Báo cáo thực hành hóa sinh

Báo cáo hóa sinhDocument Transcript1. 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG – THỰC PHẨM Lớp 12DSH02 BÁO CÁO THỰC HÀNH HÓA SINH GVHD: Nguyễn Thị Hai Sinh viên: Trương Thị Thảo MSSV:1211100186 Ngô Lê Hồng Duyên MSSV: 1211100062 Cao Thị Nhâm MSSV:1211100142 Đoàn Ngọc Kiểng MSSV:1211100293 Võ Nguyễn Anh Thư MSSV:1211100192 Phan Thị Thúy Vy MSSV: 12111002832. 2 BÀI 1: GIỚI THIỆU PHÒNG THÍ HÓA SINH, CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH DÙNG TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH Lý thuyết I. Quy tắc làm việc trong phòng thí nghiệm hóa sinh a. An toàn khi làm việc với axit và kiềm  An toàn khi làm việc với axit Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản ứng với các axit tự do Khi pha loãng luôn phải cho axit vào nước .  An toàn khi làm việc với kiềm Kiềm có thể làm cháy da Mang găng tay , khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm Thao tác trong tủ hút, mang mặc nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm b. Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm  Hóa chất thí nghiệm: Các hóa chất dùng để phân tích, làm tiêu bản, tiến hành phản ứng, trong phòng thí nghiệm được gọi là hóa chất thí nghiệm.  Nhãn hiệu hóa chất : Hóa chất được bảo quản trong chai lọ, thủy tinh hoặc nhựa đóng kín có nhãn ghi tên hóa chất, công thức hóa hoc, mức độ sạch, tạp chất, khối lượng tịnh, khối lượng phân tử, nơi sản xuất , điều kiện bảo quản.  Cách sử dụng và bảo quản hóa chất: Khi làm việc với hóa chất , nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết sức cẩn thận tráng gậy những tai nạn đáng tiếc cho mình cũng như cho người khác.3. 3 Bao giờ cũng đổ axit hay bazơ vào nước khi pha loãng . Không hút axit hay bazơ bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riệng như: ống bóp cao su. II. Cách pha chế các dung dịch trong thí nghiệm hóa sinh:  Dung dịch : Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hổ với nhau về mặt vật lí và hóa học. Trong dung dịch gồm có chất hòa tan và dung môi .  Các đơn vị nồng độ dung dịch: Nồng độ phần trăm, (% )  Nồng độ phần trăm – khối lượng, % (ww): là số gam chất tan có trong 100g dung dịch.  Nồng độ trăm khối lượng thể tích (wv): là số g chất tan có trong 100ml dung dịch.  Nồng độ phần trăm thể tích – thể tích , % (vv): là số ml dung chất có trong 100ml dung dịch.  Nồng độ gam – lít, (gL): là số g chất tan có trong 1 lít dung dịch.  Nồng độ phân tử g hay nồng độ mol, (molL): là số phân tử g ( hay số mol) chất tan trong 1 lít dung dịch.  Nồng độ đương lượng (N); là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1 lít dung dịch. Số đương lương chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z) Hệ số đương lượng (z) : phụ thuộc vào bản chất của chất đó và phản ứng mà chất đó tham gia.  Nồng độ dung dịch bão hòa: là nồng độ dung dịch khi tối đa chất hòa tan có mặt trong dung dịch.  Đơn vị nồng độ dùng trong các phép phân tích vi lượng : Nồng độ mgmL : số mg chất tan trong 1mL dung dịch4. 4 Miligam phần trăm , mg% : mg chất tan trong 100g dung dịch Phần nghìn ,0 00 : số gam chất hòa tan trong 1000g dung dịch Phần triệu , ppn : số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lịt dung dịch Phần tỷ , ppb : sồ µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch  Cách pha dung dịch có nồng độ xác định a. Pha dung dịch có nồng độ theo khối lượng ,% (ww) Chất tan là chất rắn khan Chất tan là chất rắn ngậm nước ( CuS04.5H2O..) Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn. b. Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn c. Pha dung dịch bão hòa : Lấy chất tan cần pha vào becher , thêm một ít nước cất và khuấy cho tan . Nếu sau khi khuấy , chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dung dịch bão hòa. Nếu chất tan tan hết , thêm chất tan và tiếp tục khuấy , cứ như thế cho đến khi chất tan không còn tan được nào. d. Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích : Chất tan là chất rắn khan Cân lượng chất tan cần thiết , chuyển sang bình định mức , dùng nước cất hòa tan và định mức đến thể tích đúng. Chất tan là chất rắn ngậm nước Khi pha dung dịch ta cần phải tính lượng kết tinh có sẵn giống như phần a Chất tan dạng lỏng : một số chất tan ở dạng lỏng như HCl, H2S04… Ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệm được pha chế theo nồng độ khới lượng thể tích (wv). i. Pha dung dịch nồng độ phân tử gam: Chất tan là chất rắn khan :5. 5 Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó , ta tính khối lượng phân tử chất đó theo đơn vị gam. Cân chính xác lượng chất tan , qua phễu cho vào bình định mức có dung tích 1 lít . Cho vào từng lượng nước cất nhỏ , lắc để hòa tan hoàn toàn và đưa nước cất tới mức . Chuyển dunh dịch sang bình chứa, lác để trộn đều đồng nhất. Khi phải đun dung dịch để hòa tan, hoặc quá trình hòa tan có tỏa nhiệt thì phải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêm nước tới vạch định mức. Chất tan là chất rắn ngậm nước : khi tính lượng chất tan cần cân phải tính luôn cả khối lượng các phân tử nước. Chất tan dạng lỏng: nếu chất tan là dung dịch, ta phải tính toán dựa vào nồng độ dung dịch đó.  Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch. a. Dung dịch chuẩn. Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn, đảm bảo chính xác và được dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm.  Cách pha dung dịch từ ống chuẩn: Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình định mức, dùng bình tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit, vừa thêm nước cất vừa lắc và đưa nước cất tới vạch mức. Đối với các hợp chất bền vững, có thành phần không thay đổi như NaCl, AgNO3, acid oxalic,.. có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xác chất cần pha, pha loãng và định mức tới thể tích đúng. Đối với các chất như NaOH, HCl, Na2S2O3,..không thể pha ngay được dung dịch chuẩn, do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần, vì vậy sau khi pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ. b. Phương pháp hiệu chỉnh nồng độ dung dịch6. 6 Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu muốn pha dung dịch có nồng độ chính xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau đó hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp. Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản, mỗi lần sử dụng lại phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Xét một phản ứng trung hòa acid – base, 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1 ion gam OH. Do đó: C1V1 =C2V2 Nếu gọi Cp là nồng độ dung dịch định pha và Ct là nồng độ thực của dung dịch ta có hệ số hiệu chỉnh K: K = CpCt = VpVt III. Dung dịch đệm a. Định nghĩa dung dịch đệm Dung dịch đệm là dung dịch có pH không thay đổi nhiều lắm khi 1 lượng axit (H+ ) hoặc bazơ (OH ) . Vậy, dung dịch đệm gồm 1 cặp axit bazơ liên hợp ( axit yếu và muối của axit yếu này hoặc bazơ yếu và muối của bazơ này) và tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH dung dịch. Trong cơ thể sống, dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng ví dụ như ổn định pH của máu bằng các hệ đệm cacbonat và phosphat. b. Cách pha một số dung dịch đệm thường dùng Dung dịch đệm borat Dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 3,6) Dung dịch đệm phosphate( pH = 5,7 – 8,0) Dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (Ph = 5,0 – 8,0) Dung dịch đệm glycine – HCl (pH = 2,2 – 3,6) Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8,6 – 10,6) Dung dịch đệm axetat (pH = 3,6 – 5,6) Dung dịch đệm vạn năng 0.1 M7. 7 CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: Pha 1L dung dịch NaOH 40% (wv): cân X=(40x1000)100=400(g) NaOH khô. Câu 2: Nồng độ mol của H2SO4 đđ là: CM = (10.d.C%)M = (10x97x1.84)98 = 18.2 (mol) Thể tích H2SO4 cần sử dụng là: VH2SO4 = (VH2SO4 2M. CMH2SO4)CMH2SO4 đđ = (2x500)18.2 = 54.91(ml) Lượng nước cần bổ sung là: 500 – 54.91 = 445.09 (ml) Câu 3: Pha 250ml dung dịch CuSO4 1M, cân m = n.M = 0.25 x 250 = 62.5 (g) CuSO4.5H2O Câu 4:H2SO4 2M = H2SO4 4N C1.V1 = C2.V2  V2 = (1000 x 0.1)4 = 25 (ml) Câu 5: Lượng NaOH cần để pha dung dịch 10% là: X= ( 10x500)100 = 50 (g) Lượng dung dịch NaOH 40% cần dùng là: Y = (100x50)40 = 125 (g) Lượng nước cất thêm vào: 500 – 125 = 375 (g) Câu 6: Lượng HCl cần để pha dung dịch 2% là: X = (2x500)100 =10 (g) Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là: Y = (100 10)37 = 27.03 (g) => 27.03 1.19 = 22.71 (ml) Lượng nước cất thêm vào : 500 – 22.71 = 477.29 (ml)8. 8 BÀI 2 : ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ACID DINITROSALICYLIC (DNS) LÝ THUYẾT  Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS) .Cường độ màu của hỗn hợp phản tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. THỰC HÀNH I. Dụng cụ Hóa chất: 1. Dụng cụ Máy đo màu Cuvette d = 1 cm, V = 4ml Ống nghiệm có nắp và các dụng cụ thủy tinh khác Bếp điện 2. Hóa chất Mẫu rau quả chứa đường (dứa) Thuốc thử DNS Dung dịch glucose chuẩn 1mgml (bảo quản lạnh) II. Tiến hành 1. Chiết xuất đường trong thực vật Chuẩn bị mẫu thơm 20g Giã nhỏ Vắt lấy nước cho vào bình định mức Thêm nước cất đủ 100ml Pha loãng mẫu hệ số n (20,50,100,200 lần)9. 9 2. Dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng đường Hóa chất ống1 ống2 ống3 ống 4 ống5 ống6 ống7 Glucose 1mgml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 Nước cất(ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 Mẫu pha loãng(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 ? DNS (mol) 3 3 3 3 3 3 3 OD540nm 0 0.333 0.712 1.233 1.469 1.623 0.179 Đo ở bước sóng 540nm CHÚ Ý : tiến hành các mẫu dựng đường chuẩn và thí nghiệm đồng thời y = 1,7206x + 0,0347 R² = 0,9756 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 OD540nm C Đường chuẩn nồng độ đường khử (mgml) với mật độ quang OD540nm10. 10  Tính kết quả: Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được mgml đường khử trong dung dịch đường pha loãng. Nhân với hệ số pha loãng n để được lượng đường trong 1 ml dung dịch gốc Chọn hệ số pha loãng n sao cho OD nằm trong giới hạn đường chuẩn Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ đường khử (mgml) với mật độ quang OD540 ở trên ta tính được hàm lượng đường khử P ở trong mẫu phân tích X. y = 1,7206x + 0,0347 ⟹ x =

