Phụ lụcPhần 1 Giới thiệu về phương pháp PCR1.1Khái niệm21.2 Lịch sử phát triển21.3Nguyên tắc phương pháp PCR51.4Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR91.5Giải pháp tối ưu hóa cho phản ứng PCR111.6Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật PCR131.7Ứng dụng của PCR15Phần 2 Ứng dụng của PCR trong kỹ thuật DGGE2.1Khái niệm DGGE162.2Ứng dụng của kỹ thuật DGGE16Phần 3 Ứng dụng3.1 Ứng dụng 1: Nghiên cứu khả năng phân hủy dioxin và phân loại gen mã hóa dioxin dioxingienaza của hỗn hợp chủng vi khuẩn kị khí không bắt buộc SETDN20 từ đất nhiễm độc hóa học tại Đà Nẵng173.2 Ứng dụng 2: Xác định cấu trúc và sự đa dạng của tập đoàn vi khuẩn khử sunfate trong mẫu bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ dioxin tại sân bay Đà Nẵng bằng kỹ thuật PCRDGGE26
LOGO www.themegallery.com ỨNG DỤNG CỦA PCR GVHD: PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ DANH SÁCH: 1. Trần Công Nhất 2. Nguyễn Thanh Hồng Nhật 3. Hoàng Thị Nhung LOGO www.themegallery.com NỘI DUNG 1 2 4 4 NỘI DUNG CỦA PHƯƠNG PHÁP GIỚI THIỆU CHUNG 4 4 5 5 2 5 3 5 6 ỨNG DỤNG PCR TRONG KĨ THUẬT DGGE ỨNG DỤNG CỦA KĨ THUẬT DGGE LOGO www.themegallery.com I. GIỚI THIỆU CHUNG GiỚI THIỆU CHUNG Được Kary Mullis (Mỹ) phát minh năm 1985 Là phản ứng nhân tạo tổng hợp và khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa 2 trình tự gọi là Mồi PCR đã thực sự làm một cuộc đại cách mạng sinh học phân tử LOGO www.themegallery.com II.NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP Khái niệm 1 Lịch sử ra đời của phương pháp 2 3 Nguyên tắc của phương pháp Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng 4 Giải pháp tối ưu hóa cho phản ứng 5 Ưu điểm và hạn chế của phương pháp 6 Ứng dụng của PCR 7 LOGO www.themegallery.com KHÁI NiỆM • PCR (Polymerase Chain Reaction) là phương pháp invitro để tổng hợp và khuếch đại một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi oligonucleotide gắn vào 2 sợi đôi của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase. LOGO www.themegallery.com LỊCH SỬ PHƯƠNG PHÁP PCR 1. Lịch sử ra đời của phương pháp . Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này. LOGO www.themegallery.com 1.Lịch sử ra đời của phương pháp Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase. Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymerase lấy từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên 110°C Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiênđược phân lập được từ Thermus aquaticus và được gọi là Taq. Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực nghiệm PCR (5/2004) LOGO www.themegallery.com 1. Lịch sử ra đời của phương pháp PCR cần rất nhiều thành phần.Những thành phần đó là: DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại Cặp mồi (primer), để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại DNA-Polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA. Nucleotides (ví dụ dNTP)là nguyên liệu cho DNA- polymerase để xây dựng DNA mới. Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA- polymerase LOGO www.themegallery.com Sự phát hiện ra các men polymerase chịu nhiệt độ Máy chu kỳ nhiệt 2. Hai bước tiến quan trọng đã đưa PCR đến cuộc đại cách mạng sinh học phân tử: Thermus aquaticus Thermus thermophilus Máy PCR LOGO www.themegallery.com NGUYÊN TẮC PHƯƠNG PHÁP Một phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: Giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp và giai đoạn kéo dài chuỗi: Giai đoạn biến tính (denaturation): Tách chuỗi ADN từ mạch đôi thành dạng mạch đơn.Phân tử DNA sợi đôi được hình thành bởi mối liên kết hydro giữa hai mạch đơn. Trong quá trình biến tính, nhiệt độ phản ứng gia tăng lên nhanh chóng đến 95oC và giữ ở nhiệt độ này trong khoảng 15-50 giây. Ở nhiệt độ này mối liên kết hydro giữa hai mạch đơn của phân tử DNA sợi đôi bị phá vỡ. Trong giai đoạn bắt cặp tiếp theo, nhiệt độ phản ứng giảm nhanh chóng làm cho mối liên kết hydro ban đầu không hình thành lại được kết quả làm tạo thành hai phân tử DNA mạch đơn. Giai đoạn bắt cặp (anealation): Gắn cặp mồi đặc trưng theo nguyên tắc bổ sung.Trong giai đoạn bắt cặp, nhiệt độ lai thường duy trì khoảng 50- 600C, trong thời gian 15-60 giây. Quá trình này giúp cho các mồi (primer) tìm kiếm và bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự đích (DNA hoặc cDNA) tại vị trí mong muốn. Nhiệt độ bắt cặp phụ thuộc vào số lượng G,C có trong mồi (primer). [...]