Kỹ thuật nhân giống in vitro

Kỹ thuật nhân giống in vitro

Lớp Cây trồng 49C - Nhóm Công nghệ sinh häc n«ng nghiƯp Chun đề Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro o o -Nuôi cấy mô tế bào thực vật phạm trù khái niệm chung cho loại ni cấy ngun liệu thực vật hồn tồn vi sinh vật, mơi trường dinh dưỡng nhân tạo, điều kiện vô trùng Nhân giống vơ tính trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) lĩnh vực ứng dụng có hiệu trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Bao gồm: + Nuôi cấy trưởng thành + Nuôi cấy quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, nỗn chưa thụ tinh + Ni cấy phôi: phôi non phôi trưởng thành + Nuôi cấy mô sẹo (callus) + Nuôi cấy tế bào đơn + Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu tách vỏ gọi nuôi cấy tế bào trần Đây phương pháp nhân giống đại thực phịng thí nghiệm nên gọi phương pháp nhân giống ống nghiệm (in vitro) để phân biệt với trình ni cấy điều kiện tự nhiên ngồi ống nghiệm (in vivo) Khác vối phương pháp nhân giống truyền thống giâm, chiết cành ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả thời gian ngắn tạo số lượng lớn để phủ kín diện tích đất định mà phương pháp nhân giống khác thay Ngồi phương pháp khơng phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên tiến hành quanh năm Đây hướng ứng dụng rộng rãi Ở Việt Nam có nhiều phịng thí nghiệm ni cấy mơ, nhiều trung tâm sản xuất giống trồng hàng năm cung cấp lượng đáng kể giống có chất lượng cao cho sản xuất chuối, dứa, khoai tây, loại lan, cảnh, lâm nghiệp *Cơ sở khoa học Kỹ thuật ni cấy mơ tế bào (tissue culture) nói chung kỹ thuật nhân giống vơ tính nói riêng dựa vào sở khoa học tính tồn năng, phân hố phản phân hố - Tính tồn tế bào: Haberland (1902) lần quan niệm tế bào thể sinh vật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành thể hoàn chỉnh Theo quan điểm sinh học đại tế bào chun hố chứa lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông tin di truyền thể trưởng thành Vì vậy, điều kiện định tế bào Líp C©y trång 49C - Nhãm C«ng nghƯ sinh häc n«ng nghiƯp phát triển thành thể hồn chỉnh Đặc tính tế bào gọi tính tồn tế bào Qua người ta biến tế bào (hoặc mẩu mô) thành thể hồn chỉnh ni cấy mơi trường thích hợp có đầy đủ điều kiện cần thiết cho tế bào thực trình phân hố, phản phân hố - Tính phân hố phản phân hố tế bào + Tính phân hố tế bào biến đổi tế bào phôi sinh thành tế bào mô chuyên hoá đảm nhiệm chực khác Trong thể thực vật có khoảng 15 loại mơ khác đảm nhiệm chức khác (mô dậu, mô dẫn, mơ bì, mơ khuyết…) chúng có nguồn gốc từ tế bào môi sinh trải qua giai đoạn phân hố tế bào để hình thành mơ riêng biệt + Tính phản phân hố tế bào: dó tế bào phân hố thành mô riêng biệt với chức khác điều kiện định chúng quay trở trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào Trong kỹ thuật nuôi cấy quan dinh dưỡng lá, thân…thì giai đoạn tạo mơ sẹo tế bào quay trở trạng thái phơi sinh có khả phân chia liên tục mà hẳn chức quan dinh dưỡng lá, thân… trước Sự phân hố phản phân hố tế bào phơi sinh tế bào chuyên hoá biểu diễn theo sơ đồ sau: Phân hố tế bào Tế bào phơi sinh Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá tế bào Về chất phân hoá phản phân hoá trình hoạt hố gen, thời điểm q trình phát triển thể số gen hoạt