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG – THỰC PHẨM

Lớp 12DSH02

BÁO CÁO

THỰC HÀNH HÓA SINH

GVHD: Nguyễn Thị Hai

Sinh viên: Trương Thị Thảo MSSV:1211100186

Ngô Lê Hồng Duyên MSSV: 1211100062 Cao Thị Nhâm MSSV:1211100142 Đoàn Ngọc Kiểng MSSV:1211100293

Võ Nguyễn Anh Thư MSSV:1211100192 Phan Thị Thúy Vy MSSV: 1211100283

BÀI 1: GIỚI THIỆU PHÒNG THÍ HÓA SINH, CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH DÙNG TRONG PHÒNG THÍ

NGHIỆM HÓA SINH

Lý thuyết

a An toàn khi làm việc với axit và kiềm

 An toàn khi làm việc với axit

- Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản ứng với các axit tự do

- Khi pha loãng luôn phải cho axit vào nước

 An toàn khi làm việc với kiềm

- Kiềm có thể làm cháy da

- Mang găng tay , khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm

- Thao tác trong tủ hút, mang mặc nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm

b Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm

tử, nơi sản xuất , điều kiện bảo quản

 Cách sử dụng và bảo quản hóa chất:

- Khi làm việc với hóa chất , nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết sức cẩn thận tráng gậy những tai nạn đáng tiếc cho mình cũng như cho người khác

- Bao giờ cũng đổ axit hay bazơ vào nước khi pha loãng

- Không hút axit hay bazơ bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riệng như: ống bóp cao su

II Cách pha chế các dung dịch trong thí nghiệm hóa sinh:

 Nồng độ trăm khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dung dịch

 Nồng độ phần trăm thể tích – thể tích , % (v/v): là số ml dung chất có trong 100ml dung dịch