... tra huyết thống Ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng LOGO DỤNG PCR TRONG KĨ THUẬT DGGE ỨNG Khái niệm DGGE: LOGO ỨNG DỤNG CỦA KĨ THUẬT DGGE LOGO ỨNG DỤNG 1 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DIOXIN VÀ PHÂN LOẠI GEN MÃ HÓA DIOXIN DIOXINGIENAZA CỦA HỖN HỢP CHỦNG VI KHUẨN KỊ KHÍ KHÔNG BẮT BUỘC SEDTN20 TỪ ĐẤT NHIỄM ĐỘC HÓA HỌC TẠI ĐÀ NẴNG LOGO ĐẶT VẤN ĐỀ: LOGO NGUYÊN LIỆU : Hỗn hợp chủng SETDN20 Đã được phân lập... ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG PCR Mồi Chu kì của phản ứng PCR DNA mẫu Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR Biến tính Enzyme Nồng độ ion Mg2+ dNTP LOGO GiẢI PHÁP TỐI ƯU HÓA CHO PHẢN ỨNG PCR Do PCR rất nhạy, nên phải tránh ô nhiễm các DNA khác có trong phòng thí nghiệm (vi khuẩn, virus, DNA, ).Vì vậy các mẫu DNA, hỗn hợp phản ứng và quy trình DNA, ngoài ra còn có phản ứng phân tích sản phẩm, nên được thực... trường phản ứng Kết quả quá trình này phản ứng PCR đã tạo ra hai phân tử DNA mạch đôi mới từ một phân tử DNA mạch đôi ban đầu LOGO NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP http://users.ugent.be/~avierstr/pdf /PCR. pdf LOGO NGUYÊN TẮC PHƯƠNG PHÁP http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrani.html LOGO NGUYÊN TẮC PHƯƠNG PHÁP Sơ đồ tổng hợp nguyên tắc của phương pháp PCR LOGO CÁC CHỈ TIÊU ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG PCR Mồi... Mật độ sự hiện diện của vi sinh vật trong mẫu thực phẩm thường thấp Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết Chi phí cho việc phát hiện các vi sinh vật đơn lẻ trong thực phẩm thường tốn kém LOGO Ứng dụng của PCR Sử dụng PCR để tạo nhanh các gen tổng hợp Tạo dòng cDNA Gây đột biến điểm Xác định kiểu gen của các đột biến So sánh mức độ biểu hiện của gen Vân tay... bắt cặp bổ sung với trình tự đích, nhiệt độ của phản ứng lại nhanh chóng chuyển về nhiệt độ thích hợp với hoạt động của enzyme DNA polymerase thường là 720 C và giữ ở nhiệt độ này 30 giây đến 2 phút tùy theo chiều dài của đoạn DNA đích cần tổng hợp Trong quá trình tổng hợp DNA polymerase sẽ lấy nucleotide (A,T,G,C) từ môi trường phản ứng để gắn vào đầu 3’ của mồi (primer) theo nguyên tắc bổ sung với... hiện trong một khu vực riêng biệt.Ở giai đoạn chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, phải chuẩn bị phòng riêng biệt với đèn UV.Phải sử dụng găng tay sạch cho mỗi bước PCR cũng như thay thế các pipet Thuốc thử dùng trong PCR phải được chuẩn bị riêng biệt và chỉ được dùng cho mục đích này Các mẫu phải được giữ riêng biệt với các mẫu DNA khác.Phản ứng có kiểm soát (kiểm soát bên trong), ngoại trừ DNA khuôn mẫu, phải... thực hiện cực nhanh Đơn giản và ít tốn kém Độ tinh sạch của mẫu không cần cao PCR có thể giúp phân biệt được gen đột biến do mất đoạn, thêm đọa hay đột biến điểm Dùng để định lượng so sánh bằng cách cho tiến hành khuếch đại đòng thời trình tự đích và một trình tự chứng có nồng độ đã biết LOGO ƯU ĐiỂM VÀ NHƯỢC ĐiỂM Nhược điểm Trình tự của khích thước cần khuếch đại giới hạn Sự ngoại nhiễm... dioxin Máy đọc trình tự tự động Phần mềm Avan Data Collection V1.0 và DNA Sequencing Analysis LOGO CÁC PHƯƠNG PHÁP: Phương pháp phân lập vi khuẩn Nghiên cứu hình thái tế bào vi khuẩn Tách chiết DNA tổng số PCR và nhân dòng đọc trình tự Phương pháp điện di gel biến tính ( DGGE ) LOGO www.themegallery.com Thank You ! . tắc của phương pháp Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng 4 Giải pháp tối ưu hóa cho phản ứng 5 Ưu điểm và hạn chế của phương pháp 6 Ứng dụng của PCR 7 LOGO www.themegallery.com KHÁI NiỆM • PCR. kém LOGO www.themegallery.com Ứng dụng của PCR Sử dụng PCR để tạo nhanh các gen tổng hợp. Tạo dòng cDNA. Gây đột biến điểm. Xác định kiểu gen của các đột biến. So sánh mức độ biểu hiện của gen. . LOGO www.themegallery.com ỨNG DỤNG CỦA PCR GVHD: PHẠM TRẦN VĨNH PHÚ DANH SÁCH: 1. Trần Công Nhất 2. Nguyễn Thanh Hồng Nhật 3. Hoàng Thị Nhung LOGO www.themegallery.com NỘI DUNG 1 2 4 4 NỘI DUNG CỦA PHƯƠNG