hoá số gen khác bị ức chế Điều xảy theo chương trình mã hố cấu trúc phân tử ADN Khi nằm thể hoàn chỉnh tế bào có ức chế lẫn nhau, tách rời điều kiện định gen hoạt hố dễ dàng nên chúng có khả mở tất gen để hình thành thể Đó sở làm tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào *Các ứng dụng Đây lĩnh vực mà nuôi cấy mô tế bào thực vật mang lại hiệu kinh tế to lớn thực Một ưu việt phương pháp nhân giống in vitro việc sử dụng mô nuôi cấy kích thước nhỏ Ở kích thước nhỏ, tương tác tế bào mô đơn giản Tác động phương pháp hiệu Mơ ni cáy dễ phân hố sau dễ tái sinh Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có ưu việt mà phương pháp khác khơng có là: nhân giống trồng quy mô công nghiệp (kể i Lớp Cây trồng 49C - Nhóm Công nghƯ sinh häc n«ng nghiƯp tượng khó nhân phương pháp thơng thường), phương pháp có hệ số nhân cao cho cá thể hoàn toàn đồng mặt di truyền Ứng dụng: - Duy trì nhân nhanh kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống - Nhân nhanh trì cá thể đầu dịng tốt để cung cấp giống loại trống khác + Nhân nhanh lồi hoa, cảnh khó trồng hạt + Duy trì nhân nhanh dòng bố mẹ dòng lai để tạo hạt giống rau, hoa loại trồng khác + Nhân nhanh kết hợp với làm virus + Bảo quản tạp đoàn gen, đặc biệt với loại dễ bị nhiếm bệnh điều kiện tự nhiên, hoặccác dễ bị giao phấn Với phương pháp nhiều giống hoa (hoa lan, cẩm chướng, đồng tiền, cúc…), lương thực thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cọ dầu, mía, cà phê…), ăn (chuối, dứa, dâu tây…), lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai, dứa sợi…) phổ biến nhanh vào sản xuất *Các bước nhân giống in vitro Bước 1: Chọn lọc chuẩn bị mẹ Trược tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cần bệnh, đặc biệt bệnh virus giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng mẹ điều kiện mơi trường thích hợp với chế độ chăm sóc phịng trừ sâu bệnh hiệu truớc lấy mẫu làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả sống sinh trưởng mẫu cấy in vitro Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn cần đảm bảo yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn sinh trưởng tốt Kết giai đoạn phụ thuộc vào nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào mục đích khác nhau, loại khác để nuôi cấy phù hợp Khi lấy mẫu cần chọn mô, giai đoạn phát triển cây, quan trọng đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đỉnh chồi hoa cuối đoạn thân, mảnh Ví dụ: Vật liệu ni cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro Măng tây: chồi (Kohter, 1975) Khoai tây: mầm (Morel, 1952) Dứa: chồi nách, chồi đỉnh (Paunethier, 1976) Bắp cải: mảnh (Bimomilo, 1975) Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978) Cần thiết phải khử trùng mẫu trước đưa vào nuôi cấy hoá chất khử trùng để loại bỏ vi sinh vật bám bề mặt mẫu cấy Chọn phương pháp khử trùng đưa lại tỷ lệ sống cao chọn mơi trường dinh dưỡng thích hợp đạt Líp C©y trång 49C - Nhãm C«ng nghƯ sinh häc n«ng nghiƯp tốc độ sinh trưởng nhanh Thường dùng chất: HgCl 0.1% xử lý 5-10 phút, NaOCl Ca(OCl)2 5-7% xử lý 15-20 phút, H2O2, dung dịch Br… Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến: Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige Skoog (1962) Chất hữu cơ: đường