 Nồng độ gam – lít, (g/L): là số g chất tan có trong 1 lít dung dịch

 Nồng độ phân tử g hay nồng độ mol, (mol/L): là số phân tử g ( hay số mol) chất tan trong 1 lít dung dịch

 Nồng độ đương lượng (N); là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1 lít dung dịch

Số đương lương chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z)

- Hệ số đương lượng (z) : phụ thuộc vào bản chất của chất đó và phản ứng mà chất

đó tham gia

 Nồng độ dung dịch bão hòa: là nồng độ dung dịch khi tối đa chất hòa tan có

mặt trong dung dịch

 Đơn vị nồng độ dùng trong các phép phân tích vi lượng :

- Nồng độ mg/mL : số mg chất tan trong 1mL dung dịch

- Miligam phần trăm , mg% : mg chất tan trong 100g dung dịch

- Phần nghìn ,0/

00 : số gam chất hòa tan trong 1000g dung dịch

- Phần triệu , ppn : số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lịt dung dịch

- Phần tỷ , ppb : sồ µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch

 Cách pha dung dịch có nồng độ xác định

a Pha dung dịch có nồng độ theo khối lượng ,% (w/w)

- Chất tan là chất rắn khan

- Chất tan là chất rắn ngậm nước ( CuS04.5H2O )

Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn

b Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn

c Pha dung dịch bão hòa :

Lấy chất tan cần pha vào becher , thêm một ít nước cất và khuấy cho tan Nếu sau khi khuấy , chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dung dịch bão hòa Nếu chất tan tan hết , thêm chất tan và tiếp tục khuấy , cứ như thế cho đến khi chất tan không còn tan được nào

d Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích :

Khi pha dung dịch ta cần phải tính lượng kết tinh có sẵn giống như phần a

- Chất tan dạng lỏng : một số chất tan ở dạng lỏng như HCl, H2S04…

Ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệm được pha chế theo nồng độ khới lượng- thể tích (w/v)

i Pha dung dịch nồng độ phân tử gam:

- Chất tan là chất rắn khan :

Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó , ta tính khối lượng phân tử chất

đó theo đơn vị gam Cân chính xác lượng chất tan , qua phễu cho vào bình định mức có dung tích 1 lít Cho vào từng lượng nước cất nhỏ , lắc để hòa tan hoàn toàn và đưa nước cất tới mức Chuyển dunh dịch sang bình chứa, lác để trộn đều đồng nhất

Khi phải đun dung dịch để hòa tan, hoặc quá trình hòa tan có tỏa nhiệt thì phải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêm nước tới vạch định mức

- Chất tan là chất rắn ngậm nước : khi tính lượng chất tan cần cân phải tính luôn cả khối lượng các phân tử nước

- Chất tan dạng lỏng: nếu chất tan là dung dịch, ta phải tính toán dựa vào nồng độ dung dịch đó

 Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch

a Dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn, đảm bảo chính xác và được dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm

 Cách pha dung dịch từ ống chuẩn:

- Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình định mức, dùng bình tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit, vừa thêm nước cất vừa lắc và đưa nước cất tới vạch mức

- Đối với các hợp chất bền vững, có thành phần không thay đổi như NaCl, AgNO3, acid oxalic, có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xác chất cần pha, pha loãng và định mức tới thể tích đúng

- Đối với các chất như NaOH, HCl, Na2S2O3, không thể pha ngay được dung dịch chuẩn, do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần, vì vậy sau khi pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ

b Phương pháp hiệu chỉnh nồng độ dung dịch

Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu muốn pha dung dịch có nồng độ chính xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau đó hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp

Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản, mỗi lần sử dụng lại phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch

Xét một phản ứng trung hòa acid – base, 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1 ion gam

CÂU HỎI ÔN TẬP

- Lượng NaOH cần để pha dung dịch 10% là: X= ( 10x500)/100 = 50 (g)

- Lượng dung dịch NaOH 40% cần dùng là: Y = (100x50)/40 = 125 (g)

- Lượng nước cất thêm vào: 500 – 125 = 375 (g)

BÀI 2 : ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG

1 Chiết xuất đường trong thực vật

- Chuẩn bị mẫu thơm 20g

2 Dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng đường

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2

C

Đường chuẩn nồng độ đường khử (mg/ml)

với mật độ quang OD540nm

 Tính kết quả:

Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được mg/ml đường khử trong dung dịch đường pha loãng

