(phản ứng kháng nguyên + kháng thể) Phương pháp này đã có nhiều cải tiến nhưlàm sạch protein virus trước khi tiêm vào thỏ; tạo ra kháng thể đơn dòng có tính đặchiệu rất cao đã nâng cao chất lượng của huyết thanh

- Phương pháp chuẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử: Kính hiển vi điện tử có độ

phóng đại từ một đến hàng chục vạn lần, có thẻ quan sát được các sợi, thể hạt củavirus Tuy nhiên phương pháp này còn hạn chế do:

+ Chi phí cho thiết bị khá lớn

+ Số lượng mẫu hạn chế, phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu khá phức tạp

+ Không phát hiện được virus cầu do chúng khá giống cơ quan tử của tế bào

- Phương pháp chuẩn đoán bằng test ELISA (enzym linked immunosorbent assay):

Test ELISA là một tiến bộ trong lĩnh vực chuẩn đoán bệnh virus hại cây trồng.Phương pháp có độ đặc hiệu cao Chính xác, nhậy, nhanh, dễ tiến hành nên nhanhchóng trở thành phương pháp thông dụng

Test ELISA được Enguall và Permann (1971;1972) đề cập đầu tiên trong lĩnh vựcnhân y Từ năm 1986 nó được sử dụng như một test có độ nhạy rất cao để chuẩnđoán virus ở thực vật (Clark, Adams và Barbara 1976) Với khả năng phát hiện

nhạy, mọi virus nhất là virus cuốn lá hại khoai tây (nồng độ thấp), phương pháp này

là tốt nhất, dễ sử dụng (Casper 1977)

Nguyên lý của phương pháp vẫn dựa vào phản ứng kháng nguyên và kháng thể,nhưng kháng thể được liên kết với một enzym (enzym linked) Phức enzym – khángthể- kháng nguyên sẽ dễ nhận biết do một phản ứng màu nhờ hính sự có mặt củaemzym xúc tác Phản ứng màu thường là sử dụng các phản ứng phân giải 4-nitrophenolphosphat bởi photphataza Khi tách phosphat, α-nitrophenol sẽ có màuvàng Mỗi enzym có thể xúc tác cho hàng ngàn phân tử cơ chất nên tín hiệu màuđược khuếch đại rất rõ Phản ứng test được tiến hành khi gắn trên các mặt bản thửplastic, nên có tên gọi là immunosorbent Như vậy, trên bản thử lỗ nào có màu vàng,nơi ấy có mặt phức kháng nguyên – kháng thể - enzym, tức là có virus Cho đến nay

có thể nói test ELISA là công cụ chính trong việc chuẩn đoán bệnh virus Bằngphương pháp ELISA có thể chuẩn đoán chính xác cả mặt định tính và định lượng

- Chuẩn đoán bằng kỹ thuật phân tích ADN:

Phương pháp này cho kết quả nhanh và chính xác Phương pháp thông dụng gọi làphương pháp PCR

Nguyên lý chung của phương pháp là xác định trực tiếp sự có mặt của phần lõi axitnucleic của virus Phần lõi này có trình tự rất đặc hiệu tùy theo mỗi loại virus Từ đó

mà có thể là phát hiện trực tiếp qua bảng phản ứng PCR Sử dụng các cặp mồi là cácđoạn nucleotid (dài từ 10-30 nu) có trình tự bổ sung với hai đầu (phía 3’) của hai sợiđoạn ADN cần nhân Sau thời gian cho phản ứng trên máy PCR khoảng 3 giờ có thểlấy mẫu và đánh giá kết quả Nếu mẫu sạch virus tức là không có khuôn ADN củavirus thì cặp mồi không bắt cặp, quá trình nhân ADN không xảy ra Còn ở mẫubệnh, sự nhân ADN diễn ra mạnh mẽ (sau 30 chu kỳ có thể nhân hàng trăn triệuđoạn ADN) Có thể nhận biết ADN qua phương pháp điện di Từ đây cso thể kếtluận mẫu có nhiễm bệnh hay không Tuy nhiên, một số virus có cấu tạo phần axitnucleic là ARN, trong trường hợp này cần phải chuyển ARN virus sang dạng ADN(cADN) sau đó phát hiện ADN này bằng phương pháp PCR