sarcaroza Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Xytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin (GA3) Bước 3: nhân nhanh Mục đích cảu giai đoạn kích thích phát triển hình thái tăng nhanh số lượng chồi đơn vị mẫu cấy thời gian định thông qua đường: hoạt hố chồi nách, tạo chồi bất định tạo phơi vơ tính Vật liệu khởi đầu in vitro chuyển sang mơi trường nhân nhanh có bổ sung chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù chồi thành nhiều chồi Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ống nghiệm Vấn đề phải xác định môi trường điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu cao Chế độ nuôi cấy thường 25-270C 16 chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím thành phần quan trọng để kích thích phân hoá chồi (Weiss Jaffe, 1969) Tuy nhiên với đối tượng ni cấy địi hỏi chế độ ni cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng giờ/ngày, nhân phong lan Phalenopsis giai đoạn đầu cần che tối… Bước 4: Tạo in vitro hoàn chỉnh Kết thúc giai đoạn nhân nhanh có số lượng chồi lớn chưa hình thành hồn chỉnh chưa có rễ Vì vậy, cần chuyển từ mơi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Tách chồi riêng cấy chuyển vào mơi trường ni cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin Mỗi chồi rễ thành hoàn chỉnh Một số loại phát sinh rễ sau chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng Đối với phôi vơ tính cần cấy chúng mơi trường khơng có chất điều tiết sinh trưởng mơi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp phơi phát triển thành hồn chỉnh Bước 5: Thích ứng in vitro điều kiện tự nhiên Để đưa từ ống nghiệm vườn ươm với tỷ lệ sống cao, sinh trưởng tốt cần đảm bảo số yêu cầu: - Cây ống nghiệm đạt tiêu chuẩn hình thái định (số lá, số rễ, chiều cao cây…) - Cần có thời gian huấn luyện (từ 1-2 tuần tuỳ loại cây) để thích nghi với thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh cách đặt bình ngồi điều kiênj tự nhiên, mở nắp bình ni… Líp C©y trång 49C - Nhãm C«ng nghƯ sinh häc n«ng nghiƯp - Có giá thể tiếp nhận in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoat nước Phải chủ động điều chỉnh độ ẩm, chiếu sánh vườn ươm có chế độ dinh dưỡng thích hợp * Các phương pháp nhân giống in vitro Tất phương pháp nhân giống in vitro có ưu, nhược điểm sau: * Ưu điểm - Phương pháp nhân giống in vitro có khả hình thành số lượng giống từ mô, quan với kích thước nhỏ khoảng 0.1-10mm Trong phương pháp nhân giống truyền thống để tạo thành giống, phải sử dụng phần quan dinh dưỡng với kích thước từ 5-20cm - Hoàn toàn tiến hành điều kiện vô trùng nên giống tạo đựoc không bị nhiễm bệnh từ mơi trường bên ngồi - Sử dụng vật liệu virus có khả nhân nhanh số lượng giống virus - Hoàn toàn chủ động điều chỉnh tác nhân, điều chỉnh khả tái sinh thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều tiết sinh trưởng… theo ý muốn - Hệ số nhân giống cao nên sản xuất số lượng giống thời gian ngắn Hệ số nhân giống loại nằm khoảng 6-1012/năm, khơng có kỹ thuật nhân giống vơ tính khác lại có hệ số nhân giống cao - Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu chi phối điều kiện ngoại cảnh thời vụ Líp C©y trång 49C - Nhãm C«ng nghƯ sinh häc n«ng nghiƯp - Cây giống in vitro chưa có nhu cầu sử dụng bảo quản thời gian dài điều kiện in vitro * Nhược