Nhân với hệ số pha loãng n để được lượng đường trong 1 ml dung dịch gốc

Chọn hệ số pha loãng n sao cho OD nằm trong giới hạn đường chuẩn

Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ đường khử (mg/ml) với mật độ quang OD540 ở trên ta tính được hàm lượng đường khử P ở trong mẫu phân tích X

CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: Đường khử là các đường chứa nhóm aldehyde (-CHO) hoặc ketone (-CO) như

glucose , fructose ,arabinose , maltose , lactose (saccharose , trehalose không phải đường khử

Câu 2: Áp dụng phương pháp đo đường khử trong trường hợp phân tích nồng độ

đường khử trong dung dịch

Câu 3 : Sai số hệ thống do những lý do:

- Hóa chất chuẩn bị cho thí nghiệm không được chuẩn

- Do vận chuyển mẫu không đúng cách

- Thao tác đo không chính xác

- Ghi không chính xác chỉ số

- Ở dụng cụ cuvete khi đo OD

- Hút hóa chất không chính xác

Câu 4 : Khi đo OD máy báo over là do mẫu quá đậm đặc cần phải pha loãng lại

Gía trị OD nằm trong khoảng từ 1 đến 5 Vì nếu cao quá hoặc thấp quá đường chuẩn sẽ

bị lệch

Câu 5: Trong bài thực hành chọn đường glucose để dựng đường chuẩn điều này

không luôn đúng vì đường khử có nhiều loại như fructose, maltose…

BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG

PHÁP KJELDAHL

1 Định nghĩa:

- Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số Nitơ có trong các thành phần amino acid của protein là nitơ protein Nitơ không có trong thành phần protein như của các muối NH4+, các amino acid tự do, các peptide, urea và các dẫn xuất của urea, các alkaloid, các base purin và pyrimidine,… là nitơ phi protein Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein

- Đạm tổng số hay protein tổng số là nitơ tổng số nhân với hệ số chuyển đổi Hệ số này phụ thuộc vào hàm lượng nito trong protein Thông thường nito chiếm 16% protein nên hệ số chuyển đổi thường sử dụng là 100/16 = 6.25

- Đạm tổng số = Nito tổng số X hệ số chuyển đổi

- Bảng dưới đây biểu diễn hệ số chuyển đổi cụ thể cho nhiều đối tượng mẫu khác nhau

a) Vô cơ hóa mẫu

- Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:

2H2SO4  2H20 + 2SO2 + O2

- Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác Các phân tử chứa nito dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3 Ví dụ các protein bị thủy phân thành amini acid, cacbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O, còn nito được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch

- m: số gam mẫu hay ml mẫu sau khi chuẩn độ lại

- n: hệ số pha loãng mẫu khi vô cơ hóa mẫu để đưa vào chưng cất

1.42: hệ số nito, cứ 1ml H 2 SO 4 dùng để trung hòa NH 4 OH thì tương đương với 1.42mg nito

Bài tập: pha loãng 50 lần sữa tươi nguyên chất Vinamilk bằng bình định mức

100ml, sau đó chưng cất đạm với lượng H2SO4 cho vào bình là 20ml và chuẩn độ bằng NaOH 0.1N Tính hàm lượng N tổng số trong mẫu, tính ra protein tổng số

 Vô cơ hóa mẫu

Nito (tổng số) = Nito tổng số X hệ số chuyển đổi = 0.40825 x 6.25 = 2.5515625

Dd trước chuẩn độ Dd sau chuẩn độ

CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1) Giải thích ý nghĩa các bước trong thí nghiệm

a) Vô cơ hóa mẫu

- Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác Các phân tử chứa nito dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3.NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành

(NH4)2SO4 tan trong dung dịch

 Sai số của máy chưng cất

Câu 3 Vì sao phải bảo đảm NaOH trong bình chưng cất đạm dư?

Vì NaOH dư thì sẽ chuyển tất cả (NH4)2SO4 thành NH3

Câu 4 Nếu thay H2SO4 trong bình hứng bằng acid boric (H3BO3) thì kết quả có thay đổi gì không?

Ta có: 0.1N H2SO4 = 0.05M H2SO4

Ta chuyển qua phương trình và 1.42 là hệ số nito, cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa

NH4OH thì tương đương với 1.42mg nito Vì lấy 1ml nên nhân thêm cho 10-3

 2NH4OH + H2SO4  (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 (dư)

0.1*10-3 0.05*10-3

 mN=0.1*10-3 * 14.2

3NH4OH + H3BO3  (NH4)3BO3 + 3H2O + H3BO3 Dư

0.15*10-3*14.2 0.05*10-3

 mN=0.15*10-3 * 14.2= 2.13*10-3

Vì vậy nếu thay thành acid boric thì hệ số sẽ là 2.13

Câu 5 Nếu chuẩn độ bằng NaOH 0.05N thì kết quả N tổng số thay đổi thế nào?