Phương pháp này được coi là vũ khí vô cùng lợi hại của con người Phương phápnày có thể phát hiện virus ở nồng độ rất thấp với độ chính xác rất cao Chính vì vậy,phương pháp này đã được ứng dụng rất nhiều trong công nghệ sản xuất các giốngsạch bệnh virrus hiện nay

Chuyên đề 5:

Trình bày kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro và ứng dụng của chúng trong công tác giống cây trồng?

o 0 o

* Khái niệm về cây đơn bội:

Các cây trồng khác nhau thường có mức bội thể khác nhau Có thể là đơn bội (n),lưỡng bội (2n), tứ bội (4n), v.v Tuy nhiên phổ biến trong tự nhiên là lưỡng bội (2n)

và tứ bội (4n) Như vậy, với các loại cây trồng này kiểu hình thể hiện ra ngoài là sựtác động tổng hợp của nhiều kiểu gen, phụ thuộc và tính trạng là lặn hay trội Trongcông tác chọn giống người chú ý nhiều tới thể đơn bội (n), bởi lẽ cây trồng ở dạngđơn bội thường rất khó tồn tại trong tự nhiên Nó chỉ sống được trong điều kiện nhântạo của con người Cây đơn bội mang bộ NST (n), vì vậy để cho nó sống được người

ta phải tiến hành đồng hợp tử tuyệt đối, tức là tạo ra alen hoàn toàn giống nhau.Những biểu hiện của cây đơn bội (kiểu hình) thể hiện chính xác kiểu gen mà nóđang có, kể cả các gen lặn Đây sẽ là nguồn vật liệu di truyền vô cùng quý giá trongcông tác chọn giống

* Các đường hướng tạo cây đơn bội:

Cơ thể thực vật trong tự nhiên chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế bàođơn bội Nếu như chúng phát triển thành cây thì cây đó có mức bội thể đơn bội (n).Tuy nhiên trong tự nhiên rất hiếm gặp các cây đơn bội, vì vậy các nhà khoa học đãtiến hành nghien cứu bằng các con đường khác nhau nhằm tạo ra cây đơn bội làmnguồn vật liệu cho công tác chọn giống Vào năm 1924, Blakeslee và cộng sự đãchứng minh được rằng có thể thu được các dòng nhị bội thuần đồng hợp bằng cáchnhị bội hóa các thể đơn bội Đến năm 1964, hai ông Guka & Maheshwari (Ấn Độ)

đã lần đầu tiên tạo thành công cây đơn bội bằng nuôi cây bao phấn cà độc dược.Tiếp sau đó với các đóng góp của Nitsch và Noieel (1973-1976) đã càng khẳng địnhviệc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy là hoàn toàn có thể thành công Cho đếnnay, đã có khoảng 170 loài cây trồng được tạo ra bằng con đường đơn bội

Việc tạo cây đơn bội có thể có nhiều hướng khác nhau:

- Tạo cây đơn bội (dòng thuần) bằng con đường tự phối Đây là một hướng có thểcoi là thủ công và rất mất thời gian Thường phải mất đến 5-7 thế hệ mới tạo đượcdạng đồng hợp tử Đây cũng là một phương pháp khó thực hiện và tốn kém

- Tạo cây đơn bội bằng in vitro Đây là phương pháp chiếm ưu thế bởi sự tiệndụng và nhanh chóng của phương pháp này Chỉ mất 1 thế hệ để tạo ra cây đơn bội

Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua việc kích thích tiểu bào tử phát triểnthành cây khi nuôi cấy bao phấn, hạt phấn và gần đây, người ta còn nuôi cây kíchthích các tế bào trứng (noãn chưa thụ tinh) phát triển thành cây đơn bội Đặc biệt vớicây ngô đã nhanh chóng tạo hàng loạt cây đơn bội ứng dụng trong công tác giốngcây trồng

* Khả năng ứng dụng trong nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống cây trồng:

Cây đơn bội có thể ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau:

- Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen

- Tạo đột biến ở mức đơn bội

- Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ công tác giống cây trồng

Sơ đồ các hướng ứng dụng cây đơn bội:

Dòng thuần ổn định (F1, F2)

Chọn giống ưu thế lai

dòng đồng hợp tử tuyệt đối

Nhị bội hóa số lượng NST(Tự phát, xử lý, colchicine)

Cá thể đơn bội

Lai với các thể đơn bội khác

bằng dung hợp tế bào trần Nuôi cây tế bào trần

(lai Soma) của các thể đơn bội

Gây đột biến, chọn lọc in vitro

Tái sinh cây

Nguyên liệu khởi đầucho chọn giống

* Kỹ thuật tạo cây đơn bội:

- Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn:

+ Nguyên lý:

Nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứacác hạt phấn đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thíchcác hạt phấn này phát triển thành cây đơn bội

Sự phát sinh cây đơn bội từ hạt phấn được gọi là sự sinh sản đơn tính đực(androgensis) Khi nuôi cấy hạt phấn đơn nhân in vitro có thể có 3 phương thức sinhsản đơn tính đực như sau:

 Sinh sản đơn tính đực trực tiếp như ở thuốc lá, cà độc dược Khi đó hạt phấnđơn nhân (tiểu bào tử) tạo phôi 1n, phôi này sẽ phát triển thành cơ thể 1n (cây 1n)  Sinh sản đơn tính đực gián tiếp như ở lúa, ngô Khi đó hạt phấn đơn nhân (tiểubào tử) tạo mô sẹo 1n, nhân nhanh thành chồi 1n, phát triển thành cây 1n

 Sinh sản đơn tính đực hỗn hợp: Qua trình này diễn ra tương tự như sinh sản đơntính đực gián tiếp, nhưng sự thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết như ở cây cà chua + Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn:

Bước 1: Chọn bao phấn Giai đoạn phát triển của hạt phấn có vai trò quyết địnhtrong việc tạo cây đơn bội, tốt nhất là hạt phấn ở giai đoạn sắp phân bào giảm nhiễmlần một Bao phấn của những hoa đầu tiên của cây cho kết quả cao hơn hoa muộn Bước 2: Xử lý nụ hoa Xử lý nhiệt độ thấp cho nụ hoa sau khi cắt khỏi cây vàtrước khi tách bao phấn để cấy sẽ kích thích sự phân chia của tiểu bào tử để tạo câyđơn bội Chế độ xử lý lạnh phụ thuộc vào loại cây Ví dụ: lúa Japonica xử lý ở 100Ctrong 2-3 tuần; lúa Indica xử lý ở 70C trong 1 tuần; thuốc lá xử ý ở 2-3 ngày

Bước 3: Chọn môi trường thích hợp Môi trường nuôi cấy thích hợp là điều vôcùng quan trọng Với mỗi loại cây trồng khác nhau thì lại có môi trường thích hợpkhác nhau Chẳng hạn, với họ hòa thảo cần nhiều auxin, đặc biệt 2,4 D ở nồng độcao để khởi động sự phân chia đầu tiên (lúc mì 10-5mol 2,4 D trong 12 ngày); Cây

họ cà cần ít hơn, khoảng 10-6mol Về hàm lượng đường cũng khác nhau, ở ngô là 120g saccarose/l, lúa 50-60 g saccarose/l, cây họ cà 20-40g saccarose/l, v.v Ngoài ramột số hỗn hợp tự nhiên như dịch chiết khoai tây, nước dừa tỏ ra có tác dụng tốttrong nuôi cấy bao phấn Còn các nguyên tố đa lượng và vi lượng ít ảnh hưởngtrong nuôi cấy bao phấn

Bước 4: Chọn lọc cây đơn bội Không phải tất cả các cây tái sinh khi nuôi cấy baophấn đều là cây đơn bội, vì vậy để xác định cây đơn bội có thể sử dụng một sốphương pháp như đếm số lượng NST, đo gián tiếp hàm lượng ADN của tế bào, trồngcây tái sinh và so sánh với cây mẹ về hình thái, kích thước, khả năng sinh trưởng + Kỹ thuật nuôi cây cấy hạt phấn: Các bước nuôi cấy hạt phấn tương tự như nuôicấy bao phấn, tuy nhiên hạt phấn được rời khỏi bao phấn trước khi nuôi Các hạtphấn này thước được nuôi cấy trong môi trường lỏng kèm theo chế độ lắc hay nuôicấy trong môi trường bán lỏng

Sơ đồ tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn:

Cây đơn bội

môi trường dinh dưỡng đặc hiệu

- Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh:

Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh gọi là sự sinh sản đơn tính cái haytrinh nữ sinh (gynogensis)

Đã có nhiều thành công trong việc nuôi cây bao phấn và hạt phấn để tạo cây đơnbội Tuy nhiên, khi đi sâu vào nghiên cứu và thực hiện người ta thấy rằng, nuôi cấybằng bao phấn và hạt phấn đã bộc lộ nhiều nhược điểm như tỷ lệ bạch tạng là rấtcao Đặc biệt với các loại cây như hành, củ cải đường, hướng dương, v.v đã khôngcho kết quả như mong muốn Trên cơ sở đó, vòa những năm 70 các nhà khoa học đãtập trung nghiên cứu giải quyết cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh và đãthu được nhiều thành tựu

Tỷ lệ tạo cây đơn bội bằng trinh nữ sinh biến động ở các loại cây khác nhau Đốivới hành, củ cải đường tỷ lệ này là 5-20%; ở lúa là 1,5-12%; ở dâu tằm là 3-6%, …Tuy nhiên kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn nhiều khó khăn và phức tạp doviệc tách tế bào trứng rất khó và dễ gây thương tổn Nhằm tăng hiệu quả của quátrình này, người ta tập trung nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen cây mẹ, giai đoạnphát triển của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi cấy, …

Trong các cây ngũ cốc, ở cây ngô việc nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tương đối đơngiản và thu được nhiều thành công hơn cả.

Chuyên đề 6 Kỹ thuật tách, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần (protoplast)

o 0

a Khái niệm tế bào trần

Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào chỉ còn phầnnguyên sinh chất, nhân, các cơ quan tử khác và màng sinh chất là ranh giới phân biệtbên trong và bên ngoài tế bào trần

- Nồng độ chất áp suất thẩm thấu và thời gian lưu giữ tối đa thay đổi cho phù hợpvới từng loại cây trồng

Đây là phương pháp dùng phổ biến và có hiệu quả cao: Có thể thu được từ 1g látươi có thể thu được 6÷12 triệu tế bào trần

* Các bước tiến hành

- Chọn nguyên liệu: ex ivtro: mô lá non (cần phải khử trùng), in vitro: lá, mô sẹo,

tế bào huyền phù

- Xử lý gây co nguyên sinh chất (CaCl2, đường monitol …0,5÷0,7M)

- Xử lý hỗn hợp enzym cellulolaza và hemicellulolaza, pectinaza

Thời gian ủ: 4÷12h (ngâm qua đêm)

Các tế bào trần sau khi tách thành tế bào được lọc qua rây có kích thước 50÷80μm,m,rồi rửa bằng dung dịchkhông có enzym bằng ly tâm

c Quá trình tái sinh của tế bào trần và các yếu tố ảnh hưởng

* Quá trình tái sinh:

- Nuôi cấy protoplast: thường chia 2 giai đoạn

+ Giai đoạn 1: Nuôi cấy để protoplast tái sinh thành (vỏ) tế bào và phân chiatạo thành cụm nhỏ tế bào (4÷10 tế bào): nuôi cấy trong tối hay trong điều kiện ánhsáng yếu, trong môi trường lỏng có lắc hoặc bán lỏng Môi trương cần giàu dinhdưỡng và áp suất thẩm thấu phù hợp Nhiều trường hợp cần dùng lớp nuôi trợdưỡng

+ Giai đoạn 2: Nuôi cấy tạo mô sạo ổn định và tái sinh cây hoàn chỉnh: nuôicấy trong điều kiện chiếu sáng tốt với quang chu kỳ phù hợp, trên môi trường đặc.Cần chú ý tới tỷ lệ và hàm lượng Auxin và xytokinin để tái được cây từ callus

- Có hai con đường phát sinh hình thái trong quá trình hình thành cây hoàn chỉnhđối với các tế bào có nguồn gốc protoplast:

+ Thông qua quá trình phát sinh cơ quan (organogenesis), ví dụ tế bàoprotoplast có nguồn gốc từ mô thịt lá của cây thuốc lá

+ Thông qua con đường phát sinh phôi soma (somatic embryogenesis), ví dụcác tế bào protoplast có nguồn gốc từ các tế bào phôi được nuôi cấy dạng huyền phùmột số loài cây thuộc họ hoà thảo

Nếu đảm bảo được môi trường nuôi cấy phù hợp, thì phôi và các mô phân sinh sẽhình thành sau khoảng 3÷5 tuần Nhưng nếu điều kiện nuôi cấy không tối ưu, cácbiến đổi di truyền có thể xảy ra Ví dụ, trong một số nghiên cứu nuôi cấy protoplast

từ cây khoai tây, tần số cây 2n được tái sinh chỉ khoảng 10%, con lai là cây 4n

Embryogenesi s

Protoplast tái sinh vỏ tế bào

và phân chia tạo microcallus Callus phát triển từ microcallus

Callus trên môi trường tái sinh

* Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của tế bào trần

- Nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu một số thay đổi so với quy trình nuôi cấy

mô bình thường như: sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu

cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng đểkích thích sự phân chia tế bào

+ Ammonium nitrate, Calcium: kích thích sự phân chia tế bào

+ Bổ sung các thành phần hữu cơ: insitol, nicotinic acid, pyridoxine, thiamin,glycine, fonic acid và biotin

+ Casein hydrolysate, D-Ca- pantothenate, choline chloride, cysteine, malicacid, ascorbic acid, adenine sulfate, riboflavin và glutamine: có tác dụng tăng nhanh

sự tổng hợp vỏ tế bào và kích thích sự phân chia tế bào

+ Auxin (NAA và 2,4D 0,45÷10,7μm,M) và Cytokinin (BA, zeatin 2÷5μm,M;nước dừa 20÷40ml/l

+ Đường manitol, sorbitol 0,3÷0,7M; Sucrose và glucose 0,2÷0,6M

- Điều kiện nuôi cấy

+ Cường độ chiếu sáng: nuôi cấy protoplast trong tối hoặc trong điều kiện ánhsáng đã lọc bớt

+ Chất lượng ánh sáng: ánh sáng trắng là tốt nhất, ánh sáng xanh và đỏ gây ứcchế sự hình thành chồi

+ Nhiệt độ: các protoplast thường được nuôi cấy ở 20÷250C

* Dung hợp protoplast: có 2 phương pháp

+ Năm 1974, Kao phát hiện ra PEG (polyethylenglycol) có tác dụng làm tănghiệu quả dung hợp của protoplast Khi được ngâm vào dung dịch PEG (20÷40%w/v), các protoplast kết dính lại với nhau Sau đó, PEG được rửa bằng dung dịchCa2+ có độ pH cao, màng nguyên sinh chất ở chỗ tiếp xúc sẽ vỡ ra và các protoplast

sẽ dung hợp với nhau Do PEG độc với tế bào, nồng độ PEG thường được giảm đi

và bổ sung thêm vào đó DMSO (dimethyl sulfuside)

- Dung hợp bằng xung điện: đưa dung dịch hỗn hợp tế bào trần vào một điệntrường, các tế bào trần sẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi giữa hai bản cực Khi có mộtxung điện cao (750÷1000V) trong một thời gian rất ngắn (1÷200 mili giây) vùng tiếpxúc giữa hai màng tế bào sẽ bị vỡ, hai tế bào trần hoà nhập vào nhau - qua trìnhdung hợp sẽ xảy ra

trong các test thanh lọc sẽ được tái sinh thành cây để khảo sát tính chống chịu củachúng.

- Một số hệ thống chọn lọc:

+ Chọn lọc dòng tế bào kháng kháng sinh, các dòng tế bào kháng sâu bệnh,chịu thuốc trừ cỏ, chịu điều kiện bất thuận, và các dòng tế bào có khả năng sinhtrưởng trên các amono acid đặc thù trong số những acid amin khác

+ Chọn các dòng tế bào có khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp

* Biến nạp di truyền

- Nhận biết gen thông qua chức năng sinh học ( tính trạng liên quan đến đặc điểmhình thái, đặc điểm chức năng…) Xác định điều kiện đặc trưng cho quá trình biểuhiện và kìm hãm gen

- Gen gắn với các vectơ: thông thường người ta sử dụng các loại plasmid manggen kháng sinh để tiện lợi cho việc chọn lọc sản phẩm biến nạp sau này

- Chuyển gen vào protoplast: có nhiều phương pháp chuyển gen bằng hoá học,xung điện, súng bắn gen, thông qua vi khuẩn Agrobacterium

- Chọn lọc sản phẩm biến nạp

- Đánh giá kết quả và theo dõi biểu hiện của gen biến nạp

Protoplast ngay sau khi tách

Tế bào lai soma mang đặc của cả hai giống, loài A và B