điểm - Mặc dù có hệ số nhân giống lớn giống tạo cí kích thước nhỏ đơi xuất dạng không mong muốn - Cây giống in vitro cung cấp nguồn hydrat cacbon nhân tạo nên khả tự tổng hợp hợp chất hữu Đồng thời giống in vitro ni dưỡng bình thuỷ tinh bình nhựa nên đọ ẩm khơng khí thường bão hồ Do trồng điều kiện tự nhiên thường bi cân nước, gây tượng bị héo chết Vì trước chuyển từ điều kiện in vitro điều kiện in vivo cần phải trải qua giai đoạn huấn luyện để quen dần với điều kiện bên ngồi có độ ẩm khơng khí thấp ánh sáng mạnh - Cần trang thiết bị đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao - Những vấn đề tồn vi nhân giống + Tính bất định mặt di truyền + Sự nhiễm mẫu + Việc sản sinh hợp chất độc từ mơ ni cấy + Hiện tượng thuỷ tinh hố Lớp Cây trồng 49C - Nhóm Công nghệ sinh häc n«ng nghiƯp Chun đề 4: Vì nuôi cấy mô phân sinh (meristem) để tạo virus? Các bước điều kiện cần thiết hệ thống sản xuất giống bệnh? - o o * Tác hại virus: Trong giới lồi sinh vật giới lồi vi sinh vật vơ đa dạng phức tạp mà đến nhiều loài mà người chưa biết đến Người ta thường phân vi sinh vật thành loại vi sinh vật có tác dụng tốt cho người vi sinh vật có hại cho người Trong giới vi sinh vật virus loại nguy hiểm Đối với người loài động thực vật khác nhiễm bệnh virus khơng có loại thuốc chữa được, mà phụ thuộc vào khả đề kháng thể Vì vậy, để đề phịng chống lại tác hại virus người ta tạo loại vacxin thuốc kháng sinh nhằm tăng cường sức đề kháng cho thể Phổ tác động virus lớn Nó khơng tác động đến người, động thực vật, chí lồi vi sinh vật khác Trong nông học, quan tâm chủ yếu đến thực vật đối tượng chủ yếu sản xuất nông nghiệp Theo thống kê, có khoảng 600 lồi virus thực vật mà người biết đến, có 80 loại truyền qua hạt giống Bệnh virus hại thực vật loại bệnh nguy hiểm, dễ lan truyền qua nhân giống vơ tính (do tồn mô sống), qua mô giới truyền bệnh (các loại côn trùng rệp, bọ phấn, nhện, v.v.), qua tiếp xúc giới (vết cắt, xây xát, v.v.) Tác hại virus vơ lớn Nó ảnh hưởng trực tiếp tới suất phẩm chất nông sản Côn trùng truyền bệnh Biểu số bệnh virus Lớp Cây trồng 49C - Nhóm Công nghƯ sinh häc n«ng nghiƯp * Cơ sở lý luận phương pháp: Virus tồn thể sống Theo White (1934), Limasset & Cornuet (1950), Morel & Martin (1952): nồng độ virus mô phân sinh đỉnh rễ, đỉnh chồi bao thứ khơng sau tăng dần xa với mơ phân sinh phía Như vậy, sử dụng mô phân sinh đỉnh để tạo virus hoàn toàn từ nhiễm bệnh Gần đây, vào năm 1987 nghiên cứu mình, ông Meyer cho thấy phương pháp nuôi cấy meristem để loại virus hoàn toàn đắn Sự loại virus phụ thuộc nhiều có mặt hay nhiều loại virus xâm nhiễm Ví dụ sử dụng đỉnh sinh trưởng với kích thước 1-2mm để loại virus chủ yếu hại khoai tây (trừ virus X đòi hỏi kích thước 0,2mm) Theo nghiên cứu Mathews (1970) & Wang et Hu (1980) hồn tồn có sở khẳng định mơ phân sinh đỉnh khơng có virus Theo ơng lý sau: - Virus vận chuyển nhờ hệ mô dẫn, hệ thống khơng có mơ phân sinh đỉnh - Trong phân chia, tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép chép thông tin di truyền virus - Hệ thống vơ hiệu hóa virus vùng mô phân sinh đỉnh mạnh vùng khác - Nồng độ auxin cao mơ phân sinh đỉnh ngăn cản q trình chép virus * Kỹ thuật làm virus in vitro: - Ni cấy mơ phân sinh đỉnh: tách xác mơ phân sinh đỉnh có kích thước