Áp dụng công thức: C1V1 = C2V2

V1, C1 cố định và V2 phải chuẩn độ

Mà C2 giảm 1 nữa thì V2 tăng thể tích gấp đôi  Công thức thay đổi

BÀI 4 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein

Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ Dung dịch protein chuẩn thường là bovine serum albumin (BSA) Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu

sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế

ta được ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng trong mẫu Thực hiện một đối chứng với nước cất (OD0). Lấy giá trị OD = ODx - OD0 Lượng protein mẫu trong dung dịch đo được xác định bằng cách chấm trên đường chuẩn theo OD, lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành

Đó chính là lượng protein mẫu trong dung dịch đo

Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250

- Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm

0, lắc đều để yên Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1, lắc đều để

yên, cứ tiếp tục cho đến hết

- Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595nm

- Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 ở trên ta tính được hàm lượng protein P ở trong mẫu phân tích X

y = 10,514x + 0,0015 R² = 0,9675

0 0,1

CÂU HỎI ÔN TẬP:

1 Giải thích ý nghĩa các bước trong thí nghiệm

- Pha loãng mẫu với hệ số pha loãng n lần để được mẫu phân tích

 Phải giảm bớt nồng độ protein trong mẫu, để khi đo nồng độ quang không bị vượt

quá giới hạn cho phép

- Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫu

nghiệm 1, lắc đều để yên, cứ tiếp tục cho đến hết

 Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm

Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein

- Tính thời gian ống 0 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 595 nm Ta có giá trị OD0, ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD1),

tương tự cứ cách một phút đo cho hết các ống Ghi lại giá trị OD

 Trong 20 phút thuốc nhuộm kết hợp với protein khi đó thuốc nhuộm hấp thu cực

đại ở bước sóng 595 nm

2 Thảo luận các yếu tố dẫn đến sai số

 Do sai thao tác trong tiến hành thí nghiệm

 Mẫu protein chuẩn bị không được chuẩn

 Hóa chất chuẩn bị cho thí nghiệm không được chuẩn

 Do vận chuyển mẫu không đúng cách

 Lấy mẫu không đúng theo thể tích yêu cầu

 Ghi không chính xác chỉ số

 Thao tác đo không chính xác

 Máy đo OD không chuẩn

3 Áp dụng phương pháp bradford cho trường hợp nào

 Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein.Hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thu ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ

với nồng độ protein trong dung dịch

 Tiết kiệm thời gian và dễ thực hiện

 Cường độ màu tỉ lệ nồng độ protein trong dung dịch nồng độ càng cao thì màu

xanh càng đậm không phụ thuộc nồng độ acid amin của dung dịch

 Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát phát hiện tới vài protein 5-200 µg/

ml Nhạy hơn phường pháp Lowry gấp 4 lần

 Ít bị ảnh hưởng bởi các chất thường gặp trong tế bào gặp chẳng hạn như muối

4 Trường hợp mẫu ở thể rắn cần phải xử lý mẫu như thế nào?

Cân m = 5-10g mẫu rắn đã nghiền nhỏ, cho vào bình nón dung tích 250ml, bổ sung 50ml nước cất và 10ml dung dich đệm phosphat pH = 4,9 Giữ hỗn hợp ở nhiệt độ 30oC trong thời gian 1 giờ có khuấy đảo định kỳ Lọc, rửa thu hồi dung dịch sao cho V = 100ml Bảo quản dung dịch gốc ở 2 – 4oC trong thời gian một ngày

BÀI 5: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME

 Về nguyên tắc có thể hai nhóm phương pháp chính sau:

Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định

Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định

Để thực hiện được mục đích trên, nhiều phương pháp phân tích khác nhau được sử dụng: phương pháp đo quang phổ, đo độ phân cực, áp suất, độ nhớt, phương pháp sắc ký

và phương pháp hóa học

Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính Một đơn vị họat tính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp.

b Đơn vị hoạt tính của enzyme:

Đơn vị đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt U)

Do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB) định

nghĩa:

Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được

 1 𝜇mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn